KR20020065895A - 식물의 감광성 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명자들은 연쇄 분석에 의해 벼의 감광성 유전자Hd6을 단리하는데 성공하였다. 상기 유전자의 도입이나 발현 조절에 의해 식물의 감광성을 변화시킬 수 있음을 발견하였다. 더나아가, 기능적인 상기 유전자의 유무를 검색함으로써 식물의 감광성을 평가할 수 있음을 발견하였다.

Description

식물의 감광성 유전자 및 이의 용도{Photosensitivity Gene of Plant and Utilization Thereof}

벼는 일반적으로 단일(short day)에 의해 출수(heading: flowering)가 촉진되지만 장일(long-day)에 의해 출수가 지연된다. 종래의 품종 중에서, 일반적으로 큐수나 혼슈 남부의 품종은 강한 감광성을 가지는 반면, 동북이나 북해도의 품종은 감광성이 없거나 극히 약하다. 벼는 감광성을 상실하면 광주기의 변화에 의해 출수 시기가 변화하지 않고, 일정 생육기간을 경과하면 출수하는 특징을 나타낸다. 이와 같이 벼는 감광성의 유무에 따라, 재배지역이나 재배시기 등에 관여하는 적응성이 크게 변화되기 때문에 벼의 감광성의 변화은 벼의 품종개량에 있어서 중요한 과제로 되어있다.

종래, 벼의 품종개량에 있어서 출수기의 변화는 (1) 교배에 의한 조생, 만생계통의 선택, (2) 방사선이나 화학물질에 의한 돌연변이 유발 등에 의해 일어날 수 있다. 그러나, 상기 작업들은 장기간을 요구하거나 변이의 정도나 방향성을 예측할 수 없는 등 많은 문제가 존재한다.

한편, 벼의 유전자 분야에 있어서, 벼의 감광성을 강화시키는 유전자를 총괄하여 "감광성 유전자"라고 한다. 이제까지 어느 정도의 감광성 유전자의 존재가 돌연변이나 품종에 내재한 변이로서 발견되었고 예를들어,Se1좌(chromosome 6, Yokoo and Fujimaki, Japan J Breed, 21, 35-39, 1971),E1좌(chromosome 7, Tsai, K.H., Jpn J Genet, 51, 115-128, 1976: Okumoto, Y. et al., Jpn J Breed, 42, 415-429, 1992),E2좌(불명),E3좌(chromosome 3?, Okumoto et al., Japanese Society of Breeding, 91st lecture, Jpn J Breed, 47(별 1), 31) 등에서 감광성 유전자의 존재가 시사되어 있다(Yamagata et al., In Rice Genetics, International Rice Research Institute, Manilla, 351-359, 1986).

벼 감광성 유전자가 단리되면 이 유전자를 형질전환법에 의해 임의의 품종에 도입함으로써 이런 계통의 감광성을 변화시키고 이것에 의해 벼의 출수기를 조절하는 것이 가능할 것이다. 따라서, 상기 유전자를 이용하는 품종 개량은 간편성이나 확실성의 면에서 종래의 방법과 비교하여 극히 유용할 것이다.

그러나, 벼에서 이러한 감광성에 관여하는 유전자를 단리했다는 정보는 아직까지 보고되어 있지 않다.

본 발명은 식물의 감광성에 관여하는 유전자 및 상기 유전자를 이용한 식물의 감광성의 변화에 관한 것이다. 식물의 감광성의 변화는 식물의 품종개량 등의 분야에서 유용하다.

본 발명은 신규한 식물의 감광성 유전자, 특히 벼 유래의 감광성 유전자를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용하여 식물의 감광성을 변화시키고 이에 의해 식물의 개화시기를 변화시키는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 식물의 감광성의 평가방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본, 발명자 등은 식물 중에도, 특히 출수시기를 변화시키는 간단한 방법의 개발이 요구되고 있는 벼에 착안하여 이러한 감광성에 관여하는 유전자를 단리하기 위해 예의 노력하였다.

벼에 있어서는 니폰베어(Nipponbare) 및 카사라스(Kasalath)의 교배로부터 유래된 자손을 이용하여 확인된 양적 형질 유전자좌(QTL)의 하나인Hd6이 제 3 염색체 상에 존재하는 것이 알려져 있다. 또, 니폰베어의 유전적 배경을 가지는Hd6영역의 준동질유전자 계통을 이용한 분석에서,Hd6유전자좌가 감광성 유전자좌인 것이 밝혀져 있다(Yamamoto et al., Abstract for Plant Genome Ⅳ, 124, 1996).

본 발명자들은 상기와 같이 그 존재 자체는 알게 되었지만 아직 동정되지 않은 감광성 유전자Hd6을 단리하기 위해, 먼저 연쇄분석 및 효모 인공 염색체(YAC) 클론에 의해Hd6유전자 영역의 정렬화를 하였다.

구체적으로는,Hd6유전자 단리를 위해 불가결한 대규모 분리 집단(200+980=1180개체)의 연쇄분석을 행하고 이때 CAPS 마커를 이용하여 작업효율을 향상시켰다. 또, 벼 게놈 분석 연구에서 작성된 YAC 클론의 정렬화 지도를 이용하여Hd6유전자의 후보영역에 존재하는 YAC 클론의 정확한 물리지도를 작성하였다. YAC 클론의 말단 DNA 단편이나 상기 YAC 클론 상에 존재하는 cDNA 클론을RFLP 마커로서 이용하여Hd6유전자 영역을 마커 E11893 및 Y3626L 사이의 영역으로 한계를 설정하였다.

그 후, 본 발명자 등은 P1 유래 인공 염색체(PAC) 클론을 사용하여Hd6유전자 영역을 정렬화하였다. 더 구체적으로는, 상기 분석에 의해 결정된Hd6유전자 의 존재 영역에 근접하는 DNA 클론을 이용하여 상기 DNA 클론의 염기서열을 포함하는 것으로 생각되는 PAC 클론을 니폰베어의 게놈 라이브러리로부터 7개 선택하였다. 또, 이 클론의 정렬화 상태를 조사하여 PAC 클론 P0689D1이Hd6의 후보 유전자 영역을 포함하는 것을 보여주었다(도 1).

본 발명자 등은 PAC 클론 P0689D1의 염기서열 분석에 의해,Hd6후보 유전자가 존재한다고 추정되는 영역을 약 26.4kb까지 좁히는데 성공하였다. 이러한 후보 영역의 염기서열에 대해 유전자 예측 분석 및 유사성 검사를 행하고아라비돕시스 CKIIa(ArabidopsisCKIIa) 유전자와 높은 유사성을 나타내는 영역을 발견하였다(도 2 및 도 3). 상기CKIIa유전자는아라비돕시스에서CCA1(체내시계) 유전자의 활성화에 관여한다고 보고되어 있다.

니폰베어의CKIIa유전자의 염기서열 정보를 이용하여 카사라스의CKIIa유전자의 게놈 염기서열을 조사하고 양자를 비교한 경우, 니폰베어의 단백질을 암호화하는 영역에는 정지 코돈이 확인되었지만, 카사라스에서는 이런 정지 코돈은 확인되지 않았다(도 4 내지 도 13). 감광성 유전자Hd6을 가지고 있지 않다고 생각되는 니폰베어와 카사라스의Hd6유전자가 있는 니폰베어의 준동질 유전자 계통에서, 후보유전자CKIIa의 발현의 차이를 RT-PCR법으로 분석한 경우,Hd6후보 유전자인CKIIa유전자의 전사량이Hd6의 준동질 유전자 계통과 비교하여 니폰베어에서 상당히 낮은 것을 발견하였다(도 14). 이런 결과로부터, 카사라스의CKIIa유전자가 벼 감광성 유전자Hd6이라고 판단되었다.

따라서, 벼의 감광성에 관련되는Hd6유전자가 단리되는 것으로부터,Hd6유전자나 상기 유전자와 같은 기능을 하는 식물 유전자를 이용하여 벼의 출수시기의 변화를 비롯하여 광범위한 식물의 개화시기를 변화시키는 것이 가능하게 되었다. 게다가, 재배지역이나 재배시기 등에 관여하는 적응성을 변화시키는 식물 품종의 육성이 가능하게 된다.

또, 본 발명자 등은 니폰베어 및 카사라스의Hd6유전자 사이의 ORF에서 하나의 염기의 차이가 카사라스에 특이적인 제한효소HindIII의 확인부위를 생기게 하는 것을 보여주었다. 이런 염기의 차이는 벼 품종에서 제한효소 단편 다형분석에 의한 감광성 유전자의 유무 판정에 이용할 수 있는 가능성을 시사하였다. 한편, 감광성 유전자E3은 제 3 염색체에 존재하며, 그 위치가Hd6에 상당하다는 것이 제안되었다. 따라서, 본 발명자 등은 이미 유전자 분석에 의해 감광성 유전자E3의 존재의 유무가 판단된 품종군(Okumoto et al., International Rice Research Instit ute, Rice Genetics II, 778-780, 1991)에 대해, 이러한 제한효소 단편 다형분석의 유효성을 검증하기 위해 조사하였다. 그 결과,E3을 보유하지 않는다고 판단되는 품종에서는Hd6유전자의 증폭 단편이 효소에 의해 절단되지 않았고, 반면E3을 보유한다고 판단되는 8품종에서는 효소에 의해 절단되었다. 따라서, 본 발명자 등은 이러한Hd6유전자에 있는 특정 부위에서 정지 코돈의 유무를 식별하는 수단이 벼 품종의 감광성을 평가하는데 유효한 수단으로 되는 것을 알 수 있었다.

다시 말하면, 본 발명자 등은 식물의 감광성에 관여하는 유전자를 단리하는 것에 성공하였고 또한 상기 유전자를 이용하여 식물의 감광성을 변화시키는 것이 가능하며, 또한 상기 유전자를 이용하여 식물의 감광성을 평가하는 것이 가능하다는 것을 발견하였고 이로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은, 구체적으로는,

(1) 식물의 감광성을 증가시키는 기능을 가지는 식물 유래의 단백질을 암호화하는 상기 (a)에서 (c)의 어느 하나에 기재된 DNA,

(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 DNA,

(b) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 DNA,

(c) 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 DNA와 긴축 상태(stringent condition) 하에서 혼성화하는 DNA,

(2) 제 1항에 있어서, 벼 유래인 것을 특징으로 하는 DNA,

(3) 제 1항 또는 제 2항의 DNA의 전사산물과 상보적인 안티센스 RNA를 암호화하는 DNA,

(4) 제 1항 또는 제 2항의 DNA의 전사산물을 특이적으로 개열하는 리보짐(ribozyme)의 활성을 가지는 RNA를 암호화하는 DNA,

(5) 식물세포에서 발현시에 공억제 효과(corepressing effect)에 의해 제 1항 또는 제 2항의 DNA의 발현을 억제시키는 RNA를 암호화하는 DNA,

(6) 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 식물의 감광성을 증가시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 DNA,

(7) 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 식물의 감광성을 저하시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 DNA,

(8) 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 DNA를 포함하는 벡터,

(9) 제 8항의 벡터가 도입된(transformed) 식물세포,

(10) 제 9항의 식물세포를 포함하는 형질전환 식물체,

(11) 제 10항에 있어서, 상기 형질전환 식물체가 벼인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체,

(12) 제 10항 또는 제 11항의 형질전환 식물체의 자손 또는 클론인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체,

(13) 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 형질전환 식물체의 번식 재료,

(14) 제 1항 또는 제 2항의 DNA를 식물세포에 도입하고 상기 식물세포에서 식물체를 재생시키는(regenerating) 공정을 포함하는, 제 10항 또는 제 11항의 형질전환 식물체의 제조방법,

(15) 제 1항 또는 제 2항의 DNA를 식물체의 세포 내에서 발현시키는 것을 특징으로 하는 식물의 감광성을 증가시키는 방법,

(16) 제 15항에 있어서, 식물의 감광성을 증가시키는 것에 의해 광주기에 의존하는 식물의 개화시기를 지연시키는 것을 특징으로 하는 방법,

(17) 식물체의 세포 내에서 내인성의 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항의 DNA의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 식물의 감광성을 저하시키는 방법,

(18) 제 17항에 있어서, 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 DNA를 식물체의 세포 내에서 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법,

(19) 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 식물의 감광성을 저하시키는 것에 의해 광주기에 의존하는 식물의 개화시키를 촉진시키는 방법,

(20) 제 15항 또는 제 19항의 어느 한 항에 있어서, 식물이 벼인 것을 특징으로 하는 방법,

(21) 식물에서 제 1항의 DNA의 존재의 유무를 검색하는 것을 특징으로 하는 식물의 감광성을 평가하는 방법,

(22) 제 21항에 있어서, 식물이 벼인 것을 특징으로 하는 방법,

(23) 제 22항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열에 있어서 제 2815 위치의 염기 A의 T로의 치환을 검색하는 것을 특징으로 하는 방법,

(24) 제 23항에 있어서, (a) 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 DNA 또는 이의 상보가닥에 대한 프라이머 쌍인, 서열번호 2의 염기서열의 제 2815 위치의 염기 A를 끼워넣기(sandwich) 위하여 설계한 프라이머 쌍을 이용하여 벼의 게놈 DNA를 주형으로 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하는 공정,

(b) 공정 (a)의 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭된 DNA 단편에 제한 효소HindIII을 작용시키는 공정, 및

(c) 제한효소HindIII의 작용에 의해 상기 DNA 절편이 절단되는지 여부를 검색하는 공정을 포함하는 방법,

(25) 제 1항 또는 제 2항의 DNA를 포함하는 벡터가 도입된 숙주세포,

(26) 제 1항 또는 제 2항의 DNA에 의해 암호화되는 단백질,

(27) 제 25항의 숙주세포를 배양하고 상기 숙주세포 또는 이의 배양 상청에서 재조합 단백질을 회수하는 공정을 포함하는 제 26항의 단백질의 제조방법,

(28) 제 26항의 단백질에 결합하는 항체,

(29) 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 DNA 또는 이의 상보가닥에 상보적인 적어도 15 뉴클레오타이드로 이루어지는 DNA를 제공하는 것이다.

본 발명은 벼 유래의Hd6단백질을 암호화하는 DNA를 제공한다. 본 발명자들에 의해 단리된 카사라스의Hd6게놈 DNA의 염기서열은 서열번호 2에,Hd6cDNA의 염기서열은 서열번호 3에 나타나 있고 상기 DNA가 암호화하는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타나 있다. 또한, 니폰베어의Hd6게놈 DNA의 염기서열은 서열번호 5에, 상기 DNA가 암호화하는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타나 있다.

Hd6은 니폰베어 및 카사라스 사이의 교배 자손을 이용하여 검색한 양적 형질 유전자좌(QTL)의 하나이며, 제 3 염색체 상에 존재한다고 알려져 있다. 또, 니폰베어의 유전적 배경을 가진Hd6영역의 준동질 유전자 계통을 이용한 실험에서,Hd6유전자좌는 감광성 유전자좌라는 것이 알려졌다. 이 준동질 유전자 계통은 파종에서 출수까지에 필요한 일수(도수일수)가 니폰베어와 비교하면, 5일 내지 7일정도 더 필요하다. 다시 말하면,Hd6은 감광성을 강화하고, 만생화 작용을 일으킨다. 상기Hd6유전자는 식물의 감광성에 관여하는 유전자로서, 지금까지 벼의 제 3 염색체라 불리는 광대한 영역의 어느 장소에 존재하는 것으로 알려져 있었지만, 이러한 동정 및 단리에는 이르지 못하였다. 본 발명자들은 복잡한 단계를 거쳐 드디어 그 존재영역을 해명하고 단일 유전자로서 상기 유전자를 단리하는 것에 처음으로 성공하였다.

현재, 일본의 벼 품종 개량에 있어서, 출수기의 조절은 중요한 육종 목표이다. 특히, 한령대(cold districts)에서는 가을의 저온이 빨리 도래하기 때문에 출수기의 조절은 냉해의 회피를 위해 중요하며, 한편, 서남의 따뜻한 지역(west-south warm area)에 있어서는 대규모 벼농사 지대에서 수확 작업의 집중을 회피하기 위해서도 조생화 혹은 만생화가 요구되고 있다.

Hd6단백질은 식물의 감광성을 강화하는 작용을 하기 때문에 상기 단백질을 암호화하는 DNA로 식물을 형질전환시킴으로써 식물의 만생화(개화시기의 지연화)를 유도할 수가 있다. 한편, 안티센스법이나 리보짐(ribozyme)법 등을 이용하여 상기 DNA의 발현 억제를 행하여 감광성을 저하시키고 식물의 개화시기를 조기화하는 것이 가능하다. 따라서,Hd6단백질을 암호화하는 DNA를 가지지 않는 품종에는 유전자 재조합에 의해 상기 DNA를 도입하며, 가지고 있는 품종에는 안티센스나 리보짐 등을 이용하여 상기 DNA의 발현을 억제하여 식물의 개화시기의 다양화를 도모하며, 식물의 신품종 육성을 수행하게 할 수 있다.

본 발명의Hd6단백질을 암호화하는 DNA에는 게놈 DNA, cDNA 및 화학 합성DNA를 포함한다. 게놈 DNA 및 cDNA의 조제는 당업자가 상시 수단을 이용하여 행하는 것이 가능하다. 게놈 DNA는 예를들어, 감광성 유전자를 가지는 벼 품종(예를들어, 카사라스)에서 게놈 DNA를 추출하고 게놈 라이브러리(벡터로서는 플라스미드, 파지, 코스미드, BAC 등이 이용될 수 있다)를 제작하고 상기 라이브러리를 전개하고 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA(예를들어, 서열번호 2)을 근거로 조제한 탐침(probe)을 이용하여 콜로니 혼성화(colony hybridazation) 또는 플라그 혼성화(plaque hybridazation)을 수행하여 조제될 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA(예를들어, 서열번호 2)에 특이적인 프라이머를 작성하고 이것을 사용하는 PCR에 의해 조제할 수도 있다. 한편, cDNA는 예를들어, 감광성 유전자를 가지는 벼 품종(예를들어, 카사라스)에서 추출한 mRNA를 기초로 cDNA를 합성하고 상기 합성된 cDNA를 λZAP 등의 벡터에 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제작하며 상기 cDNA 라이브러리를 전개하고 상기와 동일한 콜로니 혼성화 또는 플라그 혼성화를 수행하여 조제될 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의Hd6단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 암호화하는 DNA를 포함한다. 여기서 "Hd6단백질과 동등한 기능을 가진다"라는 것은 대상으로 되는 단백질이 식물의 감광성을 증가시키는 기능을 가진다는 것을 가리킨다. 이러한 DNA에는 예를들어, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 또는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 돌연변이체(mutants), 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체(homologues)를 포함한다.

당업자에게 잘 알려져 있는 아미노산 서열이 변화된 단백질을 암호화하는 DNA의 조제방법은 예를들어, 부위 방향적 돌연변이법(site-directed mutagenesis, Kr amer, W.& Fritz, H-J. Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplux DNA. Methods in Enzymology, 154, 350-367, 1987)을 들 수 있다. 또, 염기서열의 변이에 의해 암호화하는 단백질의 아미노산 서열이 변이되는 것은 자연계에 있어서도 발생된다. 천연형Hd6단백질을 암호화하는 아미노산 서열에 서 하나 또는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA에서도 천연형의Hd6단백질(서열번호 1)과 동등한 기능을 가지는 단백질을 암호화하는 한, 본 발명의 DNA에 포함된다. 또, 예를들어, 염기서열이 변이된 경우에도 이것이 단백질 중의 아미노산의 변이를 수반하지 않는 경우(축중변이)도 있고, 이러한 축중변이체(degeneracy mutants)도 본 발명의 DNA에 포함된다.

DNA가 식물의 감광성을 증가시키는 단백질을 암호화하는가 여부는 하기와 같이 평가할 수 있다. 가장 일반적인 방법으로는 상기 DNA로 도입되는 식물을 광주기를 변경시킬 수 있는 성장 캐비넷에 재배하여 조사하는 방법이다. 다시 말하면, 단일(일반적으로 9 내지 10 시간) 조건 및 장일(14 내지 16 시간) 조건에서 재배하고 파종부터 개화하기까지(벼라면 파종부터 이삭가 나올때까지)에 필요한 일수를 비교하는 방법이다. 상기 일수가 장일과 단일 사이에서 어떤 변화가 일어나지 않거나 거의 동일한 경우에는 감광성이 없다고 판단한다. 감광성이 있는 경우에는 장일에서 개화까지의 일수는 단일보다 크게 되며 그 차이의 대소는 감광성의 정도로 고려될 수 있을 것이다. 성장 캐비넷이 이용될 수 없는 경우에는 자연 광주기를 가지는 밭이나 온실에서 재배시험을 하여 판정할 수 있다. 다시 말하면, 온실에서 20일마다 파종하고 온도를 유지하여 자연 광주기 하에서 재배하고 각각의 개화일을 측정한다. 벼에 있어서는 일반적으로 8월 내지 2월에 파종하는 경우는 감광성이 큰 품종의 출수는 촉진되고 역으로 4월 내지 7월에는 지연된다. 감광성이 약한 품종에서는 도수일수는 파종기의 이동에 영향없이 변화가 적다.

서열번호 1의Hd6단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 암호화하는 DNA를 생산하기 위해, 당업자에게 잘 알려져 있는 다른 방법으로는 혼성화 기술(Southern, E.M.: Journal of Molecular Biology, 98, 503, 1975)이나 폴리머라제 연쇄반응(PCR) 기술(Saiki, R.K. et al, Science, 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R.K. et al, Science, 239, 487-491, 1988)을 이용한 방법을 들 수 있다. 다시 말하면, 당업자에 의해Hd6유전자의 염기서열(서열번호 2, 3) 또는 이의 일부를 탐침으로서 사용하고 또,Hd6유전자(서열번호 2, 3)에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여, 벼나 다른 식물로부터Hd6유전자와 높은 상동성을 가지는 DNA를 단리하는 것은 통상 행할 수 있다. 이러한 혼성화 기술이나 PCR 기술에 의해 단리되는Hd6단백질과 동등한 기능을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA도 또한 본 발명의 DNA에 포함된다.

이러한 DNA를 단리하기 위해서는, 바람직하게는 긴축 조건 하에서 혼성화(hybridization) 반응을 수행한다. 본 발명에 있어서 긴축 혼성화 조건은 6M 요소, 0.4% SDS, 0.5 X SSC의 조건 또는 이와 동등한 긴축 조건을 가리킨다.보다 고긴축 조건은 예를들어, 6M 요소, 0.4% SDS, 0.1 X SSC의 조건을 이용하면 보다 상동성이 높은 DNA의 단리를 기대할 수 있다. 이렇게 단리된 DNA는 아미노산 레벨에 있어서,Hd6단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)과 높은 상동성을 가진다고 생각된다. 높은 상동성이란 적어도 50% 이상, 더 바람직하게는 70% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상(예를들어, 95% 이상)의 서열 동일성을 가리킨다. 아미노산 서열이나 염기서열의 동일성은 카린(Karlin) 및 알트츌(Altschul)에 의한 알고리즘 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993)에 의해 결정될 수 있다. 이런 알고리즘에 기초하여 BLASTN 이나 BLASTX라 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul et al, J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990). BLAST에 근거한 BLASTN에 의한 염기서열을 분석하는 경우에는, 파라미터는 예를들어, 스코어(score) = 100, 워드랭스(wordlength) = 12로 된다. 또, BLAST에 근거한 BLASTX에 의한 아미노산 서열을 분석하는 경우에는, 파라미터는 예를들어, 스코어(score) = 50, 워드랭스(wordlength) = 3으로 된다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 이용한 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터(default parameter)를 사용한다. 이러한 분석방법의 구체적인 기술은 공지되어 있다(http://www,ncbi.nlm.nih.gov.).

본 발명의 DNA는 예를들어, 재조합 단백질의 조제나 감광성이 변화된 형질전환 식물체의 생산 등에 이용될 수 있다.

재조합 단백질을 조제하는 경우에는 통상, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA를 적당한 발현 벡터에 삽입하고 상기 벡터를 적당한 세포에 도입하며, 형질전환 세포를 배양하여 발현된 단백질을 정제한다. 재조합 단백질은 정제를 용이하게 하는 등의 목적으로, 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현시키는 것도 가능하다. 예를들어, 대장균을 숙주로 하여 말토오즈(maltose) 결합 단백질과의 융합단백질로서 조제하는 방법(New England BioLabs, USA, vector pMAL series), 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(GST)와의 융합 단백질로서 조제하는 방법(Amersham Pharmacia Biotech, vector pGEX series), 히스티딘을 부가하여 조제하는 방법(Novagen, pET series) 등을 이용한 것이 가능하다. 숙주세포로서는 재조합 단백질의 발현에 적당한 세포라면 특히 제한되지 않으며, 상기의 대장균 뿐 아니라 예를들어, 효모, 각종의 동식물 세포, 곤충 세포 등을 이용할 수 있다. 숙주세포로의 벡터 도입에는 당업자에게 공지된 각종의 방법을 이용할 수 있다. 예를들어, 대장균으로의 도입에는 칼슘을 이용하는 도입 방법(Mandel, M. & Higa, A., Journal of Molecular Biology, 53, 158-162, 1970; Hanahan, D., Journal of Molecular Biology, 166, 557-580, 1983)을 이용할 수 있다. 숙주세포 내에서 발현되는 재조합 단백질은 상기 숙주세포 또는 이의 배양 상청으로부터 당업자에게 공지된 방법에 의해 정제하고 회수할 수 있다. 재조합 단백질을 상기 말토오스 결합 단백질 등과의 융합 단백질로서 발현시킨 경우에는 용이하게 친화성 정제(affinity chromatography)를 수행할 수 있다.

얻어진 재조합 단백질을 이용하면, 이것에 결합하는 항체를 조제할 수 있다. 예를들어, 다클론 항체(polyclonal antibody)는 정제한 본 발명의 단백질 또는 이의 일부의 펩타이드를 토끼 등의 면역 동물에 면역시키고 일정기간 뒤에 혈액을 채취하고 혈구를 제거하여 정제할 수 있다. 또, 단일클론 항체(monoclonal antibody)는 상기 단백질 또는 펩타이드로 면역된 동물의 항체 생산세포로 골종양세포를 융합시킴으로써 목적으로 하는 항체를 생산하는 단일클론의 세포(하이브리도마)를 단리하고 상기 세포로부터 항체를 회수하여 조제할 수 있다. 이렇게 얻어진 항체는 본 발명의 단백질의 정제나 검색 등에 이용될 수 있다. 본 발명에는, 본 발명의 단백질에 결합하는 항체가 포함된다.

본 발명의 DNA를 이용하여 감광성이 증가된 형질전환 식물체를 제조하는 경우에는, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA를 적당한 벡터에 삽입하고 상기 벡터를 식물세포에 도입하고 이렇게 얻어진 형질전환 식물세포를 재생시킨다. 본 발명자들에 의해 단리된 감광성 유전자Hd6은 벼의 감광성을 강화시키는 작용을 하며, 그 결과, 출수기를 지연시키는 효과를 가지지만, 상기 유전자를 임의의 품종에 도입하여 발현시켜서 이런 계통의 출수기를 조절할 수 있다. 이런 형질전환에 필요한 기간은 종래처럼 교배에 의한 유전자 이입과 비교하여 극히 단기간이며, 또, 다른 형질의 변화를 수반하지 않는 점에서 유리하다. 벼에서, 출수기를 조절하는 유전자는 지금까지 단리, 동정되지 않았지만, 이러한 방법으로 본 발명에 의해 처음으로 가능하게 되었다.

한편, 감광성이 저하된 형질전환 식물체를 조제하는 경우에는 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA의 발현을 억제하기 위한 DNA를 적당한 벡터에 삽입하고 상기 벡터를 식물세포에 도입하며 이렇게 얻어진 형질전환 식물세포를 재생시킨다. "본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA의 발현의 억제"에는 유전자의 전사의 억제 및단백질으로의 번역의 억제가 포함된다. 또한, DNA의 발현의 완전한 불능 뿐 아니라 발현의 감소도 포함된다.

식물에서, 특정의 내재성 유전자의 발현을 억제하는 방법으로는 안티센스 기술을 이용하는 방법이 당업자에게 가장 잘 이용되고 있다. 식물세포에서 안티센스 효과는 에커 등(Ecker et al)이 일시적 유전자 발현법을 이용하여 전기천공법(electroporation)으로 도입한 안티센스 RNA가 식물에 관한 안티센스 효과를 발휘하는 것에서 최초로 증명되었다(J. R. Ecker and R. W. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83, 5372, 1986). 그후, 담배나 페튜니아(petunia)에서도, 안티센스 RNA의 발현에 의한 표적 유전자의 발현이 저하되는 예가 보고되어 있고(A. R. van der Krol et al., Nature, 333, 866, 1988), 현재 식물에서 표적 유전자 발현을 억제시키는 수단으로서 확립되어 있다. 안티센스 핵산이 표적 유전자의 발현을 억제하는 작용에는 하기의 다양한 요인이 존재한다. 다시말하면, 삼중환 형성에 의한 전사 개시 저해; RNA 폴리머라제가 국소 개상(open) 루프 구조를 만드는 부위에서 하이브리드 형성에 의한 전사의 억제; 합성이 계속되는 RNA와의 하이브리드의 형성에 의한 전사 억제; 인트론과 엑손 사이의 접합점에서 하이브리드 형성에 의한 스프라이싱(splicing) 억제; 스프라이소좀(spliceosome)의 형성 부위에서 하이브리드 형성에 의한 스프라이싱 억제; mRNA와의 하이브리드 형성에 의한 핵에서 세포질로의 이행 억제; 캡핑(capping)부위나 폴리(A) 부가 부위와의 하이브리드 형성에 의한 스프라이싱 억제; 번역 개시인자 결합부위와의 하이브리드 형성에 의한 번역개시 억제; 개시 코돈 근방의 리보솜 결합 부위와의 하이브리드형성에 의한 번역 억제; mRNA의 번역영역이나 폴리솜 결합부위와의 하이브리드 형성에 의한 펩타이드 사슬의 신장 저해; 및 핵산 및 단백질과의 상호작용 부위에서 하이브리드 형성에 의한 유전자 발현 억제 등이 있다. 이들 요인들은 전사, 스프라이싱, 또는 번역의 과정을 저해하여 표적 유전자의 발현을 억제한다(Hirashima and Inoue, "Shin Seikagaku Jikken Koza (New Biochemistry Experimentation Lectures) 2, Kakusan (Nucleic Acids) Ⅳ, Idenshi No Fukusei To Hatsugen (Replication and Expression of Genes)", Nihon Seikagakukai Hen (The Japanese Biochemical Society), Tokyo Kagaku Dozin, 319-347, 1993).

본 발명에서 사용된 안티센스 서열은 상기의 어느 하나의 작용에 의해 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 하나의 유형으로는, 유전자의 mRNA의 5' 말단 근방의 비번역 영역에 상보적인 안티센스 서열을 설계하면 유전자의 번역저해에 효과적일 것이다. 그러나, 암호화 영역 또는 3'측의 비번역 영역에 상보적인 서열도 사용할 수 있다. 이렇게 유전자의 번역 영역 뿐 아니라 비번역 영역의 서열의 안티센스 서열을 포함한 DNA도 본 발명에서 이용되는 안티센스 DNA에 포함된다. 사용되는 안티센스 DNA는 적당한 프로모터의 하류에 연결되고 바람직하게는 3'측에 전사종결체 신호를 포함하는 서열이 연결된다. 이렇게 제조된 DNA는 공지 방법으로 원하는 식물에 형질전환할 수 있다. 안티센스 DNA의 서열은 형질전환하는 식물이 가지는 내재성 유전자 또는 이의 일부와 상보적인 서열인 것이 바람직하지만, 유전자의 발현을 효과적으로 저해하는 한, 완전히 상보적이지 않아도 무방하다. 전사된 RNA는 표적으로 하는 유전자의 전사산물에 대하여 바람직하게는 90% 이상,가장 바람직하게는 95% 이상의 상보성을 가진다. 안티센스 서열을 이용하여 효과적으로 표적 유전자의 발현을 저해하기 위해서는 안티센스 DNA의 길이가 적어도 15 염기 이상이어야 하며, 바람직하게는 100 염기 이상, 더 바람직하게는 500 염기 이상이다. 통상, 사용되는 안티센스 DNA의 길이는 5kb보다도 짧고 바람직하게는 2.5kb보다도 짧다.

내재성 유전자의 발현의 억제는 또한, 리보짐(ribozyme)을 암호화하는 DNA를 이용하여 수행할 수 있다. 리보짐은 촉매활성을 가지는 RNA 분자를 말한다. 리보짐은 다양한 활성을 가지지만, 그 중에도 RNA를 절단하는 효소로서의 리보짐 연구에 의해 RNA의 부위 특이적인 절단을 목적으로 하는 리보짐의 설계를 할 수 있게 되었다. 리보짐에는 그룹I 인트론 형이나 RNaseP에 함유되는 M1RNA와 같이 400 뉴클레오티드 이상의 큰 것도 있지만, 하머해드(hammerhead) 형이나 헤어핀(hairpin)형이라 불리는 약 40 뉴클레오티드 정도의 활성 도메인을 가지는 것도 있다(Makoto Koizumi and Eiko Ohtsuka, Tanpakushitsu Kakusan Kohso (Nucleic acid, Protein, and Enzyme), 35, 2191, 1990).

예를들어, 하머해드형 리보짐의 자기절단 도메인은 G13U14C15의 C15의 3' 측을 절단하지만, 리보짐의 활성에는 U14가 9 부위의 A와 염기쌍 형성하는 것이 중요하며, 15 부위의 염기는 C 대신에 A 또는 U일 경우에도 절단되는 것이 나타나 있다(M. Koizumi et al, FEBS Lett., 228, 225, 1988). 리보짐의 기질 결합부를 표적부위 근방의 RNA 서열과 상보적으로 되도록 설계하면, 표적 RNA 내의 UC, UU 또는 UA라 불리는 서열을 확인하는 제한효소적인 RNA 절단 리보짐을 제조할 수 있다(M. Koizumi et al., FEBS Lett., 239, 285, 1988; Makoto Koizumi and Eiko ohtsuka, Tanpakushitsu Kakusan Kohso (Protein, Nucleic acid and Enzyme), 35, 2191, 1990; M. Koizumi et al., Nucleic Acids Res., 17, 7059, 1989). 예를들어,Hd6유전자의 암호화 영역(서열번호 3) 중에는 표적으로 되는 부위가 다수 존재한다.

또한, 헤어핀형 리보짐도, 본 발명의 목적을 위해서 유용하다. 헤어핀형 리보짐은 예를들어, 타바코 링스파트 바이러스(tabbaco ringspot virus)의 부수체(satellite) RNA의 마이너스 가닥에서 발견되었다(J. M. Buzayan, Nature, 323, 349, 1986). 이 리보짐도 또한 표적 특이적인 RNA 절단을 일으키도록 설계할 수 있음이 알려져 있다(Y. Kikuchi and N. Sasaki, Nucleic Acids Res., 19, 6751, 1992; Yo Kikuchi, Kagaku To Seibutsu (Chemistry and Biology) 30, 112, 1992).

표적을 절단할 수 있도록 설계된 리보짐은 식물세포 중에서 전사될 수 있도록 컬리플라워 모작 바이러스 35S 프로모터(cauliflower mosaic virus 35S promoter) 등의 프로모터 및 전사종결 서열에 연결되었다. 그러나, 이때, 전사시킨 RNA의 5' 말단이나 3' 말단에 여분의 서열이 부가되면 리보짐의 활성이 상실될 수 있다. 이런 경우, 전사시킨 리보짐을 함유하는 RNA에서 리보짐 부분만을 정확하게 절단하기 위해, 리보짐 부위의 5'측이나 3'측에 트리밍(trimming)을 수행하기 위해 시스(cis)에서 기능을 하는 별개의 트리밍 리보짐을 배치시킬 수도 있다(K. Taira et al., Protein Eng. 3, 733, 1990; A. M. Dzaianott and J. J. Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4823, 1989; C. A. Grosshands and R. T. Cech,Nucleic Acids Res., 19, 3875, 1991; K. Taira et al., Nucleic Acid Res., 19, 5125, 1991). 또한, 이러한 구성단위를 탄뎀(tandem)에서 정렬하여 표적 유전자의 다수의 부위를 절단할 수 있도록 하여 보다 효과를 증진시킬 수 있다(N. Yuyama et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 186, 1271, 1992). 이러한 리보짐을 사용하여 본 발명에서 표적으로 하는 유전자의 전사산물을 특이적으로 절단하여 상기 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

내재성 유전자의 발현의 억제는 또한, 표적 유전자 서열과 동일 또는 유사한 서열을 가지는 DNA에 의한 형질전환을 통하여 공억제(coreprssion)에 의해서도 달성될 수 있다. "공억제(co-repression)"는 식물에 표적 내재성 유전자와 동일 또는 유사한 서열을 가지는 유전자를 형질전환에 의해 도입하면 도입된 외래유전자 및 표적 내재성 유전자의 쌍방의 발현이 억제되는 현상을 말한다. 공억제의 상세한 기전은 알려져 있지 않지만 식물에서 자주 관찰된다(Curr. Biol. 7, R793, 1997; Curr. Biol. 6, 810, 1996). 예를들어,Hd6유전자가 공억제되는 식물체를 얻기 위해서는Hd6유전자 또는 이것과 유사한 서열을 가지는 DNA를 발현할 수 있도록 제작된 벡터 DNA를 목적의 식물에 형질전환하여 얻어진 식물체에서Hd6변이체의 형질을 가지는 식물, 즉 감광성이 저하된 식물을 선택하면 된다. 공억제에 사용되는 유전자는 표적 유전자와 완전히 동일할 필요는 없지만, 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상(예를들어, 95% 이상)의 서열의 동일성을 가진다. 서열의 동일성을 상기의 방법에 의해 결정할 수 있다.

또한, 본 발명에서 내재성 유전자의 발현의 억제는 표적 유전자의 우성 음성형질(dominant negative phenotype)을 가지는 유전자를 식물에 형질전환함으로써도 달성된다. 우성 음성 형질을 가지는 유전자는 상기 유전자를 발현시키기 위해서 식물체가 본래 가지는 내재성 야생형 유전자의 활성을 상실 또는 저하시키는 기능을 가지는 유전자를 말한다.

식물세포의 형질전환에 사용되는 벡터로는 상기 세포 내에서 삽입된 유전자를 발현시키는 것이 가능한 한 특별히 제한되지 않는다. 예를들어, 식물세포 내에서의 항상적인 유전자 발현을 하기 위한 프로모터(예를들어, 컬리플라워 모작 바이러스 35S 프로모터)를 가지는 벡터나 외적인 자극에 의해 보다 유도적으로 활성화시킬 수 있는 프로모터를 가지는 벡터를 이용할 수도 있다. 여기서 "식물세포"에는 다양한 형태의 식물세포, 예를들어, 배양세포 현탁액, 원형질체(protoplast), 잎 절편 및 컬러스(callus)를 포함한다.

식물세포로의 벡터의 도입은 폴리에틸렌 글리콜(polymethylene glycol) 방법, 전기천공법(electroporation),아가로박테리움(Agrobacterium) 매개 전이법, 입자 충격법(particle bombardment) 등 당업자에게 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다. 형질전환 식물세포로부터 식물체의 재생은 식물세포의 종류에 따라 당업자에게 공지된 방법으로 행할 수 있다(Toki et al., Plant Physiol., 100, 1503-1507, 1995). 예를들어, 벼에서 형질전환 식물체를 제조하는 방법은, 폴리에틸렌 글라콜에 의한 원형질체로 유전자 도입, 식물체(인도형 벼 품종이 적당함)를 재생하는 방법(Datta, S. K., In "Gene Transfer Plants" , Potrykus I and Spangenberg Eds., 66-74, 1995), 전기 펄스에 의한 원형질체로 유전자 도입, 식물체(니폰베어 벼 품종이 적당함)를 재생하는 방법(Toki et al, Plant Physiol., 100, 1503-1507, 1992), 입자 충격법에 의한 세포로 유전자를 직접 유도, 식물체를 재생하는 방법(Christou et al, Bio/Technology, 9, 957-962, 1991) 및아그로박테리움을 매개로 한 유전자 도입, 식물체를 재생시키는 방법(Hiei et al., Plant J., 6, 271-282, 1994) 등, 몇가지의 기술이 이미 확립되어 있고 본 발명의 기술분야에서 광범위하게 이용될 수 있다. 본 발명에는 이러한 방법을 적절하게 사용할 수 있다.

게놈 내에 본 발명의 DNA가 도입된 형질전환 식물체가 얻어지면, 상기 식물체는 유성생식 또는 무성생식에 의해 자손을 얻을 수 있다. 또, 상기 식물체나 이의 자손 혹은 클론에서 얻어진 번식 재료(예를들어, 종자, 과실, 이삭, 괴경, 괴근, 주, 컬러스, 원형질체 등)를 얻고 이것을 기초로 상기 식물체를 양산할 수도 있다. 본 발명은 본 발명의 DNA가 도입되는 식물세포, 상기 세포를 포함하는 식물체, 상기 식물체의 자손 및 클론 뿐 아니라 상기 식물체, 이의 자손 및 클론의 번식재료를 포함한다.

이렇게 제조된 감광성이 변화된 식물체는 야생형 식물체와 비교하여 개화시기가 변화된다. 예를들어,Hd6단백질을 암호화하는 DNA가 도입된 식물체는 감광성의 증가에 의해 개화시기가 지연되고 한편, 안티센스 DNA 등의 도입에 의해Hd6단백질을 암호화하는 DNA의 발현이 억제된 식물체는 감광성의 저하에 의해 개화시기가 빨라진다. 이렇게Hd6유전자의 발현을 조절하는 것에 의해, 식물의 개화시기를 조절할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하면, 유용 농작물인 벼의 출수시기를 조절할 수 있고 생육환경에 적당한 벼 품종의 육성에 있어서 상당히 유익하다.

본 발명은 또, 식물의 감광성을 평가하는 방법을 제공한다. 본 발명자 등은 벼에서 감광성 품종인 카사라스의Hd6유전자와 감광성 품종이 아닌 니폰베어의Hd6유전자를 비교할 경우, 상기 품종들의 ORF 사이의 차이는 하나의 염기 치환만 있고 이것에 의해 카사라스에서 라이신(lysine)을 암호화하는 부위가 니폰베어에서는 종결 코돈으로 되어 있다는 것을 발견하였다. 니폰베어는 이런 종결 코돈의 존재에 의해 기능적인 산물의 번역을 할 수 없다. 이것은 식물에서 감광성의 정도가 기능적인Hd6단백질을 발현하는지 아닌지의 하나의 요인으로 되어 결정되는 것을 보여준다. 본 발명의 식물의 감광성을 평가하는 방법은 이런 지견에 근거하여 식물이 기능적인Hd6단백질을 암호화하는 DNA를 보유하고 있는가 아닌가를 검색하는 것을 특징으로 한다.

식물이 기능적인Hd6단백질을 암호화하는 DNA를 보유하고 있는가 아닌가를 기준으로 하는 식물의 감광성의 평가는 벼에서 서열번호 2에 기재된 염기서열의 제 2815 위치의 염기 A의 변이를 검색하는 것에 의해 행할 수 있다. 또, 본 발명에서 카사라스 및 니폰베어의Hd6유전자의 ORF 내의 염기서열의 차이에 의해 카사라스에 있는 DNA에서 제한효소HindIII의 확인부위로 되는 영역이 니폰베어에서는 제한효소HindIII에 의한 인식을 받지 않도록 변화되는 것을 발견하였다. 또한, 이런 지견을 근거로, 감광성 유전자E3유전자의 존재 유무에 의한 감광성의 유무가 특징지워지는 벼 품종에서 이러한 제한효소 인식부위의 존재를 검색하는 경우, 감광성 품종에서 특이적으로 그 존재가 검색되었다. 따라서, 상기의 염기의 변이는 제한효소HindIII에 의한 인식의 유무에 의해 검색되는 것이 가능하다(CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)법). 제한효소HindIII를 이용한 방법은 구체적으로는 (a) 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 DNA 또는 상보 가닥에 대한 프라이머 한쌍인, 서열번호 2의 염기서열의 제 2815 위치의 염기 A를 함유하도록 설계된 프라이머 한쌍을 이용하여, 벼의 게놈 DNA를 주형으로 이용하여 폴리머라제 연쇄반응을 수행하는 공정, (b) 공정 (a)의 폴리머라제 연쇄반응에 의해 증폭된 DNA 단편에 제한효소HindIII을 작용시키는 공정, 및 (c) 제한효소HindIII 의 작용에 의해 상기 DNA 단편이 절단되는지 아닌지를 검색하는 공정을 포함하는 방법이다. 이러한 방법에서 사용되는 프라이머 한쌍으로는 예를들어, 서열번호 20 및 서열번호 21에 기재된 프라이머를 사용할 수 있다. 제한효소HindIII의 작용에 의해 PCR 산물이 절단되는지 아닌지는 제한효소를 작용시킨 후의 DNA를 전기영동시키고 전기영동 패턴을 검색하여 판단할 수 있다. 그 결과, PCR 산물이 상기 제한 효소에 의해 절단되지 않는 경우에는 피검식물은 감광성을 가지지 않는다고 판단된다.

또한, 본 발명의 방법에 의해서는 상기의 CAPS법 이외에, dCAPS법(Neff et al, The Plant Journal, 14, 387-392, 1998)을 이용한 것도 할 수 있다. 이러한 방법은 염기치환의 부위가 특정 제한효소 부위와 일치하지 않는 경우, 염기치환에 근접한 영역에 프라이머를 설계하고 프라이머 일부의 염기에 미스매치(mismatch)를 도입하여 증폭산물내에 새로운 제한효소 부위를 제작하는 방법이다. 본 발명자등은 실제로 미스매치를 도입시키는 프라이머로 '서열번호 22/5'-CTTTGTGGAGGTCCAAACATTGTG-3' 및 CAPS 마커와 공통 프라이머 '서열번호 21/5'-CTACAGATCCACAGAACAGG-3'를 상기 방법에 이용한다.

또한, 본 발명의 방법에서는 염기치환이 생기는 부위에 하나의 프라이머 3' 말단이 대응하도록 프라이머 설계를 하고 어느 쪽의 품종에서도 증폭산물이 얻어지지 않도록 고안된 ASPCR(allele-specific PCR)법(Dan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2757-2760, 1989)을 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 의한 식물의 감광성의 평가는 예를들어, 식물의 교배에 의한 품종개량을 하는 경우에 유리하다. 즉, 감광성 형질의 도입을 바라지 않는 경우에, 감광성을 가지는 품종과의 교배를 피할 수 있고 역으로, 감광성 형질의 도입을 바라는 경우에 감광성을 가지는 품종과의 교배를 할 수 있다. 또한, 교배 자손 개체로부터 원하는 개체를 선택하는 때에도 유효하다. 식물의 감광성의 유무를 그 표현형에 의해 판단하는 것과 비교하여 유전자 레벨에서 판단하는 것은 간단하고 확실하기 때문에 본 발명의 감광성의 평가 방법은 식물의 품종개량에 있어서 큰 기여를 할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2에 기재된 염기서열로 이루어진 본 발명의 DNA 또는 이의 상보 가닥에 상보적인 적어도 15 뉴클레오티드로 이루어진 DNA를 제공한다. 여기서, "상보가닥"은 A:T, G:C의 염기 쌍으로 이루어지는 이중가닥 DNA의 하나의 가닥에 대한 다른 가닥을 가리킨다. 또, "상보적"은 적어도 15개의 연속된 뉴클레오티드 영역 내에서 완전하게 상보서열인 경우에 한하지 않고 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 더 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95% 이상의 염기서열이 상보서열이면 좋다. 이러한 DNA는 본 발명의 DNA의 검색이나 단리를 수행하기 위한 탐침 및 DNA를 증폭을 행하기 위한 프라이머로 사용된다.

도면의 간단한 설명

도1은Hd6영역의 연쇄지도, YAC 및 PAC 정렬화 지도를 나타내며,

도2은 후보 게놈 영역의 유전자 예측의 결과를 나타내며,

도 3은Hd6영역의 상세한 유전지도를 나타내며,

도 4는 니폰베어 및 카사라스의 후보 유전자CKII의 염기서열의 비교를 나타내며,

도 5는 후보 유전자 영역의 게놈 염기서열의 니폰베어 및 카사라스의 정렬을 나타내며,

도 6은 도 4의 계속이며,

도 7은 도 5의 계속이며,

도 8은 도 6의 계속이며,

도 9은 도 7의 계속이며,

도 10은 도 8의 계속이며,

도 11은 도 9의 계속이며,

도 12은 도 10의 계속이며,

도 13은 추정된 아미노산 서열의 니폰베어 및 카사라스의 정렬을 나타내며

도 14는 후보 유전자CKIIα의 발현 패턴을 RT-PCR법에 의해 분석한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. 그림 중, "M"은 마커(λ/HindIII+ΦX174/HaeIII)을 나타낸다. 레인 1, 6, 11이 니폰베어 전체 DNA, 레인 2, 7, 12가Hd6NIL 전체 DNA, 레인 3, 8, 13이 니폰베어 전체 RNA, 레인 4, 5, 9, 10, 14, 15가Hd6NIL 전체 RNA이다. PCR 프라이머는 레인 1 내지 5가 액틴 유전자를 증폭하기 위한 프라이머, 레인 6 내지 10이 C10214를 증폭하기 위한 프라이머(Hd6과 같은 자리의CKIIα), 레인 11 내지 15가 R2856을 증폭하기 위한 프라이머(Hd6과 같은 자리가 아닌CKIIα)이다.

도 15는 CAPS법에 의한 니폰베어 및 카사라스의 게놈 DNA 사이의 다형을 검색한 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더 구체적으로 설명되지만 본 발명은 이러한 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다

<실시예 1. 연쇄분석 및 효모 인공 염색체(YAC) 클론에 의한Hd6유전자 영역의 정렬화>

Hd6영역이 분리되는 니폰베어 및 카사라스의 역교배된 자손 집단(advanced backcross progeny population, 1180 개체)을 포장(field)에서 재배하고Hd6근접에 생기는 재조합 염색체를 가지는 개체를 선별하였다. 선별에는 작업의 효율화를 도모하기 위해 CAPS 마커를 이용하였다(Konieczny nad Ausubel, Plant J., 4, 403-410, 1993).

먼저,Hd6유전자 영역을 끼워놓은 RFLP 마커인 R2404 및 C1329의 CAPS 마커화를 하였다. R2404는 이의 cDNA 클론에 특이적인 프라이머 "서열번호 6/5'-GCAAAATGCCACTTTGTGGC-3'"와 "서열번호 7/5'-AACTTACGCTCAAATCAAAA-3'(안티센스)"를 이용하여 94℃에서 2분, "94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분"을 40주기, 72℃에서 7분의 조건에서 PCR 반응로 증폭하여, 얻어진 산물이 다형을 나타내었다. C1329는 특이적인 프라이머 "서열번호 8/5'-TGTTGCCCTCATTATCTGCT-3'" 및 "서열번호 9/5'-GGAGGTCGGAGTAAAGGAAA-3'(안티센스)"을 이용하여 94℃에서 2분, "94℃에서 1분, 60℃에서 2분, 72℃에서 3분"을 35주기, 72℃에서 7분의 조건에서 PCR 반응을 하여 얻어진 산물을 제한효소EcoT22I로 절단하여 다형을 나타낸다. 또, PCR의 주형으로 한 DNA는 Manner 및 Tenning 방법(Plant Mol. Biol. Reptr., 15, 38-45, 1997)을 개량한 방법으로 추출하였다. 다시말하면, 2, 3㎝ 정도의 길이의 잎을 추출 버퍼(100mM Tris-HCl pH 8.0, 50mM Na-EDTA, 1.25% SDS, 0.38% 중황산 나트륨, 200㎕/ml 단백질분해효소 K)에서 분쇄하고 65℃에서 2시간동안 배양한 뒤 원심분리하였고 이의 상청을 이소프로판올로 처리한 후 침전을 건조하고 적당량의 물로 용해하였다. CAPS 마커 R2404 및 C1329 사이에 발생하는 재조합 개체는 전체 40 개체 선택되었다.

선별된 개체에서 DNA를 추출하고Hd6근접의 RFLP 마커로 분석하고 상세한 연쇄지도를 작성하였다.Hd6유전자좌의 유전자형의 결정은 자손 검정에 의하였다. 다시 말하면, 선별 개체의 자기 자식을 포장에서 성장시키고 각 계통내의 출수기의 분리상황으로부터 유전자형을 판정하였다. 그 결과,Hd6은 RFLP 마커R2404 및 G1015 사이에 존재하고 R2856과는 공분리한다는 것을 보여주었다.

상세한 연쇄지도를 이용하여, 벼 게놈 연구에서 작성된 YAC 클론의 정렬화 지도의 정보를 근거로 상세한 정렬화 지도를 작성하였다. 연쇄지도의 작성에 이용된 각 마커를 서던 혼성화(southern hybridization) 및 각 마커의 STS화 프라이머를 이용한 PCR에 의해, 각 YAC 클론 상에 포함되고 있는지 아닌지를 확인할 수 있었다. 또,Hd6영역에 존재하는 YAC 클론의 말단 DNA 절편이나 상기 YAC 클론 상에 존재하는 cDNA 클론도 비슷하게 분석되었다.

이러한 분석과정에서, 다른 모든 마커와 달리, R2856은 서던 혼성화에 의해서는Hd6영역에 존재하는 YAC 클론에 대한 신호를 검색할 수 있었지만, PCR에서는 상기 YAC 상에는 R2856은 존재하지 않는다는 결과를 얻었다. 이 결과는Hd6유전자의 후보영역에 R2856과 극히 높은 상동성을 가지는 영역이 존재하며 R2856이 혼성화하는 염기서열은 존재하지만, cDNA 클론 R2856을 암호화하는 유전자는 존재하지 않는 것을 제안하고 있다. 즉, RFLP 마커로서의 R2856은Hd6영역 내의 이것과 극히 높은 상동성을 나타내는 영역을 가지고 있지만, 본래는 게놈 상의 다른 영역에 존재하는 유전자에 의해 암호화되는 것이다.

PCR 분석은 R2856에 특이적인 마커 "서열번호 10/5'-AGCACTCAAAAACACCAAGC-3'" 및 "서열번호 11/5'-AACAAAGATACAAACAGCAC-3'(안티센스)"를 사용하여 94℃에서 2분, "94℃에서 1분, 60℃에서 2분, 72℃에서 3분"을 30주기, 72℃에서 7분의 조건에서 행하였다.

벼 게놈 연구 프로그램에서 분석된 니폰베어의 ETS 클론을 검색할 경우(DDBJ(DNA Data Bank of Japan)), R2856과 높은 상동성을 나타내는 C10214(Ac. No. D22035)가 발견되었다. 상기 클론을 암호화하는 유전자가Hd6영역에 존재하는 것을 확인하기 위해, C10214에 특이적인 마커 "서열번호 12/5'-CTTGATCCTCAGCTTGAAGCT-3'" 및 "서열번호 13/5'-TGCAAGGCTACAAGCACATTC-3'(안티센스)"를 사용하여, 상술과 동일한 조건에서 PCR을 하였다. 그 결과, 상기 클론이 암호화하는 유전자가Hd6영역에 존재하는 것이 판명되었다.

더 상세한 YAC 클론의 정렬화 지도에 근거하여, 각 YAC 말단 DNA 단편이나 YAC 클론 상의 cDNA 클론을 RFLP 마커를 이용하여 연쇄지도를 더 상세하게 설계하였다. 그 결과,Hd6유전자 영역을 마커 E11893 및 Y3626L의 사이에 존재하는 영역임을 보여주었다(도 1).

<실시예 2. P1 유래 인공 염색체(PAC) 클론을 이용한Hd6유전자 영역의 정렬화>

Hd6에 근접한 EST나 YAC 말단, C10214, E11893, Y3626L, C63403, C11482 및 C60478의 염기서열에서 STS화 프라이머를 작성하고, 니폰베어의 PAC 게놈 클론 라이브러리(8352 클론, 평균 인서트 길이 112kb)의 스크린(screen)을 하였다. STS화에 사용된 프라이머는 C10214에 관하여 상술의 서열번호 12 및 13을, E11893에 관하여 "서열번호 14/5'-TCGTCGCGCTCATAGCTAGA-3'" 및 "서열번호 15/5'-ACTTCCTCGCTATGCCACAG-3'(안티센스)", Y3626L에 관하여는 "서열번호 16/5'-GCCCATAATGATACGATATACT-3'" 및 "서열번호 17/5'-TGGTGGTGGTTGCTGTTCGA-3'"을 사용한다. C63403, C11482 및 C60478에 관하여는 벼 게놈 연구에 의해 작성된 EST 맵핑(mapping)용의 프라이머를 사용하였다. PCR의 조건은 94℃에서 2분, "94℃에서 30초, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분"을 35주기, 72℃에서 7분이다. 그 결과,Hd6근접 클론 단편을 가진 것으로 생각되는 PAC 클론을 7개 선택하였다. 또, 이것의 클론 말단 단편을 RFLP 마커로 이용하여 조사하여, PAC 클론 P0689D1이Hd6의 후보 유전자 영역을 모두 포함하는 것이 나타났다(도 1).

<실시예 3. 염기서열 분석에 의한 후보 유전자 영역의 특정>

Hd6유전자를 포함한다고 생각되는 PAC 클론 P0689D1의 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열의 분석은 P0689D1의 인서트 DNA(벡터를 포함)를 초음파에서 단편화하고, 2kb 및 5kb의 평균 인서트 길이의 서브라이브러리(sublibrary)를 작성하였다. 상기 서브라이브러리에서 임의로 선택한 2000개의 클론의 염기서열을 분석하고 컴퓨터 소프트웨어 Phred/Phrap에 의한 어셈블(assemble)을 하였다. 연쇄분석에 의해 특정되는 후보 유전자 영역의 염기서열 정보를 이용하여 더 새로운 CAPS 마커를 작성하고, 후보 영역의 범위를 한계 설정하면서 후보 유전자가 존재한다고 생각되는 영역을 47kb로까지 좁힐 수 있었다. 이 후보 영역의 염기서열에 대한 컴퓨터 프로그램 GENSCAN에 의한 유전자 예측 및 유사성 검색 BLAST를 수행하면서,아라비돕시스의CKIIα유전자와 상당히 높은 유사성을 나타내는 영역이 발견되었다. 또, 그 영역의 염기서열은 EST 클론 C10214와 일치하였다(도 2).아리비돕시스의CKIIα유전자는 빛에 의해 발현이 조절되는 몇가지 유전자의 발현에 영향을주는 것이 나타나 있고(Lee et al., Plant Physiol., 119, 989-1000, 1999), 또, 체내 시계 유전자 CCA1 단백질을 인산화에 의해 활성화시키는 것이 알려져 있다(Sugano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 11020-11025, 1998).

<실시예 4. 고정도연쇄분석(fine-scale linkage analysis)>

Hd6유전자의 후보 영역을 더 자세하게 결정하기 위해, 대규모 집단의 연쇄분석을 다시 수행하였다. 전술한 방법에 따라, 새로운 1627 개체의 분리집단에서Hd6유전자를 끼워넣은 CAPS 마커 R2404 및 G1015의 마커 사이의 재조합 개체를 선택하였다. G1015은 특이적인 프라이머 "서열번호 18/5'-CTGCAAGTTCAAGCCGATCA-3'" 및 "서열번호 19/5'-TTGCAATTGGCTAAGCAAGAC-3'"를 이용하여 "94℃에서 40초, 65℃에서 40초, 72℃에서 90초"의 40주기 후, 72℃에서 7분의 조건에서 PCR을 수행하여 얻어진 산물을 제한효소HaeIII로 절단하여 다형 분석을 행하였다. 선별된 개체에서Hd6후보 유전자 게놈 영역(E11893 및 Y3626L의 사이)에서 재조합된 개체를 새롭게 11 개체 선별하였다. 이렇게 선별된 DNA를 추출하여 전술한 연쇄분석에 의해 확인된 4개의 재조합 개체를 가지는 CAPS 마커를 이용하여 상세한 유전자 지도를 작성하였다. 사용된 CAPS 마커는 후술하는 염기서열분석 결과에 기초하여 작성하였다.Hd6유전자좌의 유전자형은 전술과 동일하게 자손 검정에 의해 결정되었다. 그 결과,Hd6유전자는 CAPS 마커인 cnt13GNheI 및 cnt13BBgIII 사이에 위치되며, cnt13CRsaI, cnt912HindIII 및 A5M7AluI과는 공분리하였다(도 3). 그 결과,Hd6유전자의 후보영역은 26.4kb의 게놈 영역으로 제한 결정되었다.

<실시예 5. 카사라스 및 니폰베어의CKIIα유전자의 염기서열의 비교>

PAC 클론의 분석에 의해 얻어진 니폰베어의CKIIα유전자의 염기서열 정보를 이용하여, 카사라스의CKIIα유전자의 게놈 염기서열을 조사하였다. 다시말하면, 후보 유전자의 특정 영역이 증폭될 수 있는 프라이머를 작성하고 카사라스의 게놈 DNA를 주형으로 하여 증폭한 단편을 얻었고, 클론화하여 염기서열을 분석하였다. 프라이머의 위치를 조금씩 변화하면서 분석하여CKIIα유전자 주위 전영역의 염기서열을 결정하였다. 양자를 비교하면, 다수의 염기 치환이나 결실 및 삽입이 확인되었지만, ORF에서의 차이는 하나의 염기 치환만 있었고, 이에 의해 카사라스에서는 라이신(lysine)을 암호화하는 부위가 니폰베어에서는 종결코돈으로 되어 있었다(도 4 내지 13, 서열번호 2). 카사라스에서는CKIIα유전자가 333 아미노산으로 이루어진 기능적인 단백질을 암호화한다고 추측되는 반면, 니폰베어에서는 상기 종결코돈의 존재에 의해 기능적인 산물의 번역을 할 수 없다고 사료된다.

<실시예 6. 후보 유전자CKIIα의 발현 패턴의 분석>

감광성 유전자Hd6을 가지지 않는다고 생각되는 니폰베어 및 카사라사의Hd6유전자를 가지는 니폰베어의 준동질 유전자 계통(isogenic lines)에서, 후보 유전자CKIIα의 발현의 차이를 RT-PCR법에 의해 분석하였다. 프라이머는 상술한 서열번호 7 및 8을 사용하여 94℃에서 2분, "94℃에서 30초, 62℃에서 40초, 72℃에서 1분"을 25주기, 72℃에서 7분의 조건에서 PCR을 수행하였다. 그 결과, 액틴 유전자 및Hd6과 다른 영역에 존재하는CKIIα유전자의 발현에 차이가 발견되지 않은 반해, 후보 유전자인CKIIα유전자의 발현량은Hd6의 준동질 유전자 계통과 비교하여 니폰베어에서 주목할 만큼 낮았다(도 14).

<실시예 7. 벼 품종의 감광성의 평가방법의 확립>

종래 그 존재가 유전자적으로 증명된 감광성 유전자 중에서,E3유전자는 제 3 염색체 상에 존재할 가능성이 제안되었다. 그리고, 니폰베어 및 카사라스의Hd6의 암호화 영역에 있는 염기서열의 차이를 간단히 식별하는 방법을 이용하여,E3및Hd6의 상호관계를 증명하였다. 니폰베어 및 카사라스의Hd6유전자 내에 존재하는 변이 염기 부위(서열번호 2의 2815번째의 염기 A의 T로의 치환)가 제한효소HindIII의 인식부위로 되어, 카사라스에서는 절단되고 니폰베어에서는 절단되지 않는 것을 발견하였다. 따라서, 이러한 변이 부위를 포함하는 543bp의 DNA 절편을 프라이머 "서열번호 20/5'-ACCTGGCAGCATGTTATGAC-3'(센스, 제 1 인트론)" 및 "서열번호 21/5'-CTACAGATCCACAGAACAGG-3'(안티센스, 제 3 인트론)"을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 단편을 제한효소HindIII로 처리한 때, 카사라스와 동일한 서열을 가지는 경우(종결 코돈 없이)에는 329bp 및 214bp의 2가지의 단편으로 절단되며, 이것 이외의 경우는 절단되지 않았다(도 15). 따라서, 감광성을 부여할 수 있는 유전자인지 여부의 확인에 이용될 수 있는 가능성을 시사하였다. 또, 이제까지 유전자 분석에 의해E3유전자를 가지는지 아닌지가 판명된 품종군(Okumoto et al., International Rice Research Institute, Rice Genetics II, 778-780, 1991)에 대해 유효성을 검증하였다. 그 결과,E3을 가지지 않는다고 판정되는 8품종에서는 증폭단편이 절단되지 않고 E3을 가진다고 판단되는 8품종에서는 절단되었다(표 1).

<표 1>

품종명	유전자형	CAPS 분석
킨메이즈	E3	+
코시히카리	e3		-
만료우	e3	_
니폰베어	e3		_
나카테신센본	E3	+
호우요쿠	E3	+
아케보노	E3	+
노린 6	e3		-
후지미노리	E3	+
후지사카 5	E3	+
키요니시키	e3		-
노린 1	e3	-
노린 8	e3		-
시라누이	E3	+
노린 22	e3		-
주이호	E3	+

유전자형 E3: 감광성 있음

유전자형 E3: 감광성 없음

CPAS 분석 +:HindIII 부위를 포함하며, 절단됨

CPAS 분석 -:HindIII 부위를 포함하지 않으며, 절단되지 않음

따라서,Hd6유전자가E3유전자에 대응할 가능성이 극히 높다고 생각되어, 금번에 개발한 정지 코돈의 유무를 식별하는 방법은 감광성 유전자Hd6또는E3의 감광성을 평가하는 효과적인 수단으로 사료된다.

<실시예 8.Hd6유전자를 발현하는 형질전환 식물의 생산 및 이의 도수일수>

Hd6의 후보 유전자로 생각되는 카사라스의CK2유전자를 포함하는 게놈 단편(NheI-Bg1II 8.9kb)을 이성분 벡터(binary vecter) pPZP2H-lac에 삽입한 플라스미드 pPZPCKII-10A를 니폰베어에아가로박테리움을 매개로 도입하였다. 이러한 형질전환 세대(TO)에서는 벡터만으로 형질전환된 개체 및 pPZPCKII-10A로 형질전환시킨 개체 사이에서 재분화 후의 식물체의 생육양이 일치하지 않기 때문에 뚜렷한 출수기의 차이는 관찰되지 않았다. 따라서, 형질전환 2개체의 자가 자손를 니폰베어,Hd6의 준동질 유전자 계통[NIL(Hd6)] 뿐 아니라 벡터만의 형질전환체 자가 자손과 함께 폐쇄계 온실(Tsukuba, Ibaraki)에서 5월 16일에 파종하고 이것의 도수일수를 조사하였다. 최초의 이삭이 난 개체의 수는 2일마다 관측하였다(표 2).

그 결과, 후보 유전자의 도입 개체 자손에서는 도수일수에 큰 분리가 일어나, 조생 개체 및 만생 개체의 출수기는 각각 니폰베어 및 NIL(Hd6)과 거의 일치하였다. 또, 벡터만의 도입 개체 자손에서 전부 개체의 출수기가 니폰베어와 동일하였다. 이상의 결과는 후보 유전자CK2가 자연광주기 조건하에서 출수기를 지연시키는Hd6유전자의 기능을 가진다는 것을 강하게 시사한다.

<표 2>

	도수일수(heading date)
	93	95	97	99	101	103	105	107	109	111	113	115	117
니폰베어	3	6	1
NIL(Hd6)							1	3	4
벡터만	3	6	2
pPZPCKII-10A형질전환체 1	1*		1*					8	3
pPZPCKII-10A형질전환체 2	1*							1	2	1	1		1

표 중의 유전자 도입 개체의 (^*)는 도입 유전자를 가지지 않는 개체를 나타낸다.

본 발명은 벼의 감광성 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 벼에 감광성을 주며 이에 의해 출수기를 조절하는 기능을 하기 때문에 벼의 품종 육성에 대단히 기여할 수 있다. 특히, 본 발명의 유전자를 이용하면 벼의 출수기를 변화시킬 수 있고 재배지역이나 재배시기에 적당한 벼 품종 육성에 유용하다. 또, 본 발명의 유전자를 이용한 벼의 품종 육성은 단기간에 높은 확실성을 가져다 주어 목적 식물체를 얻을 수 있다는 점에서 종래의 방법보다 유리하다.

또한, 본 발명은 식물의 감광성의 평가방법을 제공한다. 종래의 평가방법은 특정의 유전자의 존재를 조사하기 위해 검정 계통에 대상 품종을 교배하여 그 자손의 출수기의 분리에서 유전자의 유무를 추정한 것이며, 1 품종에 관한 결론을 얻기 위해 2 내지 3년이라는 커다란 노력을 요구하였다. 본 발명의 방법은 파종후 2주간 정도 경과한 볏모의 일부를 수확하여 DNA를 추출하고 이 DNA를 주형으로 하여 PCR 반응 및 제한효소 처리만으로 판정할 수 있다. 감광성 유전자를 가지는지 아닌지를 판정할 수 있다면 이 품종의 자손의 감광성의 정도를 교배 전에 추정할 수 있고 교배모체의 선정이나 선별을 위해 유용한 정보로 된다. 또, 선별 집단의 각 개체의 감광성 유전자의 유무를 상기 방법으로 용이하게 판정할 수 있기 때문에 상기 유전자는 선별 마커로서도 또한 이용될 수 있다.

Claims (29)

1. 식물의 감광성을 증가시키는 기능을 가지는 식물 유래의 단백질을 암호화하는, 상기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나의 DNA,

   (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 DNA,

   (b) 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 DNA,

   (c) 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 DNA와 긴축 상태(stringent condition) 하에서 혼성화하는 DNA.
2. 제 1항에 있어서, 상기 DNA는 벼 유래인 것을 특징으로 하는 DNA.
3. 제 1항 또는 제 2항의 DNA의 전사산물과 상보적인 안티센스 RNA를 암호화하는 DNA.
4. 제 1항 또는 제 2항의 DNA의 전사물을 특이적으로 개열하는리보짐(ribozyme)의 활성을 가지는 RNA를 암호화하는 DNA.
5. 식물세포에서 발현시에 공억제 효과(corepressing effect)에 의해 제 1항 또는 제 2항의 DNA의 발현을 억제시키는 RNA를 암호화하는 DNA.
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 식물의 감광성을 증가시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 DNA.
7. 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 식물의 감광성을 저하시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 DNA.
8. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 DNA를 포함하는 벡터.
9. 제 8항의 벡터로 형질전환시킨 식물세포.
10. 제 9항의 식물세포를 포함하는 형질전환 식물체.
11. 제 10항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 벼인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
12. 제 10항 또는 제 11항의 형질전환 식물체의 자손 또는 클론인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
13. 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 형질전환 식물체의 번식 재료.
14. 제 1항 또는 제 2항의 DNA를 식물세포에 도입하고 상기 식물세포로부터 식물체를 재생하는(regenerating) 공정을 포함하는, 제 10항 또는 제 11항의 형질전환 식물체의 제조방법.
15. 제 1항 또는 제 2항의 DNA를 식물체의 세포 내에서 발현시키는 것을 특징으로 하는 식물의 감광성을 증가시키는 방법.
16. 제 15항에 있어서, 식물의 감광성을 증가시키는 것에 의해 광주기에 의존하는 식물의 개화시기를 지연시키는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 식물체의 세포 내에서 내인성의 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항의 DNA의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 식물의 감광성을 저하시키는 방법.
18. 제 17항에 있어서, 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 DNA를 식물체의 세포 내에서 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 식물의 감광성을 저하시키는 것에 의해 광주기에 의존하는 식물의 개화시기를 촉진시키는 방법.
20. 제 15항 또는 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 벼인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 식물에서 제 1항의 DNA의 존재 유무를 검색하는 것을 특징으로 하는 식물의 감광성을 평가하는 방법.
22. 제 21항에 있어서, 상기 식물이 벼인 것을 특징으로 하는 방법,
23. 제 22항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열에서 제 2815 위치의 염기 A의 T로의 치환을 검색하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 23항에 있어서, (a) 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 DNA 또는 이의 상보가닥에 대한 프라이머 한쌍인, 서열번호 2의 염기서열의 제 2815 위치의 염기 A를 끼워넣기(sandwich) 위하여 설계한 프라이머 한쌍을 이용하여, 벼의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하는 공정,

    (b) 공정 (a)의 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭된 DNA 단편에 제한 효소HindIII을 작용시키는 공정, 및

    (c) 제한효소HindIII의 작용에 의해 상기 DNA 단편이 절단되는지 여부를 검색하는 공정을 포함하는 방법.
25. 제 1항 또는 제 2항의 DNA를 포함하는 벡터가 도입된 숙주세포.
26. 제 1항 또는 제 2항의 DNA에 의해 암호화되는 단백질.
27. (a) 제 25항의 숙주세포를 배양하고 (b) 상기 숙주세포 또는 이의 배양 상청으로부터 재조합 단백질을 회수하는 공정을 포함하는 제 26항의 단백질의 제조방법.
28. 제 26항의 단백질에 결합하는 항체.
29. 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 DNA 또는 이의 상보가닥에 상보적인적어도 15개 뉴클레오타이드를 포함하는 DNA.