KR20020080504A

KR20020080504A - 돼지 설사병 저항성 유전자 검정방법

Info

Publication number: KR20020080504A
Application number: KR1020010019282A
Authority: KR
Inventors: 최윤재; 조광근; 이승호; 김철욱
Original assignee: 최윤재; 조광근; 이승호
Priority date: 2001-04-11
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2002-10-26
Also published as: KR100432588B1

Abstract

본 발명은 돼지 설사병 저항성 유전자 검정방법에 관한 것으로, 돼지의 설사를 일으키는 독성Escherichia coliF18 미생물이 결합하는 장상피세포에 존재하는Escherichia coliF18 receptor에 대한 저항성과(resistance) 민감성(susceptibility)을 검정하고, 돼지의 돌연변이 유무를 확인하기 위하여FUT1유전자에 대한 프라이머(primer)를 제작하여 PCR로 증폭한 후 전기영동한 결과, 질병 저항성 돼지 유전형질을 단시간에 간단히 확인할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

돼지 설사병 저항성 유전자 검정방법{Detection method of resistance gene against diarrhea disease in pork}

본 발명은 돼지 설사 저항성 유전자에 대한 돌연변이 유무 확인용 프라이머를 제작하고 이 프라이머를 사용하여 설사 저항성 돼지를 검정하는 방법에 관한 것이다. 상기방법은 돼지의FUT1유전자 염기서열중에서 돌연변이가 일어난 부위에 대한 돌연변이 유무 확인용 프라이머를 제작하고 PCR로 증폭하여 전기영동한 후 유전자형(genotype)을 확인함으로써 경제적인 방법으로 짧은 시간에 돼지의 질병(설사) 저항성 돼지를 검정하는 방법을 말한다.

생후 4-12주령의 자돈은 부종병(Oedema disease,Escherichia colienterotoxemia; 대장균성 장성중독증), 이유후 설사병(enteric colibacillosis, 대장성 대장균증)과 같은 질병이 발생하여 양돈 농가에게 상당한 경제적 손실을 초래한다. 독일에서 발표된 자료에 의하면 이유자돈의 대장균성 폐사돈은 전체의 1.8%에 달하며, 이러한 현상을 스위스에서 사후 부검을 통하여 확인한 결과 4-12 주령된 자돈의 전체 폐사율 중에서 부종병은 22%, 설사병은 38%로 확인되었다. 스위스 Landrace와 Large White의 경우 이들 병원균에 대한 저항성을 가진 돼지는 전체의 5-10% 이하인 것으로 나타났다. 이러한 부종병의 전형적인 임상적 증상은 운동실조증(ataxia), 경련(convulsion), 마비(paralysis)와 같은 신경성 증상을 나타낸다. 부종병에 걸린 자돈을 사후 부검을 해 보면 결장간막, 위장 벽, 얼굴 앞면, 눈꺼풀 등에서 일반적인 증상이 발생하며, 이러한 질병의 원인은 소장의 상피세포에서 부착성 대장균이 생산한 장독소 LT, STa, STb 혹은 Shiga-like toxin-Ⅱ에 의하여 발생한다. 1990년 Bertschinger 등은 자돈의 부종병을 일으키는 원인균은 혈청형(serogroup) O139:K12(B):H1을 가진 대장균의 섬모가 장상피세포에 부착한다고 보고하였으며, 이들이 가지는 섬모들을 F107로서 명명하였다(Vogeli 등, Animal Genetics. 27:321-328. 1996). 그후 많은 혈청학적검사와 혼성화 방법으로 확인한 결과 부종병과 이유시 설사병에 있어서 F107 섬모를 가진 많은 다른 용혈성 균주(혈청형 O138, O139, O141, O147, O157)가 매우 높은 비율로 존재하며, 일부 O16과 O108의 혈청형도 존재하는 것으로 보고되었다. 1995년 Rippinger 등은 InternationalEscherichia&KlebsiellaCenter와 함께 이들 대장균들을 F18로 다시 명명하였다.

혈청학적 검사에 의하면 섬모 F18은 항원결정인자 a, b, c를 가지고 있으며, F18ab와 F18ac는 두 개의 변종을 의미한다. F18ab(혈청형 O139:K12:H1)에 대한 자돈의 표현형은 F18ab⁺대장균이 장상피세포에 부착하는 민감형(susceptibility)과 부착하지 못하는 저항형(resistant) 2가지가 있으며, 민감형의 자돈은 우성 대립인자 B를 가지며, 저항형의 자돈은 열성대립인자 b를 가지고 있는 것으로 확인되었다. 실제로 F18ab(혈청형 O139:K12:H1)를 자돈의 구강을 통하여 감염시키면 민감형은 폐사되고 저항형은 별다른 질병을 일으키지 않는 것으로 나타났다.

이렇게 자돈이 2가지 표현형의 차이를 보이는 것은 열성인자 b를 가진 표현형이 F18ab 대장균이 결합하는 장상피세포 부착(brush border adhesion) 당단백질수용체(glycoprotein receptor)의 표면당(surface carbohydrate)에 변화가 있기 때문이다.

세포 표면당의 변화는 당화(glycosylation) 과정의 변화를 대변하는 것으로서 일반적으로 내형질세망(endoplasmic reticulum)과 골지체(Golgi apparatus)에 존재하는 당전이효소(glycosyltransferase)의 posttranslational modification 기능에 의하여 일어난다. 당화에 관여하는 100 종류 이상되는 효소중 현재까지 약 20 종류가 클로닝 되었는데, 이들 효소의 발현수준이 낮거나 효소 기능에 이상이 있으면 당화 과정에 변화가 발생한다.

돼지의 대장균 F18ab 수용체(ECF18R)의 유전적 좌위는 6번 염색체(SSC6)에 존재하며, S 좌위와 Halothane(HAL) linkage group과 밀접한 연관이 있는 것으로 맵핑(mapping) 되었다. S 좌위가S ^s S ^- 일 때 혈액형 A-O blood group system의 발현은 억제된다(Meijerink 등, Mammalian Genome. 8:736-741, 1997). 마찬가지로 사람에서도 ABO와 Lewis(Le) blood group system은 blood groupH와 Secretor(Se) 좌위에 의해서 영향을 받는다. 만약 이들 좌위의 유전자들이 불활성화 변이(inactivating mutation)가 일어나면 H 결정인자 전구체의 발현이 억제되어 결국 A, B와 Le^b의 결정인자의 발현이 억제된다. 사람의 소장에 있는 Lewis 항원의 발현은 Lewis 유전자(α 1,3/4 fucosyltransferase)와 Secretor 유전자에 의해서 조절 받고 있다. Blood group H 유전자(FUT1)는 적혈구세포의 H 항원의 발현을 결정하고, Se 유전자(FUT2)는 분비상피세포나 침속의 H 항원 발현을 조절한다.

혈액형 항원의 탄수화물 구조는 일부 병원성 미생물의 접착성을 매개하는 역할을 한다. 예를 들면 헬리코박터 파이로리(Helicobactoer pylori)는 Lewis^bblood group 항원, 요도염을 일으키는 대장균은 P blood group 물질과 접착하게 된다. 따라서 혈액형 특이 탄수화물 구조를 결정하는 당전이효소(glycosyltransferase)는 박테리아의 접착성을 매개하는 유전자라고 볼 수 있다.

fucose 전이효소(α-1,2-fucosyltransferase;FUT1)는 특정 분자의 갈락토스 말단에 fucose를 α(1,2) 결합 방법으로 연결하는데, 이 효소는 medial Golgi에 존재하고 α(1,3) galactosyltransferase(GT)는 trans Golgi에 존재한다. 따라서 합성된 단백질이 골지체를 통과할 때 FUT1에 의해서 먼저 posttranslational modification을 받은 후 GT에 의해서 받게 된다.

돼지의 FUT1 유전자중에서 +307 염기 G가 A로 염기전위돌연변이(transition mutation)가 일어나면 알라닌(neutral nonpolar)이 트레오닌(neutral polar)으로 바뀌게 되어 이 효소의 기능에 이상을 초래하게 된다.

스위스 랜드레이스와 Large white의 경우ECF18R ^b (자돈 부종병과 이유후 설사병 저항 대립인자)와 M307^A와는 100% 연관이 있는 것으로 나타났는데, 이것은 돼지의 FUT1 유전자중에서 +307 염기 G가 A로 염기전위돌연변이(transition mutation)가 일어나면 자돈의 부종병과 이유후 설사병에 대하여 저항을 가지고 있다는 것을 의미한다. 더욱 중요한 것은 스위스 랜드레이스품종의 경우에서RYR1 ^T (스트레스 민감성 대립인자)가ECF18R ^b 의 93%를 차지하고 있는 것으로 나타났다. 부종병과 이유후 설사병 저항성을 가진 돼지를 선발하게 되면 그 돼지의 93%가 스트레스 민감성 돼지라는 것을 의미하는 것으로서 7%의 돼지만이 부종병 및 이유후 설사 저항성과 스트레스 저항성을 동시에 가지고 있다는 것을 의미한다. 따라서 돈육종시 이 두 유전자의 검사가 반드시 필요하고 동시에 이루어 져야 한다는 것을 알 수 있다.

그러나 종래에는 이러한 유전자형을 검사하기 위하여 돼지의 DNA를 주형으로 한 PCR-RFLP 방법을 수행함으로써 시간과 비용이 많이 소요되는 경향이 있었다(Vogeli, Animal Genetics. 27:321-328, 1996).

따라서 본 발명의 목적은 자돈 질병(설사) 저항성 유전자(FUT1)의 돌연변이 유무를 단시간 내에 경제적인 방법으로 확인하여 자돈 질병 저항성 자돈을 검정함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 질병 저항성 유전자(FUT1)의 돌연변이를 확인할 수 있는 프라이머를 제작하고 이 프라이머를 PCR로 증폭하여 질병 저항성 가축을 검정함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 돼지의 혈액, 조직, 털로부터 DNA를 추출한 후, Fut1 유전자의 서열중 특정 부위에 대한 Int 1(internal 1), Int 2(Internal 2), Ext 1(External 1), Ext 2(External 2: 단 모근 DNA을 주형으로 사용할 경우 Ext2-2 프라이머를 이용함) 프라이머 2쌍을 2가지 다른 방법으로 제작하고, Int 1 프라이머와 Ext 1 프라이머 쌍, Int 2 프라이머와 Ext 2 프라이머 쌍을 각각 다른 튜브에서 반응시켜 PCR을 행한 후, 전기영동으로 증폭된 DNA 단편의 사이즈 차이에 의한 유전자형을 확인함으로서 달성하였다.

도 1은 돼지의 fucose 전이 효소(α-1,2-fucosyltransferase) 유전자인FUT1유전자의 염기서열(a, b)이다.

도 2는 Internal 프라이머(Int1, Int2)와 external 프라이머(ext1. ext 2. ext2-2)의 위치와 이들의 반응에 의해 나타나는 PCR 산물의 밴드 크기(band size)를 나타낸 설명도이다.

도 3은 프라이머 제작에 대한 2가지 방법을 나타낸 설명도이다.

도 4는 혈액과 조직의 DNA를 주형으로 Int 1과 Ext 1 프라이머, Int 2와 Ext 2 프라이머를 각각 다른 튜브에서 반응시킨 후 전기영동을 실시한 전기영동 결과 사진도이다.

도 5는 모근의 DNA를 주형으로 한 Int 1과 Ext 1 프라이머, Int 2와 Ext 2-2 프라이머를 각각 다른 튜브에서 반응시킨 후 전기영동을 실시한 전기영동 결과 사진도이다.

본 발명은 돼지 혈액과 조직(꼬리, 귀), 모근으로부터 DNA를 추출하는 단계; PCR 프라이머 5개(Int 1, Int 2, Ext 1, Ext 2, Ext 2-2)를 2가지 다른 방법으로 제작하는 단계; 대립형질에 특이적인 밴드(allele-specific band)를 확인하기 위한 PCR을 수행하는 단계 및 전기영동으로 유전형(genotype)에 따라 차이가 나는 밴드를 확인하는 단계로 구성된다.

상기 단계에 있어서, 질병 저항성 돼지(돼지의 Fut 유전자의 +307염기에서 G가 A로 염기전위 돌연변이된 경우)를 검출할 경우 Int2, Ext 2(시료를 모근을 사용할 경우 Ext 2-2)프라이머를 사용하며, 질병에 저항성을 나타내지 못하는 돼지(돼지의 Fut 유전자의 +307염기에서 G가 A로 염기전위 돌연변이되지 않은 경우)를 검출할 경우 Int 1, Ext 1 프라이머를 사용한다.

이하 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1: 혈액으로부터 게놈 DNA추출

돼지로부터 채취한 혈액을 원심분리기로 8분간 원심분리한 후, 혈구와 혈장 사이에서 분리된 백혈구(buffy coat)를 1.5mL 튜브에 모았다. 모은 백혈구를 다시 14,000rpm으로 3분간 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 튜브에 1mL의 ddH₂O를 첨가한 후 즉시 50㎕ 5 x SSC를 넣어 잘 혼합하였다. 이어서, 14,000rpm으로 3분간 원심분리한 후, 2분간 14,000rpm으로 재원심분리하고 1mL 1 x SSC를 넣어 잘 섞어 준 후 2분간 14,000rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후에 500㎕ TE buffer와 35㎕ 20% SDS를 잘 혼합한 다음 5분간 방치하였다. 12㎕의 프로테아제 K (20mg/mL)를 첨가한 후 65℃에서 12시간 처리하였고 동량의 페놀처리를 거쳐 14,000rpm으로 7분간 원심분리한 다음 상등액을 다른 튜브에 모았다. 다음은 페놀:클로로포름(1:1), 클로로포름:아이소아밀알콜(24:1)을 처리하여 원심분리한 후, 상등액을 다른 튜브로 옮긴 후 0.1 볼륨의 3M 소디움 아세테이트(pH 5.0)와 1 볼륨의 이소프로판올을 가한 다음 잘 혼합하였다. 10분 동안 -20℃에 방치하였다가 10,000rpm으로 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 건조시킨 후 TE buffer(pH 8.0)에 녹였다.

실시예 2: 조직(꼬리, 귀)으로부터 DNA 추출

돼지로부터 채취한 조직(꼬리, 귀)을 소독된 가위로 잘게 분쇄(homogenization)하였다. 분쇄된 조직을 1.5mL튜브에 옮기고 700㎕의 용해용액(50mM Tris-Cl pH 8.0 100mM)에 부유시켰다. 시료에 20㎕ RNase(13㎍/mL)를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 처리하였다. 동량의 페놀로 처리하고 14,000rpm으로 7분간 원심분리한 후 상등액을 다른 튜브에 옮겼다. 페놀:클로로포름(1:1)으로 처리하고 클로로포름;아이소아밀알콜(24:1)로 처리한 후, 원심분리하고 상등액을 다른 튜브로 옮긴 후 0.1 볼륨의 3M 소디움 아세테이트(pH 5.0)와 1 볼륨의 이소프로판올을 가한 다음 잘 섞었다. 10분 동안 -20℃에 방치하였다가 10,000rpm으로 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 건조시킨 후 TE buffer(pH 8.0)에 녹였다.

상기 실시예1과 실시예2에서 추출한 DNA를 DNA 농도 측정기로 측정하여 PCR에 알맞은 농도(100 ng/㎕)로 희석하였다.

실시예 3: 모근으로부터 DNA 추출

돼지로부터 채취한 털(모근)을 소독된 가위로 모근 3-5 가닥을 1-2cm 가량 잘라서 이 부분 1.5mL 튜브에 옮기고 얼음에 10분간 정치시킨 620ul의 용해용액[0.5M EDTA(pH8.0) 120㎕+500㎕ Nuclei Lysis solution]에 부유시켰다. 시료에 튜브당 600㎕의 EDTA/Nuclei lysis solution을 첨가한 후 17.7㎕(20㎎/㎖)의 프로테아제 K(proteinase K)용액을 첨가하였다. 55-65℃에서 하룻밤 incubation 한후 3㎕ RNase solution을 첨가해서 10번 정도 위 아래로 섞은 후에 37℃에서 30분 동안 incubation하고 200㎕의 단백질 침전용액(protein precipitation solution)을 첨가하여 볼텍스로 섞어 얼음에 10분간 정치하였다. 원심분리를 통해 상층액을 다른 튜브로 옮긴 후 페놀:클로로포름:아이소아밀알콜 (25:24:1)을 처리하여 원심분리한 상층액을 다른 튜브로 옮겼다. DNA 용액에 0.1 볼륨의 3M 소디움 아세테이트(pH 5.0)와 1 볼륨의 이소프로판올을 가한 다음 잘 섞고 10분 동안 -20℃에 방치하였다가 10,000rpm으로 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 다음은 70% 알코올로 세척한 후 튜브당 30ul의 TE buffer(pH 8.0)에 녹인 후 10ul씩 PCR 반응에 사용하였다.

실시예 4: 프라이머 제작

프라이머 제작 과정은 다음과 같다. 도 1은 돼지의 질병 저항성 유전자(FUT1)를 나타내고 있다. 화살표가 가리키고 있는 915 bp 부분의 g가 a로 mutation 됨으로써 질병(설사) 저항성 돼지가 발생하게 된다. 따라서 915 bp 부분이 g가 a로 mutation 된 것을 확인하기 위하여 도 1과 같이 각기 다른 2가지 방법으로 프라이머를 제작하였고 프라이머 제작에 사용된 Internal 프라이머 1, 2와 External 프라이머 1, 2 염기서열은 도 1(a,b)에 이탤릭 글씨로 나타내었으며, 모근 genomic DNA 대상 External 프라이머는 혈액 genomic DNA 대상 External 프라이머 보다 가까운 거리에 위치해 있다. 도 2에서는 각각의 대립인자 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR 수행시 나타나게 되는 band의 크기를 나타내고 있다. 967 bp 부분의 g가 a로 mutation 되면 혈액의 경우 1054 bp가 만들어지며, g가 a로 mutation이 되지 않았을 경우 307 bp가 나타난다. 모근의 경우에는 g가 a로 mutation 되면 271 bp가 나타나고 g가 a로 mutation 되지 않으면 307 bp가 나타난다.

실시예 5: 혈액, 조직 DNA와 모근 DNA의 중합효소연쇄반응(PCR) 조건

대립형질 특이적인 밴드(Allele-specific band)를 확인하기 위해 실시한 PCR 조건은 표 1에 나타낸 바와 같다.

하기 N은 돼지의 Fut1 유전자 중 +307 염기에 g가 a로 변이되지 않은 유전자형(genotype), 즉 부종병과 설사병에 대한 저항을 가지지 못하는 형질을 나타내며, n은 g가 a로 변이된 유전자형(genotype) 즉 부종병과 설사병에 대한 저항을 가지는 형질을 나타낸다.

혈액, 조직 DNA와 모근 DNA의 중합효소 연쇄반응(PCR)조건

	N-specific AS-PCR 조건	n-specific AS-PCR 조건
혈액 조직 DNA의 경우	- 반응조건10x taq buffer: 2.5u, 10mM dNTP: 0.5ul, 5 unit taq: 0.2ul, 10pmol P1: 1ul, 10pmol P2: 1ul, templete: 100ng, 25mM MgCl₂: 2.5ul, DMSO: 2.5ul, ddH₂O: ? ⇒ 총 부피 : 25ul	- 반응조건:10x taq buffer: 2.5ul, 10 mM dNTP: 0.5ul, 5 unit taq: 0.2ul, 10pmol P1: 1ul, 10pmol P2: 1ul, templete: 100ng, 25mM MgCl₂: 2.5ul. DMSO: 1.25 ul, ddH₂O: ? ⇒ 총 부피 : 25 ul
	- PCR 사이클94℃: 2 분, 95℃: 15 초, 62℃: 20 초 72℃: 40 초 ⇒ 38 회 반복 ⇒ 72℃: 5 min, 4℃: ∞	- PCR 사이클94℃: 2 분, 95℃: 15 초, 66℃: 20 초, 72℃: 1 분 ⇒ 32회 반복 ⇒ 72℃: 5 분, 4℃: ∞
	N-특이적인 Primer5'-CGGCCGTTGAGCTGTGC-3'--------Int 15'-GCCGCCACCTCTGTCTGACCTTC-3'--Ext 1	n-특이적인 Primer5'-TGCCACGCTGCTGGCCCGGA-3'------Int 25'-AAGCGTCTCCAGACATTGCCAGCC-5'--Ext 2
모근 DNA의 경우	N-특이적인 AS-PCR반응조건은 혈액·조직의 genomic DNA를 이용한 조건과 동일	- 반응조건10x taq buffer: 2.5ul, 2.5 mM dNTP: 2 ul, 5 unit taq: 0.2ul, 10 pmol P1: 1ul, 10pmol P2: 1ul, templete: 10ul in 30ul, DMSO: 1.25 ul, ddH₂O: ? ⇒ 총 부피: 25 ul
	N-특이적인PCR 사이클은 혈액·조직의 genomic DNA를 이용한 조건과 동일	-PCR 사이클94℃: 2 분, 95℃: 15 초, 66℃: 20 초 ⇒ 38회 반복 ⇒ 72℃: 30 초, 72℃: 5 분, 4℃: ∞
	N-특이적인 프라이머는 혈액·조직의genomic DNA를 이용한 조건과 동일	n-특이적인 프라이머5'-TGCCACGCTGCTGGCCCGGA-3' ----Int 25'-GGTGAACTCGCTGCGGATCTGCTC-3'-Ext2-2

실시예 6: 아가로즈 전기영동법에 의한 대립형질 특이적 밴드(allele-specific band) 확인

혈액과 조직에서 추출한 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR한 산물과 모근에서 추출한 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR한 산물을 아가로즈 전기영동법에 의한 대립형질을 확인하였다.

실험예 1 : 혈액과 조직의 genomic DNA를 이용한 AS-PCR 결과

아가로즈(sigma Chemical Co.)를 1 x TAE buffer에 녹인 후, EtBr(ethidium bromide)을 첨가하여 굳힌 겔을 1 x TBE buffer에서 약 30분 정도 전기영동(2.5volts/cm)한 후, UV light에서 각 종류별로 나타난 특이적 DNA band를 관찰하였으며, PCR 단편의 크기를 측정하기 위하여 1-kb ladder를 이용하였다. 도 4는 혈액과 조직의 genomic DNA에 대하여 2쌍의 프라이머를 각각의 튜브에 넣어 PCR 반응시킨 후, 아가로즈 전기영동한 결과이다. M 레인은 1-kb ladder size marker를 나타내고 있으며, 1 레인은 NN, 2 레인은 Nn, 3 레인은 nn 유전자형을 나타내고 있다. 915 bp 부분의 g가 a로 mutation이 되지 않은 대립 유전자형을 검출하는 Int 1과 Ext 1 프라이머 쌍을 이용하여 PCR한 결과 1 레인(NN)과 2 레인(Nn)에서만 307 bp 밴드가 나타나고, 3 레인(nn)에서는 나타나지 않아 Int 1과 Ext 1 프라이머가 915 bp 부분의 g가 a로 mutation이 되지 않은 대립 유전자형을 검출하는데 특이적으로 제작되었다는 것을 알 수 있다. 또한 4 레인은 nn, 5 레인은 Nn, 6 레인은 NN 유전자형을 나타내고 있는데, 915 bp 부분의 g가 a로 mutation된 대립 유전자형을 검출하는 Int 2와 Ext 2 프라이머 쌍을 이용하여 PCR한 결과 4 레인(nn)과 5 레인(Nn)에서만 1054 bp 밴드가 나타나고, 6 레인(NN)에서는 나타나지 않아 Int 2와 Ext 2 프라이머가 915 bp 부분의 g가 a로 mutation된 대립 유전자형을 검출하는데 특이적으로 제작되었다는 것을 알 수 있다. 7 레인(NN)과 8 레인(nn)은 두가지의 homozygote 유전자형에 대하여 2쌍의 프라머로 PCR 결과를 나타내고 있다.

실험예 2 : 모근의 genomic DNA를 이용한 AS-PCR 결과

도 5는 모근의 genomic DNA에 대하여 2쌍의 프라이머를 각각의 튜브에 넣어 PCR 반응시킨 후, 아가로즈 전기영동한 결과이다. 도 5-A에서 M 레인은 1-kb ladder size marker를 나타내고 있으며, 1 레인은 NN에 대한 모근 3가닥, 2 레인은 NN에 대한 모근 5가닥을 이용한 것이며, 3 레인은 Nn에 대한 모근 3가닥, 4 레인은 Nn에 대한 모근 5가닥을 나타내고 있다. 5 레인은 nn에 대한 모근 3가닥, 6 레인은 nn에 대한 모근 5가닥에 대한 유전자형을 나타내고 있다. 915 bp 부분의 g가 a로 mutation이 되지 않은 대립 유전자형을 검출하는 Int1과 Ext1 프라이머 쌍을 이용하여 PCR한 결과 1 레인(NN), 2 레인(NN), 3 레인(Nn), 4 레인(Nn)에서만 307 bp 밴드가 나타나고, 5 레인(nn), 6 레인(nn)에서는 나타나지 않아 Int1과 Ext1 프라이머가 모근에서 915 bp 부분의 g가 a로 mutation이 되지 않은 대립 유전자형을 검출하는데 특이적으로 제작되었다는 것을 알 수 있다. 또한 도 5-B에서 M 레인은 1-kb ladder size marker를 나타내고 있으며, 1 레인은 nn에 대한 모근 3가닥, 2 레인은 nn에 대한 모근 5가닥을 이용한 것이며, 3 레인은 Nn에 대한 모근 3가닥, 4 레인은 Nn에 대한 모근 5가닥을 나타내고 있다. 5 레인은 NN에 대한 모근 3가닥, 6 레인은 NN에 대한 모근 5가닥에 대한 유전자형을 나타내고 있다. 915 bp 부분의 g가 a로 mutation이 되지 않은 대립 유전자형을 검출하는 Int 2와 Ext 2 프라이머 쌍을 이용하여 PCR한 결과 1 레인(nn), 2 레인(nn), 3 레인(Nn), 4 레인(Nn)에서만 271 bp 밴드가 나타나고, 5 레인(NN), 6 레인(NN)에서는 나타나지 않아 Int2와 Ext2 프라이머가 모근에서 915 bp 부분의 g가 a로 mutation이 된 대립 유전자형을검출하는데 특이적으로 제작되었다는 것을 알 수 있다.

이상, 상기 실시예와 실험예에서 설명한 바와 같이 질병 저항성 유전자(FUT1)의 돌연변이 유무는 2가지 다른 방법으로 제작된 프라이머를 PCR로 증폭한 후, 전기영동으로 유전형질을 결정하여 알 수 있으므로 질병 저항성 돈의 검정을 단시간에 간단히 수행할 수 있는 효과가 있어 설사병의 유인이 되는 FUT1 유전자 검색은 양돈육종사업에서 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

(a) 질병 저항성 돼지를 검정하기 위하여 돼지로부터 시료를 채취하여 Int 1(서열번호 1), Int 2(서열번호 2), Ext 1(서열번호 3), Ext 2(서열번호 4) 또는 Ext 2-2(서열번호 5; 모근일 경우)의 프라이머 중 어느 하나이상을 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 PCR 산물을 아가로즈 겔에 전기영동하여 유전형질을 결정하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 질병 저항성 돼지의 검정방법.
제 1항에 있어서, 상기 질병은 설사병, 부종병임을 특징으로 하는 질병 저항성 돼지의 검정방법.
제 1항에 있어서, 중합효소 연쇄반응을 하기 위한 시료는 돼지의 혈액, 조직 또는 모근 중에서 어느 하나를 선택함을 특징으로 하는 질병 저항성 돼지의 검정방법.
제 1항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응(PCR)은 선택된 1개 또는 2개의 프라이머 쌍을 하나 또는 두 개의 튜브에서 실행함을 특징으로 하는 질병 저항성 돼지의 검정방법.
질병 저항성 유전자(FUT1)를 검정하는 서열번호1(Int 1), 서열번호2(Int 2), 서열번호3(Ext 1), 서열번호4(Ext 2) 및 서열번호 5(Ext 2-2)로 기재되는 염기서열을 가진 대립 유전자 확인용 프라이머.
제 4항의 프라이머를 제작함에 있어서, 질병 유전자를 검정하기 위하여 Int 1, Int 2, Ext 1, Ext 2 및 Ext 2-2 프라이머 중 Int 1, Int 2에 돌연변이를 유도함을 특징으로 하는 대립 유전자 확인용 프라이머 제작방법.
제 5항에 있어서, 상기 프라이머 Int 1(서열번호 1)의 3'-말단에서는 3번째 염기를 C에서 C가 아닌 다른 G, A, T로 치환시킴을 특징으로 하는 대립 유전자 확인용 프라이머 제작방법.
제 5항에 있어서, 상기 프라이머 Int 2(서열번호 2)에서는 3'-말단에서는 3번째 염기를 T에서 T가 아닌 G, A, C로 치환하고, 915 bp 부분의 g가 a로 변이된 것을 확인하기 위하여 1번째 염기를 G에서 A로 치환시킴을 특징으로 하는 대립 유전자 확인용 프라이머 제작방법.