KR20020084163A - 파클리탁셀과 13-아세틸-9-디히드로바카틴 ⅲ 의 제조방법 - Google Patents

파클리탁셀과 13-아세틸-9-디히드로바카틴 ⅲ 의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탁산을 함유하는 원료로부터 파클리탁셀 및 그 밖의 다른 탁산을 수득하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 탁산을 함유하는 원료로부터 수득한 탁산 화합물을 유기 용매내로 추출하는 단계, 분배 크로마토그래피 컬럼에 이러한 조성물을 통과시키는 단계 및 건조 분배 컬럼으로 탁산 화합물을 용리하는 단계를 포함한다. 또다른 가공 기술에 의해 용리된 탁산 화합물을 분리하였다.

Description

파클리탁셀과 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 의 제조방법 {PROCESS FOR MANUFACTURING PACLITAXEL AND 13-ACETYL-9-DIHYDROBACCATIN Ⅲ}
추출 방법(Journal of Natural Products 53, 1249-55, 1990)이 기재된 이전의 문헌에는, 추출물에 0.009 % 내지 0.07 % 범위로 파클리탁셀이 함유되어 있음이 밝혀졌다. 가용성의 헥산 불순물(왁스, 색소 등)을 제거하고 물과 디클로로메탄을 분리한 후에, 가용성의 디클로로메탄 조(粗)추출물에 용해된 파클리탁셀 농도의 범위는 0.03 내지 0.3 중량 % 이다. 파클리탁셀(탁솔)은 하기의 화학식을 갖는 항암 화합물이다 :
파클리탁셀은 세포 분열 및 그밖의 다른 세포 기능에 중요한 역활을 하는 미세소관에 영향을 미침으로써 암 세포의 성장을 저해하는 독특한 메카니즘을 나타낸다.
파클리탁셀은 인체의 내함성(retractory) 난소암 및 유방암 치료에 임상학적으로 효과적이며 간암, 복막암, 경관암, 전립선암, 결장암 및 식도암과 같은 다양한 형태의 다른 암에 대항한 효과적인 활성도를 나타낸다.
파클리탁셀은 일차적으로 태평양 주목 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)의 껍질에서 추출한 것이다. 불행하게도 주목은 대략 1 년에 8 인치 정도로 성장이 매우 느리므로 주목의 껍질은 파클리탁셀의 제한된 원료이다. 이러한 이유 때문에 연구가들은, 증가된 수용성을 갖는 9-디히드로탁솔의 유도체와 같은 우수한 항종양 활성도를 나타내는 파클리탁셀 및 그의 유사체를 생산하는 대안적 방법을 모색하고 있다. 13-아세틸-9-디히드로바카틴(dihydrobaccatin) Ⅲ 예로서, 탁산 디테르펜은 상기 유사체를 제조하기 위한 유용한 전구체로 밝혀졌다. 이러한 것에 관하여 1995 년 8 월 8 일에 공고된 Klein 등의 미국 특허 번호 제 5,440,056 호에 기재되어 있다.
13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 및 바카틴 Ⅲ 는 하기의 화학식 구조를 나타낸다 :
파클리탁셀은, 예를 들어, 탁수스 브레비폴리아보다 광범위하게 분포되어 있는 탁수스 카나덴시스(Taxus Canadensis)로부터 수득할 수 있다. 따라서, 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 는 파클리탁셀보다 훨씬 더 이용가능하다.
파클리탁셀, 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 및 바카틴 Ⅲ 를 포함하는 탁산류를 분리하기 위한 통상적인 방법은 알콜 용매로 바이오매스로부터 탁산을 추출하는 단계 및 크로마토그래피에 의해 각각의 탁산을 정제하는 단계를 포함한다.
선행 기술의 방법에는 파클리탁셀 및 그것의 유도체를 분리하기 위해 다양한 형태의 크로마토그래피 기술을 사용하는 것에 관해 기술되어 있다. 예를 들어, 1995 년 1 월 10 일에 공고된 Rao 의 미국 특허 번호 제 5,380,916 호에는 C18 역상 액체 크로마토그래피를 이용한 방법에 관해 기재되어 있다. 역상 크로마토그래피로 탁산을 분리하는데 성공적일 수 있지만, 이러한 프로토콜은 값비싼 흡착제를 사용하며 많은 시간을 필요로 한다. 따라서, 이러한 방법은 비경제적이며 상업적으로 이용가능하지 않다.
1995 년 12 월 26 일에 공고된 Nair 의 미국 특허 번호 제 5,478,736 호에는 탁산을 정제하기 위해 실리카 겔 정상 흡수 크로마토그래피를 사용한 방법에 관해 기재되어 있다. 정상 흡수 크로마토그래피에서, Al2O3또는 실리카 겔은 흡착제로 사용되는데 이는 일반적인 역상 흡착제보다 약 100 배 더 저렴하다. 정상 실리카 겔 흡수 크로마토그래피를 사용할 경우의 문제점으로는 용매 혼합물에 의해 용리되지 않는 파클리탁셀과 흡착제가 결합하여 산물의 수득량이 감소한다는 것이다.
1996 년 6 월 25 일에 공고된 Gunarvardana 등의 미국 특허 번호 제 5,530,020 호에는 플래니트 코일 역류 크로마토그래피(PCCC)를 사용하여 탁수스 카나덴시스(Taxus Canadensis)로부터 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 를 분리하는 방법에 관해 기재되어 있다. 이러한 방법과 관련된 몇몇 단점은 방법이 복잡하고 유효량의 용매를 소비하며 아주 극소량(밀리그램)의 시료를 정제하기 위해 사용된다는 것이다.
지금까지, 파클리탁셀 및 관련 탁산을 분리하고 정제하기 위한 분배 컬럼 크로마토그래피에 관해서는 전혀 논의된 바가 없었다.
본 발명은 태평양 주목, 관상용 주목 또는 다른 주목 종의 침엽, 껍질 및 뿌리로부터 파클리탁셀을 생산하는 것에 관한 것이며 특히, 본 발명은 추출 과정 중에 추출물을 수득하기 이전에 원치않는 매우 높은 비율의 불순물로 인해 현재는 고비용의 방법에 의해 추출되는 파클리탁셀을 경제적으로 추출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 탁수스 종으로부터 탁산, 특히, 파클리탁셀, 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 를 분리하는 향상된 방법을 제공한다.
본 발명의 양상은 조추출물을 건조 컬럼 크로마토그래피 및 분배 컬럼 크로마토그래피에 사용하는 단계를 포함하는 탁수스 종의 조추출물로부터 탁산을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 거대한 산업 규모 뿐만 아니라 작은 실험실 규모에서도 실행할 수 있다.
환류 단계에서 알콜성 용매에 의해 식물 물질의 추출물로부터 용이하게 탁산을 수득하였다. 바람직하게, 본 발명의 방법에 의해 사용되는 컬럼은 건조 컬럼 분배 크로마토그래피로서 사용하기에 적합하도록 150 메쉬와 250 메쉬 사이의 마이크로스피어 크기를 갖는, 전처리한 실리카 겔로 충전(充塡)시킨 나일론 튜브를 포함한다.
습식 분배 컬럼 크로마토그래피로서 사용하기에 적합하도록 150 메쉬와 250 메쉬 사이의 입자 크기를 갖는 전처리한 실리카 겔로 유리 컬럼을 충전시켰다.
본 발명의 실시형태에서, 방법에는 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 를 수득하기 위해 건조 컬럼 분배 크로마토그래피 단계가 포함되며, 파클리탁셀 및 바카틴 Ⅲ 를 수득하기 위해 정상 분배 컬럼 크로마토그래피 단계가 포함된다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 는 용리 용매 헥산 및 아세트산에틸 (4 : 6)로 건조 컬럼 분배 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 또다른 실시형태에서, 정상 분배 컬럼 크로마토그래피에 의해 파클리탁셀은 좀 더 정제될 것이다. 바람직하게, 이러한 단계에 적합한 용리 용매는 헥산 : 아세트산에틸(6 : 4 로 시작하여 3 : 7 로 종결됨)이다. 필요하다면 이러한 크로마토그래피를 수 회 반복할 것이다.
본 발명의 다른 양상에 따라, 다음을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는 탁수스 종으로부터 탁산을 수득하는 방법을 제공한다 :
탁수스 브레비폴리아(T. brevifolia), 탁수스 바카타(T. baccata), 탁수스 쿠스피다타(T. cuspidata), 탁수스 카나덴시스(T. canadensis), 탁수스 월리치아나(T. wallichiana), 탁수스 치넨시스(T. chinensis), 탁수스 퓨나네시스(T. funanesis), 탁수스 엑스 메디아 오브이. 덴시포름미스(T.X media ov. densiformis) 및 탁수스 엑스 메디아 오브이. 힉시(T.X media ov. Hicksii).
이러한 방법은 잔류물을 함유하는 탁산을 얻기 위해 알콜성 추출물을 농축시킨 알콜성 용매를 사용하여 원료 물질을 추출하는 단계, 물과 CH2Cl2사이에서 분리된 잔류물을 분배하는 단계, 그리고나서 CH2Cl2를 농축시키는 단계를 포함한다.
탁산이 풍부한 잔류물을 얻기 위한 해결책으로, 건조 크로마토그래피 컬럼에서, 탁산이 풍부한 잔류물을 건조 컬럼 분배 크로마토그래피에 사용하여 탁산을 탁산 함유 분획으로 분할하였으며 컬럼으로부터 각각의 모든 탁산을 회수하였다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 를 수득하기 위해 알콜성 용매로 탁산-함유 용액에서 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 를 결정화하는 단계 및 정상 컬럼 분배 크로마토그래피에 의해 파클리탁셀-함유 용액을 정제하는 단계에 의해 파클리탁셀 및 바카틴 Ⅲ 는 좀 더 정제될 것이다.
본 발명의 이점은 신속하고 수행하기 편리하며 비용-효율적이고 효과적이며 소규모 및 대규모 생산에도 적합한 탁산을 분리하는 방법을 제공하는데 있다.
발명의 실행 방법
본 발명의 출발물질은 탁수스 종, 특히 탁수스 카나덴시스로부터 선택한 식물 물질이다.
탁산은 탁수스의 껍질, 침엽, 뿌리, 줄기 및 목재 또는 그것의 혼합물로부터 수득할 수 있다. 바람직하게, 그것의 가지 또는 침엽 또는 혼합물을 사용한다. 사용되는 바이오매스는 건조시킨것 이거나 신선한 것이다.
바이오매스를 분쇄하고 알콜, 바람직하게 메탄올과 같은 극성 용매로 추출하였다. 3 시간 동안 환류하에 추출을 지속하고 여과하였다. 다시 한 번 2 시간 동안 환류하에 잔류물을 추출하고 여과하였다. 추출물을 결합하고 증발시켜 원 부피의 약 5 % 로 농축시켰다. 이러한 농축물에서 파클리탁셀 함량은 HPLC 백분율 영역에 0.2 % 와 0.3 % 사이이다. 약 2 동량(equal amount)의 물을 농축물에 첨가하였다. 수용액을 디클로로메탄으로 여러 번 추출하고 나서 수용층을 버렸다. 유기층을 소형 부피로 농축시켰다. 이러한 잔류물내의 파클리탁셀 함량은 약 1 % 이다. 잔류물을 건조 컬럼 분배 크로마토그래피에 사용하였다.
건조 컬럼 크로마토그래피(DCC)는 박층 크로마토그래피(TLC) 및 정제 컬럼 크로마토그래피에 대한 대안적 방법을 제공한다. 비용은 정제 액체 크로마토그래피(LC)의 비용과 비교하여 훨씬 저렴하다. 실리카 겔 또는 중성 알루미나 TLC 플레이트 상에서 분리가능한 시료 또한 DCC 에 의해 분리할 수 있다. DCC 의 이점 중에 하나는 TLC 에서 DCC 으로의 조건의 직접적인 변이가 가능하다는 것이다. DCC 상에서 시료를 분리하기 위한 조건을 결정하기 위해 행해진 모든 과정을 TLC 플레이트 상에서 예비적으로 행하였다. 일단 결정되어 지면, 박층 플레이트 상에서 수득한 것과 유사한 정도로 분리할 수 있는 DCC 에 이러한 조건들을 적용할 것이다. 수집하려는 분획이 다량(>50) 필요한 "액체-유동(liquid-flow)" 컬럼과는 대조적으로, DCC 의 처리하려는 분획의 수는 일반적으로 15 개를 초과하지 않으며, 가장 일반적으로 10 개의 분급을 초과하지 않는 분급 수에 따라 결정되는 또다른 이점을 제공한다. DCC 의 또다른 이점은 컬럼으로서 나일론 튜브 및 단순화된 탐지와 분리 과정을 제공하는 형광 흡착제를 사용한다는 것이다. 그러므로, "액체-충전(liquid-filled)" 컬럼 크로마토그래피와는 대조적으로, 건조 컬럼 크로마토그래피는 일반적으로 신속하고 용이하며 비용이 저렴한 기술이다.
건조 컬럼 크로마토그래피에 관한 방법은 일반적으로 "Progress in Separation 및 Purification", Marjorie, M., E.S. Perry 및 C.J. Van OssEd., John Wiley & Sons, 1970. Volume 3, pages 73 - 95 에 기재되어 있다.
간략하게, 건조 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 일반적인 과정에는 나일론 튜브를 포함한 컬럼의 사용이 포함되며 유리와 같은 다른 형태의 튜브 또한 사용할 것이다. 이 튜브를 밤새 아세톤에 두고 모든 용매를 제거하기 위해 공기 건조시켰다. 튜브의 한 쪽 끝을 막고 다른 쪽 끝으로부터 면 또는 유리 솜으로 만든 소형 패드를 삽입함으로써 컬럼을 제조하였다. 샐 구멍을 만들기 위해 튜브의 막은 끝 부분에 구멍을 뚫었고 클램프에서 똑바로 설 수 있을 만큼 충분하게 튜브가 견고해질 때까지 삼산화알루미나 또는 실리카 겔로 튜브를 건식 충전시켰다. 시료를 직접 튜브에 붓거나 전개에 사용하려는 소량의 용매에 용해시키고 나서 컬럼의 상층부 상에 균일하게 분배하였다. 선택적으로, 시료를 소량의 흡착제 위에서 코팅시키고, 건조시켰으며 분쇄한 다음에 컬럼의 상층부에 첨가하였다. 용리 용매와 함께 시료를 컬럼에 통과시켰다. 약 1 내지 2 센티미터의 용매의 일정한 액체 헤드(head)는 항상 유지시켜야 한다. 컬럼이 절대로 건조되지 않도록 하였다.
본 발명의 방법은 바람직한 화합물의 분리를 완료하기 위해 3 내지 약 5 시간이 소요됨이 밝혀졌다. 일반적인 소규모의 실험 과정보다분리 시간이 느리다. DCC 는 또한 분리를 완료하는데 소요되는 3 내지 5 일이 걸리는 "액체-충전" 크로마토그래피보다 빠른 기술이다. 혼합물을 컬럼에 통과시켰을때 분리가 되었다. 혼합물이 컬럼의 바닥에 도달했을때, 전개는 정지되었고 컬럼의 끝부분을 막았다. 추출물의 다양한 성분은 예를 들어, UV 또는 가시 방법에 의해 탐지할 수 있는 분리 밴드로 확인할 수 있다. 그리고나서 컬럼을 바람직한 절편으로 자르고 적절한 용매로 순수한 화합물을 용리시켰다.
나일론 컬럼을 사용하여 본 발명을 최상으로 실행하였다. 삼산화알루미나 또는 실리카 겔은 적절한 지지체(Supporting agent)이며, 본원에서는 실리카 겔이 바람직하다. 흡수 크로마토그래피에서, 실리카 겔은 용질의 극성기와 결합하는 수산화시릴기(-SiOH)를 함유한다. 따라서 좀더 극성을 띠는 화합물은 이보다 덜 극성을 띠는 화합물보다 컬럼을 따라 좀 더 천천히 이동한다. 역상 크로마토그래피에서, 실리카 겔의 표면은 용질의 비-극성기와 결합하는 다양한 작용기에 의해 변형되어 왔다. 따라서 좀 더 극성을 띠는 화합물은 이보다 덜 극성을 띠는 화합물보다 컬럼을 따라 좀 더 빠르게 이동한다. 역상 크로마토그래피는 정상 크로마토그래피 보다 비용이 많이 들며 많은 시간이 소비된다는 단점이 있다. 그러나 두 과정은 모두 흡수 크로마토그래피에 속한다.
정상 흡수 크로마토그래피는 파클리탁셀을 완전히 분리하지 못했으며, 조추출물에서 다수의 불순물 때문에 파클리탁셀의 최종 순도에 도달하도록 과정을 10 번 정도 반복할 필요가 있다.
본 발명에서 정상 분배 크로마토그래피라고 명명된 신규한 크로마토그래피를 사용하여 파클리탁셀 및 관련 탁산류를 분리하고 정제하였다.
이 분배 컬럼 크로마토그래피에서, 실리카 겔을 포름아미드로 전처리하였다. 실리카 겔의 (-SiOH)기가 -SiOH 기와 H-C=O-NH2기 사이의 수소결합이나 반데르발스 힘에 의해 (H-C=O-NH2)에 결합하였다. 그리하여 실리카 겔의 흡수 성질이 없어져 포름아미드(FAM)의 담체로만 사용되었다.
분리하려는 물질은 그것의 극성에 따라 포름아미드와 용리 용매 사이에 분배될 것이다. 이 크로마토그래피 작용은 정상 크로마토그래피와 유사하므로 좀더 극성인 화합물이 덜 극성인 화합물보다 컬럼을 따라 좀 더 느리게 이동한다.
건조 분배 컬럼 크로마토그래피 :
실리카 겔 또는 삼산화 알루미나를 하기의 방법에 따라 처리하였다 :
1) 사용하려는 실리카 겔을 Me2CO 에 용해된 여분의 10 % 내지 약 15 % FAM 과 혼합하고 실온에서 15 분간 교반한 다음 여과하였다. 용매를 회수하기 위해 여과액을 모았으며 잔류물을 제거하였다.
2) 그런 다음 실리카 겔을 건조하여 모든 용매를 제거하였다. 공기 건조된 실리카 겔을 준비하여 사용하였다.
습식 분배 컬럼 크로마토그래피 :
사용하려는 실리카 겔을 아세톤에 용해된 여분의 10 % 내지 15 % 사이의 포름아미드와 혼합하였다. 이 혼합물을 실온에서 15 분간 교반한 다음 컬럼에 부었다. 용매 헤드(head)의 1 ㎝ 내지 2 ㎝ 가 충전된 실리카 겔 베드에 거쳐질 때까지 여분의 용매를 컬럼을 통해 흘려보냈다. 컬럼의 상층부에 시료를 가하기 전에 몇 시간 동안 이 컬럼을 실온에서 유지시켰다.
나일론 컬럼을 사용하여 본 발명을 가장 잘 실행할 수 있다. 삼산화 알루미나 또는 실리카 겔은 담체로 적절하며 실리카 겔이 바람직하다.
실리카 겔은 일반적으로 표면 주위에 -SiOH 기능기를 가지고 있다. 실리카 겔이 H-C=O-NH2(포름아미드)로 전처리됐을 때 SiOH 기능기와 포름아미드 사이에 몇몇 다른 상호작용하는 힘 뿐만 아니라 몇몇 수소결합이 형성되며, 그 결과로 실리카 겔은 더이상 흡수 성질을 가지지 않으며 오직 포름아미드의 담체로만 사용된다. 실리카 겔 입자의 표면에, 고정상이라고 명명되는 포름아미드의 아주 얇은 필름이 형성되었다.
이 분배 크로마토그래피는 전통적인 흡수 크로마토그래피와 상이하다. 전통적인 흡수 크로마토그래피에서 계는 흡착제(고정상), 용리 용매(유동상) 및 용질로 구성되었으므로 이 계는 3 가지 성분계이다. 분배 크로마토그래피에서, 크로마토그래피계는 지지체(담체), 극성 용매(고정상), 용리 용매(유동상) 및 용질로 이루어졌으므로 이 계는 4 가지 성분계이다.
상기 두 크로마토그래피계에서의 분리 메카니즘은 차이가 있다.흡수 크로마토그래피에서, 고정 베드를 따라서 시료 성분이 이동하는 동안 흡착/탈착 단계를 반복한 결과 물질이 분리되며 각각의 시료 성분의 흡착/탈착 평형 상수 차이에 의해 분리하였다.
분배 크로마토그래피에서, 분리하려는 물질은 두 불용성 액체상의 분배 차이에 의해 분리되며 각각의 시료 성분의 두 불용성 액체상에서 분배 상수 차이에 의해 분리하였다.
일반적으로, 분배 크로마토그래피를 당, 펩티드, 글리코시드 및 그외 극성 화합물과 같은 극성 화합물을 분리하는데 사용하였다.
본 발명에서, 분배 크로마토그래피가 정상 및 역상 크로마토그래피를 포함하는 흡수 크로마토그래피보다 탁산 디테르펜을 더 잘 분리한다는 것이 발견되었다.
본 발명은 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 의 분리를 위해 전처리된 실리카 겔로 건조 충전된 나일론 컬럼을 사용하여 가장 잘 실행할 수 있다. 실리카 겔은 150 메쉬 내지 250 메쉬 사이의 마이크로스피어 크기를 갖는다. 컬럼의 지름은 12 인치 × 120 인치이다. 필요한 실리카 겔의 양은 시료에 의해 차례로 결정된다. 본 발명의 건조 컬럼 분배 크로마토그래피 분리를 실시할 때, 탁산을 분리하기 위한 시료의 양에 대해 필요한 실리카 겔의 양의 비의 범위는 1 : 15 내지 1 : 20 사이이며, 바람직하게는 1 : 20 임을 발견하였다. 그러므로, 필요한 실리카 겔의 양은 약 15 내지 20 배이며, 바람직하게는 시료 양의 20 배이다. 상기 비는 비용 및 분리 정도에 관해 최적임이 발견되었다. 사용된 실리카 겔의 양의 증가는 대규모 방법에서 실질적인 비용을 증가시킬 것이다. 반면에, 실리카 겔 양을 감소시키면 분리가 잘 안될 것이다.
본 발명에는 본 발명에 적합한 조건 및 건조 컬럼 분배 크로마토그래피 기술이 기재되어 있으며, 본 발명에 따라 탁산을 분리하는 방법의 바람직한 실험은 다음과 같다.
컬럼의 상층부에 조추출물을 채우고 여기에 헥산 및 아세트산에틸의 혼합물(4 : 6)을 첨가하여 디클로로메탄 조추출물을 각각의 탁산으로 분리하였다. 용매가 컬럼의 바닥에 다다르면, 용리를 멈추고 나일론 튜브를 잠근 뒤 컬럼을 다양한 절편으로 절단하였다. 절단된 절편의 화합물을 알콜 즉, 메탄올과 같은 극성 용매로 세척하였다. 각각의 탁산을 TLC 로 확인하였다.
13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 를 메탄올로부터 결정화하여 수득하였다. 결정화를 일반적으로 실온에서 밤새도록 지속하였다.
파클리탁셀을 하기와 같이 정제하여 다른 탁산류에서 분리하였다. 분획을 TLC 로 분석하였다. 10 % H2SO4에탄올 용액을 분무함에 의해 TLC 플레이트에 파클리탁셀은 녹자색의 점으로 보여지며 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 는 암녹색의 점으로 보여진다.
파클리탁셀 함유 분획을 결합하였으며 건조시켜 농축하였고 잔류물은 CH2Cl2에 용해하였다. CH2Cl2용액을 습식 컬럼 분배 크로마토그래피로 정제하였다. 150 메쉬 내지 250 메쉬 사이의 마이크로스피어 크기를 가지며 30 p.s.i 압력에서 작용하는 전처리된 실리카 겔로 컬럼을 충전하였다. 본 발명에 유용한 용리액은 헥산 및 아세트산에틸 혼합물 또는 헥산 및 아세톤과 같은 크로마토그래피의 표준 텍스트에서 선택할 수 있다.
헥산 및 아세트산에틸의 비가 약 5 : 5 내지 3 : 7 인 헥산 및 아세트산에틸의 기울기 용매계는 밀접하게 관련된 탁산류로부터 파클리탁셀을분리하는 목적에 특히 유용함이 발견되었다. 탁산 함유 분획을 컬럼에서 수집하고, 파클리탁셀 함유 분획을 결합시키고 용매를 제거하기 위해 농축하였다. 잔류물을 메탄올에 용해하여 약 30 % 당량의 물을 첨가하였다. 수용액을 실온에서 밤새도록 유지시키고 여과하여 결정을 형성하고 70 ℃ 의 진공 오븐에서 건조시켰다. 파클리탁셀을 크림색의 분말 형태로 수득하였다.
바카틴 Ⅲ 함유 분획을 결합시키고 건조를 위해 농축하였다. 잔류물을 메탄올에 용해시켰다. 메탄올 용액을 밤새도록 냉각기에 넣어놓았다. 바카틴을 백색의 결정으로 수득하였으며 이 고체를 소량의 아세톤으로 용해시켜 다시 재결정화하였다. 아세톤 용액을 같은 양의 헥산으로 희석하고 그 혼합물을 실온에서 밤새도록 유지시켜 바늘 모양의 백색 결정 형태로 바카틴 Ⅲ 를 수득하였다.
실시예 1
산업용 다기능 추출기내에서 탁수스 카나덴시스의 건조되고 분쇄된 침엽 및 작은 가지 약 350 ㎏ 에 메탄올 1200 리터를 첨가하였다.혼합물을 3 시간 동안 환류시키고 여과하였다. 그런 다음 정제하지 않은 물질을 메탄올 900 리터와 함께 2 시간 동안 환류시킨 후 메탄올 용액을 다시 여과하였다. 여과액을 결합시키고 진공 상태의 분무 증발기에서 약 150 리터로 농축시킨 후 1 당량의 물을 이 농축물에 첨가하여 희석시켰다. 수용액을 전기 교반기를 갖춘 1000 L 반응기내에서 물과 염화 메틸렌(450 L, 1 : 1) 사이에 첨가하였다. 혼합물을 80/분의 속도로 5 분 동안 교반한 후 실온에서 1 시간 동안 또는 혼합물이 두 층을 이룰 때까지 유지하였다. 유기층을 수집하고 수성층을 염화 메틸렌(각 200 리터씩) 400 리터로 두 번 이상 추출하였다. 염화 메틸렌 용액을 진공 상태하에서 두 개의 사이클론 분리기를 갖춘 얇은 필름 증발기에서 결합시키고 농축시켜 슬러리 형태가 되게 하였다.
실시예 2
전기 교반기를 갖춘 500 리터 혼합기내에 있는 실리카 겔 약 70 ㎏ 에 아세톤에 용해된 15 % 포름아미드 250 리터를 첨가하고 그 혼합물을 실온에서 15 분 동안 교반한 후 30 분 동안 실온에서 유지시키고 여과하였다. 고체 실리카 겔을 수집하여 경사 건조기(shelve dryer)에서 공기 건조시키고 여과물을 용매, 아세톤 및 여분의 포름아미드를 회수하기 위해 농축하였다.
실시예 3
건조 컬럼 분배 크로마토그래피
실시예 2 의 전처리한 실리카 겔을 약 0.1 ㎜ 두께의, 지름이 9 인치 × 120 인치인 나일론 튜브에 충전시켰다. 사용된 실리카 겔은 150 메쉬 및 250 메쉬 사이의 마이크로스피어 크기를 갖는다. 그런 다음 나일론 컬럼을 같은 크기의 강철 컬럼내로 위치시켜 나일론 컬럼의 무게를 지탱하게 하였다. 헥산 및 아세트산에틸의 혼합물(4 : 6)을 용리액으로 사용하였으며 포름아미드에 용해되지 않는 다른 유기 용매를 사용하기도 한다.
실시예 1 의 시료(6 ㎏, 약 70 % 고체 질량)를 아세트산에틸 5 리터로 희석시킨 후 나일론 컬럼 상층부에 위치시키고 건조 컬럼 분배 크로마토그래피에 이 컬럼을 사용하였다.
액체 헤드가 언제나 1 내지 2 ㎝ 로 일정하게 유지되도록 헥산 : 아세트산에틸(4 : 6)로 조심스럽게 컬럼을 전개하였다. 컬럼의 바닥에 용리액이 도달하면 더이상의 컬럼 전개를 중단하였다. 나일론 컬럼을 강철 컬럼에서 꺼낸 후 15 개 부분으로 절단하였다. 각부분을 TLC 분석으로 조사하였다(에탄올에 용해된 10 % H2SO4를 시료에 분무한 후 2 분 동안 100 - 105 ℃ 로 가열하였다). 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 및 바카틴 Ⅲ 가 파클리탁셀보다 컬럼을 따라 더 빨리 이동하며 분배 크로마토그래피에서의 크로마토그래피 작용이 정상 흡수 크로마토그래피와 상이하고 역상 흡수 크로마토그래피와 유사함을 발견하였다.
13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ, 바카틴 Ⅲ 및 파클리탁셀 함유 부분을 6 인치의 짧은 유리 컬럼에 위치시키고 각각 메탄올로 세척하였다. 메탄올 용액을 수집한 후 각각 건조시키기 위해 농축하였다.
13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 부분 잔류물을 소량의 메탄올(60 ℃ 에서 잔류물을 용해시키기에 충분한 양)에 용해시키고 메탄올 용액을 실온에서 식힌 다음 실온에서 밤새도록 유지하였다. 형성된 결정을 여과하고 아세톤으로 세척한 다음 진공 상태에서 80 ℃ 의 오븐에 건조시켜 바늘 모양의 결정으로 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 를 생산하였으며 이를 NMR 분광학으로 확인하였다.
실시예 4
정상 흡수 크로마토그래피
실시예 3 의 바카틴 함유 부분 잔류물을 소량의 디클로로메탄(용매를 가온할 때 물질을 용해시키기에 충분한 양)으로 용해시킨 후 디클로로메탄 용액을 정상 속성 크로마토그래피에 사용하였다. 10 ㎝ × 150 ㎝ 유리 컬럼을 사용하였다. 실리카 겔(150 메쉬 및 250 메쉬)을 컬럼에 충전시켰다. 헥산 및 아세톤의 감소하는 기울기계(70 : 30 에서 시작하여 45 : 55 까지 진행시킴)를 용리 용매로 사용하였다. 1000 ㎖ 의 분획을 수집하였다. 바카틴 Ⅲ 함유 분획을 결합시키고 건조를 위해 농축시켰다. 잔류물을 메탄올 1000 ㎖ 에 용해시키고 실온에 밤새도록 보존하였다. 몇몇의 백색 결정이 형성되었다.결정을 여과하고 메탄올로 재결정화하였다. 백색 결정 23 g 을 수득하였으며 바카틴 Ⅲ 의 HPLC 참조 표본과 비교하여 확인하였다.
실시예 5
정상 분배 크로마토그래피
실시예 3 의 파클리탁셀 함유 부분을 소량의 아세트산에틸에 용해시키고 소량의 헥산으로 희석하였다. 실리카 겔 20 ㎏ 을 실시예 1 에서 기술한 바와 같이 처리한 뒤 헥산 및 아세트산에틸(6 : 4)의 혼합 용매 40 리터와 혼합한 다음 이 혼합물을 15 ㎝ × 150 ㎝ 저압 컬럼에 부었다. 컬럼의 상층부에 용매 헤드 1 ㎝ 가 남아있을 때까지 여분의 용매를 흘려보냈다. 시료 용액을 실리카 겔 베드의 상층부에 조심스럽게 첨가하였다. 그런 다음 헥산 및 아세트산에틸의 기울기 용매계(6 : 4 로 시작하여 3 : 7 로 완료함)로 컬럼을 용리시켰다. 각각 2000 ㎖ 의 분획을 수집하였으며 유속은 75 ㎖/분 및 100 ㎖/분 사이였다.
파클리탁셀 함유 분획을 결합시키고 용매 대부분을 제거하기 위해 농축시킨 후 잔류물을 메탄올(1500 ㎖)에 용해시켰다. 메탄올 용액에 약 30 % 부피의 물을 첨가한 다음 이 수용액을 5 ℃ 에서 밤새도록 보존하였다. 메탄올 수용액으로부터의 정제되지 않은 결정 고체를 여과하고 진공 상태하에서 70 ℃ 및 80 ℃ 사이의 온도로 밤새도록 건조시켰다. 이 고체는 약 70 % 의 파클리탁셀 및 23 % 의 세팔로마닌 및 다른 탁산류로 구성되었다. 생산량은 66 g 이었다.
실시예 6
거대망상 흡착 수지 흡수 크로마토그래피(Macroreticular Adsorbent Resin Absorption Chromatography)
실시예 5 의 정제하지 않은 파클리탁셀 약 50 g 을 아세톤 350 ㎖ 에 용해시킨 후 폴리메타크릴레이트-디비닐 벤젠 공중합체 수지 200 g 과 혼합하였다. 이 혼합물을 둥근 바닥 플라스크안에 넣은 후 회전 증발기에서 증발시켜 아세톤을 제거하였다. 그런 다음 코팅된 물질을 저압 정제 컬럼의 상층부에 위치시켰다. 컬럼의 크기는 100 ㎝ × 150 ㎝ 이며 폴리메타크릴레이트-디비닐 벤젠 공중합체 수지로 충전하였다. 중합체 수지 입자 크기는 75 ㎛ 및 150 ㎛ 사이이다. 공중합체 수지를 Amberlite®IRP64 로부터 제조하였다. 시료를 컬럼 상층부에가한 후 입구를 봉쇄하고 아세톤 및 물의 용매 혼합물의 단계 기울기(아세톤 : 물을 3 : 7 로 시작하여 65 : 37 로 완료함)로 용리시켰다. 컬럼을 30 p.s.i 의 압력하에서 작용시켰다. 용매의 변화를 분획의 TLC 및 HPLC 분석 결과에 기인하여 측정하였다.
약 1000 ㎖/each 의 분획을 수집하여 TLC 및 HPLC 분석으로 측정하였다. 유속은 100 ㎖/분 이었다. 파클리탁셀 함유 분획을 결합시키고 화합물의 결정화가 완료될 때까지 5 ℃ 에 유지시켰다.
결정을 여과하고 물에 용해된 65 % 메탄올로부터 재결정화하여 99 % 이상의 순도를 가지는 백색 결정(30.5 g)을 생산하였다. 파클리탁셀의 확인은 다음과 같다 :
실시예 7
미국 특허 제 5,969,165 호의 방법을 이용하여 브롬화를 실행하였다.
실시예 5 의 정제되지 않은 파클리탁셀(10 g)을 디클로로메탄 100 ㎖ 에 용해시키고 이 디클로로메탄 용액을 500 ㎖ 삼구 둥근 바닥 플라스크안에 쏟아부었다. 용액을 실온에서 몇 분간 교반한 후 5 당량의 브롬(세팔로마닌에 대한 브롬의 5 당량 몰 정량)을 1 시간 동안 점적하여 첨가하였다. 반응물을 반응이 완료될 때까지(약 2 - 3 시간) 실온에서 교반하여 TLC 분석으로 측정하였다. 반응이 완료되면, 용액을 CH2Cl2300 ㎖ 에 희석시키고 분리 깔때기에 부었다. 10 % 수용성 티오황산나트륨(Na2S2O3) 300 ㎖ 를 용액에 첨가하여 여분의 브롬(Br2)을 흡수하였다. 디클로로메탄층을 분리하여 물 및 염수로 세척한 후 진공 상태하에서 농축하고 건조시켜 연갈색의 분말을 생산하였다.
실시예 8
분배 크로마토그래피에 의한 파클리탁셀의 분리
실시예 7 의 정제되지 않은 반응물(10 g)을 아세트산에틸 50 ㎖ 에 용해시킨 후 헥산 50 ㎖ 로 희석하였다. 시료 용액을 저압 유리 컬럼(5×100 ㎝)의 상층부에 첨가하였다. 전처리한 실리카 겔로 컬럼을 충전시켜 분배 컬럼 크로마토그래피에 사용하였다. 실시예 5 에서 사용된 것과 유사한 기구 및 방법을 사용하여, 99 % 이상의 순도(HPLC 백분율 영역에 의해)를 가지는 백색의 바늘 모양 결정으로 파클리탁셀을 최종적으로 수득하였다. 생산량은 6.1 g 이었다.
본 발명의 실시형태가 상기에 기술되었지만, 이에 제한되지 않으며 본 발명에서 청구되고 기술된 의도, 본질 및 범위를 벗어나지 않는 한에 있어서 본 발명의 많은 변형된 형태가 본 분야의 숙련자에게 자명할 것이다.
본 발명은 약용 화학 분야에서 이용가능하다.

Claims (15)

  1. 탁산 화합물을 함유하는 원료(source)로부터 탁산 화합물을 분리하는 방법에 있어서,
    탁산 화합물을 함유하는 원료를 준비하는 단계 ;
    이 탁산 화합물을 유기 용매내로 추출하는 단계 ;
    분배 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 단계 ;
    상기 건조 분배 컬럼으로 탁산 화합물을 용리하는 단계 ; 및
    용리된 탁산 화합물을 분리하는 단계
    를 포함함을 특징으로하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 탁산의 상기 원료는 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 탁수스 바카타(T. baccata), 탁수스 쿠스피다타(T. cuspidata), 탁수스 카나덴시스(T. canadensis), 탁수스 월리치아나(T. wallichiana), 탁수스 치넨시스(T. chinensis), 탁수스 퓨나네시스(T. funanesis), 탁수스 엑스 메디아 오브이. 덴시포름미스(T.X media ov. densiformis) 및 탁수스 엑스 메디아 오브이. 힉시(T.X media ov. Hicksii) 중에서 적어도 하나를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 분리된 상기 화합물 중 적어도 하나는13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 분배 크로마토그래피 컬럼은 건조 분배 크로마토그래피 컬럼을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 분배 크로마토그래피 컬럼은 습식 분배 크로마토그래피 컬럼을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 유기 용매는 디클로로메탄을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 분리된 상기 화합물 중 적어도 하나는 파클리탁셀을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  8. 탁산 화합물을 함유하는 원료(source)로부터 탁산 화합물을 분리하는 방법에 있어서,
    탁산 화합물을 함유하는 원료를 준비하는 단계 ;
    이 탁산 화합물을 유기 용매내로 추출하는 단계 ;
    분배 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 단계 ;
    상기 컬럼내에 담체 물질을 사용하는 단계 ;
    용리액을 사용하는 단계 ;
    상기 건조 분배 컬럼에서 상기 용리액으로 탁산 화합물의 원료를 용리하는 단계 ;
    적어도 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ, 바카틴 Ⅲ 및 파클리탁셀을 용리하는 단계 ; 및
    상기 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ, 바카틴 Ⅲ 및 파클리탁셀을 분리하는 단계
    를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 메탄올로 상기 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ, 바카틴 Ⅲ 및 파클리탁셀을 세척하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 분리 단계는 상기 바카틴 Ⅲ 를 디클로로메탄에 용해시킴을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 정상 속성 크로마토그래피 컬럼에서 디클로로메탄에 용해된 상기 바카틴 Ⅲ 를 용리시킴을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 헥산 및 아세톤을 함유하는 용리액을 사용함을특징으로 하는 방법.
  13. 제 8 항에 있어서, 분리 단계는 상기 파클리탁셀을 아세트산에틸 및 헥산의 용액에 용해시킴을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 저압 정제 컬럼에서 파클리탁셀을 함유하는 상기 용액을 용리시킴을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 8 항에 있어서, 탁산의 상기 원료는 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 탁수스 바카타(Taxus baccata), 탁수스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 탁수스 카나덴시스(Taxus canadensis), 탁수스 월리치아나(Taxus wallichiana), 탁수스 치넨시스(Taxus chinensis) 및 탁수스 퓨나네시스(Taxus funanesis) 중에서 적어도 하나를 포함함을 특징으로 하는 방법.
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