KR20020075122A

KR20020075122A - 울금으로부터 데메톡시커큐민을 추출하는 방법, 이러한방법으로 추출된 데메톡시커큐민, 이의 유도체 및 이들을포함하는 기능성 음료

Info

Publication number: KR20020075122A
Application number: KR1020010015330A
Authority: KR
Inventors: 권호정; 김진희; 심중섭; 최승훈; 신종헌; 노정래
Original assignee: 권호정
Priority date: 2001-03-23
Filing date: 2001-03-23
Publication date: 2002-10-04

Abstract

본 발명은 한약 소재인 울금(학명:Curcuma aromatica)으로부터 신생혈관생성억제제로서 하기 화학식 1의 데메톡시커큐민(demethoxycurcumin)을 효율적으로 추출 및 정제하는 방법을 제공하고, 이러한 방법으로부터 수득된 데메톡시커큐민의 화학구조를 결정함과 동시에 이 화합물의 유도체를 합성하고, 아울러 이들 유도체들의 신생혈관 생성을 억제하는 세포내 활성을 밝힘으로써 궁극적으로 당해 화합물을 함유하는 암 예방용 기능성 음료 및 제제를 제공하는 것이다.

화학식 1

Description

울금으로부터 데메톡시커큐민을 추출하는 방법, 이러한 방법으로 추출된 데메톡시커큐민, 이의 유도체 및 이들을 포함하는 기능성 음료{A method for extracting demethoxycurcumin from Curcuma aromatica, the demethoxycurcumin extracted by the method, the curcumin derivatives and functional drinks containing them}

본 발명은 종래로부터 한약재로 널리 이용되어 온 울금(학명:Curcuma aromatica)으로부터 추출된 데메톡시커큐민(demethoxycurcumin) 및 그 유도체에 관한 것이다. 보다 상세히 본 발명은 울금으로부터 데메톡시커큐민을 보다 효율적으로 추출 및 정제하는 방법을 제공하고, 이 화합물의 신규한 유도체를 합성하며, 아울러 이들 유도체들의 신생혈관생성을 억제하는 세포내 활성을 밝힘으로써 궁극적으로 이를 함유하는 암 예방용 기능성 음료 등의 조성물을 제공하는 것이다.

울금은 생강과에 속한 다년생 숙근성 초본 식물로서 약재로는 황울금, 흑울금, 백사울금, 녹사울금 등이 쓰인다. 울금을 구성하고 있는 부분인 괴근에는 정유 6.1%, d-캄펜 0.8%, d-캄포르 2.5%, 세스퀴테르펜(L-α커큐멘 및 L-β-커큐멘) 65.5%, 세스퀴테르펜 알콜 22%, 커큐민, 데메톡시커큐민, 비스메톡시커큐민, 투르메론, 아르투르메론, 전분 30 내지 40%, 지방유 3%, 고무, 황색 색소, 카르본 및 펠란드렌이 포함되어 있으며, 항자궁경암 효과가 있는 근경에는 쿠르쿠몰, 쿠르디온, 테트라메틸피라딘, 캄포르, 보르네올, 이소보르네올, 쿠르제렌 등이 포함되어 있을 뿐 아니라, 기타 20 여종의 성분이 주 성분으로 포함되어 있는 것으로 알려져 있다.

일반적으로, 울금의 약리작용으로는 지질 대사에 영향을 주며, 탕제나 가루로 복용시 혈중 콜레스테롤 수치의 증가에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 또한, 토끼나 쥐에 투여시 주동맥 및 관상 동맥의 반괴를 형성하고, 지질의 침적을 감소시키며, 동속 식물인 커큐마 아마다(curcuma amada)의 에틸에테르 추출물은 투여시 혈중 콜레스테롤 수치를 감소시키는 것으로 알려져 있다.

기타 울금의 약리작용으로는, 울금의 침제를 사용했을 때 각종 병원성 진균을 억제하는 기능이 있으며, 정유 유제를 사람의 담낭 조영시에 사용하면 담낭이 수축되는 현상을 제거하는 것으로 알려져 있다 (완역중약대사전, 도서출판 정담, p. 144).

한편, 울금으로부터 유효성분을 추출하는 방법으로는, 울금(Curcuma aromatica)의 근경으로부터 분리된 페놀성 디케톤인 커큐민, 데메톡시커큐민 및 비스-데메톡시커큐민을 분리하는 방법이 문헌[참조: Planta Med. 66(2000) 396-398]에 기재되어 있다. 이 문헌에는 커큐민을 아세톤에 용해하고 셀라이트(celite)를 가한 후, 얻어진 분말을 소결된 유리 깔때기에서 디하이드로겐 포스페이트 포화된 실리카 겔 상에 위치시키고 이를 에틸 아세테이트 - 헵탄의 1:1 혼합물로 부터 재결정하는 방법을 개시하고 있다.

또한, 이하에서 개시하는 바와 같이 한약재의 냉침에 많이 사용되는 메탄올과 에탄올 등의 용매를 사용하여 수일간, 예컨대 5-7일간 냉침시켜 울금의 구성성분을 추출하는 방법이 종래로부터 당업계에 알려져 있다.

암은 선천적(유전적) 및 후천적(환경적) 요인에 의해 세포증식 조절의 이상으로 발생하는 만성질환으로, 일단 악성종양으로 발달하는 과정에서 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료를 하더라도 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을주며 궁극적으로는 죽음에 이르게하는 질환이다. 최근, 생명과학의 발달에 힘입어 암의 발생 원인 및 기전에 대한 이해가 증가함에 따라 암의 새로운 치료요법으로써 세포 증식조절 이상을 조속히 감지하여 악성 종양이나 다른 조직으로 전이되기 전에 암의 진전을 억제하는 이른바 암 예방법에 대한 관심이 고조되고 있다. 한약재의 경우, 기존의 항암제보다 저독성이고 이미 오랜 기간 임상에 적용되어 왔으므로 그에 대한 안전성이 이미 밝혀졌기 때문에 암 예방 치료제로서의 개발 가능성이 높다.

그러나, 대개 한약재의 경우, 다수의 성분이 혼합된 추출물로 사용되는 관계로 인하여 약리 활성의 과학적 근거가 불명확하고 혼합 추출물의 사용에 의한 부작용의 우려도 배제할 수 없다. 본 발명에 이르러, 울금의 유효성분인 DC 및 본 발명에 의해 합성된 신규 유도체들은 안전하며 유용한 신생혈관 생성 억제제임이 밝혀졌다.

본 발명자들은 신생혈관 생성을 억제하는 울금의 유효성분인 DC(demethoxycurcumin)의 효용성에 착안하여 이를 보다 효율적으로 추출 및 정제하는 방법을 발명하기에 이르렀고, 더 나아가 본 발명에 의해서 합성된 신규한 이들의 유도체가 이하에서 보는 바와 같이 DC와 같은 신생혈관 생성을 억제함을 밝히기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 암의 증식 및 암 전이 억제 활성을 지닌 것으로확인된 수종의 한약재중 가장 강력한 활성을 나타내는 소재로 알려진 울금을 선택하여, 이로부터 약리 활성 성분, 즉 데메톡시커큐민(DC)을 효율적으로 추출 및 정제하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법으로 정제된 화합물인 데메톡시커큐민의 화학적 구조를 확인하고, 이러한 화합물의 신규한 유도체를 합성하는 방법을 제공하는 데 있다.

나아가, 본 발명의 또 다른 목적은 본원의 방법으로 수득된 데메톡시커큐민으로부터 새로운 유도체를 합성하고 이렇게 합성된 유도체의 암의 증식 및 전이에 필수적인 신생혈관생성 억제 활성을 확인하여 이들 화합물을 함유하는, 암 예방에 사용하기 위한 기능성 음료 등의 조성물을 제공하는 데 있다.

현재 임상에 이미 활용되고 있는 울금의 신생혈관생성 억제 성분으로 밝혀진 DC는 새로운 암 예방제 및 관련 신약 개발의 선구물질(lead compound)로 활용 가능하다.

도 1은 데메톡시커큐민(demethoxycurcumin: DC)의 화학 구조를 도시한 것이다.

도 2는 울금으로부터 DC를 분리 및 정제하는 방법에 대한 개략도이다.

도 3은 DC의 혈관 내피 세포에 대한 독성을 나타낸 그래프이다.

도 4는 DC의 혈관 내피 세포에 대한 증식 억제 활성을 나타낸 그래프이다.

도 5는 DC의 의 혈관 생성 억제 활성을 나타낸 사진이다.

도 6은 DC의 혈관 내피 세포의 기저조직 침투 작용의 억제 활성을 나타낸 막대 그래프이다.

도 7은 DC의 혈관 내피 세포의 화학주성에 대한 억제 활성을 나타낸 막대 그래프이다.

본 발명에 의해 밝혀진 한약 소재인 울금의 구성 성분중 신생혈관 생성 억제 활성을 나타내는 성분인 데메톡시커큐민의 구조는 하기 화학식 1과 같다.

본 발명에 따른 DC의 추출방법은 울금의 유효성분을 추출하기 전에 이를 열 처리하는 것을 포함하는 방법이다. 용매로서는 메탄올을 사용하는데, 이를 70-98%의 농도로 사용한다. 열 처리는 55-65℃의 고온에서 약 2-5시간 동안 수행한다. 이 방법에 의하면 이하의 실시예에 나타난 바와 같이, 동일 농도의 용매를 사용하여 약 5일 정도의 냉침을 행하였을 때와 비교하여 약 1.5-2배의 수율을 얻음으로써 매우 효율적으로 다량의 DC를 추출할 수 있는 효과를 가져오게 된다.

본 발명의 정제 방법은 용매 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 얻은 분획을 헥산, 클로로포름 및 에탄올로 이루어진 전개용매를 사용하여 박층 크로마토그래피상에서 일정한 간격으로 처리하여 전개시키고, 각각의 분획을 혈관내피 세포에 처리하여 활성을 측정하여, 활성을 나타내는 분획을 다시 박층 크로마토그래피로 분리하는 과정을 수회 되풀이 하여 정제한다.

본 발명에 의해 제공되는 하기 화학식 2의 신규한 디메틸화 DC는 DC를 아세톤에 용해하고, 메틸요오다이드와 K₂CO₃를 첨가한 후 교반하면서 반응시키고, 반응 후 TLC와 HPLC의 분석을 통하여 디메틸화 DC를 정제함에 의해 수득한다.

본 발명에 의해 제공되는 하기 화학식 3의 신규한 DC 옥심은 DC를 메탄올에 용해하고, 벤질 하이드록실아민과 트리에틸아민을 첨가한 후 가열 및 교반하에 반응시키고, 반응 후 TLC와 HPLC 분석을 통하여 DC 옥심 유도체를 정제함에 의해 수득한다.

또한, 본 발명에 의해 제공되는 하기 화학식 4의 신규한 하이드라진 DC는 DC를 메탄올에 용해하고, 하이드라진을 첨가한 후 아세트산을 가하고 교반하면서 반응시키고, 반응 후 TLC와 HPLC 분석을 통하여 DC 하이드라진 유도체를 정제함에 의해 수득한다.

본 발명자들은 본원 발명의 방법에 의해 추출 및 정제된 상기 화학식 1의 데메톡시커큐민에 대한 여러가지 신생혈관 생성 억제 활성을 측정하였으며, 또한, DC 로부터 합성한 DC 유도체들에 대한 신생혈관 생성 억제 활성의 생체내 약리 활성을측정하고, 본원의 방법에 의해 수득된 DC와 본 발명에 의해 제조된 신규한 DC 유도체들에 대한 실험관내 및 생체내 약리 활성을 확인하였다. 이들 실험결과에 의하면 본 발명의 신규 DC 유도체들은 DC와 같거나 훨씬 강력한 신생혈관 생성 억제활성을 가진다는 것을 알 수 있었다.

따라서, 본원 발명에 의해 합성된 신규한 DC 유도체들은, 이들을 포함하는 유산균 음료나 기타의 제제로 제조할 경우, 이들의 신생혈관 생성 억제 활성이 부가된 암 예방 소재로서 개발할 수 있다. 예컨대, 유산균[비피도박테리아(Bifidobacteria) 및 락토바실러스(Lactobacillus)]은 정장 및 항암 활성이 있는 프로바이오틱(probiotic)으로서 건강기능성 음료 및 제제로 최근 주목받고 있다(참조: von Wright A., et al., 1999). DC 및 당해 DC와 같거나 더 강력한 신생혈관 생성 억제 활성을 지닌 본원 발명의 신규한 DC 유도체와 비피도박테리아를 혼합한 제제는 DC의 신생혈관 생성 억제 활성에 비피도박테리아의 암 예방 활성이 더해진 새로운 암 예방 소재로서 개발 가능하다. 비피도박테리아 1X10⁸세포/g의 분말을 사용하여 DC 5mg/g이 함유된 제제에 올리고당과 각종 비타민을 첨가하고, 카제인을 이용하여 고형분으로 제조할 수 있다. 비피도 박테리아외에도, 다당류이며 항암 생리활성이 있는 키토산이나 실크 아미노산, 상황버섯 추출물 등과 같이 DC와 화학적 성질이나 약리활성의 기전이 다른 건강기능성 소재 0.5-1%을 첨가함으로써 이들 소재의 기능이 보강된 제제를 제조할 수 있다.

이하, 본원 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 본원 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본원 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1

DC의 분리 및 정제

1) 추출방법

가. 추출 용매의 종류에 따른 DC의 함량 분석

울금(20g)에서 다량의 DC를 효과적으로 추출하기 위해서 용매 종류에 따른 DC의 함량을 조사하였다. 한약재의 냉침시 가장 많이 쓰는 용매인 메탄올(85%)과 에탄올(85%), 메탄올: 다이클로로메탄올 (1:1) (Planta Medica 66(2000) 396-398)에 울금을 5일 동안 냉침시켜 울금의 구성 성분을 추출한 후, DC의 함량을 HPLC로분석하였다. 그 결과 메탄올(85%)에서 가장 많은 DC의 함량을 나타내어 이 용매를 선택하였다.

추출 용매의 종류에 따른 울금의 구성 성분 중 DC의 함량

울금의 구성 성분	메탄올(85%)	에탄올(85%)	메탄올 : 디클로로메탄올(1:1)
커큐민(CUR)	235 mg	176 mg	59 mg
데메톡시커큐민(DC)	118 mg	106 mg	47 mg
비스데메톡시커큐민(BDC)	147 mg	129 mg	105 mg

나. 열 처리 유무에 따른 DC의 함량 분석

각각의 용매계에서 2-5시간 동안 55-65℃로 열 처리를 한 경우와 열 처리를 하지 않은 경우에 따른 DC의 함량을 각각 조사하였다. 그 결과 이하의 표 2에서 보는 바와 같이 본원 발명의 열 처리한 메탄올(85%)에서 DC의 함량이 가장 높게 나옴을 알 수 있다. 즉, 열 처리를 하지 않은 경우, DC의 함량은 메탄올(85%) 사용시 118 mg 이고, 열처리를 행한 경우, 347 mg으로 나타나, 열 처리를 하는 것이 하지 않는 것과 비교하여 약 2배의 효율이 높음을 알 수 있다. 또한 에탄올을 사용한 경우도 열 처리를 하는 경우, DC가 보다 다량 추출됨을 알 수 있다.

열 처리 유무에 따른 울금의 구성 성분 중 DC의 함량

열 처리를 안하는 경우
울금의 구성 성분	메탄올(85%)	에탄올(85%)	메탄올 : 디클로로메탄올(1:1)
CUR	235 mg	176 mg	59 mg
DC	118 mg	106 mg	47 mg
BDC	147 mg	129 mg	105 mg
열 처리 하는 경우(2-5h, 55-65℃)
울금의 구성 성분	메탄올(85%)	에탄올(85%)	메탄올 : 디클로로메탄올(1:1)
CUR	753 mg	588 mg	71 mg
DC	347 mg	235 mg	47 mg
BDC	459 mg	353 mg	106 mg

다. 메탄올의 비율에 따른 DC의 함량 분석

메탄올의 비율에 따른 DC의 함량을 조사하기 위해 100% 로부터 70% 까지 농도의 메탄올을 사용하여 울금을 추출하였는데, HPLC 분석 결과 메탄올 95%에서 가장 많은 DC의 함량을 나타내었다.

본 발명자들의 실험에 의하면 메탄올 농도 70-98%, 55-65℃의 온도하에서 2-5 시간 열처리할 경우, 기존의 5일간의 냉침에 의한 방법에 비교하여 약 1.5배 이상의 DC를 추출할 수 있음이 확인되었다.

한편, 가장 효과가 좋은 경우는 메탄올 95%로 3 시간 동안 열 처리(60℃)하는 방법이 울금으로 부터 DC를 가장 효율적으로 추출할 수 있는 조건으로 밝혀졌다.

메탄올의 비율에 따른 울금의 구성 성분 중 DC의 함량 조사

울금의구성 성분	메탄올 함량
	100%	95%	90%	85%	80%	70%
CUR	764 mg	765 mg	735 mg	753 mg	712 mg	694 mg
DC	294 mg	359 mg	353 mg	347 mg	341 mg	335 mg
BDC	353 mg	471 mg	459 mg	459 mg	459 mg	459 mg

실시예 2

생리학적 활성 물질의 분리 및 정제

울금의 에틸 아세테이트 용매 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 얻은 각각의 분획을 박층 크로마토그래피상에서 일정한 간격으로 처리하여 전개시켰다(전개 용매 조건; 헥산:클로로포름:메탄올=4:8:1, 3:9:1). 이때, 전개 이동도의 위치가 같은 것을 모아 13개의 분획을 얻은 후, 이를 박층 크로마토그래피하여 분리하고, 분리된 물질을 혈관내피 세포에 처리하여 활성을 측정하였다. 활성의 측정 결과 8번 분획에서 활성을 나타냈으며, 이 활성 물질을 다시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(전개 용매 조건; 헥산:클로로포름:메탄올=7:6:1)로 찍어 같은 전개이동도의 분획을 모아 4개의 분획을 얻었다. 이 4개의 분획을 혈관내피 세포에 처리한 결과 1번 분획에서 활성을 나타내었으며, 이 활성 물질을 효과적으로 분리 및 정제하기 위해 분취 실리카 겔 박층 크로마토그래피(전개 용매 조건; 헥산:클로로포름:메탄올=5:9:10)를 수행하였다. 분취 실리카 겔 박층 크로마토그래피 결과 3개의 분획이 수득되었으며, 이들 분획의 활성을 측정한 결과 2번 분획에서 활성을 나타내었다. 다음 1번 분획을 HPLC(0.1% 트리플루오로아세트산 : 80% 아세토니트릴 = 40 : 60)로 정제하여 단일 물질을 수득하였으며, 이 단일 물질에 대해 NMR 및 EI-MS로 화학구조를 결정한 결과 화학식 1의 DC임을 확인하였다 (도 2의 전개용매 조건과 동일함,전체 공정의 참조: 도 2).

이하의 실시예 3, 4 및 5에서는 DC의 유도체의 합성에 대하여 설명하고자 한다.

실시예 3

디메틸화 DC

5 mg의 DC(14.7 μmol)을 0.5ml의 아세톤에 용해하고, 메틸요오다이드(18.3 ㎕, 294 μmol)와 K₂CO₃(20.3 mg, 147 μmol)을 첨가한 후 12시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 TLC와 HPLC의 분석을 통하여 디메틸화 DC 2 mg을 분리하였다.

이 디메틸화 DC를 ESI MS 및¹H-NMR을 통해 분자량과 분자구조를 확인하였으며, 확인된 분자량과 물리화학적 성질은 다음과 같다:

분자량: 365

화학식: C₂₂H₂₁O₅

. 물리화학적 성질

최대흡광도: 200 nm, 430 nm

색깔: 황색

실시예 4

옥심 유도체

10 mg의 DC(29.4 μmol)을 1ml의 메탄올에 용해하고, 벤질 하이드록실아민(10.81 mg, 67.75 μmol)과 트리에틸아민(9.4 ㎕, 67.75 μmol)을 첨가한 후 12시간 동안 가열하에 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 TLC와 HPLC 분석을 통하여 DC 옥심 유도체 3 mg을 분리하였다.

이 DC 옥심 유도체를 ESI MS 및¹H-NMR을 통해 분자량과 분자구조를 확인하였으며, 확인된 분자량과 물리화학적 성질은 다음과 같다:

분자량: 547

화학식: C₃₄H₃₁O₅N₂

. 물리화학적 성질

최대흡광도: 200nm, 325nm

색깔: 연황색

실시예 5

하이드라진 유도체

5 mg의 DC(14.7 μmol)을 1ml의 메탄올에 용해하고, 하이드라진(4.7 mg, 146μmol)을 첨가한 후 50 ㎕의 아세트산을 가하고 24시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 TLC와 HPLC 분석을 통하여 DC 하이드라진 유도체 2 mg을 분리하였다.

이 DC 하이드라진 유도체를 ESI MS 및¹H-NMR을 통해 분자량과 분자구조를 확인하였으며, 확인된 분자량과 물리화학적 성질은 다음과 같다:

분자량: 333

화학식: C₂₀H₁₇O₃N₂

. 물리화학적 성질

최대흡광도: 337nm

색깔: 연황색

이하의 실시예 6-11에서는 본원 발명의 방법으로 추출 및 정제된 DC와 이의여러 유도체들에 대한 여러 가지의 신생혈관 생성 억제 실험방법 및 그 결과를 나타내고자 한다.

실시예 6

혈관 내피 세포에 대한 독성

본원 발명의 방법에 의해 추출 및 정제된 DC가 혈관 내피 세포에 대해 독성을 나타내는지의 여부를 확인하기 위해 생육억제 활성 실험을 수행하였다.

혈관 내피 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 5X10³의 세포 수가 되도록 M199(20% 혈청 함유) 1ml와 함께 3시간 동안 37℃에서 5% CO₂세포배양기속에서 배양하였다. 세포가 80%의 밀도로 증식한 후 PBS 1㎖로 웰을 세척한 후 새로운 M199(20% 혈청 함유)의 배지로 배양액을 교체하고 정제된 DC를 투여하여 최종 농도가 2.5 내지 25 ㎍/㎖ 되도록 하였다. 72 시간이 경과한 후 MTT 시약을 넣고 DMSO를 투여한 후, ELISA로 측정한 다음 다음 수학식 1에 따라 혈관 내피 세포의 생육도를 계산하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 본원 발명의 방법으로 추출 및 정제된 DC는 10㎍/㎖의 처리 농도에서 혈관 내피 세포에 대해 독성을 나타내지 않았으며, 20 ㎍/㎖의 농도에서 10% 전후의 약한 독성을 나타내었다.

따라서, 이후 수행한 신생혈관 생성 억제 활성은 DC가 혈관 내피 세포에 대해 독성을 나타내지 않고 혈관 내피 세포에 대해 충분한 생육 억제도를 나타내는 농도인 5 ㎍/㎖에서 수행하였다.

실시예 7

혈관 내피 세포에 대한 생육 억제 활성

DC가 혈관 생성인자의 자극에 의한 혈관 내피 세포의 증식을 억제한다는 사실은 신생혈관생성을 억제할 수 있다는 것을 의미하므로, DC의 혈관 내피 세포 생육에 대한 효과를 다음과 같이 확인하였다.

6 내지 12시간 동안 무혈청 배지에서 기아 상태로 배양시킨 혈관 내피 세포를 96-웰 플레이트에 5X10³세포/웰의 세포수가 되도록 분주한 후 3시간 동안 37℃에서 5% CO₂배양기속에서 배양하였다. 세포가 바닥에 부착되어 있으면 PBS 1 ㎖로 웰을 세척한 후 1 ㎖의 무혈청 M199 배지로서의 배양액 100 ㎕와 bFGF 및 DC를 농도별로 투여하였다. 72 시간이 경과한 후, MTT 시약을 넣고 DMSO를 투여한 후, ELISA로 측정한 다음 혈관 내피 세포의 증식율을 다음 수학식 2에 따라 계산하였다.

도 4에 나타낸 결과에서와 같이, 본 발명에 의해 추출 및 정제된 DC는 2.5 ㎍/㎖의 농도에서부터 혈관 내피 세포의 증식을 효율적으로 억제하며, 5 ㎍/㎖의 농도에서는 50%의 생육 억제도(IC₅₀)의 효과를 나타내었다.

실시예 8

혈관생성 억제 활성

DC가 실질적으로 혈관 내피 세포의 혈관 형성을 억제하는지를 확인하기 위하여 혈관 내피 세포를 젤라틴으로 피복된 48-웰 다중플레이트에 1X10⁴세포/웰의 밀도로 분주하고 1 ㎖의 배지를 첨가하여 DC 5 ㎍/㎖를 처리한다. 37℃에서, 5% CO₂세포 배양기속에서 배양하면서 시간별로 혈관 생성 유무를 사진으로 찍는다(참조: 도 5).

실시예 9

혈관 세포의 화학주성에 대한 억제 활성

혈관 내피 세포의 혈관 형성 특징으로서, 이들 혈관 내피 세포는 원발암 세포에서 유래되는 혈관 생성인자에 대해 반응하여 운동성을 보이는 성질이 있다.DC의 혈관 세포의 화학주성에 대한 억제 활성을 측정하기 위해 다음의 실험을 수행하였다. 공극 크기가 8.0 ㎛인 폴리카르보네이트 필터가 있는 인서트 챔버를 사용하였다. 이 필터의 하단을 젤라틴으로 피복한다. 주 챔버(24-웰 다중플레이트)에 혈관 생성인자를 포함하는 배지 600 ㎕, BSA(100 ㎍/ml) 6 ㎕, bFGF(10 ㎍/ml) 1.8 ㎕ 등을 첨가하고 인서트 챔버에는 혈관 내피 세포(1X10⁵세포/웰)를 포함하는 배지 400 ㎕를 넣은 후, 인서트 챔버를 주 챔버에 넣는다. 37℃의 배양기에 넣어 4시간 배양한 후 인서트 챔버의 폴리카보네이트 필터를 떼어내어 고정한 후, 헤마톡실린-에오신으로 염색하여 화학주성에 의해 막을 통과한 세포의 수를 계산한다. 결과는 웰당 막을 통과한 혈관 내피 세포의 수로 나타내며, 혈관 생성인자에 의한 혈관 내피 세포의 화학주성도를 다음 수학식 3으로 계산한다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 추출 및 정제된 DC(5 ㎍/㎖)는 혈관 생성인자(bFGF)에 의해 유도된 화학주성을 억제한다.

실시예 10

혈관 세포의 기저 조직 침투 활성 억제도

혈관 내피 세포는 화학주성 뿐만 아니라, 종양을 둘러싼 조직을 침투하는 성질을 가지고 있으며, 이는 혈관신생의 주요한 과정이다. 혈관 세포의 기저조직 침투 활성에 대한 DC의 효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

공극 크기가 8.0 ㎛인 폴리카보네이트 필터가 장착된 인서트 챔버를 사용한다. 필터 하단을 젤라틴으로 피복하고 필터의 상단은 마트리겔로 피복한다. 주 챔버(24-웰 다중플레이트)에 혈관 생성인자를 포함하는 배지 600 ㎕, BSA(100 ㎕/㎖) 6 ㎕, 각 샘플을 농도에 맞게 6 ㎕, bFGF(10 ㎍/㎖) 1.8 ㎕를 첨가하고 인서트 챔버에는 혈관 내피 세포(1X10⁵세포/웰)를 포함하는 배지 400 ㎕를 넣은 후, 인서트 챔버를 주 챔버에 넣는다. 37℃의 배양기속에 넣어 16 내지 20시간 배양한 후 인서트 챔버의 폴리카보네이트 필터를 떼어 내어 고정한 후 헥마톡실린-에오신으로 염색하여 마트리겔을 분해하고 이 필터를 통과한 세포의 수를 측정한다. 결과는 웰당 필터를 통과한 혈관 내피 세포의 수로 나타내며, 다음 수학식 4에 따라 혈관 내피 세포의 기저조직 침투도를 계산한다.

도 7에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 추출 및 정제된 DC(5㎍/ml)는 혈관 생성인자(bFGF)에 의한 기저조직 침투 유도를 효율적으로 억제함이 밝혀졌다.

실시예 11

난황막 혈관신생 억제 활성

이상의 실험관내 시험에서 DC의 혈관 내피 세포의 혈관신생에 대한 억제 활성과, 추가로 본 발명의 DC 유도체의 혈관 내피 세포의 혈관신생에 대한 억제 활성을 생체내에서 확인하기 위하여 난황막에서 혈관신생 억제 활성을 측정하였다. 부화용 계란을 37℃에서 배양기속에서 3일 동안 배양한다. 3일이 경과한 후, 피하 침으로 계란 알부민을 제거하여 CAM과 난황낭을 난막(shell membrane)으로부터 제거한다. 4 내지 5일이 경과한 후 배아난일 때, 터마녹스 커버슬립(thermanox coverslip)위에 DC를 처리한 후, 건조시켜 CAM 표면 위에 놓는다. 2일 후, 10% 지방 유액 2 ㎖을 CAM에 주입하고, CAM을 현미경으로 관찰한다. DC 처리 후, CAM에서 구혈 영역(avascular zone)이 관찰되면, 이를 양성으로 측정한다. 각 실험을 3회 수행하였으며, 하나의 실험당 20개의 계란을 사용하였다. 표 4에서 알수 있는 바와 같이, DC는 대조군인 레티노인산과 거의 유사한 신생혈관 생성 억제 활성을 나타내며, 따라서 새로운 신생혈관 생성 억제제임이 확인되었다.

난황막 신생혈관 생성 억제 활성

	양/디스크	억제(%)
대조군	메탄올 2㎕	15
레티노인산	20 ㎍	89
DC	20 ㎍	86
디메틸화 DC	20 ㎍	85
옥심 유도체	20 ㎍	80
하이드라진 유도체	20 ㎍	94

이상에서, 본 발명을 첨부 도면을 참조하여 설명하였으나, 이러한 구성과 실시예는 본 발명을 예시하는 것이지 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니되며, 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 범위내에서 다양한 수정과 변경이 가능하다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 이하의 특허청구의 범위는 이러한 수정과 변경을 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 방법에 의해 한약 소재인 울금(학명:Curcuma aromatica)으로부터 신생혈관생성억제제로서 데메톡시커큐민이 효율적으로 추출 및 정제될 수 있으며, 이러한 방법으로 수득된 데메톡시커큐민으로 부터 신생혈관 생성 억제제인 새로운 유도체가 합성될 수 있을 뿐 아니라, 이들 화합물이 함유된 암 예방용 기능성 음료 및 제제가 제공된다.

Claims

울금(Curcuma aromatica)을 70 내지 98%의 메탄올 용매 중에서 55 내지 65℃의 온도에서 2 내지 5시간 동안 열 처리함을 포함하여, 울금으로부터 데메톡시커큐민을 추출하는 방법.
하기 화학식 2의 디메틸화 데메톡시커큐민.

화학식 2
화학식 1의 데메톡시커큐민을 아세톤속에서 메틸요오다이드 및 K₂CO₃와 반응시킴을 포함하는, 하기 화학식 2의 디메틸화 데메톡시커큐민의 합성방법.

화학식 1

화학식 2
제3항에 따른 디메틸화 데메톡시커큐민을 함유하는, 신생혈관 생성 억제용 제제.
제4항에 있어서, 유산균으로서 비피도박테리아(Bifidobacteria) 또는 락토바실러스(Lactobacillus)를 추가로 포함하는 기능성 음료로서의 제제.
제5항에 있어서, 암 예방용 기능성 음료로서의 제제.
하기 화학식 3의 DC 옥심.

화학식 3
화학식 1의 데메톡시커큐민을 메탄올에 용해한 다음, 이에 벤질 하이드록실아민과 트리에틸아민을 첨가하여, 가열하에 교반하면서 반응시킨 후, 반응물을 정제하여 DC 옥심 유도체를 수득함을 포함하는, 하기 화학식 3의 DC 옥심의 합성방법.

화학식 1

화학식 3
제7항에 따른 DC 옥심을 함유하는, 신생혈관 생성 억제용 제제.
제9항에 있어서, 유산균으로서 비피도박테리아(Bifidobacteria) 또는 락토바실러스(Lactobacillus)를 추가로 포함하는 기능성 음료로서의 제제.
제10항에 있어서, 암 예방용 기능성 음료로서의 제제.
하기 화학식 4의 하이드라진 DC.

화학식 4
화학식 1의 데메톡시커큐민을 메탄올에 용해하고, 이에 하이드라진을 첨가한 다음, 아세트산을 가하여 교반하에 반응시킨 후, 반응물을 정제하여 하이드라진 DC를 수득함을 포함하는, 하기 화학식 4의 하이드라진 DC의 합성방법.

화학식 1

화학식 4
제12항에 따른 하이드라진 DC를 함유하는, 신생혈관 생성 억제용 제제.
제14항에 있어서, 유산균으로서 비피도박테리아(Bifidobacteria) 또는 락토바실러스(Lactobacillus)를 추가로 포함하는 기능성 음료로서의 제제.
제15항에 있어서, 암 예방용 음료로서의 제제.