KR20020068541A - 화분 특이적 징크 핑거 전사 인자 유전자의 사용에 의한화분 임성의 저하방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 웅성 불임성 식물을 생성하는 방법으로서, 페투니아 유래의 징크 핑거 전사 인자 (ZPT2-5, ZPT3-1 및 ZPT4-1)를 코딩하는 DNA인 핵산, 및 상기 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물 발현 카세트를 사용한 웅성 불임성 식물의 생성 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은, ZPT3-1 및 ZPT4-1 유전자 유래의 프로모터, 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 유전자를 포함하는 식물 발현 카세트를 사용한 형질 변경 식물의 생성 방법을 제공한다.

Description

화분 특이적 징크 핑거 전사 인자 유전자의 사용에 의한 화분 임성의 저하 방법{Method for lowering pollen fertility by using pollen-specific zinc finger transcriptional factor genes}

화분의 임성(稔性)은 여러 측면의 농업 및 원예에 있어서 문제를 야기한다. 예를 들어, 교차 육종을 위한 교배의 경우, 제웅 (除雄) (수술의 제거)에 의해 자가 수분이 회피되어야 하는데 이는 막대한 노력을 필요로 한다. 종묘 산업에 있어서, 교차 육종에 의해 수득되는 우수한 품종을 상업적으로 보호한다고 하는 관점으로부터, 화분 임성이 결여된 형질이 요구되고 있다. 이러한 요구에 부응하기 위하여, 화분의 임성을 제어하는 기술 (수분작용 제어, pollination control)이 강력히 요구되어 왔다. 종래에는, 특정의 작물에 있어서 세포질 웅성 불임성의 계통이 교차 육종에 사용되었으며 약간의 성공이 성취되었다. 그러나, 세포질 불임 형질은 종종 내병성의 저하 등과 같은 바람직하지 못한 부작용을 수반한다. 또한 형질이 불안정하여 종자의 대량 생산이 곤란한 것 등과 같은 문제가 있다. 화학 약품(들) 처리에 의해 임성을 저하시키는 방법도 연구되고 있지만, 상기 방법의 안전성 평가 및 작용 기작 설명이 완전히 행해지지 않아 이러한 방법은 아직 실용화되지 않았다. 따라서, 유전자 공학을 사용한 우수한 웅성 불임화 기술이 요구되고 있다.

화분은 종자 식물에 있어서 웅성 배우체이다. 지지체 조직으로서 약(葯)에 의해 화분이 둘러싸이면서 진행되는 화분의 발달은, 소포자 형성 세포 (화분 모세포)의 감수분열 직후의 사분자기; 사분자로부터의 소포자의 방출기; 화분 세포의 확대 및 기포 형성을 특징으로 하는 일핵기; 유사 분열에 의해 영양 세포 및 생식 세포의 분화가 일어나는 유사 세포 분열기; 및 그 후의 이핵기로 나뉘어진다. 이러한 단계 후, 최종적으로 약이 열개되며, 성숙된 화분립이 방출된다. 따라서, 소포자는 화분의 발달을 저해하며, 화분 임성을 제거하기 위하여 인위적으로 제어하기에 가장 적합한 표적 조직 중 하나라고 할 수 있다.

상기한 바와 같이, 유전자 공학을 사용한 웅성 불임화 기술이 크게 기대되고있다. 특히, 소포자와 같은 화분 세포의 적접적인 전구체에서 특이적으로 발현되는 유전자를 이용할 수 있다면, 식물에 바람직하지 않은 형질을 부여하지 않고도 웅성 불임화를 성취할 가능성이 커질 것이라 생각된다. 다양한 수술 조직에 특이적인 프로모터 및 상기 프로모터를 포함하는 웅성 불임화를 위한 유전자 구축물의 여러 예가 보고되어 있다 (Shivanna 및 Sawhney 편저, Pollen biotechnology for crop production and improvement (Cambridge University Press), pp. 237-257, 1997). 그러나, 발현의 조직 특이성 및 시기 특이성이 높으며 화분 임성의 제어에 유용한 신규한 유전자에 대한 요구가 끊임없이 존재하여 왔다.

본 발명자들은 최근, 페투니아 유래의 신규한 전사 인자, 즉, PEThy ZPT2-5, PEThy ZPT3-1, 및 PEThy ZPT4-1 (이하, ZPT2-5, ZPT3-1, 및 ZPT4-1로 각각 약칭함)을 포함하여 7개의 징크 핑거 (ZF) 전사 인자의 cDNA 서열을 특정하였다. 그리고, 본 발명자들은, 노던 블롯 분석에 의하면 각각의 전사 인자가 약-특이적 방식으로 약의 발달의 상이한 단계에서 일시적으로 발현한다는 것을 보고하였다 (Kobayashi 등, Plant J. 13: 571, 1998). 그러나, 이러한 전사 인자의 식물에 있어서의 생리적인 기능 및 작용, 그리고 전사 인자를 코딩하는 유전자의 정확한 발현 부위 및 발현 제어 기작은 명확하지 못하였다.

(발명의 요약)

본 발명의 목적은, 웅성 불임성으로 대표되는, 식물 형질의 식물 형질의 변경에 유용한 화분-특이적 유전자를 사용한 유전자 공학 기술을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 이전에 페투니아로부터 단리된 약-특이적 전사 인자를 코딩하는 유전자 (ZPT2-5, ZPT3-1, 및 ZPT4-1)를 페투니아 내로 재도입하였다. 그 결과, 화분의 정상적인 발달이 저해되어 화분 임성이 현저하게 저하되거나 (ZPT2-5 및 ZPT4-1), 실질적으로 제거 (ZPT3-1)됨을 알아내었다. 또한 본 발명자들은 ZPT3-1 및 ZPT4-1의 게놈 유전자의 상류 영역을 각각 단리하여, 프로모터 활성의 조직 특이성을 연구하였다. 그 결과, 일핵기 내지 이핵기의 소포자에 있어서, 프로모터 활성이 조직- 및 시기-특이적 방식으로 발현된다는 것을 알아내었다. 본 발명은 이러한 발견에 기초하여 완성되었다.

본 발명의 제1 측면에 따르면, 웅성 불임성의 식물을 생성하는 방법은 하기 단계를 포함한다: (ⅰ) 서열 번호 1로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 777 위치의 서열을 가지는 DNA, (ⅱ) 엄격한 조건 하에서 (i)의 염기 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA, 및 (ⅲ) (i) 또는 (ⅱ)의 DNA의 단편 중 어느 하나의 핵산; 및 상기 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계, 화분의 발달을 제어하는 내인성 전사 인자 (여기서, 내인성 전사 인자를 코딩하는 유전자는 엄격한 조건 하에서 상기 핵산과 혼성화함)를 가지는 식물 세포를 제공하는 단계, 발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계, 발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계; 및 재생된 식물에 있어서 상기 핵산이 발현되어 내인성 전사 인자의 발현이 억제된 식물을 스크리닝하는 단계.

본 발명의 제2 측면에 따르면, 웅성 불임성 식물을 생성하는 방법은 하기 단계를 포함한다: (i') 서열 번호 3으로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1640 위치의 서열을 가지는 DNA, (ⅱ') 엄격한 조건 하에서 (i')의 염기 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA, 및 (ⅲ') (i') 또는 (ⅱ')의 DNA의 단편 중 어느 하나의 핵산; 및 상기 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계, 화분의 발달을 제어하는 내인성 전사 인자 (여기서, 내인성 전사 인자를 코딩하는 유전자는 엄격한 조건 하에서 상기 핵산과 혼성화함)를 가지는 식물 세포를 제공하는 단계, 발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계, 발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계; 및 재생된 식물에 있어서 상기 핵산이 발현되어 내인성 전사 인자의 발현이 억제된 식물을 스크리닝하는 단계.

본 발명의 제3 측면에 따르면, 웅성 불임성 식물을 생성하는 방법은 하기 단계를 포함한다: (ⅰ") 서열 번호 5로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1948 위치의 서열을 가지는 DNA, (ⅱ") 엄격한 조건 하에서 (ⅰ")의 염기 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA, 및 (ⅲ") (ⅰ") 또는 (ⅱ")의 DNA의 단편 중 어느 하나의 핵산; 및 상기 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계, 화분의 발달을 제어하는 내인성 전사 인자 (여기서, 내인성 전사 인자를 코딩하는 유전자는 엄격한 조건 하에서 상기 핵산과 혼성화함)를 가지는 식물 세포를 제공하는 단계, 발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계, 발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계; 및 재생된 식물에 있어서 상기 핵산이 발현되어 내인성 전사 인자의 발현이 억제된 식물을 스크리닝하는 단계.

(ⅱ), (ⅱ') 및 (ⅱ")의 DNA는, 각각 (iv) 엄격한 조건 하에서 서열 번호 13에 의해 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1886 위치의 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA를 포함하지 않는다. 서열 번호 13에 의해 나타내어지는 염기 서열은, 페투니아로부터 단리된 다른 전사 인자 ZPT3-2를 코딩하는 cDNA 서열이다 (Kobayashi 등의 상기 문헌).

본 발명의 제1 내지 제3 측면에 따른 방법은 식물에 웅성 불임성을 부여하는 방법으로 이용된다.

상기 제1 내지 제3 측면의 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 핵산은 상기 프로모터에 대하여 순방향으로 연결되어, 상기 식물 세포 내에서 센스 방향으로 전사될 수 있다.

상기 제1 내지 제3 측면의 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 핵산은 상기 프로모터에 대하여 역방향으로 연결되어, 상기 식물 세포 내에서 안티센스 방향으로 전사될 수 있다.

상기 제1 내지 제3 측면의 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽식물이다. 쌍자엽식물은 바람직하게는 가지과 (Solanaceae) 식물, 더 바람직하게는 페투니아속 식물이다.

상기 제1 내지 제3 측면의 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 발현 카세트는 식물 발현 벡터 내로 조합된다.

본 발명의 제1 내지 제3 측면에 따르면, 상기 방법 중 어느 하나의 방법에 따른 방법에 의해 생성되는 웅성 불임성 식물이 또한 제공된다.

본 발명의 제4 측면에 따르면, 형질이 변경된 식물을 생성하는 방법은 하기 단계를 포함한다: (a') 서열 번호 7로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 2624 위치의 서열을 가지는 DNA, 및 (b') (a')의 서열의 일부를 가지며 소포자에 특이적인 프로모터 활성을 나타내는 DNA 중 어느 하나를 포함하는 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 유전자를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계, 발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계, 및 발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계.

본 발명의 제5 측면에 따르면, 형질이 변경된 식물을 생성하는 방법은 하기 단계를 포함한다: (a") 서열 번호 8로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 3631 위치의 서열을 가지는 DNA, 및 (b") (a")의 서열의 일부를 가지며 소포자, 및 임의로 약의 개열 조직에 특이적인 프로모터 활성을 나타내는 DNA 중 어느 하나를 포함하는 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 유전자를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계, 발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계, 및 발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계.

상기 제4 및 제5 측면의 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 형질은 임성이며, 형질이 변경되는 식물은 웅성 불임성 식물이다. 따라서, 본 발명의 상기 방법은 식물에 웅성 불임성을 부여하는 방법으로 이용될 수 있다.

상기 제4 및 제5 측면의 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 형질은 화합성이며, 형질이 변경된 식물은 자가-불화합성 식물이다. 따라서, 본 발명의 상기 방법은 식물에 자가-불화합성을 부여하는 방법으로 이용될 수 있다.

상기 제4 및 제5 측면의 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽식물이다. 쌍자엽식물은 바람직하게는 가지과 식물이며, 더 바람직하게는 페투니아속 식물이다.

상기 제4 및 제5 측면의 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 발현 카세트는 식물 발현 벡터 내로 조합된다.

상기 제4 및 제5 측면의 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 방법 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 생성되는 형질-변경 식물이 제공된다.

본 발명의 제6 측면에 따르면, 프로모터는 하기 (I') 또는 (ⅱ')의 DNA를 포함한다: (I') 서열 번호 7로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 2624 위치의 서열을 가지는 DNA, 또는 (ⅱ') (I')의 서열의 일부를 가지며 소포자에 특이적인 프로모터 활성을 나타내는 DNA.

본 발명의 제7 측면에 따르면, 프로모터는 하기 (ⅰ") 또는 (ⅱ")의 DNA를 포함한다: (ⅰ") 서열 번호 8로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 3631 위치의 서열을 가지는 DNA, 또는 (ⅱ") (ⅰ")의 서열의 일부를 가지며 소포자, 및 임의로 약의 개열 조직에 특이적인 프로모터 활성을 나타내는 DNA.

본 발명의 제8 측면에 따르면, 웅성 불임성을 식물에 부여하는 데에 유용한식물 발현 카세트는, 임의의 상기 소포자-특이적 프로모터 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 유전자를 포함한다.

(도면의 간단한 설명)

도 1은 ZPT2-5를 코딩하는 유전자 (이하, 간단히 "ZPT2-5 유전자"로도 칭함)의 cDNA 서열, 및 대응하는 아미노산 서열을 나타내는 도면이다. 2개의 징크 핑거 모티프, 및 DLNL 서열 (145 위치 내지 155 위치의 아미노산)을 밑줄로 표시하였다.

도 2는 ZPT3-1를 코딩하는 유전자 (이하, 간단히 "ZPT3-1 유전자"로도 칭함)의 cDNA 서열, 및 대응하는 아미노산 서열을 나타내는 도면이다. 3개의 징크 핑거 모티프, 및 DLNL 서열 (408 위치 내지 417 위치의 아미노산)을 밑줄로 표시하였다.

도 3은 ZPT4-1을 코딩하는 유전자 (이하, 간단히 "ZPT4-1 유전자"로도 칭함)의 cDNA 서열, 및 대응하는 아미노산 서열을 나타내는 도면이다. 4개의 징크 핑거 모티프, 및 DLNL 서열 (438 위치 내지 449 위치의 아미노산)을 밑줄로 표시하였다.

도 4는 ZPT2-5, ZPT3-1 및 ZPT4-1의 각각의 cDNA 서열의 발현을 위한 식물 발현 벡터 (pBIN-35S-ZPT2-5, pBIN-35S-ZPT3-1 및 pBIN-35S-ZPT4-1)의 구조를 나타내는 개략도이다.

도 5는 ZPT3-1 유전자의 코딩 영역의 상류 서열을 나타내는 도면이다. 전사 개시 부위 (2567 위치)를 진한 화살표로 표시하였다. 번역 개시 코돈 (ATG)을 진한 밑줄로 표시하였다.

도 6은 ZPT4-1 유전자의 코딩 영역의 상류 서열을 나타내는 도면이다. 전사 개시 부위 (3503 위치)를 진한 화살표로 표시하였다. 번역 개시 코돈 (ATG)을 진한 밑줄로 표시하였다.

도 7은 ZPT3-1 및 ZPT4-1 유전자의 프로모터를 분석하기 위한 식물 발현 벡터 (pBIN-ZPT3-1-GUS 및 pBIN-ZPT4-1-GUS)의 구조를 나타내는 개략도이다.

도 8은 유기체, 즉, 야생형 페투니아의 화분 및 pBIN-35S-ZPT2-5가 도입된 페투니아 (공동억제 (cosuppression)가 일어난 형질전환체)의 화분의 형태를 나타내는 사진 (배율은 400배임)을 나타낸다. 도 8(a) 내지 (d)는 야생형 페투니아의 사진이며 도 8(e) 내지 (h)는 공동억제 형질전환 페투니아의 사진인데, 이들 각각은 상이한 발달 단계의 눈 (bud)의 화분을 나타낸다. 모든 화분은 통상적인 방법으로 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌 n-히드레이트)를 사용하여 염색하였다.

도 9는 유기체, 즉, 야생형 페투니아의 화분 및 pBIN-35S-ZPT3-1가 도입된페투니아의 화분의 형태를 나타내는 사진 (배율은 700배임)을 나타낸다. 도 9(a) 내지 (c)는 야생형 페투니아의 사진이며 도 9(b) 및 (d)는 형질전환 페투니아의 사진인데, 이들 각각은 사분자기 및 소포자기의 화분을 각각 나타낸다. 사분자기의 화분 및 소포자기의 화분을, 통상적인 방법으로 DAPI 및 사프라닌을 사용하여 각각 염색하였다. pBIN-35S-ZPT4-1이 도입된 페투니아의 화분은 도 9(b) 및 9(d)와 실질적으로 동일한 형태를 나타내었다.

도 10은 유기체, 즉, pBIN-ZPT3-1-GUS 및 pBIN-ZPT4-1-GUS가 도입된 페투니아의 GUS-염색 꽃 기관의 형태를 나타내는 사진을 나타낸다. 각각의 사진은 약이 일핵기의 것인 꽃 (눈)을 촬영하였다. 도 10(a) 및 (d)는 실제 크기의 눈의 외관을 나타낸다. 도 10(b) 및 (e)는 저배율 (40배)에서의 약의 단면도를 나타낸다. 도 6(c) 및 (f)는 소포자 (도 6(c); 배율은 700배임)의 단면도, 및 고배율에서의 약의 개열 개열 조직 및 주변 근처의 단면도 (도 6(f); 배율은 200배임)를 나타낸다.

본 발명은 수술의 화분 생성 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자 및 그의 용도에 관한 것이다. 더욱 특히는, 본 발명은 소포자에서 특이적으로 발현되는 페투니아 (Petunia) 유래의 징크 핑거 (zinc finger) 전사 인자 (ZPT2-5, ZPT3-1 및 ZPT4-1)의 유전자 및 그의 용도에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

(ZPT3-2, ZPT3-1 및 ZPT4-1 유전자 유래의 전사 인자)

본 발명의 제1 내지 제3 측면에 따른 웅성 불임성 식물의 생성 방법에 유용한 핵산은 하기 DNA 중 어느 하나이다:

(i) 서열 번호 1로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 777 위치의 서열을 가지는 DNA,

(i') 서열 번호 3으로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1640 위치의 서열을 가지는 DNA,

(ⅰ") 서열 번호 5로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1948 위치의 서열을 가지는 DNA,

엄격한 조건 하에서 (i) 내지 (ⅰ") 중 어느 하나의 염기 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA (즉, (ⅱ), (ⅱ') 또는 (ⅱ")); 또는

상기 중 어느 하나의 DNA의 단편 (즉, (ⅲ), (ⅲ') 또는 (ⅲ"))인 DNA.

상기 본 발명의 핵산은 바람직하게는 (i), (i') 또는 (ⅱ")의 DNA, 즉,ZPT2-5, ZPT3-1 또는 ZPT4-1을 코딩하는 DNA, 또는 그의 단편, 더 바람직하게는 (i), (i') 또는 (ⅱ")의 DNA이다.

본 명세서에 있어서, "전사 인자"는 유전자의 조절 영역의 DNA에 결합하여 mRNA의 합성을 제어하는 단백질을 나타낸다. 특정 형태의 전사 인자는 DNA 결합 도메인에 징크 핑거 (ZF) 모티프라 불리우는 보존성이 큰 아미노산 서열을 가진다는 것이 알려져 있다. ZPT2-5는, Cys2/His2형 (EPF 패밀리)의 징크 핑거 (ZF) 단백질로서, 176개의 아미노산으로 이루어진 전장 의 아미노산 서열 내에 2개의 ZF 모티프, 및 추가로 DLNL 서열로 불리우는 소수성 영역을 포함하는 전사 인자이다.

이와 유사하게, ZPT3-1은, EPF 패밀리의 ZF 단백질로서, 437개의 아미노산으로 이루어진 전장의 아미노산 서열 내에 3개의 ZF 모티프, 및 추가로 DLNL 서열을 포함하는 전사 인자이다. 이와 유사하게, ZPT4-1은, EPF 패밀리의 ZF 단백질로서, 474개의 아미노산으로 이루어진 전장의 아미노산 서열 내에 4개의 ZF 모티프, 및 추가로 DLNL 서열을 포함하는 전사 인자이다. 임의의 상기 전사 인자에 대해서는, Kobayashi 등의 상기 문헌 참조. ZPT2-5, ZPT3-1 및 ZPT4-1을 코딩하는 cDNA 서열 (서열 번호 1, 3 및 5)를 대응하는 추정 아미노산 서열 (서열 번호 2, 4 및 6)과 함께 도 1, 2 및 3에 각각 나타내었다.

본 명세서에 있어서, 핵산 또는 DNA의 "단편"은, 적합한 방식으로 식물에 도입되어 발현될 경우 식물의 내인성 전사 인자의 발현을 저해할 수 있는 단편을 나타낸다. 이러한 단편은 상기 (i), (i'), (ⅰ"), (ⅱ), (ⅱ') 또는 (ⅱ")의 DNA의, 징크 핑거 모티프를 코딩하는 영역 이외의 영역으로부터 선택된다. 단편은 약 40개 이상의 염기, 바람직하게는 약 50개 이상의 염기, 더 바람직하게는 약 70개 이상의 염기, 훨씬 더 바람직하게는 약 100개 이상의 염기 길이를 가진다.

본 명세서에 있어서, 혼성화를 위한 "엄격한 조건"은 특정 염기 서열 (예를 들어 페투니아 유래의 ZPT2-5, ZPT3-1 또는 ZPT4-1) 및 상기 특정 염기 서열과의 상동성이 큰 다른 염기 서열 (예를 들어 페투니아 이외의 식물에 존재하며 ZPT2-5, ZPT3-1 또는 ZPT4-1의 호몰로그를 코딩하는 DNA)의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 형성에 충분한 조건을 의도한다. 본 발명에 적용되는 엄격한 조건의 대표예로는 하기가 있다: 혼성화는, 1M NaCl, 1% SDS, 10% 덱스트란 술페이트, 32P-표식 프로브 DNA (1 x 107 cpm) 및 50 ㎍/ml 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서, 60℃에서 16시간 동안 수행되며, 이어서 2 x SSC/1% SDS로 60℃에서 30분 동안 세척한다.

본 발명에 있어서, ZPT2-5, ZPT3-1 및 ZPT4-1을 코딩하는 DNA, 및 엄격한 조건 하에서 상기 DNA와 혼성화하여 화분의 발달을 저해하는 전사 인자를 코딩하는 DNA를 단리하기 위하여, 공지의 전사 인자 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 보존 영역에 대응하는 디제너레이트 (degenerate) 프라이머쌍을 사용할 수 있다. PCR은 식물의 cDNA 또는 게놈 DNA를 주형으로 하여 상기 프라이머쌍을 사용하여 수행하며, 그 후, 생성된 증폭 DNA 단편을 프로브로 사용하여 동일 식물의 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 이러한 프라이머쌍의 예로는, 5'-CARGCNYTNGGNGGNCAY-3' (서열 번호 9), 및 3'-RTGNCCNCCNARNGCYTG-5' (서열 번호 10)의 조합을 들 수 있다 (여기서, N은 이노신을 나타내며, R은 G 또는 A를 나타내고, Y는 C 또는 T를 나타냄). 상기 프라이머 서열 각각은 상기 ZPT 전사 인자의 징크 핑거 모티프에 포함된 아미노산 서열 QALGGH에 대응한다.

따라서, 본 발명에 적용되는 엄격한 혼성화 조건은 PCR에 있어서도 사용될 수 있다. 대표예에 있어서, 상기 디제너레이트 프라이머 (서열 번호 9 및 10)가 사용될 수 있다. 상기의 경우, PCR 반응 조건은 하기일 수 있다: 94℃에서 5분 동안의 변성; 이어서 94℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 30 사이클; 및 최종적으로 72℃에서 7분 동안의 인큐베이션.

PCR은 시판 키트 및 장치의 경우 제조자의 지침에 기초하여, 또는 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 방법에 기초하여 수행될 수 있다. 유전자 라이브러리의 제조 방법, 유전자의 클로닝 방법 등도 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어 Sambrook 등의 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)] 참조. 생성된 유전자의 염기 서열은 당업계에 공지된 뉴클레오티드 서열 분석 방법, 또는 시판되는 자동 서열결정기 (sequencer)로 결정될 수 있다.

본 명세서에 있어서, 전사 인자에 의해 "화분의 발달을 제어한다"는 것은, 대표적으로는 상기 전사 인자의 발현을 저해할 경우, 화분의 형태 또는 기능에 있어서의 현저한 변화가 관찰된다는 것을 의미한다. 대표적으로는, 본 발명의 전사 인자를 코딩하는 유전자의 발현을 저해함으로써, 바람직하게는 약 75% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 95% 이상의 화분 세포를 성숙 전에 사멸시킨다. 노던 블롯 방법에 의해 측정되는 mRNA의 양이 야생형 대조 식물와 비교하여 약 1/10 이하일 경우, 전사 인자의 발현이 저해된 것으로 판단한다.

상기와 같은 스크리닝에 의해 단리 동정되는 유전자에 의해 코딩되는 전사 인자 (즉, ZPT2-5, ZPT3-1, ZPT4-1 및 그의 호몰로그)가 화분의 발달을 제어하는지의 여부는, 본 명세서의 개시내용에 따라 형질전환 식물을 생성하여 상기 식물의 화분의 특성을 관찰함으로써 확인될 수 있다.

본 발명에 따르면, 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA를 이용하여, 식물 세포에 있어서 상기 DNA와 동일하거나 상동성인 염기 서열을 가지는 내인성 유전자의 발현을 저해할 수 있다. 이러한 표적 내인성 유전자는 또한 화분의 발달을 제어하는 전사 인자이다. 본 발명의 방법에 따르면, 바람직하게는 화분의 발달을 제어하는 내인성 전사 인자 이외의 유전자의 발현을 실질적으로 저해하지 않으면서 내인성 전사 인자의 발현만을 선택적으로 저해함으로써 식물에 웅성 불임성을 부여한다.

즉, 본 발명의 발현 저해 기술을 적용한 식물 세포는 화분의 발달을 제어하는 내인성 전사 인자를 가지는 식물 세포이다. 이러한 내인성 전사 인자를 코딩하는 유전자는 상기 ZPT2-5, ZPT3-1 또는 ZPT4-1, 또는 그의 호몰로그와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 유전자로 정의된다. "엄격한 조건"이라는 정의는 ZPT2-5, ZPT3-1 및 ZPT4-1의 호몰로그의 특정과 관련하여 기술한 것과 동일하다. 상기 방법으로 웅성 불임성이 부여될 수 있는 식물로는 상기 ZPT 유전자가 단리되는 페투니아, 또는 상기 ZPT 호몰로그를 코딩하는 유전자가 단리되는 식물과 진화계통학상 밀접하게 연관된 식물이 바람직하지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. "진화계통학상 밀접하게 연관된 식물"은 대표적으로는 동일 목으로 분류되는 식물, 바람직하게는 동일 과, 더 바람직하게는 동일 속, 훨씬 더 바람직하게는 동일 종으로 분류되는 식물을 의미한다. 화분의 발달이 종자 식물의 생식에 필수적이라는 사실을 고려하면, ZPT2-5, ZPT3-1 및 ZPT4-1과 동일하거나 유사한 기능을 가지는 전사 인자가 다른 식물에 광범위하게 존재할 수 있다는 것이 용이하게 이해될 수 있다.

내인성 유전자의 발현을 억제하기 위한 기술로서, 공동억제 및 안티센스 기술이 대표적으로 이용될 수 있다. 공동억제는, 재조합 유전자를 식물 세포 내로도입할 경우, 상기 유전자 그 자신 및 상기 유전자의 일부에 상동성인 서열을 포함하는 내인성 유전자 둘 모두의 발현이 억제되는 것을 말한다. 공동억제가 이용되는 경우, 본 발명에 따른 발현 카세트는, 프로모터에 대하여 순방향으로 연결된 형태의 전사 인자를 코딩하는 DNA 또는 그의 단편을 포함한다. 전사 인자를 코딩하는 DNA 또는 그의 단편을 발현 카세트로서 식물 세포 내로 도입한 후, DNA 또는 그의 단편은 프로모터의 제어 하에 센스 방향으로 전사될 수 있다. 도입된 DNA의 작용으로 인하여 표적 유전자 발현의 억제가 가능해진다. 공동억제는, 몇몇 형질전환 식물 개체에서 관찰될 수 있지만, 대부분은 다른 개체에서 충분히 일어나지 않는다. 따라서, 통상 유전자 발현이 의도된 방식으로 억제된 개체를 관용적인 수순으로 스크리닝한다.

안티센스는, 재조합 유전자를 식물 세포 내로 도입할 경우, 도입 유전자의 전사 생성물 (mRNA)가 내인성 유전자의 전사 생성물 (mRNA)의 상보성 서열과 하이브리드를 형성하여 내인성 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 번역을 저해하는 것을 의미한다. 안티센스가 이용되는 경우, 본 발명의 발현 카세트는 프로모터에 대하여 역방향으로 연결된 형태의 전사 인자를 코딩하는 DNA 또는 그의 단편을 포함한다. 전사 인자를 코딩하는 DNA 또는 그의 단편이 발현 카세트로서 식물 세포 내로 도입된 후, 상기 DNA 또는 그의 단편은 프로모터의 제어 하에서 안티센스 방향으로 전사될 수 있다. 안티센스 전사체의 작용으로 인하여 표적 유전자의 발현의 억제가 가능해진다.

(ZPT3-1 및 ZPT4-1 유전자 유래의 프로모터)

본 발명의 제4 및 제5 측면에 따른 형질이 변환된 식물의 생성 방법에 유용한 프로모터는, 임의의 (a') 서열 번호 7로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 2624 위치의 서열을 가지는 DNA; (a") 서열 번호 8로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 3631 위치의 서열을 가지는 DNA; 또는 (a') 또는 (a")의 서열의 일부를 가지며 소포자에 특이적인 프로모터 활성을 나타내는 DNA를 포함하는 프로모터이다. 상기 본 발명의 프로모터는 바람직하게는 (a') 또는 (a")의 프로모터, 즉, ZPT3-1 또는 ZPT4-1 유전자의 프로모터이다.

ZPT3-1 및 ZPT4-1 유전자의 프로모터 영역으로부터 조직-특이적 발현 활성에 필수적이지 않은 서열을 제거함으로써 얻어지는, 소포자에 특이적인 프로모터 활성을 가지는 서열은 본 발명의 범주 이내이다. 이러한 서열은 일반적으로 사용되는 방법에 따라 프로모터 결실 실험을 수행함으로써 수득될 수 있다. 간략하게는, ZPT3-1 또는 ZPT4-1 유전자의 여러 프로모터 영역 결실 돌연변이체 (예를 들어 ZPT3-1 또는 ZPT4-1 유전자의 5' 상류측으로부터 프로모터 영역을 여러 길이로 결실시킴으로써 수득되는 돌연변이체), 및 적합한 리포터 유전자 (예를 들어 GUS 유전자)를 융합시킴으로써 수득되는 플라스미드를 사용하여, 결실 돌연변이체의 조직-특이적 프로모터 활성을 측정함으로써 상기 활성에 필수적인 영역을 동정할수 있다.

일단 프로모터 활성에 필수적인 영역이 동정되면, 상기 영역 이내 또는 상기 영역에 인접한 서열을 변경하여 프로모터의 발현 활성의 정도를 증가시키는 것이 가능해진다. 이와 같이 수득되는 돌연변이체도, 돌연변이체가 소포자에 특이적인 프로모터 활성을 나타내는 한, 본 발명의 범주 이내이다.

본 발명에 있어서, "소포자에 특이적인 프로모터 활성을 나타낸다"는 것은, 천연의 식물 중에서, 또는 임의의 구조 유전자에 연결된 발현 카세트로서 프로모터가 도입된 식물에 있어서, 프로모터가 DNA의 전사의 개시에 의해 유전자의 발현을 지시하는 능력이 소포자에서 특이적으로 나타난다는 것을 의미한다. 여기에서, "특이적"이라는 것은, 프로모터의 발현 활성이 동일 식물의 꽃의 다른 모든 조직 (타페툼 (tapetum) 층, 화사, 화주, 화두, 꽃잎, 꽃받침 등을 포함함; 주: 약의 개열 조직은 제외됨)에서보다 더 크다는 것을 의미한다. 상기 특이적 프로모터는 바람직하게는 동일 식물의 꽃 및 꽃 이외의 부분의 다른 모든 조직에서의 발현 활성보다 더 큰 소포자에서의 발현 활성을 가진다. 더 바람직하게는, 특이적 프로모터는 동일 식물의 꽃 및 꽃 이외의 부분 (뿌리, 잎, 줄기 등)의 다른 모든 조직에서는 실질적으로 활성을 전혀 나타내지 않는다. "약의 개열 조직에 특이적인 프로모터 활성을 나타낸다"는 것은 상기와 유사한 방식으로 정의된다. 발현 활성의 정도는, 일반적으로 사용되는 방법에 따라 소포자에서의 프로모터의 발현 수준과, 다른꽃 조직에서의 동일 프로모터의 발현 수준을 비교함으로서 평가할 수 있다. 프로모터의 발현 수준은 대개 프로모터의 제어 하에 발현되는 유전자 생성물의 생성량에 의해 결정된다.

특이적 프로모터를 이용하는 상기 본 발명의 방법은 식물 생식에 관련된 형질을 변경하려고 하는 것이다. "변경"이라는 것은 형질전환 후의 식물의 생식 기관의 적어도 일부가 형질전환 전의 식물 (야생형 또는 원예 품종)에 존재하는 기능을 소실하거나, 형질전환 전의 식물에 존재하지 않았던 기능을 획득하거나, 형질전환 전의 식물과 비교하여 특정 기능의 수준이 증가 또는 감소되는 것을 의미한다. 이러한 형질의 변경은, 본 발명의 프로모터에 작동가능하게 연결된 임의의 이종성 유전자가, 상기 유전자를 도입한 형질전환 식물에서 프로모터의 제어 하에 소포자에 특이적으로 발현되는 결과로서 성취될 수 있다. 다수의 조직-특이적 프로모터에 있어서, 조직-특이성은 종간에 보존되어 있다는 것이 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 프로모터가 광범위한 식물종에 적용될 수 있다는 것이 용이하게 이해된다. 형질 변경의 정도는, 형질전환 후의 식물의 형질을 형질전환 전의 식물의 형질과 비교함으로써 평가될 수 있다. 변경되는 바람직한 형질로는, 자성 불임성 및 자가 불화합성을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

예를 들어, 본 발명의 프로모터는, 공지의 cDNA를 프로브로 사용하여, 식물의 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, 대응하는 게놈 클론으로부터 코딩 영역의 상류 서열을 단리함으로써 수득될 수 있다. cDNA의 예로는, 상기 페투니아 유래의 전사 인자인 ZPT3-1 및 ZPT4-1의 cDNA를 들 수 있다.

본 발명의 프로모터는 자연으로부터 단리되는 것에 한정되지 않으며, 합성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 합성 폴리뉴클레오티드는, 상기와 같이 서열결정한 프로모터의 서열 또는 그의 활성 영역을, 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 방법으로 합성 또는 변경시킴으로써 수득될 수 있다.

(발현 카세트 및 발현 벡터의 구축)

본 발명의 전사 인자를 코딩하는 DNA는, 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 방법을 사용하여, 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된 발현 카세트로서 공지의 유전자 재조합 기술을 이용하여 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이와 유사하게, 본 발명의 소포자-특이적 프로모터는, 소망하는 이종성 유전자에 작동가능하게 연결된 발현 카세트로서 식물 세포 내로 도입될 수 있다.

상기 전사 인자에 연결될 수 있는 "프로모터"는 임의의 구성적 (constitutive) 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 및 유도성 프로모터를 포함하여 식물에서 발현되는 모든 프로모터를 의미한다.

"구성적 프로모터"는, 식물 세포 내부 또는 외부의 자극과 관계 없이 일정 수준으로 구조 유전자가 발현되게 하는 프로모터를 의미한다. 이종성 유전자가 식물의 다른 조직 또는 기관에서 발현되어도, 식물에게 바람직하지 못한 형질이 부여되지 않는 경우, 구성적 프로모터의 사용이 간편하며 바람직하다. 이러한 구성적 프로모터의 예로는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35S 프로모터 (P35S), 및 노팔린 신타제의 프로모터 (Tnos)를 들 수 있으나, 구성적 프로모터가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, "조직-특이적 프로모터"는 적어도 소포자에 특이적으로 구조 유전자가 발현되게 하는 프로모터를 나타낸다. 이러한 조직-특이적 프로모터는 본 발명의 ZPT3-1 및 ZPT4-1 유전자로부터 유래되는 프로모터, 및 추가로 약-특이적 발현 활성을 가지는 기타 공지의 프로모터를 포함한다. 따라서, 소포자-특이적 프로모터, 및 전사 인자를 코딩하는 서열을 포함하는 천연 ZPT3-1 및 ZPT4-1 유전자의 발현 카세트를 임의로 다른 조절 요소와 조합하여 사용하는 것은 본 발명 이내이다.

"유도성 프로모터"는 화학 약제, 물리적 스트레스 등의 특정 자극의 존재 하에서 구조 유전자가 발현되게 하며, 상기 자극의 부재 하에서는 발현 활성을 나타내지 않는 프로모터를 나타낸다. 이러한 유도성 프로모터의 예로는, 옥신에 의해 유도될 수 있는 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST) 프로모터 (van der Kop, D. A.등, Plant Mol. Biol., 39: 979, 1999)를 들 수 있으나, 유도성 프로모터가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서, "발현 카세트" 또는 "식물 발현 카세트"라는 용어는 본 발명의 전사 인자를 코딩하는 DNA 및 상기 DNA에 작동가능하게 (즉, 상기 DNA의 발현을 제어할 수 있는 방식으로) 연결된 식물 발현 프로모터를 포함하는 핵산 서열, 및 본 발명의 소포자-특이적 프로모터 및 상기 프로모터에 작동가능하게 (즉, 인-프레임 (in-frame)으로) 연결된 이종성 유전자를 포함하는 핵산 서열을 나타낸다.

상기 소포자-특이적 프로모터에 연결될 수 있는 "이종성 유전자"는 ZPT3-1 및 ZPT4-1 유전자 이외의 페투니아의 내인성 유전자, 페투니아 이외의 식물에 있어서의 내인성 유전자, 또는 식물에 대하여 외인성인 유전자 (예를 들어 동물, 곤충, 세균류, 및 진균류 유래의 유전자)를 나타내는데, 여기서, 이러한 유전자 산물의 발현은 소포자에서 소망된다. 본 발명에 있어서 이러한 이종성 유전자의 바람직한 예로는, 세포독성 유전자 산물을 코딩하며 그의 발현이 화분의 발달을 저해하는 유전자이다. 이러한 유전자의 구체예로는 바르나제 (barnase) 유전자 (Beals, T. P. 및 Goldberg, R. B., Plant Cell 9: 1527, 1997)을 들 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

"식물 발현 벡터"는 발현 카세트, 및 이에 부가하여 숙주 식물의 세포 중에서 작동될 수 있는 방식으로 상기 카세트에 연결되어 있는 다양한 조절 요소를 포함하는 핵산 서열을 나타낸다. 바람직하게는, 이러한 식물 발현 벡터는 터미네이터, 약제 내성 유전자, 및 인핸서를 포함할 수 있다. 식물 발현 벡터의 형태 및 사용되는 조절 요소의 형태는 숙주 세포에 따라 다양해질 수 있다는 것은 당업계의 숙련자에게는 잘 알려진 사항이다. 본 발명에서 사용되는 식물 발현 벡터는 추가로 T-DNA 영역을 가질 수 있다. T-DNA 영역은, 특히 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 사용하여 식물을 형질전환시킬 경우, 유전자 도입의 효율을 증가시킨다.

"터미네이터"는 유전자의 단백질을 코딩하는 영역의 하류에 위치하며, DNA가 mRNA로 전사되는 경우 전사의 종결, 및 폴리 A 서열의 부가에 연루된 서열이다. 터미네이터가 mRNA의 안정성에 기여하며, 유전자 발현량에 영향을 끼친다는 것이 알려져 있다. 이러한 터미네이터의 예로는, 노팔린 신타제 유전자의 터미네이터 (Tnos), 및 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35S 터미네이터를 들 수 있으나, 터미네이터가 이에 한정되는 것은 아니다.

"약제-내성 유전자"는, 형질전환 식물의 선발을 용이하게 하는 것이 바람직하다. 카나마이신 내성을 부여하기 위한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NPTII) 유전자, 및 하이그로마이신 내성을 부여하기 위한 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자가 바람직하게 사용될 수 있지만, 약제 내성 유전자가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터는 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 식물 발현 벡터는, 예를 들어, 바람직하게는 pBI계 벡터 또는 pUC계 벡터를 사용하여 구축되지만, 식물 발현 벡터가 이에 한정되는 것은 아니다.

(형질전환 식물의 생성)

상기와 같이 구축되는 발현 카세트, 또는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터는, 공지의 유전자 재조합 기술을 사용하여 소망하는 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 도입된 발현 카세트는 식물 세포의 DNA 내로 통합되어 존재한다. 식물 세포 중의 DNA는, 염색체, 및 식물 세포 중에 포함되어 있는 여러 세포소기관 (organelle) (예를 들어 미토콘드리아, 및 엽록체) 중에 포함되는 DNA를 포함한다는 것을 알아야 한다.

본 명세서에 있어서, "식물"이라는 용어는 단자엽식물 및 쌍자엽식물을 포함한다. 바람직한 식물은 쌍자엽식물이다. 쌍자엽식물은 이판화아강 (Archichlamiidae) 및 합판화아강 (Sympetalidae)을 포함한다. 바람직한 아강은 합판화아강이다. 합판화아강은 임의의 용담목 (Gentianales), 가지목(Solanales), 꿀풀목 (Lamiales), 별이끼목 (Callitrichales), 질경이목 (Plantaginales), 초롱꽃목 (Campanulales), 현삼목 (Scrophulariales), 꼭두서니목 (Rubiales), 산토끼꽃목 (Dipsacales), 및 국화목 (Asterales)을 포함한다. 바람직한 목은 가지목이다. 가지목은 임의의 가지과 (Solanaceae), 히드로필라세아에 (Hydrophyllaceae), 꽃고비과 (Polemoniaceae), 쿠스쿠타세아에 (Cuscutaceae), 및 메꽃과 (Convolvulaceae)를 포함한다. 바람직한 과는 가지과이다. 가지과는 페투니아속, 독말풀속 (Datura), 담배속 (Nicotiana), 가지속 (Solanum), 토마토속 (Lycopersicon), 고추속 (Capsicum), 피살리스 (Physalis), 구기자나무속 (Lycium) 등을 포함한다. 바람직한 속은 페투니아속, 독말풀속, 및 담배속이며, 더 바람직한 것은 페투니아속이다. 페투니아속은 하기의 종을 포함한다: 피. 하이브리다 (P. hybrida), 피. 악실라리스 (P. axillaris), 피. 인플라타 (P. inflata), 피. 비올라세아 (P. violacea) 등을 포함한다. 바람직한 종은 피. 하이브리다이다. "식물"은 달리 특정되지 않는 한, 현화식물 및 상기 식물로부터 수득되는 종자를 의미한다.

"식물 세포"의 예로는, 꽃, 잎, 뿌리 등과 같은 식물 기관의 각 조직의 세포, 캘러스, 및 현탁 배양 세포를 들 수 있다.

식물 발현 벡터를 식물 세포 내로 도입하려는 목적에 있어서는, 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 방법, 예를 들어 아그로박테리움을 사용한 간접 방법 및 식물내로 직접 도입하는 방법을 사용할 수 있다. 아그로박테리움을 사용하는 상기와 같은 간접 방법은, 예를 들어 Nagel 등 (FEMS Microbiol. Lett., 67: 325 (1990))의 방법을 사용할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 먼저, 식물 발현 벡터로 (예를 들어 전기천공법에 의해) 아그로박테리움을 형질전환시키고, 이어서 형질전환 아그로박테리움을 리프 디스크법 (leaf disc method) 등과 같은 잘 알려진 방법으로 식물 세포 내로 도입한다. 식물 발현 벡터를 세포 내로 직접 도입하는 방법으로는, 전기천공법, 파티클 건 (particle gun), 인산칼슘법, 폴리에틸렌 글리콜법 등을 들 수 있다. 상기 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 식물을 형질전환시키는 적당한 방법은 당업계의 숙련자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

식물 발현 벡터가 도입된 세포는, 예를 들어 카나마이신 내성 등의 약제 내성에 대하여 스크리닝한다. 선발된 세포는 일반적으로 사용되는 방법을 사용하여 식물로 재생시킬 수 있다.

재생된 식물에 있어서, 도입된 식물 발현 벡터가 작동가능한지의 여부는 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 기술로 확인할 수 있다. 예를 들어 내인성 유전자의 발현의 억제를 의도하는 경우, 이러한 확인은 노던 블롯 분석으로 전사의 수준을 측정함으로써 수행될 수 있다. 이러한 방식으로, 내인성 전사 인자의 발현이 억제된 소망하는 형질전환 식물을 선발할 수 있다. 조직-특이적 프로모터를 사용하여 이종성 유전자를 발현시키려는 목적에 있어서는, 일반적으로 표적 조직으로부터 추출한 RAN를 시료로 사용하여 노던 블롯 분석에 의해 이종성 유전자의 발현을 확인할 수 있다. 상기 분석 방법의 수순은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 방법에 따라 내인성 전사 인자의 발현이 억제되어 화분 임성이 저하되는지의 여부는, 예를 들어 전사 인자를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 식물의 화분을, 임의로 조직화학적 염색 후에 현미경으로 관찰함으로써 확인할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 프로모터가 소포자에서 특이적으로 발현되는지의 여부는, 예를 들어 프로모터가 GUS 유전자에 작동가능하게 연결된 발현 벡터로 형질전환시킨 식물의 약을 포함하는 꽃 조직을, 일반적으로 사용되는 방법에 의해 조직화학적으로 염색하여 GUS 활성의 분포를 검출함으로써 확인할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 기초로 기술한다. 본 발명의 범주는 실시예 만으로 한정되지는 않는다. 실시예에 사용되는 제한 효소, 플라스미드 등은 상업적인 공급원으로부터 입수가능하다.

(실시예 1: ZPT 전사 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티를 포함하는 식물 발현벡터의 구축)

이전에 보고된 약-특이적 ZF 유전자 (Kobayashi 등의 상기 문헌) 중에서, PEThy ZPT2-5 (ZPT2-5), PEThy ZPT3-1 (ZPT3-1), 및 PEThy ZPT4-1 (ZPT4-1)의 cDNA를 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터의 하류에 각각 연결하여 식물 발현 벡터를 제조하였다. 이러한 제법은 이하에 구체적으로 기술한다.

(실시예 1-1)

플라스미드 pBI221 (CLONTECH Laboratories Inc.로부터 구입) 중 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터를 포함하는 DNA 단편 (HindIII-XbaI 단편) 및 NOS 터미네이터를 포함하는 DNA 단편 (SacI-EcoRI 단편)을 플라스미드 pUCAP (van Engelen, F. A. 등, Transgenic Res., 4: 288, 1995)의 다중-클로닝 부위 내로 연속적으로 삽입하여 pUCAP35S를 제조하였다. ZPT2-5의 cDNA를 포함하는 pBluescript 벡터를 KpnI 부위 및 SacI 부위 (어느 것도 벡터 내의 부위임)에서 절단하고, 상기 pUCAP35S의 KpnI과 SacI 부위 사이에 삽입하였다. 또한, 상기 재조합 플라스미드를 EcoRI 및 HindIII로 절단하고, ZPT2-5를 코딩하는 DNA 단편을 2성분 (binary) 벡터 pBINPLUS (van Engelen, F. A. 등의 상기 문헌)의 EcoRI과 HindIII 부위 사이에 삽입하였다. 도 4(a)에 나타낸 바와 같이, 구축된 ZPT2-5 유전자는, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35S 프로모터 영역 (P35S; 0.9 kb), 본 발명의 ZPT2-5를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (ZPT2-5; 약 0.8 kb), 및 노팔린 신타제의 터미네이터 영역 (Tnos; 0.3 kb)를 포함한다. 도 4에 있어서, Pnos는 노팔린 신타제의 프로모터 영역을 나타내고, NPTII는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II 유전자를 나타낸다.

(실시예 1-2)

ZPT3-1의 cDNA를 포함하는 pBluescript 벡터를 KpnI 부위 및 SacI 부위 (어느 것도 벡터 내의 부위임)에서 절단하고, pUCAP35S의 KpnI과 SacI 부위 사이에 삽입하였다. 또한, 상기 재조합 플라스미드를 EcoRI 및 HindIII로 절단하고, ZPT3-1을 코딩하는 DNA 단편을 2성분 벡터 pBINPLUS의 EcoRI과 HindIII 부위 사이에 도입하였다. 도 4(b)로부터 알 수 있듯이, 구축된 ZPT3-1 유전자는, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35S 프로모터 영역 (P35S; 0.9 kb), 본 발명의 ZPT3-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (ZPT3-1; 약 1.7 kb), 및 노팔린 신타제의 터미네이터 영역 (Tnos; 0.3 kb)를 포함한다.

(실시예 1-3)

ZPT4-1의 cDNA를 포함하는 pBluescript 벡터를 KpnI 부위 및 SacI 부위 (어느 것도 벡터 내의 부위임)에서 절단하고, 상기 pUCAP35S의 KpnI과 SacI 부위 사이에 삽입하였다. 또한, 상기 재조합 플라스미드를 EcoRI 및 HindIII로 절단하고, ZPT4-1을 코딩하는 DNA 단편을 2성분 벡터 pBINPLUS의 EcoRI과 HindIII 부위 사이에 도입하였다. 도 4(c)로부터 알 수 있듯이, 구축된 ZPT4-1 유전자는, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35S 프로모터 영역 (P35S; 0.9 kb), 본 발명의 ZPT4-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (ZPT4-1; 약 2.0 kb), 및 노팔린 신타제의 터미네이터 영역 (Tnos; 0.3 kb)를 포함한다.

(실시예 2: ZPT3-1 및 ZPT4-1 프로모터 영역의 단리 및 GUS 리포터 유전자와의 연결)

ZPT3-1 및 ZPT4-1의 cDNA를 프로브로 사용하여 페투니아의 게놈 DNA 라이브러리로부터 대응하는 게놈 클론을 단리하였다. 전사 개시 부위 상류의 DNA 단편 (프로모터 영역: 약 2.7 kb 및 약 3.6 kb)을 서브클로닝하였다. 각각의 DNA 단편을 GUS 리포터 유전자의 상류에 연결하여 2성분 벡터 내로 클로닝하였다. 이러한 제법은 이하에 구체적으로 기술한다.

(실시예 2-1)

일반적으로 사용되는 랜덤 프라이밍 방법 (Sambrook 등의 상기 문헌)을 사용하여 ZPT3-1의 cDNA를 [α-32P]dCTP로 표식하여 방사성 표식 프로브를 제조하였다. 상기 프로브를 사용하여 EMBL3 벡터 (Stratagene제) 내로 제조한 페투니아의 게놈 라이브러리 (페투니아 하이브리다 var. 미첼 (Petunia hybrida var. Mitchell)을 스크리닝하였다. 생성된 클론으로부터의 유전자 상류 영역을 포함하는 약 2.7 kb의 게놈 DNA 단편 (PstI-SacI)을 pBlusescript 벡터의 PstI-SacI 부위에 서브클로닝하고 (pBS-ZPT3-1-PS), 이어서 서열결정하였다 (도 5). 다음, 상기 플라스미드를 주형으로 하여, SalI 인식 서열을 포함하는 프라이머 (3'-TATGGAGCTCGTCGACAG TTGATGGTTCATTTTTCTGGCTATTGTC-5'; 서열 번호 1) 및 시판되는 M13-20 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 ZPT3-1 단백질의 번역 개시 부위의 바로 하류 (염기 위치: 2661)에 SalI 부위를 도입하였다. 그 후, PstI 및 SalI으로 절단한 DNA 단편을 pUCAPGUSNT의 GUS 코딩 영역의 상류에 삽입하였다 (pUCAP-ZPT3-1-GUSNT). 이와 같이, ZPT3-1 유전자 코딩 영역의 N-말단 부근 영역에서 인 프레임으로 GUS 코딩 영역에 ZPT3-1 유전자를 연결하였다. 또한, pUCAP-ZPT3-1-GUSNT를 AscI 및 PacI으로 절단함으로써 수득되는 DNA 단편 (ZPT3-1 프로모터, GUS 코딩 영역 및 NOS 터미네이터 포함)을 pBINPLUS 벡터 내로 삽입하여 pBIN-ZPT3-1-GUS를 수득하였다 (도 7(a)).

(실시예 2-2)

ZPT4-1에 대해서도, 유사하게 게놈 DNA를 단리하고, ZPT4-1 유전자의 상류 영역을 포함하는 약 3.6 kb의 DNA 단편 (EcoRI-EcoRI)을 pBlusescript 벡터의 EcoRI-EcoRI 부위에 서브클로닝하고 (pBS-ZPT4-1-EE), 이어서 서열결정하였다 (도 6). 상기 플라스미드를 주형으로 하여, BamHI 인식 서열을 포함하는 프라이머 (3'-CATGGATATAGGATCCTATATC-5'; 서열 번호 12) 및 M13-20 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 ZPT4-1 단백질의 번역 개시 부위의 바로 하류 (염기 위치: 3641)에 BamHI 부위를 도입하였다. 그 후, EcoRI 및 BamHI으로 절단한 DNA 단편을 pUCAPGUSNT의 GUS 코딩 영역의 상류에 삽입하였다 (pUCAP-ZPT4-1-GUSNT). 이와 같이, ZPT4-1 유전자 코딩 영역의 N-말단 부근 영역에서 인 프레임으로 GUS 코딩 영역에 ZPT4-1 유전자를 연결하였다. 또한, 상기와 유사한 방식으로 DNA 단편 (AscI-PacI)을 pBINPLUS 벡터 내로 삽입하여 pBIN-ZPT4-1-GUS를 수득하였다 (도 7(b)).

(실시예 3: 각각의 융합 유전자의 페투니아 세포 내로의 도입)

하기 수순으로 각각의 상기 발현 벡터를 아그로박테리움을 통하여 페투니아 (페투니아 하이브리다 var. 미첼) 내로 도입하였다.

(1) 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404주 (CLONTECH Laboratories Inc.로부터 구입)을 250 mg/ml의 스트렙토마이신 및 50 mg/ml의 리팜피신을 포함하는 L 배지 중에서 28℃에서 배양하였다. 세포 현탁액을 Nagel 등 (1990) (상기)의 방법에 따라 제조하였다. 실시예 1 및 2에서 구축한 플라스미드 벡터를 전기천공법으로 상기 주 내로 도입하였다.

(2) 하기 방법을 사용하여 각각의 융합 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 페투니아 세포 내로 도입하였다: 상기 (1)에서 수득한 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404주를 YEB 배지 (DNA Cloning, 제2권, 78페이지, Glover D. M. 편저, IRL Press, 1985)에서 진탕 배양하였다 (28℃, 200 rpm). 생성된 배양액을 살균수로 20배 희석시키고, 페투니아 (페투니아 하이브리다 var. 미첼)의 엽편과 함께 공존배양하였다. 2 내지 3일 후, 항생제를 포함하는 배지로 상기 세균을 제거하였다. 페투니아 세포를 매 2주마다 선발 배지로 계대하였다. 상기 5종류의 융합 유전자와 함께 도입한 pBINPLUS 유래의 NPTII 유전자의 발현에 의한 카나마이신 내성의 존재 또는 부재에 기초하여 형질전환 페투니아 세포를 선발하였다. 선발한 세포를, 통상적인 방법으로 캘러스로 유도하였다. 캘러스를 식물로 재분화하였다 (Jorgensen R.A. 등, Plant Mol. Biol., 31: 957, 1996).

(실시예 4: ZPT 유전자를 도입한 형질전환 페투니아의 표현형)

실시예 1의 벡터를 도입함으로써 수득한 형질전환체를 사용하여 ZPT2-5, ZPT3-1 및 ZPT4-1의 발현의 제어와 결부된 화분 형태 변화를 관찰하여, 상기 ZPT 유전자의 cDNA의 도입의 식물에 대한 영향을 연구하였다. 이러한 연구는 이하에서 상세하게 기술한다.

(실시예 4-1)

노던 블롯 분석에 의해, ZPT2-5의 cDNA를 35S 프로모터의 제어 하에 도입한 형질전환체 (14개체)로부터 공동억제에 의해 유전자 발현이 억제된 개체 (3개체)를 선발하였다 (주: 14개체 중 4개체에서는 도입된 ZPT2-5 유전자의 과다 발현이 관찰됨). 노던 블롯 분석의 조건은 하기와 같았다: 7% SDS, 50% 포름아미드, 5 x SSC, 2% 블로킹 시약 (Boehringer Mannheim제), 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.0), 0.1% 소듐 라우릴 사르코신, 50 ㎍/ml의 효모 tRNA, 및 32P-표식 프로브 DNA (1 x107 cpm)을 포함하는 용액 중에서, 68℃에서 16시간 동안 혼성화를 수행하고, 이어서 2 x SSC/0.1% SDS로 68℃에서 30분 동안 세척하였다.

상기 공동억제 형질전환체 3개체에 있어서, 하기 표현형이 관찰되었다 (도 8).

사분자기 직전에 일어나는 감수분열 과정에 있어서, 정상 (야생형) 페투니아의 경우, 크로마틴이 세사상 구조로 응축하고 (전기 I: 세사기), 상동 염색체의 시냅시스가 일어난다 (전기 I: 접합사기). 그 후, 중기 I에 있어서, 4분 염색체가 세포 적도면을 따라 배열하고, 그 후, 방추 장치에 의해 상동 염색체가 균등하게 세포의 양극으로 분리한다. ZPT2-5 유전자가 공동억제된 형질전환체에서는, 중기 I에서 4분 염색체가 세포 적도면을 따라 배열하지는 않으면서, 염색체의 양극으로의 분열이 진행하였다. 염색체의 양극 분리는 현저하게 불균등하였다.

정상적인 감수분열의 과정에서는, 상기 제1의 염색체 분리 후, 제2의 염색체 분리에 의해 4개의 하플로이드 그룹이 형성된다. 그 후, 세포질 분리가 일어난다. 상기 공동억제가 일어난 형질전환체의 경우에는, 세포질 분리 및 세포 분열이 제1의 염색체 분리 직후에 일어났다. 이러한 불균등한 세포 분열은 1회 뿐만 아니라 추가로 2회 이상 반복하여 일어나, 8개 이하의 소포자 세포가 형성되었다. 불균등한 염색체 분리로 인하여, 소포자 세포에 포함되는 염색체의 수가 불균일하였으며,또한, 세포의 크기가 현저하게 불균등하였다. 그 결과, 정상적인 페투니아의 사분자기에 대응하는 시기 동안 상기 형질전환체에서는 정상보다 더 많은 수의 소포자 (8개 이하)가 형성되었다 (도 8(f); 눈의 크기가 6 mm인 ZPT2-5 공동억제 형질전환체의 화분 세포의 사진. 또한, 도 9(b); 사분자기의 형질전환체의 화분 세포의 사진을 참조).

공동억제 형질전환체에 있어서, 소포자의 일부 (10-20%)는 여전히 발달을 계속하였으나, 대부분의 소포자 세포는, 소포자를 싸고 있는 칼로스 (callose) 층이 분해되기 전에 파열하였다. 상기 단계에 있어서, 파열하지 않고 생존한 소포자는 실질적으로 육면체인 비정상적인 형태였으며, 정상적인 소포자의 사면체 형태와는 명확하게 상이하였다. 그 후, 비정상-형태의 소포자는 일견 정상적인 유사분열에 의해 2핵으로 되어 화분립을 형성하였다. 그러나, 상기 화분립 대부분에서는 임성이 소실되어 있었다. 구체적으로는, 정상 페투니아의 암술 상에 상기 형질전환체의 화분립을 둘 경우, 공동억제를 나타내는 3 계통으로부터의 화분에서는 종자가 전혀, 또는 거의 형성되지 않았다 (10% 이하, 즉, 하나의 페투니아에 의해 생성되는 종자의 수가 약 10개의 꽃의 평균으로서 대조의 10%임). 공동억제가 없는 3계통의 형질전환체로부터의 화분에 있어서는, 야생형의 대조 식물과 유사하게 정상적인 종자 형성을 확인하였다.

상기 공동억제 형질전환체는 또한 자성 배우체의 형성에 있어서도 이상을 나타내었으며, 자성 임성이 정상 개체의 25-35%로 저하되어 있었다. 구체적으로는, 배주 (자성 배우체)의 발달은 일견 정상적이었으나, 야생형 화분을 수분에 사용할 경우, 대다수의 배주는 수정할 수 없었으며, 심지어 수정 배주도 후속 발달에 있어서 이상을 나타내어, 대부분의 배주는 사멸 (abort)하였다. 상기의 경우, 공동억제가 없는 형질전환체는 야생형 대조 식물과 유사하게 정상 자성 배우체를 형성하였다.

(실시예 4-2)

ZPT3-1의 cDNA를 35S 프로모터의 제어 하에 도입하였다. 그 결과, ZPT2-5 유전자를 도입한 경우와 유사한 형질 변화가 15 개체 중 3 개체에서 나타났다 (도 9). 구체적으로는, 상기 형질전환체에 있어서, 감수분열 과정에서 ZPT2-5의 경우와 실질적으로 동일한 이상이 관찰되었다. 소포자기까지 발달한 세포의 수는 매우 적었으며, 생존 소포자는 형태적 이상 (육면체)을 나타내었다. 또한, 성숙한 화분립은 임성을 소실하였다. 그러나, ZPT2-5와는 달리, 상기 개체의 자성 임성은 영향을 받지 않았다.

실시예 4-1과 동일한 조건 하에 노던 블롯 방법으로 유전자 발현을 분석하였다. 그 결과, ZPT3-1 유전자를 도입한 개체에서는 ZPT3-1과 ZPT4-1 둘 모두의 유전자의 발현이 억제되었다. 둘 모두의 유전자는 고수준의 구조 유사성을 공유한다. 구체적으로는, 전체 코딩 영역의 염기 서열의 상동성이 37%이다. ZPT3-1의제2 ZF 영역과 ZPT4-1의 제3 ZF 영역, 및 ZPT3-1의 제3 ZF 영역과 ZPT4-1의 제4 ZF 영역을, 이웃하는 서열을 포함하여, 상동성 값을 최대화하는 방식으로 염기 서열 수준에서 각각 서로 비교할 경우, 상동성의 평균값은 86%이다 (서열의 비교는 Clustal V 프로그램을 사용하여 수행함). 따라서, 상기의 발현 억제 현상은, 2개의 유전자의 발현 억제 (공동억제)로 이어지는 하나의 유전자의 도입에 의해 야기되었을 가능성이 크다. 이는, 상기 2개의 유전자의 기능이 중복된다는 것을 암시하며, 양 유전자 중 어느 하나의 도입에 의해 공통되는 표현형 변화가 관찰될 수 있다는 것과 부합한다.

(실시예 4-3)

ZPT4-1의 cDNA를 35S 프로모터의 제어 하에 도입하였다. 그 결과, ZPT2-5 유전자를 도입한 경우와 유사한 형질 변화가 13 개체 중 2 개체에서 나타났다. 구체적으로는, 상기 형질전환체에 있어서, 감수분열 과정에서 ZPT2-5의 경우와 실질적으로 동일한 이상이 관찰되었다. 소포자기까지 발달한 세포의 수는 매우 적었으며, 생존 소포자는 형태적 이상 (육면체)을 나타내었다. 또한, 성숙한 화분립은 임성을 소실하였다. 그러나, ZPT3-1과 유사하게, 상기 개체의 자성 임성은 영향을 받지 않았다. 상기의 이유로, 본 실시예에 있어서도 ZPT3-1과 ZPT4-1 둘 모두의 유전자의 발현이 억제되었을 가능성이 크다 (공동억제).

상기한 바와 같이, ZPT2-5, ZPT3-1 또는 ZPT4-1을 코딩하는 유전자를 도입함으로써 고효율로 화분의 발달을 저해할 수 있으며, 임성을 제거할 수 있다 (ZPT3-1의 경우 99% 이상, 그리고 ZPT2-5 및 ZPT4-1의 경우 90% 이상). 상기 유전자의 도입은, 상기 유전자의 효과가 화분 (ZPT2-5의 경우, 화분 및 자성 배우체)에 특이적이며, 식물의 다른 형질이 영향을 받지 않는다는 점에서 선택적 형질 전환 기술로 유용할 수 있다.

(실시예 5: ZPT3-1 및 ZPT4-1의 프로모터 활성의 조직 특이성)

실시예 2의 벡터를 도입함으로써 수득한 형질전환체를 사용하여, GUS 활성에 의해 조직화학적 염색으로 상기 DNA 단편의 조직-특이적 프로모터 활성을 검출하였다. 이를 이하에 상세하게 기술한다.

(실시예 5-1)

ZPT3-1 유전자의 상류 영역과 GUS의 융합 유전자를 도입함으로써 수득한 형질전환체의 꽃을 사용하여, X-GUS를 기질로 하여 GUS 활성의 분포를 연구하였다 (Gallagher, S. R. 편저, GUS protocols: using the GUS gene as a reporter of gene expression, Academic Press, Inc., pp 103-114, 1992). 그 결과, GUS 활성은 일핵기의 소포자에서 특이적으로 검출되었다 (도 10(a) 내지 (c)).

(실시예 5-2)

ZPT4-1 유전자의 상류 영역과 GUS의 융합 유전자를 도입함으로써 수득한 형질전환체의 꽃을 사용하여, 상기와 유사한 방식으로 GUS 활성의 분포를 연구하였다. 그 결과, GUS 활성은 일핵기 내지 이핵기의 소포자 및 약의 개열 조직에서 특이적으로 관찰되었다 (도 10(d) 내지 (f): 약의 개열 조직을 도 10(e) 및 (f)에서 화살표로 표시함).

상기한 바와 같이, ZPT3-1 및 ZPT4-1 유전자의 프로모터는, 일핵기의 소포자 (ZPT3-1) 및 일핵기 내지 이핵기의 소포자 (ZPT4-1)에서 각각 특이적으로 활성을 나타내었다. ZPT4-1 유전자의 프로모터도 일핵기 내지 이핵기의 약의 개열 조직에서 특이적으로 활성을 나타내었다.

소포자는 후속적으로 성숙하여 화분립을 형성하는 전구체 세포이다. 따라서, 이러한 프로모터는 화분의 발달에 대한 상세한 연구를 위한 도구로서 유용하다. 또한, 이러한 프로모터 또는 그의 활성 단편을 사용하여 세포독성 유전자 등을 소포자에서 특이적으로 발현되게 함으로써 화분 세포를 사멸시키거나 그의 기능을 제거하여 화분의 발달을 직접적으로, 그리고 효율적으로 제어할 수 있다.

ZPT2-5, ZPT3-1 및 ZPT4-1 유전자 유래의 전사 인자를 코딩하는 DNA, 및 ZPT3-1 및 ZPT4-1 유전자 유래의 프로모터를 이용하는 본 발명의 방법은, 유전자공학적 방법을 사용하여 식물의 형질을 선택적으로 변경시키는 기술, 특히 웅성 불임성을 부여하는 기술로 유용하다.

Claims (27)

1. 웅성 불임성 식물의 생성 방법으로서,

   (i) 서열 번호 1로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 777 위치의 서열을 가지는 DNA, (ⅱ) 엄격한 조건 하에서 (i)의 염기 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA, 또는 (ⅲ) (i) 또는 (ⅱ)의 DNA의 단편인 핵산; 및 상기 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계;

   화분의 발달을 제어하는 내인성 전사 인자 (여기서, 내인성 전사 인자를 코딩하는 유전자는 엄격한 조건 하에서 상기 핵산과 혼성화함)를 가지는 식물 세포를 제공하는 단계;

   발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계;

   발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계; 및

   재생된 식물에 있어서 상기 핵산이 발현되어 내인성 전사 인자의 발현이 억제된 식물을 스크리닝하는 단계

   를 포함하며,

   여기서, (ⅱ)의 DNA는, (iv) 엄격한 조건 하에서 서열 번호 13에 의해 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1886 위치의 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA를 포함하지 않는

   것을 특징으로 하는 방법.
2. 웅성 불임성 식물의 생성 방법으로서,

   (i') 서열 번호 3으로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1640 위치의 서열을 가지는 DNA, (ⅱ') 엄격한 조건 하에서 (i')의 염기 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA, 또는 (ⅲ') (i') 또는 (ⅱ')의 DNA의 단편인 핵산; 및 상기 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계;

   화분의 발달을 제어하는 내인성 전사 인자 (여기서, 내인성 전사 인자를 코딩하는 유전자는 엄격한 조건 하에서 상기 핵산과 혼성화함)를 가지는 식물 세포를 제공하는 단계;

   발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계;

   발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계; 및

   재생된 식물에 있어서 상기 핵산이 발현되어 내인성 전사 인자의 발현이 억제된 식물을 스크리닝하는 단계

   를 포함하며,

   여기서, (ⅱ')의 DNA는, (iv) 엄격한 조건 하에서 서열 번호 13에 의해 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1886 위치의 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA를 포함하지 않는

   것을 특징으로 하는 방법.
3. 웅성 불임성 식물의 생성 방법으로서,

   (ⅰ") 서열 번호 5로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1948 위치의 서열을 가지는 DNA, (ⅱ") 엄격한 조건 하에서 (ⅰ")의 염기 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA, 또는 (ⅲ") (ⅰ") 또는 (ⅱ")의 DNA의 단편인 핵산; 및 상기 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계;

   화분의 발달을 제어하는 내인성 전사 인자 (여기서, 내인성 전사 인자를 코딩하는 유전자는 엄격한 조건 하에서 상기 핵산과 혼성화함)를 가지는 식물 세포를 제공하는 단계;

   발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계;

   발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계; 및

   재생된 식물에 있어서 상기 핵산이 발현되어 내인성 전사 인자의 발현이 억제된 식물을 스크리닝하는 단계

   를 포함하며,

   여기서, (ⅱ")의 DNA는, (iv) 엄격한 조건 하에서 서열 번호 13에 의해 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1886 위치의 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA를 포함하지 않는

   것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 프로모터에 대하여 순방향으로 연결되며, 식물 세포 내에서 센스 방향으로 전사될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 프로모터에 대하여 역방향으로 연결되며, 식물 세포 내에서 안티센스 방향으로 전사될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 식물이 쌍자엽식물인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 식물이 가지과 (Solanaceae) 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 식물이 페투니아속 (Petunia) 식물인 것을 특징으로 하는방법.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 식물 발현 벡터 내로 조합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성되는 웅성 불임성 식물.
11. 웅성 불임성을 식물에 부여하는 방법으로서,

    (i) 서열 번호 1로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 777 위치의 서열을 가지는 DNA, (ⅱ) 엄격한 조건 하에서 (i)의 염기 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA, 또는 (ⅲ) (i) 또는 (ⅱ)의 DNA의 단편인 핵산; 및 상기 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계;

    화분의 발달을 제어하는 내인성 전사 인자 (여기서, 내인성 전사 인자를 코딩하는 유전자는 엄격한 조건 하에서 상기 핵산과 혼성화함)를 가지는 식물 세포를 제공하는 단계;

    발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계;

    발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계; 및

    재생된 식물에 있어서 상기 핵산이 발현되어 내인성 전사 인자의 발현이 억제된 식물을 스크리닝하는 단계

    를 포함하며,

    여기서, (ⅱ)의 DNA는, (iv) 엄격한 조건 하에서 서열 번호 13에 의해 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1886 위치의 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA를 포함하지 않는

    것을 특징으로 하는 방법.
12. 웅성 불임성을 식물에 부여하는 방법으로서,

    (i') 서열 번호 3으로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1640 위치의 서열을 가지는 DNA, (ⅱ') 엄격한 조건 하에서 (i')의 염기 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA, 또는 (ⅲ') (i') 또는 (ⅱ')의 DNA의 단편인 핵산; 및 상기 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계;

    화분의 발달을 제어하는 내인성 전사 인자 (여기서, 내인성 전사 인자를 코딩하는 유전자는 엄격한 조건 하에서 상기 핵산과 혼성화함)를 가지는 식물 세포를 제공하는 단계;

    발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계;

    발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계; 및

    재생된 식물에 있어서 상기 핵산이 발현되어 내인성 전사 인자의 발현이 억제된 식물을 스크리닝하는 단계

    를 포함하며,

    여기서, (ⅱ')의 DNA는, (iv) 엄격한 조건 하에서 서열 번호 13에 의해 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1886 위치의 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA를 포함하지 않는

    것을 특징으로 하는 방법.
13. 웅성 불임성을 식물에 부여하는 방법으로서,

    (ⅰ") 서열 번호 5로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1948 위치의 서열을 가지는 DNA, (ⅱ") 엄격한 조건 하에서 (ⅰ")의 염기 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA, 또는 (ⅲ") (ⅰ") 또는 (ⅱ")의 DNA의 단편인 핵산; 및 상기 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계;

    화분의 발달을 제어하는 내인성 전사 인자 (여기서, 내인성 전사 인자를 코딩하는 유전자는 엄격한 조건 하에서 상기 핵산과 혼성화함)를 가지는 식물 세포를 제공하는 단계;

    발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계;

    발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계; 및

    재생된 식물에 있어서 상기 핵산이 발현되어 내인성 전사 인자의 발현이 억제된 식물을 스크리닝하는 단계

    를 포함하며,

    여기서, (ⅱ")의 DNA는, (iv) 엄격한 조건 하에서 서열 번호 13에 의해 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 1886 위치의 서열을 가지는 DNA와 혼성화하며 화분의 발달을 제어하는 전사 인자를 코딩하는 DNA를 포함하지 않는

    것을 특징으로 하는 방법.
14. 형질이 변경된 식물의 생성 방법으로서,

    (a') 서열 번호 7로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 2624 위치의 서열을 가지는 DNA, 또는 (b') (a')의 서열의 일부를 가지며 소포자에 특이적인 프로모터 활성을 나타내는 DNA를 포함하는 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 유전자를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계;

    발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계; 및

    발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 형질이 변경된 식물의 생성 방법으로서,

    (a") 서열 번호 8로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 3631 위치의 서열을 가지는 DNA, 또는 (b") (a")의 서열의 일부를 가지며 소포자, 및 임의로 약의 개열 조직에 특이적인 프로모터 활성을 나타내는 DNA를 포함하는 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 유전자를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계;

    발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계; 및

    발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 형질은 임성이며, 형질이 변경된 식물은 웅성 불임성 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제14항 또는 제15항에 있어서, 형질은 화합성이며, 형질이 변경된 식물은 자가-불화합성 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제14항 또는 제15항에 있어서, 식물이 쌍자엽식물인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 식물이 가지과 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 식물이 페투니아속 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제14항 또는 제15항에 있어서, 발현 카세트가 식물 발현 벡터 내로 조합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성되는 형질-변경 식물.
23. 식물에 웅성 불임성을 부여하는 방법으로서,

    (a') 서열 번호 7로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 2624 위치의 서열을 가지는 DNA, 또는 (b') (a')의 서열의 일부를 가지며 소포자에 특이적인 프로모터 활성을 나타내는 DNA를 포함하는 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 유전자를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계;

    발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계; 및

    발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 식물에 웅성 불임성을 부여하는 방법으로서,

    (a") 서열 번호 8로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 3631 위치의 서열을 가지는 DNA, 또는 (b") (a")의 서열의 일부를 가지며 소포자, 및 임의로 약의 개열 조직에 특이적인 프로모터 활성을 나타내는 DNA를 포함하는 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 유전자를 포함하는 식물 발현 카세트를 제공하는 단계;

    발현 카세트를 식물 세포 내로 도입하는 단계; 및

    발현 카세트가 도입된 식물 세포를 식물로 재생하는 단계

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 하기 (I') 또는 (ⅱ')의 DNA를 포함하는 프로모터:

    (I') 서열 번호 7로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 2624 위치의 서열을 가지는 DNA, 또는 (ⅱ') (I')의 서열의 일부를 가지며 소포자에 특이적인 프로모터 활성을 나타내는 DNA.
26. 하기 (ⅰ") 또는 (ⅱ")의 DNA를 포함하는 프로모터:

    (ⅰ") 서열 번호 8로 나타내어지는 염기 서열의 1 위치 내지 3631 위치의 서열을 가지는 DNA, 또는 (ⅱ") (ⅰ")의 서열의 일부를 가지며 소포자, 및 임의로 약의 개열 조직에 특이적인 프로모터 활성을 나타내는 DNA.
27. 제25항 또는 제26항에 따른 프로모터 및 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 유전자를 포함하는, 식물에 웅성 불임성을 부여하는 데에 유용한 식물 발현 카세트.