KR20020090545A - 페놀성 물질를 함유하는 노화방지 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은 빈랑으로부터 추출한 페놀성 물질을 함유하여 엘라스타제 저해효과, 항산화 효과, 프리라디칼 소거능, 히아루론산 분해효소(hyaluronidase) 저해효과, 미백효과인 티로시나아제 저해효과 등의 종합적 노화방지 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 빈랑의 종자를 말려, 무수 또는 함수의 저급 알코올로 추출물을 제조한 후 아세톤, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산, 부탄올 등의 유기 용매로 물과 동량으로 혼합하여 추출한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, TLC 그리고 역상 HPLC을 통하여 얻은 페놀성 물질을 함유한다.

Description

페놀성 물질를 함유하는 노화방지 화장료 조성물{Anti-aging cosmetics composition containing Phenolic compound}

본 발명은 빈랑(Areca CatechuL.)의 성숙한 종자로부터 분리한 페놀성 물질를 함유하는 노화방지 화장료 조성물 관한 것이다.

생명체의 노화 과정은 우리 몸의 구성기관 모두에서 일어나고 피부도 마찬가지로 노화해 간다. 피부는 인체의 건강을 조절하는데 매우 중요한 기관이므로 피부 노화 메카니즘과 생체에서 이와 관련된 효소들의 작용기작을 밝히는 연구는 매우 중요하다. 피부 노화는 정상적인 대사과정에서도 진행되며, 질병상태나 스트레스를 받을 때는 더욱 빠르게 진행된다. 특히, 피부는 자외선 (UV)에 노출되어 있어 광화학적 반응들이 계속해서 일어나고 있다. 또한 흡연, 공해 및 세균 감염 등도 노화의 원인이 되고 있다. 피부 세포 및 조직 손상을 주도하는 것은 반응성이 큰 활성 산소이며, 이들은 항산화 효소와 비효소적 항산화제들로 구성된 항산화 방어망을 파괴함으로써 지질 과산화, 단백질 산화, 세포 성분을 파괴시키는 단백질 분해효소들의 활성화, 탄력섬유인 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합, 히아루론산 사슬의 절단, 멜라닌 생성 반응 촉진, DNA 산화와 같은 생체 구성 성분들의 손상을 야기 시킨다. 결국에는 탄력 감소, 주름 및 기미, 주근깨 생성 등으로 특징 지워지는 피부 노화가 가속화된다 (J. Soc. Cosmet. Sci. Kor.,23, 75-132 (1997)). 따라서, 피부 노화를 지연시키고 억제하기 위해서는 생체 내 뿐만 아니라 피부에서 주로 작용하는 효소 생성의 활성화 또는 노화를 촉진하는 효소를 억제할 수 있는 시스템 구축이 필요하다.

피부는 신체 구조에서 가장 복잡한 부분 중 하나로서 표피, 진피, 피하조직의 3 부분으로 구분되며 피지선 (sebaceous gland), 누출 분비선 (eccrine gland)등과 같은 많은 부속기관들이 함께 존재한다. 피부는 자외선 (UV)에의 노출에 의한 광노화와 선천적인 노화 과정에 의하여 진피 결합 조직 등에 심각한 손상을 입게 된다. 피부에 빛이 조사되면 피부는 빛을 산란, 반사, 또는 흡수하게 된다. 이때 피부내로 흡수된 빛은 핵산, 아미노산, 멜라닌 그리고 다양한 발색단(chromophore)들에게 빛에너지를 전달하게 된다. 그 결과, 발색단 들은 화학적으로 불안정한 여기상태 (excited state)가 되거나 광분해 반응을 일으켜서 프리 라디칼 들을 생성한다. 또한, 빛은 생체내에 존재하는 유리 산소분자와 상호작용을 하여 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical)을 만들 수 있으며, 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼은 여러 가지 반응 경로를 거쳐서 싱글렛(singlet) 산소 (1O2), 히드록실 라디칼(·OH), 또는 과산화수소(H2O2)와 같은 유해 활성 산소종을 만드는 연쇄 반응을 거친다 (약학잡지 (일),111,103-119 (1991)). 슈퍼옥사이드 라디칼은 단구(monocyte), 백혈구(neutrophil), 대식구(macrophage), 비반세포(mast cell)들과 외부 물질이나 면역 복합체들과의 반응과정 중에서도 과량 생성되어, 다양한 유해활성 산소종을 생성한다 (PNAS USA, 77,1159-1163 (1980)). 이러한 유해 활성 산소종들은 핵산, 지질, 단백질, 탄수화물 등과 반응하여 조직에 직접적인 상해를 유발하고, 과산화 라디칼(peroxy radical)이나 과산화물들을 반응 산물로 생성하여, 이차적인 연쇄 반응을 일으킴으로써 조직 손상은 광범위하게 일어나게 된다. 또한, 자외선 (UV)이 피부에 조사되면 이 자외선의 광자에 의해 포스포리파아제 A가 활성화되어 세포막 구성성분인 인지질의 포스파디딜콜린의 두 번째 탄소에 에스테르 결합을 하고 있는 불포화 지방산인 아라키돈산의 방출을 유도한다 (Dermatol.,9,11-15 (1990)). 20 개의 탄소로 구성된 에이코자노이드인 아라키돈산은 시클로옥시게나아제(cyclooxygenase)와 리폭시게나아제(lypoxygenase)의 작용으로 프로스타글란딘과 류코트리엔을 생성하고 이들은 염증 유발인자로 작용한다. 프로스타글란딘에 의해 매스트 셀(mast cell)내에 히아루로니다아제가 활성화되고 히스타민과 화학 물질들이 분비되면 이로인해 혈관 확장, 단백질 손상등 염증이 일어나게 된다. 또한 UV의 자극에 의해 PMNs (polymorphonuclear leukocytes)으로부터 방출되는 엘라스타아제와 같은 단백질 분해효소의 작용으로 조직과 세포가 손상되고, 식작용(phagocytosis) 과정 중에 발생되는 과량의 유해 산소종에 의해서 염증은 더욱 증폭된다. 피부에서 엘라스틱 섬유는 콜라겐 섬유와 더불어 진피(epiderm)안쪽에서 가교 결합을 형성한다. 나이가 들어감에 따라 엘라스틴 분해 효소인 엘라스타제의 작용으로 피부의 탄력이 급격히 저하되고, 함몰(sagging)이 생긴다. 조직학적으로는 염증 세포의 침윤이 증가하며, 엘라스틴 섬유의 결핍과 응집, 콜라겐 섬유의 감소를 보여주며, 생화학적으로는 엘라스타제의 활성도가 현격히 증가한다. 엘라스타제는 엘라스틴을 분해 할 수 있는 지금까지 알려진 유일한 효소이며, 이에 대한 저해는 피부 노화를 근본적으로 줄여 줄 수 있다. 피부 노화를 지연시키기 위하여 종래에는 보습제, 항염증제, 엘라스틴 및 콜라겐 가교 결합이 파괴되어 있는 조직에 영양 및 첨가제 등을 화장료에 배합하는 방법이 이용되고 있는데, 이는 근본적으로 노화를 지연시키는데는 한계가 있는 실정이다. 따라서 피부 탄력을 유지시키는 엘라스틴 및 콜라겐의 분해를 근본적으로 저해시키는 저해제가 요구되고 있는 실정이다. 종래의 노화 방지 효과를 갖는 원료가 근본적으로 저해하지 못하는 단점으로 인하여 새로운 기능성 물질들을 찾고자 시도되고 있다. 특히, 종래의 동물성 추출물이나 콜라겐과 엘라스틴과 유사한 구조를 가진 합성 펩타이드 유도체 등이 사용되고 있으나, 안전성 및 안정성, 그 효과를 충분히 나타내지 못하고 있는 단점으로 인하여 새로운 기능성 물질들을 찾고자 시도되고 있다. 특히 종래부터 생약등으로 사용되어 오던 여러 가지 자연의 천연물 등은 안정성이 뛰어날 뿐만 아니라 여러 가지 유익한 약효 성분들을 함유하고 있어 노화 방지 및 미백 물질 등의 좋은 검색 대상이 되어오고 있다.

본 발명은 이러한 견지에서, 종래의 엘라스틴 저하 및 파괴로 인한 피부 탄력성 감소의 근본적 물질을 찾고자하여 자연의 여러 가지 천연식물들 중에서 노화 예방에 유효한 물질을 검색한 결과, 빈랑의 종자로부터 추출한 추출물이 매우 우수한 엘라스타제 저해 물질일 뿐만 아니라 사람 피부에 직접 도포한 실험 결과에서도 뚜렷한 피부 탄력 및 노화로 기인한 피부상태가 개선되는 효과를 발휘하게 됨을 본 발명자들이 발견하였다(대한민국 특허 출원 :1997-78817, 1999-0056924 ;Int. J.Cosmet. Sci., 21, 71-82, 275-295, 1999).

본 발명자들은 이미 피부의 진피내에서 백혈구로부터 과다하게 분비되는 엘라스타아제를 저해하는 유효성분을 빈랑 추출물로부터 찾기 위하여, 빈랑 종자를을 90% 에탄올로 추출한 다음, 다양한 용매를 사용하여 분획하였고, 각 분획에 대해 엘라스타아제 저해활성을 측정하였다. 이 중 저해 활성이 뛰어난 분획은 실라카겔 컬럼 크로마토그래피, preparative TLC 그리고 역상 HPLC를 실시하였다. 역상 HPLC에서 엘라스타아제 저해 활성이 있는 피이크는 성분을 확인할 수 있는 여러 가지 정색 반응과 UV, IR 스펙트럼을 통하여 페놀성 물질임을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 빈랑으로부터 추출한 페놀성 물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 빈랑으로부터 추출한 페놀성 물질을 함유하여 엘라스타제 저해효과, 항산화 효과, 프리라디칼 소거능, 히아루론산 분해효소(hyaluronidase) 저해효과, 미백효과인 티로시나아제 저해효과 등의 종합적 노화방지 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 엘라스타아제 저해활성이 있는 페놀성 물질을 빈랑으로부터 추출하는 추출방법을 제공하는 것이다.

빈랑(Areca CatechuL.)은 중국 남부, 대만, 말레이시아에 분포하며, 열대 각지에서 재배하고 있다. 빈랑은 건위, 소화, 구충약으로서 소화불량, 변비, 복통,구충약 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.(특개평 5-320037)

상기 본 발명의 목적은 빈랑의 종자를 말려, 무수 또는 함수의 저급 알코올로 추출물을 제조한 후 아세톤, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산, 부탄올 등의 유기 용매로 물과 동량으로 혼합하여 추출한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, preparative TLC 그리고 역상 HPLC을 통하여 얻은 페놀성 물질에 의해 달성된다.

상기 본 발명의 목적은 또한 이러한 방법으로 추출한 페놀성 물질을 함유하는 본 발명의 화장료 조성물에 의해 달성된다.

본 발명은 기존에 개발된 빈랑자 추출물(대한민국 특허 출원 :1997-78817, 1999-0056924 ;Int. J. Cosmet. Sci., 21, 71-82, 275-295, 1999)에서 분리 정제한 페놀성 물질이 종합적인 노화방지 효과가 있음이 발견되어 화장료에 함유시킴으로써 미백 화장료와 주름개선 화장료를 동시에 가지게 하는 종합적인 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 목적하는 효과를 얻기 위하여 상기 페놀성 물질은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001∼5.0중량%, 바람직하게는 0.001∼1.0중량%의 양으로 함유한다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 특별히 한정되는 바가 없는데, 예를 들면, 주름개선 및 미백 기능성 화장품, 유연화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클린징워터, 에센스, 파우다, 팩 등의 제형을 가질 수 있다.

또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기한 빈랑 추출물로부터 분리 정제한 페놀성물질을 포함하여 주름개선 및 미백 원료로서 이외의 성분들을 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

이하, 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 상세히 설명하고자 하나, 본 발명을 이들 시험예에 한정하고자 하는 것은 아니다.

시험예를 위하여 하기 본 발명의 빈랑추출물로부터 페놀성 물질의 분리정제 제조예와 페놀성 물질을 함유한 조성물(실시예) 및 함유하지 않은 조성물(비교실시예)이 제조되었다.

제조예 : 빈랑추출물로부터 페놀성 물질의 분리정제 제조방법

빈랑의 종자를 깨끗한 물로 세척한 다음 건조하여 잘게 분쇄하고, 분쇄물 건조중량에 대하여 추출 용매로서 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급 알코올을 각각 또는 물과 혼합한 것 1-15배 부피량을 가하거나, 헥산, 아세톤, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름 등을 각각 가한다. 추출 방법으로는, 냉각 콘덴서가 장치되어 유효성분이 증발되는 것을 방지한 상태에서 50-95℃, 4-20시간 가열하여 추출하거나 5-37℃에서 1-15일간 침적시켜 유효성분을 추출한다. 이렇게 추출한 빈랑 추출물을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축한 후 그 건조된 빈랑추출물을 얻는다.

90% 에탄올 추출물중 100 g을 취하여 1 ℓ의 증류수에 녹인 후 동량의 헥산을 넣어준다. 분별 깔때기를 이용하여 분획한 후 헥산층을 감압 농축하여 3.39 g을 얻었다. 물층에 다시 동량의 클로로포름을 넣어 분획한 후 클로로포름층을 감압 농축하여 1.05 g을 얻었다. 물층에 동량의 에틸아세테이트를 넣어 분획한 후 에틸아세테이트층을 감압 농축하여 5.97 g의 분말을 얻었고, 반복적으로 물층에 부탄올을 넣은 후 분획하여 부탄올층 21.90 g과 물층 30.29 g을 얻었다. 각 분획 추출물들로 엘라스타아제에 대한 저해 활성을 측정하였다.

실리카겔(70-230 메쉬) 100g은 에틸아세테이트에 넣어 컬럼 (3×45cm)에 충진하였다. 분획에서 얻은 부탄올층 분말 1.8 g을 소량의 메탄올에 녹인 후 loading하였고 에틸아세테이트 : 메탄올 : 물을 이용하여 단계적으로 극성을 증가시킨 용매로 각각 600 ml씩 용출시켰다. 각 분획을 플라스크에 받아 감압 농축시킨 후 100 ㎍/㎖의 농도로 엘라스타아제에 대한 저해활성을 측정하였다.

각 단계에서는 TLC를 하였으며 전개 용매는 에틸아세테이트 : 메탄올 : 물 = 9 : 2 : 2를 사용하였다. 발색은 아니즈알데히드 시액을 뿌린 후 TLC 판을 가열하여 발색시켰다. 실리카 컬럼 크로마토 그래피 용출 분획 중 활성이 높은 분획을 에틸아세테이트 : 메탄올 : 물 = 9 : 2 : 2 조건에서 preparative TLC를 하여 활성이 있는 부분을 분취한 다음, 이를 메탄올에 녹여 여과하고 감압 농축하였다.

효소 활성 저해 물질의 정제를 위해 preparative TLC한 시료로 HPLC를 수행하였다. 이 때 컬럼은 YMC-pack ODS-AQ 컬럼 (10 × 250 mm)을 사용하였고, 용매는 메탄올 : 물 = 30 : 70 조건으로 용출하였으며 유속은 1.5 ml/분, 검출은 UV 280 nm에서 측정하였다. 이 때 확인된 각 피이크들을 분취하여 페놀성 물질임을 확인및 엘라스타아제 저해활성 등 노화방지 효과에 대해 측정하였다.

[표 1] 실시예 및 비교실시예

	중 량 부	중 량 부
배합성분	실시예	비교 실시예
페놀성물질	0.005	-
부틸렌글리콜	2.0	2.0
프로필렌글리콜	6.0	6.0
카르복시비닐폴리머	0.5	0.5
밀납	2.0	2.0
바셀린	7.0	7.0
폴리솔베이트 60	2.0	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.5	2.5
스쿠알란	3.0	3.0
유동파라핀	10.0	10.0
트리에탄올아민	0.5	0.5
토코페릴아세테이트	0.1	0.1
향료, 방부제	0.3	0.3
정제수	to 100	to 100

[시험예 1]

[정제된 효소 활성 저해 물질의 성분 확인 실험]

(ⅰ) IR 스펙트럼 : HPLC로 분리한 저해 물질을 KBr 펠렛으로 만들어 Jasco FT/IR-300E로 기록하였다.

(ⅱ) UV 흡수 스펙트럼 : HPLC한 분리된 저해 물질을 메탄올에 녹인 후 UV/Vis 분광광도계를 사용하여 200 nm에서 800 nm까지 흡광도를 측정하였다.

(1) 아미노산 : 추출액에 닌히드린 시액 (0.2% 수용액, 쓰기전에 만들 것)을넣고 수욕상에서 끓일 때 자색으로 정색하는가 관찰하였다.

(2) 페놀성 물질, 플라보노이드, 탄닌

: 추출액에 2.5% FeCl3 에탄올 용액을 1-2 방울 떨어뜨려 방치할 때, 암녹색으로 정색하거나 침전의 생성 여부를 관찰하였다.

(3) 당 : 추출액에 5% α-나프톨 알콜 시액 2-3 방울을 넣은 후 농황산을 기벽을 통하여 가할 때 경계면에 적자색이 나타나는지 관찰하였다.

(4) 트리테르페노이드, 사포닌 : 추출액에 무수초산을 가해 섞은 후 농황산을 가할 때 경계 부위가 적갈색으로 정색되는지 관찰하였다.

[시험예 2]

[프리 라디칼 소거 효과 측정]

빈랑으로부터 HPLC까지 정제한 활성 성분에 대해 프리 라디칼 소거 작용을 측정하였다. 메탄올에 녹인 시료 용액 100 ㎕에 0.3 mM의 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질 라디칼 (DPPH) 메탄올 용액 100 ㎕를 첨가한 다음 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 대조 실험은 시료 대신 메탄올을 첨가한 것을 사용하였다.

[시험예 3]

[히아로론산 분해효소(Hyaluronidase) 저해 활성 측정]

빈랑으로부터 HPLC까지 정제한 저해 물질에 대해 히아루론산 분해효소 활성저해 효과를 보고된 방법에 따라 측정하였다. 감압 농축된 시료를 메탄올에 녹인 다음 이 시료 100 ㎕에 50 ㎕ 히아루론산 분해효소 용액 (히아루론산 분해효소 타입 Ⅳ-S, 10100 units/ml)을 첨가한 후 37 ℃에서 20분간 방치하였다. 그 다음 100 ㎕의 효소 활성화 용액 (2 mg 화합물 48/80／15 mg CaCl₂·H₂O/4 ml 아세테이트 완충액)을 넣어 37 ℃, 20분간 방치하였다. 250 ㎕의 히아루론산 용액 (1.2 mg/0.1 M 아세테이트 완충액)을 첨가한 후 37 ℃ 수욕상에서 40분간 반응시켰다. 0.4 N NaOH 100 ㎕와 0.4 M 붕산칼륨 용액 100 ㎕를 차례로 넣어준 다음 잘 섞고 95 ℃ 수욕상에서 3분간 끓인 후 냉각하였다. p-디메틸아미노벤즈알데히드(p-DMAB)용액 (5 g/아세트산 44 ml, 10 N HCl 6 ml, 사용시 아세트산으로 10 배 희석해서 사용) 2 ml을 첨가한 후 잘 섞고 37 ℃ 수욕상에서 20분간 방치하였다. 히아루론산 분해효소 저해 활성은 585 nm에서 흡광도를 측정하였고 다음 식을 이용하여 계산하였다.

대조군 흡광도 - 검체 흡광도

히아루론산 분해효소 저해율(%) = ---------------------------------- × 100

대조군 흡광도

바탕시험(Blank)에는 정제된 시료와 p-DMAB 용액이 첨가되었고, 대조군으로는 시료대신 메탄올이 사용되었다.

[시험예 4]

[티로시나아제 저해 활성 측정]

티로시나아제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로(SIGMA)사에서 구입하여 사용하였다. 기질인 티로신은 0.05M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 녹여 0.1㎎/㎖ 용액으로 만들어 사용하였다.

페놀성 물질은 완충용액에 희석하여 적당한 농도로 조절하여 녹인 후 시료액으로 사용한다. 티로신 용액 0.5㎖을 시험관에 넣고 여기에 시료액 0.5㎖을 가하고 37℃ 항온기에서 10분간 방치한 후 200U/㎖ 티로시나아제 0.5㎖을 넣고 37℃에서 10분간 반응시킨다. 이때 대조군은 완충용액을 0.5㎖ 넣은 것이다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉 시켜 반응을 중지시키고 분광광도계로 파장 475㎚에서의 흡광도를 측정한다. 티로시나아제 활성 증가 효과는 하기의 공식으로 구한다.

시험물질의 흡광도

티로시나아제 활성 저해율(%) = 100 - 〔 ------------------- × 100 ]

대조군 흡광도

각 분리정제 단계의 수율 및 저해효과를 표 2, 3에, 확인 시험 결과를 표4에 나타내었다.

[표 2]유기용매들로부터 빈랑추출물의 수율 및 엘라스타제 저해활성

용매분획	수율(%)	IC50(㎍/㎖)엘라스타제 저해효과
90 % 에탄올헥산클로로포름에틸아세테이트부탄올물	1003.391.055.9721.9030.29	64.05>500>500>500104.9331.04

여기에서 IC₅₀값은 효소 저해율이 50%됨을 나타내는 농도임.

[표 3]페놀성 물질의 분리 정제 단계별 수율 및 활성도

분리정제 단계	수율(%)	IC50 (㎍/㎖)
		엘라스타아제	히아루론산분해효소	티로시나아제	프리라디칼소거능
BuOH층추출물	100	104.9	416	120	6.9
Silica 컬럼크로마토그래피	28.2	31.6	-	78	5.0
TLC후 채취	3.9	25.0	-	41	6.5
HPLC후페놀성물질	2.8	26.9	210	49	6.0
비교물질비타민C	-	-	-	-	19.0
비교물질BHT	-	-	-	-	18.5
비교물질감초 추출물	-	-	330	-	-
비교물질우르손	-	31.0	-	-	-
비교물질알부틴	-	-	-	65.2	-

빈랑으로부터 정제한 페놀성 물질은 돼지 췌장 엘라스타아제(PPE)와 사람 백혈구 엘라스타아제(HNE)에 대한 IC50 값이 각각 26.9 ㎍/㎖과 60.8 ㎍/㎖로서, 기존에 엘라스타아제의 저해제로 알려진 올레아놀산(oleanolic acid)(각각 76.5 ㎍/㎖, 219.2 ㎍/㎖)와 우르손(ursolic acid)(각각 31.0 ㎍/㎖, 118.6 ㎍/㎖)에 비하여 더 우수한 저해 활성을 나타내었으며, PPE와 HNE에 대하여 기질과 경쟁적으로 반응함을 알 수 있었다. 또한 빈랑으로부터 정제한 페놀성 물질이 염증 과정 중에 발생하는 프리 라디칼을 소거할 수 있는지를 조사한 결과, 프리 라디칼을 50% 소거시키는 농도 값이 6 ㎍/㎖로 표준물질인 비타민 C (19 ㎍/㎖)나 부틸래이티드 히드록실 톨루엔(18.5 ㎍/㎖)보다 우수한 효과를 나타내었다. 그리고 비반세포 내에서 활성화되며 히아루론산을 분해하는 히아루론산 분해효소에 대한 저해를 조사한 결과, IC50 값이 210 ㎍/㎖로서 효과적인 저해 활성을 나타내었다. 또한, 미백효과 측정인 티노시나제 저해 활성에서 IC50 값이 49 ㎍/㎖로 이미 미백물질로 알려진 합성물질인 코직산(Kojic acid) IC50 값 5.82 ㎍/㎖, 알부틴(Arbutin) IC50 값 65.2 ㎍/㎖과 비슷한 저해 효과를 보였다.

[표 4]빈랑으로부터 분리 정제한 페놀성 물질의 특성 확인

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외관 연한 갈색

융점 > 300 ℃

IR cm-1(KBr) 3367, 1617, 1110

UVmax (H₂O/nm) 279

색상

반응 (+) FeCl₃

(-) 닌히드린

p-아니지딘-프탈산

아닐린-디페닐아민

몰리슈

드라겐도르프

용해도

용해 H₂O, 메탄올

불용 다른 일반적인 유기 용매

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빈랑으로부터 HPLC 단계까지 정제한 시료가 어떤 종류의 화합물인지 알아보기 위한 UV, IR 스펙트럼을 얻었다. 또한, 색 변화로써 알 수 있는 여러 가지 정색 반응을 실시하였다.

UV 스펙트럼 결과, 280nm에서 최대 흡광을 나타내었고 이것으로 방향족 고리를 가진 화합물임을 추정할 수 있었다. 또한 가시광선 파장에서도 약간의 흡수를 나타냈는데 이것은 저해 물질의 색이 갈색을 띠고 있는 것을 설명해 줄 수 있다(Data not shown). IR 스펙트럼에서는 3367.10 (OH), 1617.02 (C=C conjugated), 1110.31 (C-O) cm^-1을 추정할 수 있었다.

유효 성분의 확인 방법으로 정색 반응이 있다 (천연물화학 연구법, 서울 대학교 출판부). 빈랑으로부터 HPLC 단계까지 정제한 저해 물질의 UV 스펙트럼 결과로부터, 280nm에서의 흡광이 티로신, 트립토판, 페닐알라닌과 같은 방향족 아미노산에 의한 것인지를 확인해 볼 필요가 있었다. 그래서 HPLC 단계까지 정제한 저해 물질로 닌히드린 반응을 실시했다. 닌히드린 반응에서는 아미노산이 존재할 경우 자색으로 정색되는데, 시험 결과 색변화 없이 음성 반응임을 관찰하였다. 이 결과로부터 분리된 저해 물질은 아미노산이나 단백질이 아님을 확인할 수 있었다. 플라보노이드, 탄닌을 포함한 페놀성 물질은 2.5% FeCl₃용액을 가하면 짙은 녹색, 자주색, 청색, 또는 흑색으로 정색되는데, HPLC까지 정제된 저해 물질은 암녹색으로 변화하고 농도가 높을 경우에는 암녹색의 침전물을 형성했다. 이것으로 저해제가 페놀성 물질임을 확인할 수 있었다. 그 다음으로 트리테르페노이드나 사포닌인 경우는 무수 초산을 첨가한 다음 황산을 가하면 적갈색을 나타내는데, 이 실험 결과에서는 색 변화가 없어 분리된 저해 물질이 트리테르페노이드나 사포닌은 아님을 확인할 수 있었다. 또 시료내에 당의 여부를 확인하는 몰리슈 반응이 있다. 이것은 5% α-나프톨 에탄올 용액 2-3 방울을 넣은 후 황산을 가하면 적자색환이 나타난다. 분리된 저해제를 시험한 결과 적자색환을 관찰할 수 있었으며, 이로써 시료내에 당도 존재함을 알 수 있었다. 위의 결과로 종합해 볼 때, 빈랑으로부터 분리된 엘라스타아제 저해 물질은 당이 함께 존재하는 페놀성 물질임을 추측할 수 있었다.

하나 또는 둘 이상의 OH기로 치환된 방향족환을 가지고 있는 식물 성분을 일반적으로 페놀성 물질이라고 하는데, 페놀성 물질은 당과 결합하여 배당체로서 존재하는 경우가 많으므로 보통 수용성이다. 페놀성 물질 중에는 항균작용이 있는 물질이 많으므로 진균, 세균 또는 바이러스등 병균의 침입에 대한 방어작용을 할 것이라고 보고되고 있다 (Biochemistry of plant phenolics, Plenum, N.Y., 557-588 (1977)). 또한 항암 작용, 혈압강하 작용, 피임 작용, 간보호 작용, 진경 작용등 여러 작용이 알려져 있으며, 의약품 개발에 밝은 전망을 보여주고 있다. 본 발명에서 빈랑으로부터 정제한 페놀성 물질로 추정되는 성분은 엘라스타아제를 저해, 히아루론아제 저해, 티로시나제 저해, 프리라디칼 소거가 우수함으로 피부 결합 조직 단백질들을 보호 및 미백효과를 가지는 피부 노화 방지 화장료 조성물을 제공하여 기능성화장품 개발을 가능하게 되었다.

[시험예 5]

[인간 섬유아세포 증식 효과에 대한 시험]

1) 실험방법

인체 정상 섬유아세포(Human normal Fibroblast)를 96웰 마이크로 플레이트(96-well microplate)의 각 웰(well)에 1x104 세포가 되도록 접종하여 디엠이엠(DMEM) 배지에서 24시간 배양한다. 배양 후 디메틸설폭시드(DMSO:Dimethyl sulfoxide)에 제조예 1에서 제조한 페놀성 물질을 용해시키고 다시 완충용액에 적당한 농도로 희석하여 최종 농도가 250㎍/㎖ 되도록 조정한 시럼(serum)이 없는 디엠이엠(DMEM) 배지로 교체한 후 24시간 더 배양한다. MTT 용액[3-(4,5-디메틸-티아졸-2-일) 2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드: 5 ㎎/㎖] 10㎕씩 첨가하고 4시간 방치 후, 배지 부분을 버린다. 각 웰당 100㎕의 디메틸 설폭시드 (DMSO :Dimethyl sulfoxide)용액을 가하여 20분간 교반 후 마이크로 플레이트 리더 (microplate Reader)로 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과는 표5에 나타내었다. 세포 증식 효과는 다음 공식에 의해 산출되었다.

추출물 처리시의 흡광도 - 대조군의 흡광도

세포증식효과(%) = ----------------------------------------- X 100

대조군의 흡광도

2) 실험 결과

[표 5] 인간 섬유아세포에서 세포증식효과

추출물	세포증식효과(%)
빈랑 추출물	28.7
분리 정제한 페놀성 물질	48.2

본 발명의 빈랑자 추출물과 분리 정제한 페놀성 물질은 피부의 주름개선 및 피부탄력증진에 있어 중요한 섬유아세포의 증식효과에 있어 우수한 세포증식효과가 있음을 알 수 있다. 섬유아세포의 증식은 피부주름 및 피부탄력증진에 있어 중요한 콜라겐, 엘라스틴, 인테그린 및 라미닌의 생합성 증가와 매우 밀접한 관계를 가지고 있다.

[시험예 6]

[피부주름 개선의 임상효과]

실시예 및 비교실시예 에 따라 제조된 화장료 조성물에 대한 피부주름개선의 임상효과를 다음과 같이 측정하였다.

30세 이상의 여성 20명(평균연령 37.7세)을 2그룹으로 나눈 다음, A그룹에는 실시예의 화장료 조성물을, B그룹에는 비교실시예의 화장료 조성물을 각각 주름이 있는 눈가를 중심으로 12주간 도포한 후, 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가를 다음의 6등급으로 분류하여 평가함으로써 피부주름의 개선정도(ΔW)를 측정하였다. 결과는 하기 표 6 및 표 7와 같다.

·피부주름개선의 평가 기준 :

-3 : 극히 심하게 악화

-2 : 악화

-1 : 약간 악화

0 : 변화없음

1 : 약간 개선

2 : 개선

3 : 매우 개선

[표 6] 피부주름개선 임상효과(숙련자의 객관적 평가)

	피부주름 개선 정도(ΔW)
	실시예	비교실시예
	T0	T12	T0	T12
피검자 1	0	3	0	1
피검자 2	0	3	0	1
피검자 3	0	3	0	1
피검자 4	0	2	0	1
피검자 5	0	2	0	2
피검자 6	0	3	0	1
피검자 7	0	2	0	1
피검자 8	0	3	0	2
피검자 9	0	2	0	1
피검자 10	0	2	0	1
ΔW(T-T0)		2.5		1.2

[표 7] 피부주름개선 임상효과(피검자의 주관적 평가)

	피부주름 개선 정도(ΔW)
	실시예	비교실시예
	T0	T12	T0	T12
피검자 1	0	2	0	1
피검자 2	0	3	0	1
피검자 3	0	3	0	1
피검자 4	0	3	0	1
피검자 5	0	3	0	2
피검자 6	0	2	0	1
피검자 7	0	1	0	1
피검자 8	0	3	0	2
피검자 9	0	3	0	1
피검자 10	0	1	0	1
ΔW(T-T0)		2.4		1.2

임상 시험 결과 실시예의 경우 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가가 각각 2.5 및 2.4로 주름개선 효과가 매우 우수함을 알 수 있다. 이는 페놀성 물질을 함유하지 않은 비교실시예에 비해 숙련자의 객관적 평가와 피검자의 주관적 평가가 100% 증가한 것으로서, 빈랑자 추출물로부터 분리 정제한 페놀성 물질이 주름개선효과를 증진시킨 것을 알 수 있다.

[시험예 7]

[피부탄력개선의 임상효과]

실시예 및 비교실시예의 표 1에 따라 제조된 화장료 조성물에 대한 피부탄력개선의 임상효과를 다음과 같이 측정하였다.

온도 24-26℃, 습도 75% 조건에서 건강한 여성 15명(평균연령 36.3세)을 대상으로 눈가를 중심으로 왼쪽에는 실시예의 화장료 조성물을 오른쪽에는 비교예의 화장료 조성물을 12주간 도포한 후, 피부탄력측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 8에 Cutometer SEM 575의 △R8 값으로 기재하였는데, R8 값은 피부 점탄성(viscoelasticity)을 나타낸다.

[표 8] 피부탄력개선의 임상효과

	피부탄력효과
실시예	0.31
비교실시예	0.15

표 8에서 볼 수 있는 바와 같이 실시예의 피부탄력은 비교실시예에 비해 106% 증가했다. 이로부터 볼 때, 빈랑자 추출물로부터 분리 정제한 페놀성 물질은 섬유아세포의 증식효효과로 콜라겐이나 엘라스틴등의 단백질 합성과 엘라스타제의 효과적 저해로 인해 콜라겐이나 엘라스틴의 분해를 매우 효과적으로 촉진함으로써 피부탄력이 급격하게 증가되는 것으로 보인다.

[시험예 8]

본 발명의 제조예을 함유하는 실시예에 대한 색소침착 개선에 대한 임상실험(미백효과)을 실시하였다

1) 실험방법

본 발명의 화장료의 색소침착 개선에 대한 임상을 시험하기 위하여, 기미, 주근깨 및 색소침착증을 갖고 있는 건강한 성인 남녀 20명을 대상으로2개 그룹(A, B)으로 나눈 후, A그룹에는 실시예, B그룹에는 비교실시예를 상기 표 1에 따라 제형하여 각각 1일 2회씩 12주간 도포한 후 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 이때 색소침착 개선정도는 하기의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

[색소침착 개선 평가 기준]

-3: 매우 악화 -2: 악화-1: 약간 악화0: 변화 없음

1: 약간 개선 2: 개선 3: 매우 개선

[표 9] 색소침착 개선 정도에 대한 임상결과

피검자	피부색의밝기 변화(ΔL)	숙련자의객관적 평가	피검자의주관적 평가
	A	B	A	B	A	B
1	5.0	4.6	3	2	3	3
2	5.2	3.0	3	1	3	2
3	6.1	5.1	2	2	2	1
4	4.9	2.2	2	1	2	1
5	5.6	3.2	3	2	2	1
6	6.2	3.1	2	2	3	2
7	3.9	2.5	2	1	2	1
8	6.6	4.3	2	1	3	1
9	6.4	4.0	3	1	1	1
10	5.5	3.9	1	1	3	2
평균값	5.54	3.59	2.3	1.4	2.4	1.5

상기 표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예을 상기 표1에 따라 제형하여 도포한 A그룹의 평균 ΔL값은 5.54(P＜0.01)로 비교실시예 3.59 보다 54% 높게 나타나 피부색소침착 개선에 매우 우수한 결과를 보임을 알 수 있다.

숙련자에 의한 평가와 피검자의 주관적 평가에서도 본 발명의 실시예가 피부색소침착을 효과적으로 개선시킴을 볼 수 있다.

이하 상기한 시험예들의 결과를 근거로 하여 본 발명의 빈랑자추출물로부터 분리 정제한 페놀성 물질을 함유하는 화장료를 조성하여 제시한다. 본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없는데, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 엣센스, 팩 등의 제형을 가질 수 있다.

제형예 1. 유연화장수(스킨로션)

배합성분	중량부(%)
페놀성물질(제조예)	0.005
알부틴	1.0
1,3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
올레일알코올	0.1
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	15.0
벤조페논-9	0.05
향, 방부제	0.3
정제수	to 100

제형예 2. 영양화장수(밀크로션)

배합성분	중량부(%)
페놀성물질(제조예)	0.001
알부틴	2.0
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올아민	1.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동 파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다미아너트오일	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.0
카르복시비닐 폴리머	1.0
비에치티이	0.01
이디티에이-2엔에이	0.01
향, 방부제	0.3
정제수	to 100

제형예 3. 영양크림

배합성분	중량부(%)
페놀성물질(제조예)	0.001
알부틴	2.0
세토스테아릴알콜	2.0
글리세릴스테아레이트	1.5
트리옥타노인	5.0
폴리솔베이트 60	1.2
솔비탄스테아레이트	0.5
스쿠알란	5.0
유동파라핀	3.0
싸이클로메치콘	3.0
비에치티이	0.05
델타-토코페롤	0.2
농글리세린	4.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
산탄검	0.1
이디티에이-2엔에이	0.05
향, 방부제	0.3
정제수	to 100

제형예 4. 마사지크림

배합성분	중량부(%)
페놀성물질(제조예)	0.001
알부틴	2.0
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올아민	0.5
밀납	2.0
토코페릴아세테이트	0.1
폴리솔베이트 60	3.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.5
세테아릴알코올	2.0
유동파라핀	30.0
카르복시비닐폴리머	0.5
향, 방부제	0.3
정제수	to 100

제형예 5. 팩

배합성분	중량부(%)
페놀성물질(제조예)	0.001
알부틴	2.0
프로필렌글리콜	2.0
글리세린	4.0
카르복시비닐 폴리머	0.3
에탄올	7.0
피이지-40 히드로게비이티드 캐스터 오일	0.8
트리에탄올아민	0.3
비에치티이	0.01
이디티에이-2엔에이	0.01
향, 방부제	0.3
정제수	to 100

빈랑으로부터 정제한 페놀성 물질은 돼지 췌장 엘라스타아제 (PPE)와 사람 백혈구 엘라스타아제 (HNE)에 대한 우수한 저해 활성을 나타내었으며, PPE와 HNE에 대하여 기질과 경쟁적으로 반응함을 알 수 있었다. 또한 빈랑으로부터 정제한 페놀성 물질이 염증 과정 중에 발생하는 프리라디칼 소거능도 우수한 효과를 나타내었다. 그리고 비반세포(mast cell)내에서 활성화되며 히아루론산을 분해하는 히아루론산 분해효소(hyaluronidase)에 대한 저해에서도 효과적인 저해 활성을 나타내었으며, 미백효과 측정인 티노시나아제 저해 활성에서 우수한 저해 효과를 보였다.

Claims (5)

1. 빈랑자 식물로부터 추출된 페놀성 물질을 함유하는 것을 특징으로 하는, 미백 및 주름개선 효과를 가지는 노화방지 화장료 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 페놀성 물질은 총 중량에 대하여 0.00001 - 5.0중량%의 양으로 배합됨을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 페놀성 물질은 총 중량에 대하여 0.001 - 1.0중량%의 양으로 배합됨을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 페놀성 물질은 빈랑의 종자로부터 무수 또는 함수의 저급 알코올을 사용하여 추출물을 제조한 후 아세톤, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산, 및 부탄올로 구성된 그,룹으로부터 선택된 하나 이상의 유기 용매를 물과 혼합하여 추출한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, preparative TLC 그리고 역상 HPLC을 통하여 실리카 컬럼(Silica Column), 엷은막 크로마토그래피(TLC)를 한 후 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC)를 거쳐 얻어짐을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림 또는 팩의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.