CN101487045A - 猪糖基磷脂酰肌醇锚1蛋白编码基因gpi1作为猪抗病育种遗传标记的应用 - Google Patents

猪糖基磷脂酰肌醇锚1蛋白编码基因gpi1作为猪抗病育种遗传标记的应用 Download PDF

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施启顺
柳小春
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Abstract

本发明涉及猪的分子生物学技术及育种领域，具体涉及与肠毒素大肠杆菌F4ad受体相关的猪糖基磷脂酰肌醇锚1蛋白编码基因GPI 1的单核苷酸多态性的检测方法。本发明采用δ差异显示PCR的方法首先筛选出GPI 1基因为F4ad受体的相关基因，继而在猪GPI 1基因上筛选到与受体相关的SNP，并且通过生产实践验证确定GPI 1基因为F4ad受体相关基因，且筛选的SNP为与F4ad受体相关的SNP。本发明筛选的猪GPI 1基因的SNP可作为猪抗病育种辅助选择的遗传标记，从而培育出抗性猪，具有极其重大的应用价值和经济效益。

Description

猪糖基磷脂酰肌醇锚1蛋白编码基因GPI1作为猪抗病育种遗传标记的应用
技术领域
本发明涉及猪的分子生物学技术及育种领域，具体涉及与肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4 ad受体相关的猪糖基磷脂酰肌醇锚1蛋白编码基因GPI 1的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，缩写为SNP)的检测方法。
背景技术
在猪病中，仔猪泻痢是最普遍而重要的疾病，由腹泻使仔猪的死亡率达11.5％-29.5％，其中大肠埃希氏菌(Escherichia coli简称E.coli)引起的发病率和死亡率占整个发病率与死亡率的56.2％和24.7％，值得一提的是致病性E.coli的抗原特性是可变的，已发现的E.coli菌体(O)抗原血清型就有100多种，给研制疫苗及药物治疗带来很大困难，因此，从根本上开展猪对肠毒素大肠杆菌病抗性遗传机制研究，进行抗病育种，已引起国内外学者的重视。
肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪泻痢的主要病原体之一，它可引起仔猪黄痢、仔猪白痢、猪水肿病等多种大肠杆菌病。ETEC与共生性非致病性大肠杆菌不同，其致病性决定于它们在宿主小肠上皮细胞上的定居能力和产生肠毒素的能力，两者缺一不可。ETEC定居宿主小肠上皮细胞能力是由菌体表面的特异菌毛介导的，这种ETEC特异菌毛通常称为定居因子或粘附素。
在引起仔猪泻痢的ETEC中，已发现的粘附素有K88(F4)、K99(F5)、F17、F18等多种，其中初生仔猪腹泻是由F4引起的。这些粘附素要在小肠粘膜附着，还必须在小肠粘膜上皮细胞刷状缘有特异性受体，不同猪只肠粘膜有无特异性受体是由基因控制的，无受体的猪在受到细菌感染时不发病，表现为抗性，因此寻找和筛选该受体的遗传标记是培育出抗性猪的重要途径。
发明内容
本发明的目的是采用δ差异显示法筛选F4 ad受体的相关基因；
本发明的另一个目的是筛选与黏附性(受体有无)相关的SNP，以期应用于标记辅助选择或标记辅助渗入。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下步骤：
(1)分别采集不同品种初生仔猪的小肠，采用体外黏附测定检测各样品的黏附性；
(2)提取小肠上皮细胞总RNA，并将之反转录成cDNA；
(3)利用δ差异显示引物实施差异PCR，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法显示PCR产物；
(4)将差异带回收后再PCR扩增，以增加差异DNA数量；
(5)Northern blot鉴定阳性差异带；
(6)将阳性差异带克隆并测序后，将序列进行数据库同源性分析；
(7)根据测序结果和序列分析结果，筛选与受体有关的基因；
(8)根据相关基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；
(9)筛选与黏附性(受体有无)相关的SNP。
本发明采用PCR与DNA测序结合的方法首先筛选出GPI 1基因为F4 ad受体的相关基因，继而从猪GPI 1基因上筛选到与受体相关的SNP，并且通过生产实践验证确定GPI 1基因为F4 ad受体相关基因，筛选的SNP为与F4ad受体相关的SNP。本发明筛选的猪GPI 1基因的SNP可作为猪抗病育种辅助选择的遗传标记，从而培育出抗性猪，具有极其重大的应用价值和经济效益。
本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。
附图说明
图1为实施例的技术路线图；
图2为显微镜下的黏附型的黏附情况图(X 1000)；
图3为显微镜下的不黏附型的黏附情况图(X 1000)；
图4为δ差异片段电泳图；
其中，R为不黏附型，S为黏附型，M为100bp DNA ladder，箭头所示为差异片段；
图5为Northern杂交图；
其中，R为无受体，S为有受体；
图6为F4ad受体差异带9序列的BLAST结果图；
图7为F4ad受体差异带4序列的BLAST结果图；
图8为引物2扩增的GPI 1基因序列同源比对结果图；
图9为引物2扩增的GPI 1基因序列同源比对结果图；
其中，a3、a5、a6、b7为有受体个体，c6、c9、a8、b8为无受体个体，箭头处显示的是突变位点。
具体实施方式
本实施例的技术路线如图1所示：(1)分别采集大约克初生仔猪30头和沙子岭初生仔猪33头的小肠，采用体外黏附测定检测各样品的黏附性；(2)提取小肠上皮细胞总RNA，并将之反转录成cDNA；(3)利用δ差异显示引物实施差示PCR，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法显示PCR产物；(4)将差异带回收后再PCR扩增，以增加差异DNA数量；(5)Northern blot鉴定阳性差异带；(6)将阳性差异带克隆并测序后，将序列进行数据库同源性分析；(7)根据测序结果和序列分析结果，筛选与受体有关的基因；(8)根据相关基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；(9)筛选与黏附性(受体有无)相关的SNP。
实施例1 两个猪种F4受体黏附差异研究
解剖1周龄内沙子岭猪33头、大约克猪30头，取猪小肠组织用于制备上皮细胞刷状缘和保存于液氮中用于提取RNA。
取大肠杆菌悬液和仔猪小肠黏膜上皮细胞刷状缘悬液各0.1ml置于1.5ml离心管中，加入甘露糖(0.4mg/ml)1μl，轻轻混合，室温培养30min，不时轻摇。混悬后滴一滴于载玻片上，酒精灯下微热烘干，再加一滴结晶紫染色液，3min后用水冲洗载玻片，酒精灯下微热烘干，油镜下观察，随机计数20个形态清晰的细胞上所黏附的细菌数。
判断标准：在油镜下随机检测20或更多形态清晰的刷状缘，对于单个的刷状缘，多于两个细菌黏附其上判为黏附；对于仔猪个体样，样品中至少有10％的刷状缘结合多于2个细菌才判为黏附；少于10％的刷状缘结合多于2个细菌，但多于10％的刷状缘结合1～2个细菌，判为弱黏附。最后用数码相机进行拍照(黏附型见图2，不黏附型见图3)。
统计两个猪种的黏附比率，如表1所示：
表1 两个猪种黏附型比较
Figure A200810025912D00071
两个猪种在三种血清型的黏附比率均表现为ab型的最大，ad型的次之，ac型的最小。其中ab型的均超过了0.6，而其他的均低于0.4，ac型的黏附比更低于0.1。可见，初生仔猪患仔猪黄痢主要是大肠杆菌F4ab型与仔猪小肠上皮细胞刷状缘结合。沙子岭猪ab型的黏附个体比率为0.727，稍高于大约克的0.667；ad型的黏附个体比率为0.400，显著高于大约克的0.242(p<0.05)。
试验结果表明：F4 ab黏附素对大约克猪和沙子岭猪均黏附强烈，而F4ac则表现为不黏附。也意味着两个品种中均存在较高频率的F4abR+-F4acR-。
图2和图3分别是黏附与不黏附型图。由图2可见，刷状缘结合了多个细菌，而图3则不然。试验结果表明，此方法在显微镜下能够非常清楚的观察到黏附情况，从而对个体黏附型进行准确判定。
实施例2 差异片段的获得
一、cDNA的合成
取实施例1中保存于液氮中的猪小肠组织，采用常规方法提取总RNA，并进行定量、纯度和完整性检测，再用无RNase的DNase I处理总RNA，采用Fermentas公司的第一链cDNA合成试剂盒中的oligo(dT)引物进行cDNA的合成。
二、δ差异显示引物
δ差异显示引物由上海英骏生物有限公司合成，每个引物浓度为20μM。引物序列如下：
(1)5’P随机引物共10条：
P1：5’-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGGGA-3’
P2：5’-ATTAACCCTCACTAAATCGGTCATAG-3’
P3：5’-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTGG-3’
P4：5’-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTAG-3’
P5：5’-ATTAACCCTCACTAAAGATCTGACTG-3’
P6：5’-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGGTG-3’
P7：5’-ATTAACCCTCACTAAATGCTGTATG-3’
P8：5’-ATTAACCCTCACTAAATGGAGCTGG-3’
P9：5’-ATTAACCCTCACTAAATGTGGCAGG-3’
P10：5’-ATTAACCCTCACTAAAGCACCGTCC-3’
(2)3’oligo(dT)引物共9条：
T1：5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAA-3’
T2：5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAC-3’
T3：5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAG-3’
T4：5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCA-3’
T5：5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCC-3’
T6：5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCG-3’
T7：5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGA-3’
T8：5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGC-3’
T9：5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGG-3’
三、长距离PCR(LD-PCR)
1、PCR循环参数
前4个循环使用低严谨条件，后28个循环使用严谨条件。
1个循环：94℃，6min；40℃，5min；68℃，5min。
3个循环：94℃，2min；40℃，5min；68℃，5min。
28个循环：94℃，1min；60℃，1min；68℃，2min。
另外68℃，7min。
2、PCR操作流程
(1)融化下述试剂：
①10×PCR反应缓冲液。②dNTP混合物。③25mM MgCl2。④引物P与T。⑤实验cDNA样品。⑥纯水。完全融化后保持上述溶液在冰上，使用之前混合好，以避免盐浓度的局部差异。
(2)对每一个差异显示即样品与引物组合，在0.2mlPCR管中加入如下反应成分：
0.8μL  实验cDNA样品
0.8μL  P引物
0.8μL  T引物
(3)根据表2所示准备主体混合物：
表2 PCR反应体系成分
Figure A200810025912D00101
主体混合物体积应比PCR操作分析的总数量大10％，如总共分析10个反应管，则应准备11个反应管上述成分，因为由于操作或tips与移液枪等原因存在误差。在每一个实验中，另准备一个否定控制(没有模板DNA)。Taq DNA聚合酶最后加入，然后通过上下移液彻底混合。
(4)每个PCR反应管加入上述主体混合物17.6μL，构成总体积20μl。
(5)旋涡混合器上混合后轻轻离心
(6)开启PCR仪，当PCR仪达到94℃时，放PCR管到PCR仪中(简单的热起始)。
(7)PCR结束后将进行聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染显示。
四、结果讨论
两个猪种共63头猪小肠总RNA浓度与纯度检测结果表明，总RNA浓度在560～1152μg/ml之间，纯度在1.75～2.00之间，一般在1.85左右，说明采用提取的总RNA质量高，基本无蛋白质污染，可保证mRNA扩增的顺利进行。通过检测总RNA完整性表明提取的总RNA分子完整，没有发生降解。δ差异显示部分结果见图4，采用在δ差异显示的109个引物组合的PCR中，在F4ad黏附差异带检测中，共检测到24条差异条带，其中有13条在黏附型中特异表达，11条在不黏附型样品中特异表达。
实施例3 差异片段的回收、再扩增、纯化与Northernblot
本发明的差异片段指：在δ差异显示中，在黏附型样品中表达，但在非黏附型样品中不表达，或者在非黏附型样品中表达，但在黏附型样品中不表达的基因片段，即为实施例2中，F4ad黏附差异带检测中，检测到的24条片段。
用干净的手术刀从实施例2中得到的银染凝胶片上切下所需的差异带，回收其中的DNA，并对差异片段实施再扩增、纯化与回收步聚，之后进行Northern印迹杂交，确定总RNA中样品同源RNA的存在与否或样品中特定RNA分子的大小和丰度。
结果显示：
1、在24条δ差异片段的再扩增PCR中，有1条差异片段没能实现特异性扩增，表现为多带或无带，估计这些差异片段实际可能包含几条大小相近的片段，需要通过其它方法才能分离出来，本实施例将其作为假阳性差异，没作进一步分析。
2、在23个再扩增差异片段中，Northern blot(见图5)结果表明有3个差异片段表现为假阳性。说明在差异显示中找到了20个阳性差异片段，阳性率为87％(20/23)。
实施例4 阳性差异片段的克隆、测序与序列分析
本实施例中的材料为通过实施例3确定的纯化后的阳性差异片段，通过感受态细胞的制备、连接、转化、筛选、鉴定等过程，克隆阳性差异片段，然后送上海英骏生物有限公司测序，将测序结果到NCBI网站通过BLAST程序进行同源比对，再根据比对结果确定该片段是否为新基因或者与某一基因有较大长度的高同源性。
克隆载体送测序公司测序后，到NCBI网站进行BLAST比对，本试验共测序了20条片段，其中比对结果有高同源性(>85％)且同源的长度大于60个碱基的片段有2条，比对结果见图6和图7；有同源性但低于85％或同源的长度较短的片段有12条，其余11条为新基因片段。20条片段序列已登录到GenBank中，登录号分别为DQ217772、EC268686、DW286736～DW2867939、EB739624～EB739627和EE392468～EE392477
1、BLAST结果表明：
(1)如图5所示，BLAST结果表明，F4ad黏附差异带9，即引物P4 X T6扩增之差异片段与glycosylinositolphohatidyl anchor 1(GPI 1)有91％(216/237)的同源性。可见该基因与F4 ad受体有无存在相关。
(2)如图6所示，BLAST结果表明，F4ad黏附差异带4，与丝氨酸蛋白酶有87％(63/72)的同源性。
2、F4受体的相关报道
F4受体已从上皮细胞刷状缘、小肠膜和粘液中提取。它可能是一种复合糖[10]。而Grange和Mouricout报道它可能是74kDa的转铁蛋白，以及一种小肠中性鞘糖脂。
GPI锚定蛋白是一类通过其羧基末端的糖基化磷脂酰肌醇结构锚定于真核细胞膜表面的蛋白。细胞中存在很多这种类型的蛋白，其中包括各种功能的蛋白细胞表面的酶、受体、粘附分子、特异性抗原等，起着免疫识别，补体调节及跨膜信号转导等重要作用。不同类的GPI蛋白，GPI的分子结构不尽相同，但均含有一组最基本的化学结构，主要由胆胺甘露糖，葡萄糖胺，和肌醇连接而成。GPI锚定蛋白主要参与细胞与细胞，细胞与环境间的作用，如信号转导、膜蛋白转运、细胞粘附、补体调节等。
GPI微域由GPI锚定蛋白、鞘糖脂、胆固醇、src家族蛋白酪氨酸激酶PTK、G蛋白和细胞骨架蛋白、少量穿膜蛋白等组成。GPI锚定蛋白通过与这些组分相互作用来进行细胞内外的信号传递。
作为膜的组成成分，GPI的乙醇胺，通过酰氨基结合于羧基端，并成为蛋白质固定于膜的锚，结合到GPI的蛋白称为GPI锚蛋白。磷脂酶C(PLC)能释放蛋白质锚定于糖基磷脂酰肌醇，人糖基磷脂酰肌醇被PLC分解产生IP3和DG，它们是重要的第2信使。虽然还不清楚为什么这么多蛋白质与人糖基磷脂酰肌醇锚蛋白有关，但已知GPI与一些蛋白质功能有关(Brown and Waneck)。例如，作为活跃的免疫系统的抗原，GPI锚蛋白对MHC表达的抗原有调控作用。人中目前至少知道一个疾病，即突发性夜血红素尿是由于GPI锚蛋白缺陷引起的。因此，GPI基因可望作为F4ad受体的候选基因进一步研究，目前还没有关于F4ad受体相关基因的报道。
由于GPI蛋白具有如此广泛的作用，疯牛病办公室创建和支持了GPI蛋白网站(http://cyber-dyne.com/～tom/gpi.html)。该网站站提供了有关糖基磷脂酰肌醇(GPI，是许多蛋白以及盶病毒蛋白结合于膜上的锚点)的信息。同时，网站还提供了许多相关链接和资源。
根据GPI锚定蛋白的的结构与功能特点分析，它与K88受体有着复杂的关系，可以作为候选基因进行深入研究。
综上所述，GPI蛋白的化学结构和生理功能都与F4受体的相关报道相吻合，因此该基因很可能是F4 ad的相关基因。
本发明综合同源比对的结果和对基因功能的了解，选择了GPI 1基因为F4 ad受体的相关基因，并进行了进一步的研究。
实施例5 猪相关基因SNP筛选
本实施例随机选择黏附型和不黏附型样本各4个，提取基因组DNA。根据人GPI 1基因cDNA序列(Genbank登录号为NM 153487)设计了4对引物(如表3所示)分别对所有F4 ad黏附型个体(a3、a5、a6、b7)和所有不黏附型个体(c6、c9、a8、b8)进行了扩增，扩增产物经纯化后送测序公司测序，测序结果SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
采用DNAStar软件之Seqman程序对上述8条序列进行同源比对，筛选与黏附性有关的SNP，其中引物2的扩增测序比对结果如图8和图9所示。
表3 引物序列
Figure A200810025912D00151
结果表明，在第242、243碱基位置，所有F4 ad黏附型个体均为AT，而所有不黏附型个体均为TG。而在其它位置，如第19碱基位置、24碱基位置等虽然存在SNP，但这些SNP都与黏附性没有相关性。该结果表明，引物2所扩增产物在第242、243碱基位置的突变很可能就是影响F4ad受体黏附性差异的原因。而在其它位点，虽然发现一些SNP(如第19、24碱基)，但这些SNP与样品的黏附性无关，因此不予考虑。
对其它3对引物的测序结果分析，未发现一SNP在所有黏附/不黏附个体中特异表现。因此认为该区段不存在影响黏附性的多态位点。
实施例6 与黏附性有关的SNP在生产实践中的验证
在湖南农业大学种猪场用ETEC F4感染初生仔猪，采集腹泻和腹泻的初生仔猪各30头血样，提取基因组DNA，利用引物1、2扩增，并检测其SNP。
1、引物
引物1：5′-GCTACAACATGGACATCCTG-3′
引物2：5′-GTCTTGTTCACCTCAGCCAT-3′
2、PCR
PCR反应体系，如表4所示：
表4 PCR反应体系中各组成成分
Figure A200810025912D00161
PCR循环参数如下：
34个循环：94℃，4min；94℃，30s；61℃，40s。
72℃，7min。
结果表明，在30头腹泻的初生仔猪中，引物扩增产物在第242、243碱基位置均为AT，而30头不腹泻的初生仔猪基因型均为TG。上述结果表明GPI 1基因为F4ad受体相关基因，本发明得到的SNP为与F4ad受体相关的SNP。
序列表.txt
SEQUENCE LISTING
<110>刘定发，蒋隽，湖南农业大学
<120>猪糖基磷脂酰肌醇锚1蛋白编码基因GPI1作为猪抗病育种遗传标记的应用
<130>
<160>8
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>245
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<400>1
<210>2
<211>250
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<400>2
Figure A200810025912D00172
<210>3
<211>243
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<400>3
<210>4
<211>241
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<400>4
Figure A200810025912D00174
Figure A200810025912D00181
<210>5
<211>246
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<400>5
<210>6
<211>245
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<400>6
Figure A200810025912D00183
<210>7
<211>240
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<400>7
Figure A200810025912D00184
<210>8
<211>241
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<400>8
Figure A200810025912D00185

Claims (2)

1、一种筛选猪抗病育种的遗传标记，其特征在于：它包含克隆得到一个猪糖基磷脂酰肌醇锚1蛋白编码基因GPI1的特异DNA片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示，其中序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示的8条序列经同源比对后，确定在第242位碱基处有一个碱基突变T242—A242，第243位碱基处有一个碱基突变G243—T243。
2、权利要求1所述的遗传标记在猪标记辅助选择中的应用。
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