KR20020086564A - Ｔｌｐ 펩티드 및 그를 암호화하는 ｄｎａ 서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TLP 복합체의 단백질로부터 유도된 펩티드를 암호화하는 DNA 분자에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 100kDa TLP 복합체의 단백질을 암호화하는 cDNA 서열에 관한 것이다.

Description

ＴＬＰ 펩티드 및 그를 암호화하는 ＤＮＡ 서열{ＴＬＰ Peptides and ＤＮＡ sequences coding the same}

TLP("Tumor Liberated Particles")라는 약어는, 인간 종양 세포, 특히 폐암에 존재하는 단백질 복합체를 가리킨다. TLP는 EP283433에 개시된 과정에 따라, 종양 조직으로부터 처음으로 분리되었다. 이후, TLP 복합체를 형성하는 특정 단백질들이 확인되었다. 폐암에서 주로 발현되는 214kDa의 TLP 단백질이 Oncology, 1983, 40:248-253에 개시되어 있다.

그와 같은 단백질에 특이적인 에피토프들(epitopes) 및 그에 대한 항체는 WO98/01462에 개시되어 있다. 부가하여, EP649433은 폐암으로부터 분리된 100kDa의 단백질 및 그로부터 유도된 면역원성(immunogenic) 펩티드를 개시하고 있다. 그들 가운데에서, RTNKEASI 펩티드는 100kDa의 TLP 복합체를 인식하는 다클로날(polyclonal) 항체를 생산하는 데에 사용되었다. 그와 같은 항체들은 다른 기원(origin)의 조직에서 TLP 발현을 특성화하고, 종양 표지(tumor marker)로서 동일한 단백질을 확인하는 데에 사용되었다(WO98/15282). 다른 종양 세포주(cell line)에서의 TLP 발현의 연구는 유방암(MCF7) 및 직장결장암(HT29)로부터 유래된 세포주들 가운데서도 비슷한 발현 수준이 나타남을 밝혔다.

더욱이, 화학요법제로 생체외 처리를 할 경우 종양 세포군(NSCLC)에서 TLP 항원의 발현을 증가시킴에 반하여, 100kDa TLP 단백질 및 그로부터 유래된 펩티드는 특정 항암 효과를 갖는 임파구들을 자극하는 것으로 나타났다(WO98/15282).

종양 단백질 TLP 복합체로부터 더욱 다양한 항원과 면역원성 펩티드 및, 진단적 또는 치료적 용도를 위한, 동일한 TLP 단백질의 광범위한 생산을 위한 효율적 수단을 제공하는 중요성은 명백하다. 그와 같은 목적을 위하여, 본 발명자들은 하기에 서술되는 바와 같이, 100kDa TLP 복합체의 펩티드를 암호화하는 cDNA 서열을 얻었다.

본 발명은 TLP 복합체 단백질로부터 유래된 펩티드를 암호화하는 DNA 분자에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 100 kDa TLP 복합체의 펩티드를 암호화하는 cDNA 서열에 관한 것이다.

도 1은 PCR 산물을 pGEM-T 이지(easy) 벡터(PROMEGA)에서 클론한 것을 나타낸 도면이다.

TLP를 발현하는 종양 세포들의 용해액(lysate)을 준비하고, 그로부터 총 RNA를 추출한 다음, TNKEASI 펩티드(전방 프라이머) 및, 각각, 무작위 헥사뉴클레오티드 서열(역 프라이머)에 대응하는 퇴화(degenerate) 서열들을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 쌍들로 RT-PCR을 수행하였다. 증폭 산물을 적당한 벡터에서 클론한 다음, 서열분석하였다. 그 내부에서, 300개 염기들을 갖는 ORF를 확인하였고, 그 서열을 서열번호 1로 명명하였다. 상기 ORF에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 서열번호 2로 명명하였다.

본 발명의 첫번째 태양에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 서열을 포함하는핵산 분자, 유전 암호 퇴화(genetic code degeneration)에 기인한 그 변이체, 및 엄격한(stringent) 조건 하에서 서열번호 1의 상보 서열과 혼성화(hybridising)하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명은 또한 여기에 개시된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지, 또는 유전 공학에서 통상적으로 사용되는 다른 임의의 벡터일 수 있으며, 이들은 암호화 서열 이외에도, 개시 및 정지 코돈, 인핸서(enhancer), 프로모터(promoter), 신호 서열(signal sequences) 등을 포함하는, 전사를 조절하는 서열들과 같은 콘트롤 성분을 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명은 상기 벡터로 감염(transfected) 또는 형질전환(transformed)된 진핵 또는 원핵 세포들을 포함한다.

TLP 단백질의 완전한 서열은 유전 공학에 의하여 그것을 다량으로 생체외에서 제조하는 것을 가능하게 한다. 그와 같은 항원 제조의 이용가능성은 인간 질병에서 TLP의 역할을 심도있게 연구하는 것을 가능하게 한다. 또한, 이는 해당되는 종양들의 조기 진단을 위한 분석의 준비 및 특이적 항암 백신의 제조를 가능하게 한다.

본 발명의 다른 태양은, 서열번호 2로 명명된, 서열번호 1의 DNA 서열에 의하여 암호화되는 펩티드 또는 그의 단편에 관한 것이다. 그와 같은 펩티드들은, 공지의 방법(예를 들어, "Merrifield, (1986)Science232:341-347", 또는 "Barany and Merrifield, 1979,The peptides, Gross and Meienhofer, eds NY Academic Press, 1-284" 참조)에 따라, 상기 서술된 cDNA를 사용하여 재조합 DNA 방법에 의하여 또는 화학적 합성으로 제조될 수 있다. 상기 합성은 자동 합성기를 사용하여 용액상 또는 고체상에서 수행될 수 있다. 면역원적 효과를 유지하기 위하여, 하나 또는 그 이상의 아미노 잔기가 다른 L- 또는 D- 잔기들에 의하여 치환될 수 있으며, 또는 면역원성, 면역 반응의 유도에 대한 선택성, 또는 투여 후 생체이용률(bioavailability)과 같은 특성들을 향상시키기 위하여, 예를 들어 카르복시 말단의 아미드화(amidation), 지용성(lipophilic) 기(예를 들어, 미리스틸)의 연결, 또는 글리코실레이션 또는 다른 펩티드의 접합(conjugation)에 의하여 화학적으로 변형될 수 있다. 또한 펩티드는 측방향 사슬, 예를 들어 자유 카르복시기에서, 화학적으로 유도화되어 염들, 에스테르들, 히드라지드들(hydrazides)을 형성할 수 있다. 또한, 상기 펩티드들은 종양에 대한 더 큰 세포독성(cytotoxic) 또는 보조(helper) 면역 반응을 유도하기 위하여 공지의 에피토프들에 접합될 수 있다.

펩티드의 면역원적 활성은, 예를 들어 t-임파구 증식(propagation) 또는 번식(proliferation) 분석법(Protti M. P. et al., 1990,J. Immunol. 144:1711-1720), 세포독성 분석법(Protti M. P. et al.,Cancer Res. 56:1210-1213), 또는 MHC 분자와의 결합 분석법을 사용한 생체외 실험들에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 서열번호 2로부터 유도된 펩티드들은 TLP-특이적 항체를 생산하는 데에 사용된다. 후자는 단일클로날 또는 다클로날일 수 있으며, 여기에 개시된 펩티드들에 대하여 특이적인 TLP 에피토프들을 인식한다. 그와 같은 항체들은 바람직하게는, 종양들에서 TLP 발현을 탐지하기 위한 면역분석법들에서 사용된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 종양, 특히 폐 종양의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 상기 핵산 분자 또는 펩티드들의 용도를 제공한다. cDNA의 사용을 포함하는 전형적인 응용은, US5593972 또는 US580859에서 개시된 바와 같이 효과를 나타낼 수 있는, DNA 백신의 제조이다. 펩티드들은 또한, 그 효과를 증가시키는 것으로 알려진, 다른 화학요법제(WO98/15282)와 조합하여 사용될 수도 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제(excipient)와 함께 유효량의 DNA 또는 펩티드를 포함한다. "유효량"이라는 용어는, 임파구를 활성화시키고, 종양에 대한 세포성 또는 체액성(humoral) 반응을 촉발시키기에 충분한 양을 의미한다.

바람직한 구현예에 따르면, 약제학적 조성물은 종양(neoplasias)에 민감한 피험체의 예방적 백신화 또는 종양 환자의 치료적 백신화에 사용된다. 본 명세서에서 "백신화"라는 용어는 능동적 백신화 즉, 환자 내에서 면역 반응을 직접적으로 활성화시키기 위한 펩티드 또는 cDNA의 생체내(in vivo) 투여 또는, 수동적 백신화 즉, 환자 내에서 T 세포독성 임파구의 생체외(in vitro) 활성화 및 그들의 연이은 재접종을 위한 펩티드의 사용을 의미한다. 백신의 제조 및 사용을 위한 과정은 당업자에게 공지되어 있다; 상세한 설명은, 예를 들어, Paul, Fundamental Immunology, Raven Press, New York(1989) 또는 Cryz, S.J., Immunotherapy and Vaccines, VCH Verlagsgesselschaft(1991)에 개시되어 있다. 백신은 통상 용액, 주사액, 현탁액의 형태로 제조되지만, 고체 또는 리포좀-기초 제제(liposome-based preparations)의 형태로 제조되기도 한다. 면역원성 성분은 에멀젼화제, 완충제, 아주반트(adjuvant)와 같은 약제학적으로 허용가능한 부형제와 혼합되어서 백신 효율을 증가시킬 수 있다.

하기 실시예들은 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1 - TLP cDNA의 분리 및 클로닝

몇몇 세포주들(HT-29, SAOS-2, A 549, MCF-7, H23, H157, H1819, WI38)로부터 RNAzol B 시약(TEL-TEST, INC)으로 총 RNA를 추출하였고, 역전사 시스템(Reverse Transcription System, PROMEGA)을 사용하여 역전사시켰다. 아미노산 서열 RTNKEASI와 부합하는 상류 퇴화 올리고뉴클레오티드: ACN AAY AAR GAR GCN TCN ATH TC를 사용하고, 하류 프라이머로서 랜덤 헥사머(Random Hexamer)를 사용하여 중합연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 35회(95℃에서 1분, 40℃에서 2분 및 72℃에서 1분) 수행하였다. PCR 산물을 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)를 포함하는 1% 아가로오스 겔 상에서 전기영동시켰다.

PCR 산물을 pGEM-T 이지(easy) 벡터(PROMEGA)에서 클론하였다(도면). 결과물인 플라스미드 클론들을 Applied Biosystems 모델 373A DNA 서열분석기를 사용한사슬 종결 방법(chain termination method)으로 서열분석하였다. 해독틀(open reading frame, ORF)을 추론하였다(서열번호 1).

실시예 2 - 항체의 제조 및 특성화

0.5ml의 프로인트(Freund) 완전 아주반트와 혼합된 0.5ml 인산-완충 식염수(phosphate-buffered saline) 내의 0.5mg 서열번호 2 펩티드로 4마리의 토끼를 피하주사하여 면역시켜 토끼 항-TLP 혈청을 얻었다. 불완전 아주반트로 2주 간격을 두고 추가접종하였다. 귀 정맥 출혈을 통하여 한 주 걸러 혈청을 채취하였다. 96 웰 미소적정판에서 방사면역분석법(radioimmunoassay)에 의하여 항혈청의 적정을 수행하였다. 웰들을 펩티드 항원의 고정된 농도로 코팅하고, 세척한 다음, 다양한 혈청 희석액에서 배양하였다. 결합된 면역글로불린을¹²⁵I-표지 단백질 A로 탐지하고 방사면역분석법으로 정량하였다. 1:1,000 희석액에서, 모든 혈청은 펩티드 항원과 양성 염색 반응을 보였다. 대응하는 랫트로부터의 사전면역 혈청을 또한 시험하였으나, 아무런 유의성 있는 반응성도 탐지되지 않았다.

웨스턴 블럿

펠렛화된(pelleted) 세포들을 200㎕ 용해 완충액(50mM Tris, 5mM EDTA, 250mM NaCl, 50mM NaF, 0.1% Triton, 0.1mM Na₃VO₄, 및 프로테아제 저해제)에 재현탁시킴으로써 종양 세포 용해액을 제조하였다. 단백질 추출액 50㎍을 8% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전개시켰다. 폴리아크릴아미드 겔 내의 단백질들을 CAPS 완충액(10mM CAPS, 20% 메탄올, pH11) 내에서 PVDF 막(Millipore)으로 전사하였다. 막을 TBS-T 완충액(2mM Tris, 13.7mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH7.6) 내에서 5% 우유로 차단하고, TBS-T 내에서 세척하였다. 친화 정제 항-TLP 항체를 3% 우유 내에서 막으로 배양하고, TBS-T 내에서 세척하였다. 막을 서양고추냉이(horseraddish) 퍼옥시다아제와 결합된 토끼 항-토끼 항체와 함께 배양하고, TBS-T에서 세척하였다. 막과 결합된 2차 항체의 존재를 ECL 시스템(Dupont NEN)을 사용하여 탐지하였다. 종양 세포 용해액에 대응하는 특정 염색이 탐지되었다. 사전면역화된 혈청 및 콘트롤 용해액은 유의성 있는 반응성을 보이지 않았다.

Claims (9)

1. 서열번호 2의 서열을 갖는 TLP 펩티드를 암호화하는 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 서열을 갖는 핵산 분자.
3. 서열번호 2의 펩티드.
4. 제3항의 펩티드에 대한 단일클론 또는 다클론 항체.
5. 제1항 또는 제2항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
6. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물.
7. 백신 형태의 제6항에 따른 조성물.
8. 종양의 예방 또는 치료에 사용되는 제6항 또는 제7항에 따른 조성물.
9. 제8항에 있어서, 폐암의 예방 또는 치료에 사용되는 조성물.