KR20020049443A

KR20020049443A - 헬리코박터 파이로리균의 리보좀 단백질 ｌ1 유래의새로운 항생 펩타이드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20020049443A
Application number: KR1020000078615A
Authority: KR
Inventors: 함경수; 이동건; 최철희; 김희남; 김형근; 박윤경; 최보화
Original assignee: 함경수; 이동건
Priority date: 2000-12-19
Filing date: 2000-12-19
Publication date: 2002-06-26
Also published as: KR100459808B1

Abstract

본 발명은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 균이 생산하는 리보좀 단백질 L1(ribosomal protein L1, RPL1)의 아미노말단(amino-terminal) 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 항생 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중 양친화성(amphipathic)을 갖고 항생활성을 나타내는 펩타이드인 HP (2-20)의 친수성 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 소수성 영역을 증가시키는 양친화성 구조로 합성한서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항생 펩타이드 및 그의 유도체는 세포독성이 없고 탁월한 항균, 항진균 및 항암 활성을 나타내므로 인체에 안전한 항생제 및 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

헬리코박터 파이로리균의 리보좀 단백질 Ｌ1 유래의 새로운 항생 펩타이드 및 그의 용도{Novel antibiotic peptide derived from ribosomal protein L1 of Helicobacter pylori and use thereof}

본 발명은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)균이 생산하는 리보좀 단백질 L1(ribosomal protein L1, 이하 "RPL1"이라 약칭함)의 아미노말단 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 항생 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로,구체적으로 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중 양친화성을 갖고 항생활성을 나타내는 펩타이드인 HP (2-20)의 친수성 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 소수성 영역을 증가시키는 양친화성 구조로 합성한서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.

세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 세균의 항생제 저항성(resistance)이 야기되었다. 실제로, 세균이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빨리 일어난다. 예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다(Stuart B. Levy,Scientific American, 46-53, 1998).

항생제에 대한 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다(Tomasz et al.,Nature, 227, 138-140, 1970). 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신(autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 이러한 사실은 페니실린이 내인성 가수분해 효소(endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.

세균이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다(Handwerger and Tomasz,Rev. Infec. Dis., 7, 368-386, 1985). 아울러, 내성이 생기는 것은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행조건이라고 간주되는데 이것은 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다. 실제적으로 모든 저항성을 보이는 세균들은 내성도 가지고 있는 것으로 알려져 있으므로(Liu and Tomasz,J. Infect. Dis., 152, 365-372, 1985), 이러한 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생제의 개발이 필요하다.

작용기작의 측면에서 내성은 크게 두가지 경로로 이루어지는데, 첫 번째는 모든 세균에 있어서 성장속도가 감소할 때 일어나는 외형적(phenotypic) 내성이며(Tuomanen E.,Revs. Infect. Dis., 3, S279-S291, 1986), 두 번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두가지 경우 모두에 있어서 기본적인 현상은 오토라이신 활성의 하부조절(down regulation)이 일어난다는 것인데, 이러한 하부조절은 외부자극에 대한 외형적인 내성일 경우에는 일시적이며, 세포 용혈을 조절하는 경로의 변화를 야기하는 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 명백하게, 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소에 결손이 일어나는 것인데 확실하지 않은 여러 가지 이유로 인해서 이러한 자살 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 임상적으로 발견된 적은 없으며, 오히려 임상적인 내성은 오토라이신의 활성을 조절함으로써 이루어진다(Tuomanen et al.,J. infect. Dis., 158, 36-43, 1988).

상기에서 살펴본 바와 같이, 항생제에 저항성을 나타내는 세균들과 싸우기 위하여 새로운 항생제의 개발이 필요하며, 아울러 오토라이신 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다. 또한, 그러한 새로운 항생제를 세균의 감염과 염증치료에 효과적으로 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이 필요하다.

한편, 세균은 펩타이드나 작은 유기물 분자들을 합성해서 이웃하는 세균을 죽일 수 있는데, 이러한 박테리오신(bacteriocin)들은 구조적으로 세부류로 분류된다. 첫 번째는 란티바이오틱스(lantibiotics)이며 두 번째는 비란티바이오틱스(nonlantibiotics)이고 세 번째는 신호 펩타이드(signal peptide)에 의해 분비되는 것들이다(Cintas et al.,J. Bad., 180, 1988-1994, 1998). 곤충을 포함하는 동물들 역시 자연적으로 생성되는 펩타이드 항생제를 생산하는데(Bevins et al.,Ann. Rev. Biochem., 59, 395-414, 1990), 상기의 항생제는 구조적으로 세 개의 그룹으로 나누어진다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한(cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-회전형(helical)의 양친화성 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한(proline-rich) 펩타이드이다(Mayasaki et al.,Int. J. Antimicrob. Agents, 9, 269-280, 1998). 이들 항균 펩타이드들은 숙주방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다(Boman, H. G.,Cell, 65:205, 1991; Boman, H. G.,Annu. Rev. Microbiol., 13:61, 1995). 이러한 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 많은 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 세크로핀(cecropin)과 같이 시스테인(cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파 나선형을 형성하는 구조이다.

지난 세기 동안 소화성 궤양은 스트레스와 위산 과다생성에 의한다는 생각이 우세하였으나, 최근에 이러한 소화성 궤양이 헬리코박터 파일로리균에 의한 것이라고 밝혀지면서(Blaser, MJ.,Trends Microbiol., 1, 255-260, 1991) 이에 대한 관심이 집중되고 있다. 헬리코박터 파일로리균은 그람 음성균에 속하고 성장속도가 매우 느린 나선모양과 편모를 가지는 혐기성 미생물이다. 헬리코박터 파일로리균이 생산하는 많은 단백질 중 RPL1이라는 단백질은 230개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 상기 단백질의 아미노말단 부위는 세크로핀과 그 구조가 유사하다는 것이 밝혀져 있는데 특히 8개의 아미노산이 동일한 것으로 알려져 있다. 헬리코박터 파일로리의 RPL1 아미노말단부위는 완벽한 양친화성 나선모양 구조를가지는데(Putsep, K. et al.,Nature, 398, 671-672, 1999), 이러한 양친화성 펩타이드는 세포막의 지질 성분과 유사한 구조를 지니므로 미생물의 세포막 지질과 결합함으로써 미생물의 세포막을 파괴하거나, 세포막의 전위에 영향을 주어 이를 변화시킴으로써 미생물을 파괴한다는 작용 기작이 보고되어 있다. 이외에도 헬리코박터 파일러리균의 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 역시 항균활성을 가진다는 보고가 있다(Putsep K. et al.,Nature, 398, 671-672, 1999).

이에 본 발명자들은 양친화성을 갖는 헬리코박터 파일로리균의 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중 특정 부위 서열과 상기 서열 중 일부를 다른 아미노산으로 치환시킴으로써 소수성 부위를 증가시키는 양친화성 구조로 펩타이드 유도체를 설계하고 합성하였으며, 이와 같이 합성된 펩타이드 유도체의 항균, 항진균, 항암활성 및 세포 독성(용혈활성)을 확인하여 상기 펩타이드 유도체가 항생제 및 항암제로 이용될 수 있는 항생 펩타이드임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항생제 및 항암제로 이용할 수 있는 세포독성이 없고 우수한 항균, 항진균 및 항암활성을 나타내는 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 리보좀 단백질 L1(ribosomal protein L1)의 아미노말단 HP (2-20) 펩타이드 유래의 유사체 펩타이드를 설계한 도해(diagram)를 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의 항생 펩타이드를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균체에 처리한 다음 LB 아가(agar) 배지에 도말하여 생균수를 확인한 사진이고,

A : 대조군(no treatment)

B : HP (2-20)

C :서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드

도 3은 본 발명의 항생 펩타이드를 대장균(Escherichia coli) 균체에 처리한 다음 LB 아가 배지에 도말하여 생균수를 확인한 사진이고,

A : 대조군(no treatment)

B : HP (2-20)

C :서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드

도 4는 본 발명의 항생 펩타이드를 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 균체에 처리한 다음 PDB 아가 배지에 도말하여 생균수를 확인한 사진이고,

A : HP (2-20)

B : 멜리틴(Melittin)

C :서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드

도 5는 본 발명의 항생 펩타이드의 세포에 대한 항암활성을 나타낸 그래프이다.

A : AML-2/WT에 대한 항암활성

B : SNU 638에 대한 항암활성

C : SNU 668에 대한 항암활성

●: HP(2-20)

○:서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드

▼: 멜리틴

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 균이 생산하는 RPL1 단백질의 아미노말단(amino-terminal) 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 항균, 항진균 및 항암용으로 사용하는 용도를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기의 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 하는 항균, 항진균 및 항암용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 헬리코박터 파일로리균이 생산하는 RPL1 단백질의 아미노말단 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 항생 펩타이드 및 그의 유도체를 제공한다.

본 발명은 헬리코박터 파일로리 유래 RPL1 단백질의 아미노 말단 부위 중 양친화성을 갖고 항생 활성을 나타내는 펩타이드인 HP(2-20)의 친수성 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 소수성 영역을 증가시킴으로써 양친화성 구조를 갖는 항생 펩타이드를 합성하였다.

상기 항생 펩타이드를 합성하기 위하여, 본 발명자들은 Fmoc 아미노기 보호 용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하였으며(Merrifield, RB.,J. Am. Chem. Soc., 85, 2149, 1963)서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 각각 트립토판으로 치환한서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드를 제조하였다(도 1참조). 이와 같이 제조된 항생 펩타이드를 분리·정제하고 그 순도를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 항생 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

서열번호 2로 기재되는 아미노산으로 구성된 본 발명의 항생 펩타이드는서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 트립토판 이외의 다른 소수성 아미노산으로 치환할 수 있으며, 바람직하게는 알라닌, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 루이신으로 치환할 수 있다.

또한, 본 발명의 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드의 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시켜 소수성 부위가 증가되는 양친화성 구조로 합성할 수 있으며, 바람직하게는 8번째 아미노산인 아르기닌과 10번째 아미노산인 글루탐산 및 20번째 아미노산인 리신을 상기에 기술한 소수성의 다른 아미노산으로 치환시켜 합성할 수 있다.

우선, 본 발명의 항생 펩타이드가 상기 용도로 사용될 수 있는지 확인하기위하여 본 발명자들은 본 발명에서 합성한 항생 펩타이드의 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도(minimal inhibitory concentration, 이하 "MIC"라 약칭함)를 측정하여 관찰하였다.

그람 양성균으로써 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를, 그람 음성균으로써 대장균(Escherichia coli)과 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)를 사용하였으며,서열번호 2로 기재되는 본 발명의 항생 펩타이드와 양성 대조군으로 멜리틴(Melittin)을 사용하여 각 균주의 MIC 값을 측정한 결과, 본 발명의 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 균주에 따라 10배 이상의 높은 항균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴과 비슷한 항균활성을 나타냄을 확인하였다(표 1참조).

또한, 대장균과B. 서브틸리스를 대상으로 본 발명의 항생 펩타이드의 항균활성을 LB 아가 배지에서 확인한 결과, 본 발명의 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 탁월한 항균 활성을 나타냄을 확인하였다(도 2및도 3참조).

본 발명의 항생 펩타이드의 항진균 활성을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이(Trichosporon beigelii) 및 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 대상으로 각 균주의 MIC 값을 MTT 분석법으로 측정한 결과, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 4배 이상의높은 항진균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴과 비슷한 항진균 활성을 나타내었다(표 2참조).

또한, 상기 균주를 대상으로 본 발명의 항생 펩타이드의 항진균 활성을 PDB 아가 플레이트에서 확인한 결과, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 탁월한 항진균 활성을 나타냄을 확인하였다(도 4참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 항생 펩타이드가 암세포에 대한 항암 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, 백혈병 세포주인 AML-2/WT와 위암 세포주인 SNU 638 및 SNU 668을 대상으로 항암 활성을 측정한 결과, HP (2-20)은 항암 활성이 나타나지 않았으나서열번호 2로 기재되는 본 발명의 항생 펩타이드와 양성 대조군으로 사용한 멜리틴의 경우에는 강한 항암활성을 나타내었다(도 5참조).

아울러, 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사한 결과, HP (2-20)과 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면에 양성 대조군으로 사용한 벌독인 멜리틴은 세포 독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있었다(표 3참조).

상기의 결과로부터, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 탁월한 항균, 항진균 및 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라 세포독성이 없기 때문에 인체에 안전한 항균, 항진균 및 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

상기서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 상기서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

상기서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체의 유효용량은 0.1 내지 2 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.5 내지 1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분활 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그의 유도체의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 펩타이드의 합성 및 분리정제

본 발명자들은 소수성 영역이 증가되어 양친화성 구조를 갖는 항생 펩타이드를 합성하기 위하여, 헬리코박터 파일로리 유래 RPL1 단백질의 아미노말단 부위 중서열번호 1로 기재되는 HP(2-20) 펩타이드의 친수성 부위를 소수성 아미노산으로 치환시켰다. 구체적으로,서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 각각 트립토판으로 치환한서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드를 제조하였다. 펩타이드 합성 방법은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노기 보호 용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하였다(Merrifield, RB.,J. Am. Chem. Soc., 85, 2149, 1963)(도 1).

구체적으로, 본 발명에서 설계한 펩타이드의 카르복실말단이 -NH₂형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬(chain)의 연장은 DCC(N-hydroxybenzo triazole (HOBt)-dicyclo-hexycarbodiimide)법에 의해 실시하였다. 각 펩타이드의 아미노말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% NMP(piperidine /N-methyl pyrolidone) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 DCM(dichoromethane)으로 여러번 세척한 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 TFA(trifluoroaceticacid)-phenol-thioanisole-H₂O-triisopropylsilane(85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 2 내지 3시간 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 후, 디에틸 에테르(diethylether)로 펩타이드를 침전시켰다. 상기의 방법으로 얻은 크루드(crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배(acetonitrle gradient)에서 정제형 역상(reverse phase, RP)-HPLC 칼럼(Delta Pak, C₁₈300Å, 15, 19.0mm ×30 cm, Waters)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6 N HCl을 이용하여 110℃에서 가수분해한 후 잔사를 감압농축하고 0.02 N HCl에 녹여서 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다.

상기의 방법으로 조성된 펩타이드의 순도를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI 질량 분석법(Hill, et al .,Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5, 395, 1991)을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 항생 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

<실시예 2> 항생 펩타이드의 항균활성 측정

<2-1> 생육 최소저해농도 측정

상기 실시예 1에서 제조된 항생 펩타이드의 항균 활성을 측정하기 위하여, 먼저 본 발명자들은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 MIC 값을 측정하였다.

본 발명자들은 항균 활성 측정을 위하여 그람 양성균으로써 바실러스 서브틸리스(KCTC 1918)와 스태필로코쿠스 아우레우스(KCTC 1621)를, 그람 음성균으로써 대장균(KCTC 1682)과 프로테우스 불가리스(KCTC 2433)를 생명공학연구소 유전자은행으로부터 분양받아 사용하였으며, 각 균주를 LB 배지(1% 박토 트립톤, 0.5% 박토 이스트 추출물, 1% 염화나트륨)에서 중간-로그 상(mid-log phase)까지 배양한 다음 1% 박토 펩톤 배지로 1×10⁴세포/100 ㎕의 균체 농도로 희석하여 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종하였다. 실시예 1에서 합성한 항생 펩타이드와 양성 대조군으로 사용한 멜리틴(Melittin)을 각각 25 μM/웰(well) 부터 1/2배씩 희석하여 플레이트에 첨가한 후 37℃에서 6시간 동안 배양하였고, 마이크로 타이트레이트 플레이트 판독기를 이용하여 620 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주의 MIC 값을 결정하였으며, 그 결과를 하기표 1에 나타내었다.

그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 항생 펩타이드의 항균 활성 측정

펩타이드	생육 최소저해농도 (μM)
	그람 양성균	그람 음성균
	B. 서브틸리스	S. 아우레우스	대장균	P. 불가리스
HP (2-20)	3.12	12.5	12.5	6.25
서열번호 2의 항생 펩타이드	0.39	0.78	1.56	0.39
멜리틴	0.19	0.78	1.56	1.56

그 결과, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 균주에 따라 10배 이상의 높은 항균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴과는 비슷한 항균활성을 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명의 항생 펩타이드는 그람 양성 및 그람 음성균 모두에서 우수한 항균 활성을 나타내었고, 특히P. 불가리스에서는 HP (2-20) 펩타이드와 멜리틴보다 항균 활성 효과가 탁월하였다.

<2-2> 항균 활성의 가시화

또한, 본 발명의 항생 펩타이드의 항균활성을 배지상에서 가시화하기 위하여, 대장균과B. 서브틸리스를 LB 배지(1% 박토 트립톤, 0.5% 이스트 추출물, 1% 염화나트륨)에 접종하여 미드-로그 상까지 배양하였다. 4×10⁵세포의 대장균과B. 서브틸리스에 각각 4 μM과 1 μM 농도의 항생 펩타이드를 섞은 후, 37℃에서 2시간 동안 배양하고 배양액을 LB 플레이트에 도말하여 균주를 가시화시켰다.

그 결과, 그람 양성균인B. 서브틸리스균에 아무것도 처리하지 않은 양성대조군에서는 많은 수의 콜로니(colony)를 발견할 수 있었고(도 2의 A) HP (2-20)을 첨가한 경우에도 균이 조금 자랐으나(도 2의 B) 본 발명의 항생 펩타이드를 첨가한 경우에는 균의 성장이 완전히 억제되어 콜로니가 보이지 않음을 확인하였다(도 2의 C). 또한, 그람 음성균인 대장균에 아무것도 처리하지 않은 양성대조군에서는 많은 수의 콜로니(colony)를 발견할 수 있었고(도 3의 A) HP (2-20)을 첨가한 경우에도 균이 자랐으나(도 3의 B), 본 발명의 항생 펩타이드를 첨가한 경우에는 균의 성장이 완전히 억제되어 콜로니가 보이지 않음을 확인하였다(도 3의 C).

상기의 결과로부터, 본 발명의 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 탁월한 항균 활성을 나타냄을 확인하였다.

<실시예 3> 항생 펩타이드의 항진균 활성 측정

<3-1> MTT 분석

본 발명의 항생 펩타이드의 항진균 활성을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(TIMM 1768), 트리코스포론 베이겔라이(KCTC 7707) 및 사카로마이세스 세르비지애(KCTC 7296)를 대상으로 MTT 분석을 수행하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트에 각종 진균을 포함한 PDB 배지(20% 포테이토 인퓨전 프럼, 2% 박토 덱스트로즈) 100 ㎕씩을 분주하고 본 발명의 항생 펩타이드를 각각 50 μM/웰(well)부터 1/2배씩 희석하여 플레이트에 첨가하여 다시 배양한 후, 5 ㎎/㎖ 농도의 MTT 용액(3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 10 ㎕를 모든 웰에 첨가하여 다시 5-6시간 배양하였다. 그 후, 살아 있는 세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 포르마잔(formazan)을 0.04 N HCl-이소프로판올(isopropanol) 용액 100 ㎕로 잘 용해시킨 후 ELISA 판독기(reader)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 발색되는 정도로 MIC 값을 측정하였고, 그 결과를 하기표 2에 나타내었다.

항생 펩타이드의 항진균 활성 측정

펩타이드	생육 최소저해농도 (μM)
펩타이드	C. 알비칸스	S. 세르비지애	T. 베이겔라이
HP (2-20)	25.0	25.0	12.5∼25.0
서열번호 2의 항생 펩타이드	6.25	3.12∼6.25	3.12
멜리틴	3.12	3.12	3.12∼6.25

그 결과, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드의 항진균 활성을 HP (2-20) 펩타이드와 비교하였을 때C. 알비칸스의 경우에는 HP (2-20) 펩타이드보다 4배 정도의 높은 항진균 활성을 보였고S. 세르비지애와T. 베이겔라이의 경우에는 4 내지 8배 정도의 높은 항진균 활성을 나타내었으며, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴과 비슷한 정도의 항진균 활성을 나타냄을 확인하였다.

<3-2> 항진균 활성의 가시화

또한, 본 발명의 항생 펩타이드의 항진균 활성을 가시화하기 위하여,C. 알비칸스 균주를 PDB 배지에서 배양하여 얻은 2×10³세포와 20 μM의 항생 펩타이드를 섞은 후 28℃에서 3시간 동안 배양한 다음, 배양액을 PDB 아가 플레이트에 도말하여 균주를 가시화시켰다.

그 결과,C. 알비칸스 균주에 HP (2-20)을 첨가한 플레이트에서는 많은 수의 콜로니를 발견할 수 있었으나(도 4의 A) 양성 대조군인 멜리틴과 본 발명의 항생펩타이드를 첨가한 경우에는 균의 성장이 완전히 억제되어 콜로니가 보이지 않음을 확인하였다(도 4의 B 및도 4의 C).

상기의 결과로부터, 본 발명의 항생 펩타이드는 HP (2-20) 펩타이드에 비해 탁월한 항진균 활성을 나타내며 양성 대조군으로 사용한 멜리틴과 비슷한 항진균 활성을 나타냄을 확인하였다.

<실시예 4> 항생 펩타이드의 항암 활성 측정

본 발명의 항생 펩타이드의 항암 활성을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 백혈병 세포주인 AML-2/WT와 위암 세포주인 SNU 638 및 SNU 668를 대상으로 MTT 분석을 수행하였다. 우선 2×10⁵세포/㎖ 농도의 AML-2/WT 세포주와 5×10⁴세포/㎖ 농도의 SNU 638 및 SNU 668 세포주 90 ㎕씩을 96-웰 플레이트에 분주하였다. 이때 음성 대조군으로는 배양액만을 넣은 것을 사용하였다. 플레이트를 잘 흔든 후 3일간 CO₂배양기에서 배양하고 살아 있는 세포의 미토콘드리아 효소에 의해 생성된 포르마잔을 0.04 N HCl-이소프로판올 용액 100 ㎕로 잘 녹여서 ELISA 판독기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항생 펩타이드를 처리한 웰의 흡광도 값을 항생 펩타이드를 처리하지 않는 대조군 세포가 들어 있는 흡광도 값으로 나눈 백분율로 본 발명의 항생 펩타이드의 항암 활성도를 나타내었다.

그 결과,도 5에서 볼 수 있는 바와 같이 HP (2-20)은 실험한 모든 세포주에 대해서 항암 활성이 나타나지 않았다. 본 발명의 항생 펩타이드는 1 μM 농도까지는 항암 활성을 나타내지 않았으나 농도가 증가할수록 급격한 항암 활성을 나타내어 10 μM 이상의 농도에서는 암세포의 성장을 완전히 억제하였고, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴과 비슷한 정도의 강한 항암활성을 나타냄을 확인하였다.

<실시예 5> 항생 펩타이드의 세포 독성 측정

본 발명의 항생 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 항생 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사하였다.

사람의 적혈구를 8%의 농도가 되도록 인산염 완충용액(PBS, pH 7.0)으로 희석하고 여기에 12.5 μM/웰 부터 1/2의 농도로 항생 펩타이드를 연속적으로 희석하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1,000 g로 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈 양을 414 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 조사하였다. 세포 파괴 정도를 조사하기 위하여 1% 트리톤-X100을 첨가하여 흡광도를 측정하였고, 1% 트리톤 X-100의 세포 파괴능을 100%로 하여 이를 각 항생 펩타이드의 적혈구 파괴능과 비교하여 하기수학식 1에 따라 계산하였다.

상기 식에서, 흡광도 A는 414 nm 파장에서 펩타이드 용액의 흡광도, 흡광도 B는 414 nm 파장에서 PBS의 흡광도 및 흡광도 C는 414 nm 파장에서 1% 트리톤 X-100의 흡광도를 나타낸다.

상기 식에 의한 적혈구 파괴능의 결과를 하기표 3에 나타내었다.

항생 펩타이드의 세포 독성 측정

펩타이드	% 적혈구 파괴능 (μM)
펩타이드	12.5	6.25	3.125	1.56	0.78	0.39	0.195	0.097
HP (2-20)	0	0	0	0	0	0	0	0
서열번호 2의 항생 펩타이드	0	0	0	0	0	0	0	0
멜리틴	100	100	95	93	31	0	0	0

그 결과, 본 발명의 HP (2-20)과서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면에 양성 대조군으로 사용한 벌독인 멜리틴은 세포 독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있었다.

<실시예 6> 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드를 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/㎏/15 ㎖의 용량으로 단회 비경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 본 발명의 항생 펩타이드는 랫트에서 5 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 비경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 10 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

상기의 결과로부터, 본 발명의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드는 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 탁월한 항균작용을 나타내었고 진균에 대해서도 높은 항진균 활성을 나타내었으며 암세포에 대한 항암 작용이 우수하고 또한 세포독성을 나타내지 않으므로, 인체에 안전한 항생제 및 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

항균, 항진균 및 항암 활성을 가지는서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그 유도체.
제 1항에 있어서, 항생 펩타이드 및 그 유도체는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)균 유래 리보좀 단백질 L1(ribosomal protein L1, RPL1)의 아미노말단 부위를 다른 아미노산으로 치환시켜 합성한 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드 및 그 유도체.
제 2항에 있어서, RPL1 단백질의 아미노말단 부위는 양친화성을 갖고 항생 활성을 나타내는서열번호 1로 기재되는 펩타이드 HP (2-20)인 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드 및 그 유도체.
제 3항에 있어서,서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 17번째 아미노산인 글루타민과 19번째 아미노산인 아스파라긴산을 트립토판 이외의 다른 소수성 아미노산으로 치환시켜 합성하는 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드 및 그 유도체.
제 4항에 있어서, 소수성 아미노산은 알라닌, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 루이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드 및 그 유도체.
제 3항에 있어서,서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시켜 소수성 부위가 증가되는 양친화성 구조를 가지도록 합성하는 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드 및 그 유도체.
제 6항에 있어서,서열번호 1로 기재되는 HP (2-20) 펩타이드의 8번째 아미노산인 아르기닌과 10번째 아미노산인 글루탐산 또는 20번째 아미노산인 리신 중 하나 혹은 그 이상을 트립토판, 알라닌, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 발린 및 루이신으로 구성된 아미노산으로 치환시켜 합성한 것을 특징으로 하는 항생 펩타이드 및 그 유도체.
제 1항의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균 및 항진균용 약학적 조성물.
제 1항의서열번호 2로 기재되는 항생 펩타이드 및 그 유도체를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물.