KR20020089817A

KR20020089817A - 조혈기능 증진 및 방사선 방호용 생약추출물

Info

Publication number: KR20020089817A
Application number: KR1020010028743A
Authority: KR
Inventors: 조성기; 김성호; 이성태; 박혜란; 유영법
Original assignee: 한국원자력연구소
Priority date: 2001-05-24
Filing date: 2001-05-24
Publication date: 2002-11-30
Also published as: KR100440863B1

Abstract

본 발명은 조혈기능 증진 및 방사선 방호용 생약추출물에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 당귀, 천궁, 작약 및 가자(訶子)를 혼합하여 추출한 생약추출물에 관한 것이며 본 발명의 생약추출물은 기존의 생물화학적 면역 및 조혈증강제제들 보다 부작용(side effect)과 독성이 적고 안전성을 보강한 것으로 다양한 질병의 예방 및 회복 또는 노약자를 위한 조혈기능 및 면역기능 증진에 광범위하게 활용될 수 있으며, 방사선 치료시 또는 방사선 피폭시 조혈계를 중심으로 일어나는 방사선 장해의 예방 및 극복에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

조혈기능 증진 및 방사선 방호용 생약추출물{Extract of herb mixture for heamatopoiesis augmentation and protection from radiation}

본 발명은 조혈기능 증진 및 방사선 방호용 생약추출물에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 당귀, 천궁, 작약 및 가자(訶子)를 혼합하여 추출한 생약추출물에 관한 것이다.

혈액세포는 림프구, 적혈구, 과립구, 대식세포 등과 같은 여러 종류의 세포로 구성되어 있는데, 이러한 세포들은 수명이 한정되어 있으며, 자기복제능력을 가진 공통의 원줄기 세포(stem cells)로부터 계속적으로 만들어져 혈액내로 공급된다. 이러한 혈액 원줄기 세포가 여러 종류의 성숙세포로 증식 분화하는 과정에는 아직도 불확실한 점들이 많으나, 최근에는 혈액 원줄기 세포의 증식과 분화에 관여하는 다양한 조혈인자가 밝혀졌다. 즉, 다양한 단백질인자(사이토카인 등)가 관여할 뿐만 아니라, 혈액 원줄기 세포 주위에 존재하는 간질세포(stromal cells)와의 접촉작용이 매우 중요하다고 생각되고 있다. 조혈조직인 골수(bone marrow) 내에는 내피세포, 지방세포, 섬유아세포, 망상세포, 그리고 대식세포 등이 존재하며 세포 사이에는 파이브로넥틴(fibronectin) 등과 같은 세포외기질(extracellular matrix)이 형성되어 있다.

조혈기능은 골수의 혈액모세포로부터 면역세포를 포함한 여러 가지 혈액세포를 생성하는 기능으로서 면역기능을 통한 생체의 방어력과 밀접한 관계가 있다. 최근 혈액모세포로부터 혈액세포로 분화하는 단계와 각 단계에 작용하는 인자들(cytokines)이 알려지면서 이 인자들을 유전공학적으로 대량생산하여 질병치료에 이용하려는 연구가 활발히 진행되었다. 그러나, 효과를 얻을 수 있을 정도의 대량으로 인체에 투여할 경우 대부분이 심한 독성을 나타내기 때문에 일부 제한적인 용도에만 활용되고 있는 실정이다.

면역기능이 여러 가지 질병요인(pathogen)으로부터 생체를 방어한다는 사실은 이미 오래 전에 알려졌는데 이에 따라 질병의 예방 및 치료를 위하여 면역기능을 이용하는 예방접종(vaccination) 및 항독소이용 방법 등이 개발되었으며 최근에는 면역기능의 작용기작이 알려짐에 따라 면역조절물질을 이용하려는 많은 시도가 있었다. 면역조절물질은 비특이적으로 면역세포들을 자극하여 생체의 면역기능을 증진시킴으로써 질병요인에 대한 생체의 방어력을 증강시키는 물질인데, 이와 같은 비특이적 면역조절물질로서 화학합성물질, 미생물 조성물, 생물제제 등을 활용하려는 시도가 계속되어 왔다. 그러나 대부분이 독성 또는 부작용 때문에 실제 적용에는 한계를 보이고 있다.

한편, 방사선에 의한 생체 장해의 방호에 있어서도 조혈기능과 면역기능 장해 극복이 중요한 문제로 알려져 있다. 방사선에 의한 장해는 피폭된 선량에 따라 다르게 나타나는데, 초고선량(100∼300 Gy) 피폭 시에는 중추신경계 장해로 인하여 수시간 내지 1∼2일 안에 대부분 사망하게 되고, 고선량(10∼30 Gy) 피폭 시에는 위장관장해(위장관 점막 손상)로 1∼2주안에 많은 수가 사망하게 되며, 중간선량(4∼8 Gy) 피폭 시에는 골수장해로 조혈 및 면역기능 저하를 초래하게 되어 30일 안에 일부가 사망하게 되고, 저선량(1∼2 Gy) 피폭 시에는 저선량장해가 만성적으로 나타나게 된다. 중추신경계 장해 시에는 지금까지 알려진 대응방법이 거의 없으며, 그 이하 선량의 방사선에 의한 장해를 방호하기 위해서는 위장관 장해 억제와 조혈기능 장해 개선이 일차적인 관건이다.

방사선 장해 방호 물질에 대한 연구는 1949년 치올기를 함유한 치올(thiol)복합제가 방사선 방호효과를 갖는다는 보고가 있은 후에, 치올기를 함유한 유기합성물인 WR(Walter Reed; 미육군의학연구소에서 합성한 물질에 붙인 연번의 물질을 총칭함)시리즈의 방호효과에 관한 연구에 집중되었으나 그 독성 때문에 실제 응용에는 한계를 보였다. 1990년 이후에는 미국, 이스라엘, 일본 등에서 디피리다몰(dipyridamole), 아데노신모노포스페이트(adenosine monophosphate), 테트라사클로데카옥사이드(tetracychlorodecaoxide), 아데투론(adeturon), 데옥시스퍼구알린(deoxyspergualin) 등 화학합성제의 효과를 연구하였으나 자체의 심각한 독성 때문에 역시 실제 적용에는 한계를 보였다. 한편으로, 면역반응에 관련된 생체내 인자들과 조혈세포의 분화 및 증식에 관련된 인자들이 밝혀지면서 이들의 일부를 이용하려는 시도가 있었다. 즉, 인터루킨-1(interleukin-1)을 비롯한 면역 자극제, 종양 괴사인자(tumor necrosis factor, TNF), 과립구 집락 형성 촉진인자(granulocyte colony-stimulating factor, GM-CSF)와 같은 조혈세포 증식 유도제 또는 호르몬 등에 의한 방사선 방호 효과를 얻고자 하였으나, 이 역시 독성 때문에 극히 제한적으로 시도되고 있다.

한편, 최근에는 식품과 생약제제를 중심으로 한 천연물들이 노인성, 퇴행성 질환들에 높은 효능을 보이는 것으로 입증되고 있으며, 이에 따라 이들의 영양생리 및 약리기전에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한, 이들 천연물로부터 생체조절 및 생체방어계를 항진시키는 생리활성물질 탐색이 활발히 진행되어 건강보조식품이나 치료제로서의 실용화 단계에 이르고 있다. 방사선에 의한 조혈기능 장해개선을 위한 천연물의 효능에 관한 연구로는 1988년 프랑스에서 가시오가피의 효능을 검색한 보고 외에, 주로 일본, 대만, 중국을 중심으로 인삼, 천연안료, 만삼, 천궁, 영지와 몇 가지 기존의 한방제에 대한 연구가 최근까지도 진행되고 있으며, 면역조절물질에 대한 연구는 일부 천연물로부터 추출한 유효성분 또는 기존의 한방제의 효과 검증을 중심으로 수행되어 왔다.

이에 본 발명자들은 방사선에 의한 장해가 면역기능 장해와 조혈기능 장해 및 재생조직의 원줄기 세포 손상 등이 복합적으로 일어나는 현상임을 감안하여 각각에 유효한 생약재를 검색하여 당귀, 천궁 및 작약을 동일 무게 비율로 혼합하고, 열탕 추출하여 기존의 면역증강제제들 보다 높은 안정성을 갖는 생약추출물을 제조하여 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제 2000-23772호). 그러나, 상기의 발명에서는 면역기능 및 조혈기능에서 광범위하게 효과를 보이긴 하지만 증진 효과의 정도가 대조군에 비하여 3배 정도이며, 방사선 방호효과도 대조군에 비해 1.5배 정도로 미약한 효과를 보였다.

이에, 본 발명자들은 더 효과적인 새로운 생약제를 검색하여 당귀, 천궁 및 작약에 가자(訶子)를 더하여 동일 무게 비율로 혼합한 후 열탕 추출한 생약추출물을 제조하였으며, 상기 생약추출물이 기존의 생물화학적 면역 및 조혈증강제제들보다 안전성이 높고, 현저한 조혈기능 증진 효과를 보이며, 또한 뛰어난 방사선 방호효과를 나타내는 것을 확인하여 다양한 질병의 예방 및 회복 또는 노약자를 위한조혈기능 및 면역기능 증진에 광범위하게 활용될 수 있으며, 방사선에 의한 조혈계 및 재생조직의 원줄기세포 등의 장해를 종합적으로 방호할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 조혈기능 및 면역기능 증진에 광범위하게 활용될 수 있으며 방사선 장해의 예방 및 극복에 유용하게 이용될 수 있는 생약추출물을 제공하는 것이다.

도 1은 골수세포 배양에서 본 발명의 생약추출물의 조혈전구세포 증식 촉진효과를 나타낸 그래프이고,

1 : 대조군, 2 : 본시료(HIM-2),

3 : 당귀, 4 : 천궁,

5 : 작약, 6 : 사물탕,

7 : HIM-1 (당귀, 천궁, 작약을 동일무게비율로 혼합),

8 : 혼합추출물-1(당귀, 천궁, 작약, 오가피),

9 : 혼합추출물-2(당귀, 천궁, 작약, 어성초)

도 2는 골수 간질세포 배양에서 본 발명의 생약추출물의 세포 증식 촉진 효과를 나타낸 그래프이고,

1 : 대조군, 2 : 본시료(HIM-2),

3 : 당귀, 4 : 천궁,

5 : 작약, 6 : 사물탕,

7 : HIM-1

도 3은 방사선을 조사한 생쥐로부터 분리한 골수세포의 증식에 본 발명의 생약추출물이 미치는 영향을 나타낸 그래프이고,

A : 대조군, B : 4 Gy 조사 생쥐,

C : 8 Gy 조사 생쥐

도 4는 실험용 생쥐에서 본 발명의 생약추출물의 항체 생성 증진 효과를 나타낸 그래프이고,

1 : 생리식염수, 2 : 본시료(HIM-2), 3 : HIM-1,

4 : 당귀, 5 : 천궁, 6 : 작약

도 5는 실험용 생쥐에서 본 발명의 생약추출물의 세포성 면역반응 증강 효과를 나타낸 그래프이고,

1 : 동종동계 + 생리식염수, 2 : 동종이계 + 생리식염수,

3 : 동종이계 + 본시료(HIM-2), 4 : 동종이계 + HIM-1,

5 : 동종이계 + 당귀, 6 : 동종이계 + 천궁,

7 : 동종이계 + 작약

□ : 수컷, ■ : 암컷

도 6은 방사선이 조사된 생쥐에서 본 발명의 생약추출물이 면역세포의 재생성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고,

△ : 방사선 대조군

■ : 본시료 투여군(HIM-2)

도 7은 방사선(12 Gy)을 조사한 생쥐에서 본 발명의 생약추출물이 소장 움의생존에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고,

1 : 방사선 대조군, 2 : 본시료(HIM-2), 3 : 천궁,

4 : 당귀, 5 : 백작약, 6 : 사물탕,

7 : 사군자탕, 8 : 십전대보탕, 9 : 보중익기탕,

10 : 삼령백출산, 11 : 귀비탕, 12 : HIM-1,

13 : 혼합추출물-1(당귀, 천궁, 작약, 오가피),

14 : 혼합추출물-2(당귀, 천궁, 작약, 어성초)

도 8은 방사선(6.5 Gy)을 조사한 생쥐에서 본 발명의 생약추출물이 조혈모세포의 생존에 미치는 영향을 비장내 조혈세포 집락 형성 수로 나타낸 그래프이고,

1 : 방사선 대조군, 2 : 본시료(HIM-2), 3 : 천궁,

4 : 당귀, 5 : 백작약, 6 : 사물탕,

7 : 사군자탕, 8 : 십전대보탕, 9 : 보중익기탕,

10 : 삼령백출산, 11 : 귀비탕, 12 : HIM-1,

13 : 혼합추출물-1(당귀, 천궁, 작약, 오가피),

14 : 혼합추출물-2(당귀, 천궁, 작약, 어성초)

도 9는 방사선(4 Gy)을 조사한 생쥐에서 본 발명의 생약추출물이 조혈기능 회복에 미치는 영향을 혈액내 재생성된 혈액세포 중 백혈구 수로 나타낸 그래프이고,

△ : 방사선 대조군, ■ : 본시료 투여군(HIM-2)

도 10은 방사선(4 Gy)을 조사한 생쥐에서 본 발명의 생약추출물이 조혈기능회복에 미치는 영향을 혈액내 재생성된 혈액세포 중 적혈구 수로 나타낸 그래프이고,

△ : 방사선 대조군, ■ : 본시료 투여군(HIM-2)

도 11은 방사선(2 Gy)을 조사한 생쥐에서 본 발명의 생약추출물이 소장 움 세포의 자사(apoptosis)에 미치는 영향(억제효과)을 나타낸 그래프이다.

1 : 방사선 대조군, 2 : 본시료(HIM-2), 3 : 천궁,

4 : 당귀, 5 : 백작약, 6 : 사물탕,

7 : 사군자탕, 8 : 십전대보탕, 9 : 보중익기탕,

10 : 삼령백출산, 11 : 귀비탕, 12 : HIM-1,

13 : 혼합추출물-1(당귀, 천궁, 작약, 오가피),

14 : 혼합추출물-2(당귀, 천궁, 작약, 어성초)

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조혈기능과 면역기능 증진 및 방사선 방호용 생약추출물로서 당귀, 천궁, 작약 및 가자(訶子)를 혼합하여 열탕 추출한 생약추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 생약추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 기능성 식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 조혈기능과 면역기능 증진 및 방사선 방호용 생약추출물로서 당귀, 천궁, 작약 및 가자(訶子)를 혼합하여 열탕 추출한 생약추출물을 제공한다.

구체적으로 본 발명에서는 기존의 수종 한방제들 및 그 구성 생약재와 기존의 처방들을 변형한 제제들을 대상으로 조혈기능과 면역기능 증진 및 방사선 방호 효과를 비교 검색하였다. 그 결과를 바탕으로 조혈기능 및 면역기능 증진과 동시에 방사선 방호 효과의 더 높은 활성을 나타내는 당귀, 천궁, 작약 및 가자(訶子)로 구성된 혼합 생약추출물을 제조하였다.

본 발명의 생약추출물은 식품소재로 이용할 수 있도록 고시되어 있는 생약재의 3 가지 즉 당귀, 천궁 및 작약 그리고 생약재로서 독성이 비교적 적은 가자(訶子)를 사용하였으며, 상기 4 가지 생약재를 혼합하고 열탕 추출하여 혼합조성물로 제조되었다.

본 발명의 생약추출물의 제조방법은

1) 당귀, 천궁, 작약 및 가자의 혼합 생약재에 물을 가하는 단계,

2) 단계 1의 물을 가한 생약재를 가열하여 추출하는 단계; 및

3) 단계 2에서 추출한 생약재를 감압 농축기로 농축하는 단계로 구성된다.

상기 단계 1에서 물은 총 생약재 무게의 5내지 20배 가하는 것이 바람직하며, 총 생약재 무게의 10배를 가하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 당귀, 천궁, 작약 및 가자는 10-35 : 10-35 : 10-35 : 10-35 중량부의 비율로 혼합하는 것이 바람직하며 각각 동일한 중량부로 혼합하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 단계 2에서, 추출은 3시간씩 3회 가열하여 추출하는 것이 바람직하다. 단계 3에서 농축한 생약재는 동결 건조시켜 분말로 제조하거나 그 자체로 이용할 수 있다.

본 발명의 생약추출물은 조혈기능 증진 효과를 나타낸다. 조혈조직인골수(bone marrow) 내에는 내피세포, 지방세포, 섬유아세포, 망상세포, 그리고 대식세포 등이 존재하며 세포 사이에는 파이브로넥틴(fibronectin) 등과 같은 세포외기질(extracellular matrix)이 형성되어 있다. 이러한 세포들과 세포외기질 등이 혈구의 분화 증식에 적합한 조혈미세환경을 형성하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 조혈미세환경을 조절할 수 있는 물질이 조혈기능을 조절할 수 있을 것으로 생각하고, 실제적으로 본 발명의 생약추출물이 시험관 내에서 골수 간질세포를 증식시킬 뿐만 아니라, 조혈 전구세포의 분화 및 증식을 촉진시킨다는 것을 확인하여, 본 발명의 생약추출물이 조혈 미세환경에서의 조혈계의 기능증진을 유도함을 밝혔다.

본 발명의 생약추출물은 정상 생쥐에 항원으로서 면양적혈구(sheep red blood cell, SRBC)를 주사한 경우 항체생산 세포수를 증가시키며, 동종이계(同種異系, allogeneic) 면역세포를 이식하였을 때의 반응(GraftversusHost Reaction), 즉 T-세포매개 세포성 면역반응을 증가시키는데, 이는 상기 생약추출물이 면역기능 증진 효과를 나타냄을 의미한다.

상기의 조혈기능 증진효과는 방사선 조사된 생쥐에서도 효과적으로 나타나는데, 이는 본 발명의 생약추출물이 방사선 방호에도 효과적임을 의미한다. 본 발명자들은 하기와 같은 사실에 근거하여 본 발명에서 제공하는 생약추출물의 방사선 방호효과를 구체적으로 확인하였다.

생체를 구성하고 있는 조직 또는 세포에는 방사선에 피폭되는 경우 장해를 받기 쉬운 방사선에 민감한 조직과 상대적으로 저항성을 보이는 조직이 있다. 방사선 장해 방호는 위장관장해를 나타내는 선량 이하의 방사선에 피폭된 경우를 주 대상으로 하고 있다. 방사선에 의한 장해를 방호함에 있어서 위장관장해 억제와 골수장해로 인한 조혈 및 면역기능 저하의 극복이 관건이다. 본 발명자들은 상기 생약추출물을 생쥐에 투여하고 위장관장해 억제와 조혈기능 및 면역기능 장해개선 여부를 확인하였다. 본 발명의 생약추출물은 고선량의 방사선을 조사한 경우 소장의 움(intestinal crypt)을 방사선으로부터 방호하여 생존 움의 수를 증가시키고, 중간 선량의 방사선을 조사한 생쥐에서 조혈모세포를 방호하여 혈액세포와 면역세포의 재생성을 촉진시키며, 저선량의 방사선을 조사한 생쥐에서는 소장 움 세포의 사멸(apoptosis) 정도를 억제하는 효과를 나타내었다. 상기 결과는 본 발명의 생약추출물이 방사선 방호에 효과적임을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 생약추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 및 기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 생약추출물은 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물로서 여러 가지 질병의 예방 및 회복 또는 노약자를 위한 조혈 및 면역 기능 증진에 광범위하게 활용될 수 있으며, 방사선 치료시 또는 방사선 피폭에 따른 방사선 장해 시 조혈계 장해의 극복 및 재생조직 원줄기세포 장해의 극복 등에 활용될 수 있다. 또한 상기 생약재 조합의 혼합비율을 최종 제품의 상품성과 소비자 기호도에 따라서 변형시키거나, 다른 식품소재를 첨가하여 기능성 식품으로 제조할 수 있다.

본 발명의 생약추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 생약추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

본 발명의 생약추출물의 유효용량은 5 내지 300 mg/kg 이고, 바람직하기로는 10 내지 150 mg/kg 이며, 하루 1 내지 3회 투여할 수 있다.

상기 생약추출물은 생쥐를 대상으로 한 급성독성검사 결과 경구 투여 시에는 2 g/kg까지 독성변화를 전혀 나타내지 않았으며, 복강내 주사시 50% 치사량(LD₅₀)이 0.4 g/kg 이상으로 나타나 독성이 경미한 물질로 판단되었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 당귀, 천궁, 작약 및 가자(訶子)를 포함한 생약추출물의 제조

당귀, 천궁, 작약 및 가자(訶子)의 생약재 4가지를 음건하고 세절하여 동일한 무게 비율로 혼합한 후 총 무게의 10배 량의 증류수를 가하여 3 시간씩 3 회 약탕기에서 끓여 추출하였다. 상기 추출물을 여과한 후 감압 농축기로 농축한 다음 동결건조하여 본 발명의 생약추출물을 제조하였다. 실험에 사용하기 위하여 증류수에 10~100 mg/ml의 농도로 녹이고 무균 여과지(Millipore membrane, 0.45 ㎛)로 여과하여 무균 상태를 유지하였다.

<실험예 1> 조혈기능 증강효과 측정

<1-1> 조혈전구세포(골수간세포, bone marrow stem cells)의 증식효과

골수세포 배양계에 본 발명의 생약추출물을 첨가하여 본 발명의 생약추출물이 조혈전구세포의 증식에 미치는 효과를 확인하였다. 골수세포는 생쥐의 대퇴골로부터 분리하여 사용하였다.

실험에 사용한 생쥐(C57BL/6 mouse)는 실험에 사용하기 전까지 온도가 22 ± 2℃, 습도가 55 ~ 60%로 유지되며 명암이 12시간씩 조절되는 표준사육 환경에서 생육하였고 고형사료와 물을 제한 없이 공급하였다.

골수세포를 얻기 위하여, 생쥐를 경추 탈구법으로 희생시킨 뒤 대퇴골을 무균적으로 적출한 다음 주사기를 이용하여 대퇴골 내부의 골수를 씻어내어 골수세포를 분리하였다. 골수세포를 장기간 배양하면, 배양접시에 부착하는 간질세포(stromal cells)와 부착하지 않고 배양액 내로 분화 증식되어 나오는 비부착성 세포(nonadherent cells)를 관찰할 수 있는데, 간질세포와의 접촉작용을 통해 증식하는 비부착성 세포는 단구/대식세포, 혈소판, 적혈구 등으로 분화가 가능한 조혈전구세포로서 이들의 증식에 본 발명의 생약추출물이 미치는 효과를 확인하였다. 이러한 세포들을 배양 상층액과 같이 회수하여 혈구계수판으로 비부착성 세포수를 계수하였다.

그 결과, 골수세포 배양계에 본 추출물을 첨가하였을 때 분화 증식되는 비부착성의 조혈전구세포가 대조군보다 훨씬 많이 증식되는 것을 확인하였다 (도 1).

<1-2> 골수 간질세포(Bone marrow stromal cells)의 증식 효과

골수간질세포 배양계에 본 발명의 생약추출물을 첨가하여 증식에 미치는 효과를 관찰하였다. 먼저 골수세포를 실험예 <1-1>과 같은 방법으로 생쥐 대퇴골로부터 분리하여 24시간 동안 배양한 후, 배양액 내에 부유하는 조혈전구세포를 배양액과 함께 제거하여 배양접시에 부착하는 간질세포만을 분리하여 준비하였다. 분리된 골수 간질세포를 장기간 배양하면서, 일주일에 한번씩 배지의 1/2을 새로운 배지로 교환하고, 생약추출물을 첨가하여 2 ~ 3주일 정도 계속 배양한 후 증식한 간질세포 수를 세어서 증식 정도를 측정하였다.

그 결과, 본 추출물에 의한 간질세포의 현저한 증식 효과를 확인할 수 있었다 (도 2).

상기 결과는 본 발명의 생약추출물이 조혈전구세포의 증식뿐만 아니라 조혈 미세환경 내의 보조세포인 간질세포의 증식도 촉진시킴으로써 조혈계의 기능증진을 유도함을 의미한다.

<1-3> 방사선 조사에 대한 골수세포 회복 효과

상기 생약추출물이 방사선 조사로 인한 골수세포 장해를 회복시킬 수 있는지를 알아보기 위하여, 감마선 조사를 한 생쥐의 골수세포를 분리한 후 본 발명의 생약추출물을 첨가한 배지에서 일정기간 배양한 다음 회복되는 정도를 세포수로 비교하였다.

그 결과, 감마선 조사를 하지 않은 대조군에서도 생약추출물의 첨가에 의해 약 1.5배 정도로 세포수가 증가되었다. 50% 치사량의 감마선인 8 Gy을 조사한 생쥐에서 분리한 골수세포는 그 생존정도가 약 7% 정도밖에 되지 않았으나, 본 발명의 생약추출물 첨가에 의해 약 1.7배 정도로 생존 세포수가 증가되었다. 또한, 4 Gy의 감마선을 조사한 생쥐에서 분리한 골수세포는 약 10% 정도밖에 생존하지 않았으나, 본 발명의 생약추출물 첨가에 의해 약 2배 정도로 생존 세포수가 증가됨을 확인하였다(도 3). 상기 결과는 본 발명의 생약추출물이 방사선에 피폭된 생쥐에서 골수세포의 회복을 유도함을 의미한다.

<실험예 2> 면역기능 증강효과

<2-1> 생체내의 항체생성 증강 효과

본 발명의 생약추출물이 생체내 면역기능 중 체액성 면역반응인 항체 생성능에 미치는 효과를 알아보기 위하여, 생쥐에 추출물을 투여하고 항원으로 면양적혈구(Sheep Red Blood Cell, SRBC)를 주사한 후 초기 면역반응에서 면양적혈구에 대한 항체를 생성하는 세포 수를 측정하였다.

실험에 사용한 생쥐(C57BL/6 mouse)는 실험예 <1-1>과 동일한 표준 사육조건에서 사육하였다.

항체생성 세포수 측정(Hemolytic plaque forming cell assay)을 위하여, 먼저 본 발명의 생약추출물의 최적용량을 정하여 생쥐 마리당(25 g) 0.25 ㎖씩 복강내 주사하였다. 다음날, 면양적혈구(SRBC)를 생쥐 마리당 2 ×10⁸개씩 정맥주사한 후 2일간 계속해서 본 발명의 생약추출물을 복강내 주사하였다. 면양적혈구 주사 후 3 일째에 마우스를 경추탈골로 희생시키고 무균적으로 비장세포를 분리한 후,비장세포(7 ×10⁵세포/0.1 ㎖), 20% 면양적혈구(SRBC) 0.1 ㎖ 및 0.5% 아가로즈(agarose) 1.6 ㎖을 시험관에서 혼합하여 배양접시(dish)에 부은(pour)후 2시간 동안 세포배양기(CO₂-incubator)에서 배양하였다. 이후 보체(GPC,1/70)를 첨가하여 2시간 더 배양한 후 항체를 생산하는 림프구 주변에 형성된 용혈 플라크(plaque)를 계수하고 희석 배수를 고려하여 비장세포 전체 중 항체를 생산하는 세포수(plaque forming cells/spleen, PFC/spleen)를 산출하였다.

그 결과, 생약추출물의 투여에 의하여 항체생성 세포 수가 현저히 증가함을 확인하였다(도 4).

<2-2> 생체내 세포성 면역반응의 증강효과

생체내 면역기능 중 세포성 면역반응에 미치는 본 발명의 생약추출물의 효과를 확인하기 위하여, 생쥐에 동종이계(同種異系, allogeneic)의 면역세포(immune cells)를 이식하여 이식된 면역세포에 의한 세포성 면역반응(Graft verus Host Reaction, GVH)을 유발시킨 후 본 발명의 생약추출물을 투여하였다.

실험에 사용한 생쥐 2종은 C57BL/6와 DBA/2이었으며, 잡종 생쥐인 BDF1(C57BL/6×DBA/2)은 C57BL/6 암컷과 DBA/2 수컷을 교배시켜 얻었다.

세포성 면역반응(Graftvs.Host Reaction, GVH)을 측정하기 위하여, 먼저BDF1(C57BL/6×DBA/2) 마우스를 수용체로 하였으며, 동종이계(同種異系, allogeneic)의 이식 세포(graft)로는 C57BL/6 생쥐의 비장림프구를 사용하였다.비장세포를 생쥐 마리당 1×10⁷개(0.2 ㎖)씩 꼬리정맥으로 주사하여 이식하였으며, 생약추출물의 투여는 적정용량이 되도록 조정하여 이식시키는 날로부터 7 일간 복강주사(0.2 ㎖/마리)로 실시하였다. 7일 후 비장을 적출하여 무게를 재고 체중으로 나누어 하기 수학식 1에 의한 비장지표(spleen index)를 산출하였다.

산출된 비장지표의 분석결과, 세포성 면역반응(GVH)이 생약추출물의 투여에 의하여 현저하게 증폭되는 것을 확인하였다(도 5).

<3-3> 방사선이 조사된 생쥐에서 비장내 면역세포의 재생성 촉진효과

본 발명의 생약추출물이 방사선이 조사된 생쥐에서 면역세포의 재생성에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 시료 투여는 생쥐에 방사선을 조사하기 전 36시간과 12시간에 생쥐 마리 당 1 mg씩 복강내로 주사하였다. 방사선 조사 후 시일 경과에 따라 비장을 적출하고 비장내 면역세포를 분리하여 계수하였다.

비장림프구를 얻기 위하여, 생쥐를 경추 탈구법으로 희생시킨 뒤 복부를 절개하여 비장을 무균적으로 적출하고 멸균된 핀셋과 수술용 칼로 지분거려 생리식염수(HBSS)에 세포를 부유시켰다. 상기 비장세포 부유액을 2분간 정치시켜 부유되지않은 세포 덩어리를 제거한 후, 트리스-염화암모늄 완충용액(Tris-NH₄Cl용액)을 가하여 적혈구를 제거하고 HBSS로 2회 세척하여 비장 림프구를 얻었다. 이를 트리판블루(Trypan blue) 염색법을 이용하여 세포수를 측정하였다.

그 결과, 생쥐 비장내 면역세포 수는 방사선 조사 후 급격히 감소하였으며, 그 후 서서히 회복되었으나, 본 발명의 생약추출물 투여군에서는 방사선 조사 후 3 주째부터 대조군에 비해 현저하게 면역세포의 수가 증가되었다(도 6). 이는 본 발명의 생약추출물이 방사선에 피폭된 생쥐에서 면역세포의 재생성을 촉진함을 의미한다.

<실험예 3> 방사선 방호효과

<3-1> 위장관장해 방호효과

본 발명의 생약추출물이 고선량 방사선에 의한 위장관장해를 방호할 수 있는지를 확인하기 위하여 소장 움 생존 증가 효과(Intestinal crypt survival)을 관찰하였다.

먼저, 소장 움 생존 증가 효과를 확인하기 위하여 생쥐를 방사선에 피폭시키기 전에 생약추출물을 주사한 다음 12 Gy의 방사선에 노출시켰다. 상기 생약추출물의 투여는 생쥐 마리 당 1 ㎎의 용량으로 방사선 조사 전 36 및 12시간 전에 복강 내로 2회 주사하였다. 그 후 3.5일째에 생쥐를 희생시켜 소장부위를 채취하고, 각 생쥐 당 8 내지 10개의 소장편을 통상적인 방법에 따라 파라핀 포매하여 절편을제작하였다. 각 생쥐 당 8개의 종절된 소장표본의 가장자리에 위치하는 소장 움을 광학현미경으로 관찰하고 그 수를 계수하였다.

그 결과, 생존 소장 움의 수가 정상 대조군에서는 평균 157.3개, 방사선 피폭 대조군에서는 21.3개, 본 생약추출물 투여군에서는 34.4개로 나타나, 본 발명의 생약추출물이 생존 소장 움의 수를 유의하게(p<0.05) 증가시킴을 확인하였다(도 7). 이는 본 발명의 생약추출물이 방사선에 의한 위장관 장해를 방호할 수 있음을 의미한다.

<3-2> 조혈모세포 방호효과

본 발명의 생약추출물이 중간선량의 방사선에 의한 조혈계 장해를 방호할 수 있는지를 확인하기 위하여, 비장내 조혈세포의 집락 형성 증가 효과(Endogenous spleen colony formation)를 조사하여 골수의 조혈모세포를 방호할 수 있는지를 관찰하였다. 생물체가 방사선에 피폭되면 혈액 내의 혈구세포가 급격히 소멸되며, 그 후 서서히 골수의 조혈모세포로부터 재생성되어 나온다. 이 때 비장에서 혈구세포가 빠르게 증식하면서 조혈세포 집락을 형성하게 되는데 이러한 원리에 근거하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 생쥐를 방사선에 피폭시키기 전에 생약추출물을 주사한 다음, 6.5 Gy의 방사선에 노출시켰다. 실험군은 각 군당 8 ∼ 9 마리의 생쥐로 하였으며, 생약추출물의 투여는 생쥐 마리 당 1 ㎎의 용량으로 방사선 조사 전 36 및 12 시간 전에 복강 내로 2회 주사하였다. 방사선 조사후, 9일째에 각 실험군의 생쥐를 희생시키고 비장을 채취하여 보우인(Bouin) 고정액으로 고정한 후 비장 표면에 형성된 조혈세포의 집락을 실체현미경으로 관찰하고 계수하였다.

그 결과, 비장 표면에 형성된 조혈세포의 집락수가 방사선 피폭 대조군에서는 평균 2.67개, 본 발명의 추출물 투여군에서는 10.13개로 나타나, 상기의 생약추출물이 조혈모세포의 생존수를 현저하게(p<0.05) 증가시킴을 확인하였다(도 8). 이는 본 발명의 생약추출물이 방사선에 의한 조혈계 장해를 방호할 수 있음을 의미한다.

<3-3> 방사선 조사 생쥐에서 혈액세포의 재생성 촉진 효과

본 발명의 생약추출물이 방사선 조사로 인한 조혈기능의 저하를 회복시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 본 발명의 생약추출물을 생쥐에 주사한 다음, 방사선을 조사하여 시일경과에 따른 혈액 내의 세포 수를 측정하였다. 생물체가 방사선에 피폭되면 혈액 내의 혈구세포가 급격히 소멸되며, 그 후 서서히 골수의 조혈모세포로부터 재생성되어 나온다. 이 때 혈액 내에 재생성된 혈액세포 수를 측정하여 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 본 발명의 생약추출물을 생쥐에 주사한 다음, 4 Gy의 방사선에 노출시켰다. 실험군은 각 군당 5마리의 생쥐로 하였으며, 생약추출물의 투여는 생쥐 마리 당 1 ㎎의 용량으로 방사선 조사 전 36 및 12시간 전에 복강 내로 2회 주사하였다. 방사선 조사 후, 3일, 1주, 2주, 3주, 5주, 7주째에 각 실험군 생쥐의 꼬리정맥을 통해 약 100 ㎕의 혈액을 항응고제가 첨가된 튜브에 채취하여 혈액내 각 혈액세포를 혈구자동분석기(Hemavet 850+)로 계수하였다.

그 결과, 전체 백혈구의 수는 방사선 조사 대조군의 경우 방사선조사 전에 비해 3일째에 약 13% 정도로 급격히 감소하였고, 1 내지 2주 후부터 서서히 회복되기 시작하여 3주 후에 약 62% 정도로 회복하였으며 7주 후에는 정상수준으로 회복되는 경향을 나타내었다. 방사선 조사 전에 본 발명의 생약추출물을 투여한 경우 2주 후 까지는 큰 차이를 보이지 않았으나 3주 후에는 정상수준의 약 85% 정도로 대조군에 비해 유의한 회복효과를 나타내었고, 이러한 효과는 7주까지 지속되었다(도 9). 적혈구 수는 유핵 세포와는 달리 방사선 조사 후 서서히 감소하여 대조군의 경우 2주 후에 정상세포수의 약 56% 까지 감소하였다가 그 후 서서히 회복되어 7주 후에 정상으로 회복되었으나, 방사선 조사 전에 본 발명의 생약추출물을 투여한 경우 극적인 회복효과를 나타내지는 않았지만, 실험기간 중에 방사선 조사군에 비해 높은 세포 수를 나타내어 어느 정도의 회복 효과를 보였다(도 10).

상기의 결과로부터 본 발명의 생약추출물이 방사선에 의한 조혈계 장해를 방호할 뿐만 아니라 조혈기능의 회복을 촉진시킴을 확인하였다.

<3-4> 재생조직의 원줄기세포 자사(自死) 억제 효과

본 발명의 생약추출물이 저선량의 방사선에 의한 장해의 하나인 세포자사(細胞自死, apoptosis)를 억제시킬 수 있는가를 확인하기 위하여 소장 움 세포(intestinal crypt cells)의 자사(自死)를 억제하는지를 관찰하였다.

실험은 각 군당 4마리씩의 생쥐를 대상으로 하였으며, 생약추출물의 투여는생쥐 마리 당 1㎎의 용량으로 방사선 조사 전 36 및 12시간 전에 복강 내로 2회 주사하였다. 2 Gy의 방사선 조사 후 6시간 지나서 생쥐를 희생시키고 소장을 채취하여 최소 30분 동안 카노이(Carnoy's) 고정액에 고정시킨 뒤, 각 생쥐 마리 당 8 ~ 10개의 소장편을 통상적인 방법에 따라 파라핀 포매하여 횡단절편을 제작하였다. 절편내 소장 움의 세포를 관찰하기 위하여 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin)으로 염색하거나 세포자사 과정에서 생성된 DNA 분절(fragments) 측정을 위하여 원발부위 자사(自死) 검출 킷트(in situapoptosis detection kit; APOPTAG TM, Oncor, Gaithersburg, MD, U.S.A.)를 사용한 원발부위 DNA 말단 표지법(in situDNA end-labeling ; ISEL)을 실시하였다. 원발부위 DNA 말단 표지법은 표본 슬라이드에 말단 데옥시 뉴클레오티딜 전달효소(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 첨가하여, 분절된 DNA에 디곡시제닌-뉴클레오타이드(digoxigenin-nucleotides)를 부착시키고 항 디곡시제닌 항체-퍼옥시다제(anti-digoxigenin-peroxidase antibody)를 결합시킨 후 디아미노벤지딘(diaminobenzidine ; Sigma Chemical Co.)을 사용하는 통상적인 방법으로 퍼옥시다제(peroxidase) 부위를 발색시켰다. 생쥐 마리당 40개의 소장 움을 광학현미경으로 관찰하였으며, 측정에 사용된 소장 움은 움의 편측 세포 수가 17개 이상으로 파네쓰 세포(Paneth cell)와 내강이 확연히 나타나는 정확히 종절된 움만을 선택하였고, 소장 움의 파네쓰 세포(Paneth cell)를 제외한 4번째 세포까지를 기저부(base)로 하여 자사세포(自死細胞, apoptotic cell)를 기저부와 전체 소장 움에서 관찰되는 총수(total)로 구분하여 계수하였다. 여러 개의 자사체(自死體, apoptotic body)가 그 크기와 형태를고려할 때, 한 세포의 잔유물로 나타날 때는 한 개의 세포로 계수하였다.

그 결과,도 11에서 보듯이 소장 움의 기저부에서의 자사 세포 수는 정상 대조군에서는 움 당 평균 0.071개, 방사선 피폭 대조군에서는 2.875개, 생약추출물 투여군에서는 2.056개로 나타났으며, 소장 움 전체에서의 자사 세포 수는 정상 대조군에서는 움 당 평균 0.091개, 방사선 피폭 대조군에서는 3.138개, 생약추출물 투여군에서는 2.456개로 나타났다.

상기 결과로부터 본 발명의 생약추출물이 방사선에 의한 세포자사를 억제함을 확인하였으며, 나아가 방사선에 의한 재생조직의 세포 장해를 방호할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 4> 생쥐에 대한 경구투여 및 복강투여 급성 독성실험

생쥐(C57BL/6 mouse)를 사용하여 본 발명의 생약추출물의 급성독성실험을 실시하였다. 실험군당 6마리씩의 생쥐에 상기 실시예 1의 생약추출물을 최대 10 g/kg의 용량으로 하여 각 용량단계별로 경구투여 및 복강내 주사하였다. 경구투여군은 2주간 관찰하였으며, 복강내주사군은 1주간 관찰하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하고 현미경검사를 실시하였다. 시험결과, 경구투여 군에서는 50% 치사량이 체중 ㎏당 10 g 이상으로 독성이 없었으며, 복강내 주사군에서는 50% 치사량이 체중 ㎏당 수컷의 경우 0.9 g이었으며 암컷의 경우 0.4 g으로 독성효과는 경미하였다. 경구투여군에서는 임상증상, 부검시 육안적 소견 및 현미경 검사 소견에서 정상의 소견을 보였으나, 복강내주사 군에서는 고농도 투여군(수컷 : 1.1 g/㎏ 이상, 암컷 : 0.5 g/㎏ 이상)에서 임상증상으로 비출혈, 안구출혈, 후구마비가 일부 관찰되었고 부검소견에서 장출혈, 신장창백, 신장점상출혈, 간의 백색반, 복수저류가 있었으며 현미경소견상 신장의 사구체충혈, 피질부 세뇨관 공포변성 괴사 및 충출혈, 간장에서 소엽중심성 괴사 및 충출혈, 심근의 변성, 비장의 적색수 충혈, 폐의 충출혈이 관찰되었다.

이상의 결과, 본 발명의 생약추출물은 생쥐에서 경구투여 시 2 g/kg까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 복강내주사시 50% 치사량(LD₅₀)이 0.4 g/kg 이상으로 나타나 독성이 경미한 물질로 판단되었다.

상기에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 생약추출물은 기존의 생물화학적 조혈 및 면역증강제제들보다 부작용(side effect)과 독성이 작고 안전성을 보강한 것으로, 다양한 질병의 예방 및 회복 또는 노약자를 위한 조혈 및 면역기능 증진에 광범위하게 활용될 수 있으며, 방사선 치료시 또는 방사선 피폭 시 조혈계 및 재생조직 원줄기세포의 방호가 일차적인 관건임을 감안하면 방사선 장해의 예방 및 극복에 유용하게 이용될 수 있다. 또한 본 혼합물은 독성이 작은 천연물이므로 본 시료를 바탕으로 한 효능이 높은 조혈기능과 면역기능 증진 기능성 식품의 제조에이용될 수 있다.

Claims

당귀 10-35 중량부, 천궁 10-35 중량부, 작약 10-35 중량부 및 가자 10-35 중량부를 포함하는 생약 추출물.
제 1항에 있어서, 당귀, 천궁, 작약 및 가자는 동일 무게 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는 생약추출물.
제 1항의 생약추출물을 유효성분으로 함유하는 조혈기능 증강용 약학적 조성물 또는 기능성 식품.
제 1항의 생약추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능 증강용 약학적 조성물 또는 기능성 식품.
제 1항의 생약추출물을 유효성분으로 함유하는 방사선 방호용 약학적 조성물 또는 기능성 식품.
1) 당귀, 천궁, 작약 및 가자로 이루어진 혼합 생약재에 혼합 생약재 총 무게의 5 내지 20배의 물을 가하는 단계;

2) 상기의 혼합물을 가열하여 추출하는 단계; 및

3) 상기의 추출물을 농축하는 단계로 구성되는 제 1항의 생약추출물의 제조방법.