KR20020091905A

KR20020091905A - 주쇄 2-아미노에틸글리신의 1차 아미노기가 알킬 또는아릴설포닐에톡시카르 보닐기로 보호된 펩타이드 핵산단량체와 그 제조방법

Info

Publication number: KR20020091905A
Application number: KR1020010030712A
Authority: KR
Inventors: 하승범; 황대일; 안지수
Original assignee: 삼성정밀화학 주식회사
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2002-12-11

Abstract

본 발명은 주쇄 2-아미노에틸글리신의 1차 아미노기가 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호된 펩타이드 핵산(Peptide Nucleic Aicd; 이하 'PNA'라 한다) 단량체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 주쇄 2-아미노에틸글리신의 골격부분의 1차 아미노기를 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호시키는 단계에 의해 제조된 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호된 2-아미노에틸글리신과 뉴클레오염기의 1차 아미노기를 4-메톡시페닐디페닐메틸기로 보호시키는 단계에 의해 제조된 4-메톡시페닐디페닐메틸기로 보호된 뉴클레오염기를 반응시켜 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기/4-메톡시페닐디페닐메틸기로 보호된 PNA 단량체를 제조함으로써, 종래에 비해 PNA 단량체 보호기 도입이 쉽고, 높은 수율로 PNA 단량체를 제조할수 있으며, 제조된 PNA 단량체를 사용하여 온화한 조건에서 효과적으로 PNA 단량체의 보호기를 탈보호시켜 진단 탐침에 유용한 PNA 올리고머 제조를 용이하게 하는 PNA 단량체와 그 제조방법을 제공하는데 있다.

Description

주쇄 2-아미노에틸글리신의 1차 아미노기가 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호된 펩타이드 핵산 단량체와 그 제조방법{Alkyl or arylsulfonylethoxycarbonyl protected PNA monomer as the amino protected group of backbone, 2-aminoethylglycine and preparation method of thereof}

본 발명은 주쇄 2-아미노에틸글리신의 1차 아미노기가 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호된 펩타이드 핵산(Peptide Nucleic Aicd; 이하 'PNA'라 한다) 단량체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 주쇄 2-아미노에틸글리신의 골격부분의 1차 아미노기를 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호시키는 단계에 의해 제조된 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호된 2-아미노에틸글리신과 뉴클레오염기의 1차 아미노기를 4-메톡시페닐디페닐메틸기로 보호시키는 단계에 의해 제조된 4-메톡시페닐디페닐메틸기로 보호된 뉴클레오염기를 반응시켜 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기/4-메톡시페닐디페닐메틸기로 보호된 PNA 단량체를 제조함으로써, 종래에 비해 PNA 단량체 보호기 도입이 쉽고, 높은 수율로 PNA 단량체를 제조할수 있으며, 제조된 PNA 단량체를 사용하여 온화한 조건에서 효과적으로PNA 단량체의 보호기를 탈보호시켜 진단 탐침에 유용한 PNA 올리고머 제조를 용이하게 하는 PNA 단량체와 그 제조방법을 제공하는데 있다.

고체상 펩티드 합성은 의학과 생물학 연구에 사용되는 생물학적 활성 펩티드의 제조에 그리고 약학, 수의학과 진단에서 활성 물질로서 광범위하게 사용된다. 고체상 펩티드 합성의 본질은 고체상 지지체(solid support)에 부착되어 있는 C-말단 단량체로부터 시작하여 화학반응의 반복에 의한 사슬의 단계적 연장(elongation)으로 요약된다. 합성과정 중 모든 반응의 목적물질은 지지체에 결합되어 남아있고, 반면 반응물들과 부산물들은 지지체의 여과와 세척에 의해서 제거된다.

이러한 펩티드의 고체상 합성을 수행하기 위하여 사용되는 PNA 단량체의 골격과 뉴클레오염기(Nucleobase) 부분의 아미노기는 적절한 보호기로 보호되어 있어야 한다. 고체상 지지체에 붙은 단량체 골격의 아미노 보호기는 단계마다 탈보호되어서 유리(free) 아민형태가 되어 다음 순서의 단량체 골격부분의 카르복실산 말단과 결합해야 하며, 뉴클레오염기 부분의 아미노기는 영구적으로 보호되어 있어서 최종적으로 원하는 PNA 올리고머가 합성된 후 고체상 지지체로부터 분절(cleave)시 탈보호 되어져야 한다.

PNA 올리고머는 주쇄인 2-아미노에틸글리신의 반복되는 단위에 DNA 염기인 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민 등의 염기가 메틸렌카르보닐기에 의해 연결된 합성 폴리아미드로서 인산-당 골격을 가진 올리고뉴클레오티드의 유사체[국제특허공개 WO92/20702호]이다. PNA 올리고머는 보상되는 DNA 또는 RNA 단편을 인식하고 안정한 DNA/PNA 듀플렉스와 PNA/DNA/PNA 트리플렉스[J. Org. Chem. 1994, 59, 5767]를 형성한다. 이러한 결합체들은 올리고뉴클레오티드만으로 이루어진 결합체보다 안정하여, 안티센스(antisense) 치료제로서 올리고뉴클레오티드를 대체하려는 연구가 활발히 진행중이다.

PNA 올리고머 제조의 가장 일반적인 방법은 골격이 3차 부틸옥시카르보닐기(이하 't-Boc기'라 한다)로 보호되어 있고, 염기의 헤테로고리에 존재하는 1차 아미노기는 카바메이트 형태인 벤질옥시카르보닐기(이하 'Cbz기'라 한다)로 보호된 PNA 단량체로[Science 1991, 254, 1497]부터 제조하는 방법이다. t-Boc/Cbz기로 보호된 PNA 단량체는 상업적으로 제품화되어 판매되고 있으나, 이 보호기들을 제거하기 위해선 매우 강한 산성조건이 필요하다(Perseptive Biosystems사). 일반적으로 Cbz기를 완전히 제거하기 위해선 PNA 올리고머를 1시간 이상 액체 불화수소 또는 트리플루오르메탄설폰산으로 처리해야 한다. 그러나, 상기조건은 종종 PNA 올리고머에 붙어있을 수 있는 산에 민감한 부분인 핵산과 당의 파손을 일으킬 수 있으며, 매우 반응성이 강한 양이온 중간체가 생성되어 PNA 사슬의 특정부분의 알킬화 및 아실화 반응을 일으킬 수 있으며, 이와같은 부반응은 아니솔, 페놀, 디메틸설파이드 및 머캡토에탄올 같은 스캐빈저(scavenger)를 사용하여 부분적으로 줄일 수도 있다. 또한, 액체 불화수소 또는 트리플루오르메탄설폰산의 극히 위험한 성질은 PNA 올리고머 합성장비를 부식시킬 수 있으므로 취급시 적당한 안전 장치를 필요로 한다.

PNA 단량체의 t-Boc/Cbz 보호기 전략은 차이론(differential principle)이다. 이 전략은 보호기들이 본질적으로 같은 형태의 시약 및 조건에서 탈보호되나, 한 보호기의 다른 보호기에 대한 탈보호 반응시 상대속도 차이에 의존한다. 즉, t-Boc/Cbz 보호기 전략에서 두 보호기 모두 산성조건에서 탈보호되며, Cbz기의 완전한 제거의 경우 더 강한 산성조건이 필요하다. 따라서, 산성조건에 더 민감한 t-Boc기를 산으로 탈보호시, 일부 Cbz기도 동시에 탈보호될 가능성이 있다. 한편 PNA 올리고머 제조는 각 합성주기에서 t-Boc기만 주쇄의 아미노기로부터 분절되어, 이 주쇄의 유리 아미노기가 다음 단량체 주쇄의 유리 카르복실산과 결합하는 화학반응에 의한 폴리머 사슬의 단계적 연장이다. 주쇄의 1차 아미노 보호기인 t-Boc기는 중간 세기의 산성 시약들, 예를 들어 트리플루오르아세트산 및 그것의 염소화 탄화수소 용액, 유기용매중의 염화수소 용액, 보론트리플루오라이드/디에틸에테르 복합체 및 몇몇 다른 산들의 작용에 의해 이소부틸렌과 이산화탄소의 형성으로써 분절 될 수 있다. t-Boc기가 탈보호 되고 PNA 올리고머 사슬이 연장되는 동안에 염기 헤테로고리의 1차 아미노 보호기인 Cbz기는 분절되지 않아야 한다. 그러나 트리플루오르아세트산은 일부 Cbz기도 동시에 분절시킬 수 있어 부산물로서 가지달린 폴리머를 생성시켜 원하는 생성물의 총수율을 감소시킨다.

반면에 직교론(orthogonal principle)은 상호 다른 조건에서 보호기들을 분절시킨다. 즉, 한 보호기는 산조건하에서 분절되고 다른 한 보호기는 염기조건하에서 분절되는 전략으로 PNA 단량체 주쇄 1차 아미노 보호기로서 t-Boc기 대신에 염기조건에서 분절되는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(이하 'Fmoc기'라 한다)가 사용되었다[Tetrahedron 1995, 51, 6179]. 비록 이 전략(Fmoc/Cbz)이 폴리머사슬의 단계적 연장과정에서 Fmoc기를 탈보호시 뉴클레오염기의 1차 아민 보호기인 Cbz기의 분절 가능성은 배제되지만, 최종적으로 Cbz기 분절시 액체 불화수소 또는 트리플루오르메탄설폰산등의 강산을 사용해야만 한다. 최근 Perseptive Biosystems사는 Fmoc기를 주쇄 보호기로 사용하고, Cbz 대신에 카바메이트 형태이나 약한 산성조건하에서 쉽게 분절될 수 있는 벤즈하이드릴옥시카르보닐기(이하 'Bhoc기'라 한다)를 뉴클레오염기의 1차 아민 보호기로 도입한 PNA 단량체를 개발하였다[국제특허공개 WO 96/40685]. 이러한, Fmoc/Bhoc기로 보호된 PNA 단량체는 제품화되어 PNA 올리고머 합성시 널리 사용되고 있다. 그러나 PNA 단량체 제조시 Bhoc기로 보호된 염기 부분과, 1차 아미노 말단은 Fmoc기로 보호되고 카르복실산 말단은 메틸에스테르 형태인 주쇄부분의 결합후 최종 가수분해 반응시 일부 Fmoc기가 제거되므로 20 ∼ 30 몰%의 Fmoc-썩시닉이미드(succinimide)를 재투입해야만 하는 문제가 있다. 또한, Fmoc기는 극도의 염기 민감도와 중성 비양자성 용매에서의 불안정성 때문에 사용시 특히 주의해야 하며, 그외에도 대량의 PNA 올리고머 제조에 있어서 높은 생산비용도 Fmoc기의 사용을 제한한다.

PNA 단량체 제조시의 다른 문제점으론 염기의 헤테로고리에 존재하는 1차 아미노기의 보호기 도입에 관한 것이다. 일반적으로 아데닌, 구아닌, 시토신 등 염기의 아미노기는 클로로포메이트와 반응하여 카바메이트 형태로 보호된다. 그러나 클로로포메이트 화합물이 불안정하고 뉴클레오염기의 아미노기의 친핵성이 약해 반응에 어려움이 있다. 카바메이트 제조법으로 이미다졸라이드[J. Org. Chem., 1982, 47, 4471∼4477]와 알킬이미다졸리움 염[J. Am. Chem. Soc., 1982,104, 5702∼5708]등의 활성화된 카보네이트를 사용하는 방법이 보고되었다. 이 방법은 카바메이트 형성에 수반되는 어려움을 극복할 수는 있으나 뉴클레오염기에 널리 사용된 예는 많지않다. 한편 카바메이트 형태가 아닌 4-메톡시페닐디페닐메틸기(이하 'MMT기'라 한다)가 PNA 단량체의 뉴클레오염기의 1차 아미노 보호기로 보고된 바 있다[Bioorg. & Med. Chem. Lett. 1996, 6, 665].

상술한 바와 같이, PNA 단량체로서 제조가 용이하고 선택적이며 약한 조건에서 쉽게 분절될 수 있고 아울러 산업적으로도 적용 가능한 주쇄 및 뉴클레오염기의 1차 아미노 보호기 조합을 가진 PNA 단량체가 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명은 상기 문제를 개선하기 위해 주쇄 2-아미노에틸글리신 골격부분의 1차 아미노기는 약한 염기조건에서 쉽게 제거되는 새로운 보호기인 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호하고, 뉴클레오염기의 1차 아미노기는 약한 산성조건에서 쉽게 탈보호되는 MMT기로 보호시킨 PNA 단량체를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 종래 PNA 단량체에 비해 쉽게 주쇄 2-아미노에틸글리신 골격 부분의 보호기와 뉴클레오염기의 보호기를 도입시킬 수 있으며, 높은 수율로 PNA 단량체를 제조할수 있으며, 제조된 PNA를 사용하여 온화한 조건에서 효과적으로 PNA 단량체의 보호기를 탈보호시켜 PNA 올리고머 제조를 용이하게 하는 PNA 단량체와 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 펩타이드 핵산 단량체를 그 특징으로 한다.

상기 화학식 1에서; R₁은 C₁∼ C₆의 알킬기, 페닐기 또는 치환된 페닐기를 나타내며 (이때 페닐기의 치환체는 NO₂, C₁∼ C₃의 알킬기, 할로겐원자를 나타낸다), B는 아데닌, 구아닌, 시토신을 나타내며, R₂는 4-메톡시페닐디페닐메틸기를 나타낸다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 주쇄 2-아미노에틸글리신 골격부분의 1차 아미노기는 약한 염기조건에서 쉽게 제거되는 새로운 보호기인 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호하고, 뉴클레오염기의 1차 아미노기는 약한 산성조건에서 쉽게 탈보호되는 MMT기로 보호시킨 PNA 단량체에 관한 것이다.

알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기는 2-아미노에틸글리신의 1차 아미노기와 알킬 또는 아릴설포닐에틸썩신이미딜 카보네이트와의 반응에 의해 쉽게 골격 보호기로 도입될 수 있으며, 약 염기에서 쉽게 탈보호 되며, 대량의 PNA 올리고머 제조에 있어서 생산 비용이 높은 종래의 Fmoc기보다 주쇄 보호기로서 더 적합하다. 한편 뉴클레오염기 보호기로서 종래의 Cbz/Bhoc기 등은 클로로포메이트 형태로 뉴클레오염기의 아미노기와 반응하여 도입 되는데 클로로포메이트 화합물이 불안정하고 뉴클레오염기의 아미노기의 친핵성이 약해 반응에 어려움이 있으며, 도입을 용이하게 하기 위해선 먼저 염기 1차 아미노기를 이미다졸라이드로 활성화 시킨 후 알콜과 반응시키는 부가적인 반응이 필요하다. 그러나 본 발명에서 기술하는 MMT기는 트리에틸아민 또는 피리딘 존재하에 4-메톡시페닐디페닐메틸 클로라이드와 뉴클레오염기의 1차 아미노기와 반응하여 쉽게 보호기로 도입이 가능하며 약한 산조건에서 쉽게 탈보호 되어 PNA 올리고머 제조시 용이하다. 각각 보호기로 보호된 주쇄 부분과 카르복시메틸-뉴클레오염기는 일반적인 펩타이드 결합 과정에서 사용되는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(이하 'EDC'라 한다)를 사용하여 고수율로 용이하게 PNA 단량체를 제조할 수 있다. 그리고, 상기한 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기는 약한 염기조건에서 쉽게 제거되며, MMT기는 약한 산성조건에서 쉽게 탈보호되어 PNA 올리고머 제조시 부반응을 줄일 수 있어 사용에 용이하다(직교론).

본 발명은 상기한 본 발명에 따른 PNA 단량체의 제조방법을 포함하며, 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 2-아미노에틸글리신과 알킬 또는 아릴설포닐에틸썩신이미딜 카보네이트를 반응시켜 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호된 2-아미노에틸글리신을 제조하는 1단계로서, 더욱 상세하게는 주쇄 2-아미노에틸글리신의 1차 아미노기에 새로운 보호기인 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기의 도입은 2-아미노에틸글리신을 디메틸포름아미드와 디클로로메탄의 혼합용매하에 클로로트리메틸실란과 반응시켜 N,O-비스-트리메틸실릴-2-아미노에틸글리신을 제조한 후, 보호기 시약인 알킬 또는 아릴설포닐에틸썩신이미딜 카보네이트와 N-메틸몰폴린의 반응에 의해 보호기 도입을 한다.

그리고, 2 단계는 상기 1 단계에 의해 제조된 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호된 2-아미노에틸글리신을 시오닐클로라이드와 반응시켜 이의 염산염을 제조하는 단계로, 더욱 상세하게는 보호기가 도입된 후 2-아미노에틸글리신 골격의 카르복실산 말단은 알콜 용매하에 시오닐클로라이드를 0℃에서 적가한 후 환류하여 다음 화학식 2로 표시되는 주쇄부분 1차 아미노기가 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호된 2-아미노에틸글리신 알킬에스테르 염산염을 제조한다.

다음 3 단계는 뉴클레오염기와 4-메톡시페닐디페닐메틸클로라이드를 반응시켜 4-메톡시페닐디페닐메틸기로 보호된 뉴클레오염기를 제조하는 단계로, 더욱 상세하게는 PNA 단량체 제조를 위한 뉴클레오염기 부분은 티민을 제외한 아데닌, 구아닌, 시토신의 경우 헤테로고리에 존재하는 1차 아미노기가 MMT기로 보호된 카르복시메틸-뉴클레오염기를 공지된 방법에 의해 제조한다[Bioorg. & Med. Chem. Lett. 1996, 6, 665].

4 단계는 상기 2 단계에서 제조된 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호된 2-아미노에틸글리신 알킬에스테르 염산염과 상기 3 단계에서 제조된 4-메톡시페닐디페닐메틸기로 보호된 뉴클레오염기를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드와 함께 반응시켜 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기/4-메톡시페닐디페닐메틸기로 보호된 PNA 단량체 알킬에스테르를 제조하는 단계로, 더욱 상세하게는 상기 3 단계에서 제조된 카르복시메틸-뉴클레오염기는 디메틸포름아미드 용매하에 디이소프로필에틸아민과 일반적인 펩타이드 결합 과정에서 사용되는 EDC를 사용하여 상기 2 단계에서 제조된 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호된 2-아미노에틸글리신 알킬에스테르 염산염과 상온에서 결합하여 골격의 카르복실산 말단이 알킬에스테르인 PNA 단량체를 제조한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 펩타이드 핵산 단량체를 제조하기 위한 다음 화학식 2로 표시되는 중간체를 포함한다.

상기 화학식 2에서; R₁은 C₁∼ C₆의 알킬기, 페닐기 또는 치환된 페닐기를 나타내며(이때 페닐기의 치환체는 NO₂, C₁∼ C₃의 알킬기, 할로겐원자를나타낸다), R'는 C₁∼ C₆의 알킬기를 나타낸다.

한편, 상기한 방법으로 제조된 PNA 단량체를 사용하여 PNA 올리고머를 제조하는 방법은 다음과 같다. PNA 올리고머는 펩타이드 제조를 위해 문헌에 공지된 다양한 합성방법들을 적용할 수 있으며, 예컨대 고체상 합성에서 첫 번째 PNA 단량체를 결합시킨 후 다음 단계로 원하는 PNA 사슬을 연장시키며 이는 탈보호/결합의 반복되는 주기를 포함한다.

본 발명에 따른 PNA 단량체를 사용하여 PNA 올리고머를 제조하는 방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 PNA 단량체의 임시 주쇄보호기인 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기를 약염기 조건하에서 쉽게 정량적으로 분절시켜 N-말단 아민기를 형성시킨다. PNA 사슬에 결합된 N-말단 아민기에 주쇄아미노기가 보호된 다음 PNA 단량체의 C-말단을 디싸이클로헥실카르보디이미드(이하 'DCC'라 한다)등의 결합시약 존재하에 결합시킨다. PNA 사슬 제조가 완결된 후 약산을 사용하여 뉴클레오염기 보호기인 MMT기를 제거하고 고체상으로부터 합성된 PNA 올리고머를 얻는다.

이와같이, 본 발명에 따른 PNA 단량체는 PNA 올리고머 제조시 반복되는 사슬 연장 단계에서 골격 보호기인 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기는 암모니아, 모르폴린, 피페리딘, 피페라진 및 그들의 비양자성 유기 용매중의 용액들을 사용하는 약염기 조건에서 쉽게 탈보호되며, PNA 올리고머 제조후 뉴클레오염기의 1차 아미노 보호기인 MMT기는 트리플루오르아세트산으로 처리하여 고체지지체로부터 최종 분절시 동시 분절되어 PNA 올리고머 제조를 용이하게 하며, 특히 골격보호기로 기존 Fmoc기보다 경제성이 있는 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기를 도입하여 산업적으로 유용하다.

이와 같은 본 발명을 실시예에 의거하여 상세하게 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: N-[p-니트로페닐설포닐에톡시카르보닐-(2-아미노에틸)]글리신의 제조

디클로로메탄 850㎖, 디메틸포름아미드 50㎖ 혼합용매에 들어있는 2-아미노

에틸글리신 50g(0.4몰)의 서스펜션에 클로로트리메틸실란 134㎖(1몰)을 가했다. 이 혼합물을 40분동안 교반한 후 5℃로 냉각하였다. p-니트로페닐설포닐에틸썩신이미딜 카보네이트 149g(0.4몰)을 넣고 N-메틸몰폴린 186㎖ (1.7몰)을 30분에 걸쳐 적가하였다. 2시간 교반후 메탄올 100㎖를 넣고 20분 교반후 에틸 아세테이트 1ℓ를 가했다. 서스펜션을 여과하고 얻은 고체를 에틸 아세테이트로 세척하였다. 고체를 물 1.5ℓ에 넣고 1시간 동안 강하게 교반한 후 남아있는 흰색 고체를 감압여과한 후 물로 세척하고 메탄올 1ℓ에 넣고 서스펜션을 강하게 교반하였다. 생성물을 감압여과하여 얻은 후 메탄올로 세척하고 진공건조하여 N-[p-니트로페닐설포닐에톡시카르보닐-(2-아미노에틸)]글리신 80g(수율 53%)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl3): δ 8.9(s, 1H), 8.4(d, 2H), 8.2(d, 2H), 4.5(t, 2H), 3.7(m, 2H), 3.6(t, 2H), 3.5(m, 2H), 3.1(t, 2H)

실시예 2 : 메틸 N-[p-니트로페닐설포닐에톡시카르보닐-(2-아미노에틸)]글리시네이트 염산염 제조

메탄올 100㎖의 상기 실시예 1에 의해 제조된 N-[p-니트로페닐설포닐에톡시카르보닐-(2-아미노에틸)]글리신 12g(0.032몰)이 첨가된 서스펜션을 0℃로 냉각한 후 시오닐클로라이드 71㎖를 질소하에 적가하였다. 반응 혼합물을 15분동안 0℃에서 교반후 11시간 동안 환류하였다. 용매를 감압하에 제거하고 농축된 부분을 에테르/메탄올(9:1) 혼합용매에 녹인 후 0℃로 냉각하고 1시간 동안 교반하였다. 침전된 흰색고체를 감압 여과 하고 에테르로 세척한 후 진공 건조하여 메틸 N-[p-니트로페닐설포닐에톡시카르보닐-(2-아미노에틸)]글리시네이트 염산염 12.3g(수율 90%)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl3): δ 8.9(s, 1H), 8.4(d, 2H), 8.2(d, 2H), 4.5(t, 2H), 3.8(m, 2H), 3.7(s, 3H), 3.6(t, 2H), 3.5(m, 2H), 3.1(t, 2H)

실시예 3: 2-[N'6-4-메톡시페닐디페닐메틸(9'-아데닐)]아세트산의 제조

무수 피리딘 50㎖가 들어 있는 100㎖ 둥근 플라스크에 아데닌 2g(0.015몰), 메톡시페닐디페닐메틸 클로라이드 6.9g(0.022몰), 트리에틸아민 1.7g (0.017몰)을넣고 상온에서 10시간 교반 하였다. 과량의 피리딘을 감압 농축하여 제거한 후, 물을 넣고 2시간 교반한 후, 감압 여과 한 후 얻은 고체를 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 N'6-4-메톡시페닐디페닐메틸아데닌 4.4g(수율 80%)을 얻었다. 얻은 고체 0.8g(0.002몰)을 무수 디메틸포름아미드 20㎖가 들어 있는 100㎖ 둥근 플라스크에 넣은 후, 0℃로 냉각 시킨 후, 수소화나트륨 0.37g(0.002몰)을 넣고 1시간 교반 하였다. 에틸 브로모아세테이트 0.25㎖(0.002몰)을 적가한 후 상온에서 3시간 교반하여 반응을 완결 하였다. 메탄올 4㎖를 넣고 1시간 교반 후 감압농축 하였다. 디클로로메탄을 넣고 물로 세척 후 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 2-[N'6-4-메톡시페닐디페닐메틸(9'-아데닐)]아세트산 에틸에스테르 0.88g(수율 91%)의 흰색 고체를 얻었다. 얻은 고체 0.88g을 아세토니트릴 5㎖, 메탄올 5㎖, 에탄올 5㎖, 물 5㎖가 들어있는 100㎖ 둥근 플라스크에 넣은 후, 리튬 히드록시드 수화물 0.77g을 녹인 수용액을 넣고 30분 동안 교반한 후 씨트릭산 1.92g을 녹인 수용액을 가해 중화 하였다. 용매를 농축 후 뜨거운 메탄올로 추출하여 0.7g의 2-[N'6-4-메톡시페닐디페닐메틸(9'-아데닐)]아세트산을 얻었다.

¹H-NMR (DMSO): δ 8.1(s, 1H), 7.8(s, 1H), 7.4∼6.8(m, 14H), 4.5(s, 2H), 3.8(s, 3H)

실시예 4: N-[N''-p-니트로페닐설포닐에톡시카르보닐-(2''-아미노에틸)]-N-[2-[N'6-4-메톡시페닐디페닐메틸(9'-아데닐)]아세틸]글리신 제조

상기 실시예 2에 의해 제조된 메틸 N-[p-니트로페닐설포닐에톡시카르보닐-(2-아미노에틸)]글리시네이트 염산염 2.1g(5 mmol)과 상기 실시예 3에 의해 제조된 2-[N'6-4-메톡시페닐디페닐메틸(9'-아데닐)]아세트산 2.0g(5mmol)을 무수 디메틸포름아미드 10㎖에 녹이고 EDC 0.96g(5 mmol)과 디이소프로필에틸아민 2.6㎖(15 mmol)를 차례로 가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 3시간 동안 교반후 감압하에 용매를 제거하였다. 농축된 부분에 에틸 아세테이트를 넣고 NaHCO₃용액으로 세척한 후 유기층을 농축하고 에틸 아세테이트와 에테르 혼합용매하에서 침전시켜 메틸 N-[N''-p-니트로페닐설포닐에톡시카르보닐-(2''-아미노에틸)]-N-[2-[N'6-4-메톡시페닐디페닐메틸(9'-아데닐)]아세틸]글리시네이트 3.6g(수율 95%)을 제조하였다. 제조된 메틸 N-[N''-p-니트로페닐설포닐에톡시카르보닐-(2''-아미노에틸)]-N-[2-[N'6-4-메톡시페닐디페닐메틸(9'-아데닐)]아세틸]글리시네이트 3.8g(5 mmol)을 다이옥산 15㎖와 물 10㎖의 혼합용매에 녹이고 0℃에서 1N 수산화나트륨과 다이옥산(1:1) 혼합물을 조금씩 가하여 메틸에스테르를 카르복실산으로 전환하였다. 소량의 고체 이산화탄소를 넣어 반응 혼합물을 어느정도 완화시키고 p-니트로페닐설포닐에틸썩신이미딜 카보네이트(10 ∼ 30몰%)를 가한 후 45분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 2M 탄산수소칼륨 용액을 가해 pH 6.5로 맞춘 후 용매를 감압하에 제거한 후 물을 넣고 탄산수소칼륨 용액을 사용하여 pH 5로 산성화시킨 후 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 합친 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후 감압하에 용매를 제거하였다. 농축된 부분을 메탄올 5㎖와 에틸 아세테이트 15㎖에 녹인 후 메틸부틸에테르를 가해 침전 시켜 N-[N''-p-니트로페닐설포닐에톡시카르보닐-(2''-아미노에틸)]-N-[2-[N'6-4-메톡시페닐디페닐메틸(9'-아데닐)]아세틸]글리신 2.8g(수율 77%)을 얻었다.

¹H-NMR (DMSO): δ 8.4(d, 2H), 8.2(d, 2H), 8.1(s, 1H), 7.8(s, 1H), 7.4∼6.8(m, 14H), 4.5∼3.9(m, 8H), 3.8(s, 3H), 3.3∼3.1(m, 4H)

실험예 1: PNA 올리고머 GATGACCGGCACACT의 제조

상기 실시예 4에 의해 제조된 p-니트로페닐설포닐에톡시카르보닐기/MMT기로 보호된 PNA 단량체와 Fmoc-Pal-Peg-PS 고체지지체를 사용하여 다음과 같은 합성주기로 PNA 올리고머를 제조하였다. 전 반응과 수지의 세척은 작은 반응용기에서 수행하였으며, 지정된 시간동안 용액들은 프릿을 통해 감압여과하여 제거하였다. [합성주기]

1) 10분 동안 20% 피페리딘이 녹아 있는 디메틸포름아미드 용액에 의해 2-아미노에틸글리신 골격부분의 1차 아미노기 탈보호

2) 디메틸포름아미드로 3회 세척후 디클로로메탄으로 2회 세척

3) 3당량의 PNA 단량체 (0.1M 디메틸포름아미드 용액)를 가지고 결합 :

반응은 3당량의 HATU(O-7-아자벤조트리아졸릴-1,1,3,3-테트라메틸우라니움 헥사플루오르포스페이트)와 3당량의 디이소프로필에틸아민을 가하여 활성화 한 후 수지에 가해지며 결합은 30분 안에 완료되었다.

4) 디메틸포름아미드로 3회 세척후 디클로로메탄으로 2회 세척

상기와 같은 단계를 통해 PNA 올리고머를 합성하였으며, 각 단계는 결합후 카이저 테스트를 하여 확인하였다. 최종 p-니트로페닐설포닐에톡시카르보닐기는 분석을 위해 PNA 올리고머에서 제거하지 않았다. MMT기의 탈보호와 수지로부터의 PNA 올리고머의 분절은 90분 동안 트리플루오르아세트산/m-크레졸 (4:1)로 처리하여 동시에 완료 하였다. PNA 올리고머는 디에틸 에테르를 가해 침전시킨 후 디에틸에테르로 2회 세척하였다. 표준조건에서 HPLC(260 nm)분석시 90% 순도의 올리고머를 얻었다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 PNA 단량체는 새로운 주쇄 보호기로서 약염기에서 쉽게 분절되는 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기를 도입하고, 뉴클레오염기부분이 아데닌, 구아닌, 시토신일 경우 헤테로고리의 1차 아미노기는 약산에서 쉽게 탈보호 되는 MMT기로 보호되어 제조가 용이하고, PNA 올리고머 합성에 적합하다. 따라서, 본 발명에서 새롭게 도입된 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기는 기존 보호기인 Fmoc기의 염기에 대한 극도의 민감성보다 안정하여 취급하기에 용이하고, 특히 Fmoc기보다 경제성이 있으므로 산업적인 생산에 매우 유용하게 사용할 수 있다.

Claims

다음 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 펩타이드 핵산 단량체.

화학식 1

상기 화학식 1에서; R₁은 C₁∼ C₆의 알킬기, 페닐기 또는 치환된 페닐기를 나타내며(이때 페닐기의 치환체는 NO₂, C₁∼ C₃의 알킬기, 할로겐원자를 나타낸다), B는 아데닌, 구아닌, 시토신을 나타내며, R₂는 4-메톡시페닐디페닐메틸기를 나타낸다.
제 1 항에 있어서, 상기 R₁은 메틸기 또는 p-니트로페닐기인 것임을 특징으로 하는 펩타이드 핵산 단량체.
1) 2-아미노에틸글리신과 알킬 또는 아릴설포닐에틸썩신이미딜 카보네이트를 반응시켜 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호된 2-아미노에틸글리신을 제조하는 단계;

2) 상기 1 단계에 의해 제조된 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호된 2-아미노에틸글리신을 시오닐클로라이드와 반응시켜 이의 염산염을 제조하는 단계;

3) 뉴클레오염기와 4-메톡시페닐디페닐메틸클로라이드를 반응시켜 4-메톡시페닐디페닐메틸기로 보호된 뉴클레오염기를 제조하는 단계;

4) 상기 2 단계에서 제조된 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기로 보호된 2-아미노에틸글리시네이트 염산염과 상기 3 단계에서 제조된 4-메톡시페닐디페닐메틸기로 보호된 뉴클레오염기를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드와 함께 반응시켜 알킬 또는 아릴설포닐에톡시카르보닐기/4-메톡시페닐디페닐메틸기로 보호된 펩타이드 핵산 단량체 알킬에스테르를 제조하는 단계

로 이루어지는 것을 특징으로 하는 펩타이드 핵산 단량체의 제조방법.
다음 화학식 1로 표시되는 펩타이드 핵산 단량체를 제조하기 위한 다음 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 중간체.

화학식 1

상기 화학식 1에서; R₁은 C₁∼ C₆의 알킬기, 페닐기 또는 치환된 페닐기를 나타내며(이때 페닐기의 치환체는 NO₂, C₁∼ C₃의 알킬기, 할로겐원자를 나타낸다), B는 아데닌, 구아닌, 시토신을 나타내며, R₂는 4-메톡시페닐디페닐메틸기를 나타낸다.

화학식 2

상기 화학식 2에서; R₁은 상기에서 나타낸 바와 같고, R'는 C₁∼ C₆의 알킬기를 나타낸다.
제 4 항에 있어서, 상기 R'는 메틸 또는 에틸기인 것임을 특징으로 하는 중간체.