KR20020037200A - 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents

그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 그레이브스 질환(Graves' disease)에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 그레이브스 질환에 특이적인 갑상선 자극 단일클론 자가면역항체에 특이적으로 결합하여 각 항체의 기능을 억제하는,서열번호 1과서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 그레이브스 질환의 진단 및 치료제로 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 각각 그레이브스 질환 특이적인 갑상선 자극 단일클론 자가면역항체에 특이적으로 결합하여 이들 자가면역항체에 의해 야기되는 갑상선 자극 호르몬 수용체를 가진 세포의 생화학적인 변화를 억제하므로 그레이브스 질환의 진단과 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 용도{Peptides of agonizing effect for Graves' disease and use thereof}
본 발명은 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 그레이브스 질환에 특이적인 갑상선 자극 단일클론 자가면역항체에 특이적으로 결합하여 각 항체의 기능을 억제하는,서열번호 1과서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 그레이브스 질환의 진단 및 치료제로 사용하는 용도에 관한 것이다.
갑상선 항진증의 주된 요인인 그레이브스 질환은 면역체계에 근본적으로 결함이 있다는 것을 나타내는 질환으로서, 갑상선을 자극하고 공격하는 항체를 생산하고 갑상선을 증식시켜 갑상선 호르몬을 과량으로 생산하게 한다.
그레이브스 질환은 일반적으로 전체 인구의 1% 이하의 적은 인구에서 나타나며, 남자보다는 여자에게서 8배 정도 높은 질병발생율을 보인다. 대부분의 그레이브스 질환은 중년의 나이에 발생하지만 어린이나 청소년기에 나타나기도 하며, 피로, 체중감소, 빈맥(tachycardia), 성적 충동(libido)의 변화, 근육의 약화, 열에 대한 과민반응(heat intolerance), 진전(tremor), 갑상선의 크기 증가,심계항진(heart palpitation), 다한증 등의 증상을 동반한다.
그레이브스 질환의 원인으로는 몇 가지가 알려져 있는데, 자가면역질환의 유전적인 경향이 있을 때 또는 감염이나 스트레스 및 임신 이후에 발생하는 경우도 있다. 그러나, 많은 경우에는 정확한 발생원인을 알 수 없으며, 남편과 아내에게서 동시에 발생하는 경우도 있지만 전염병은 아닌 것으로 알려져있다. 또한, 그레이브스 질환을 일으키는 유전자 역시 아직까지 발견되지 않았다.
정상적인 인간의 갑상선 호르몬은 갑상선 자극 호르몬에 의하여 그 생성이 조절되는데, 이는 시상하부에서 분비된 갑상선 자극 호르몬이 갑상선 조직 세포에서 세포막의 갑상선 자극 호르몬 수용체와 결합하면 G 단백질(G protein)과 아데닐레이트 사이클라제 (adenylate cyclase)를 경유하는 일련의 신호전달과정을 거쳐 갑상선 호르몬을 합성하며, 이와같이 합성된 갑상선 호르몬이 그 목적기관에 작용하고 그 정도가 정상치를 넘어서게 되면 시상하부에서의 갑상선 자극 호르몬의 발현을 억제하여 결국 갑상선 호르몬의 합성을 억제하게 된다. 하지만, 그레이브스 질환은 이러한 조절없이 계속적으로 갑상선 호르몬을 합성하여 지속적인 갑상선 기능의 항진이 일어나는 질환으로, 이는 그레이브스 질환의 환자가 갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 자가면역항체를 가지고 있어서 갑상선 자극 호르몬의 작용없이도 일련의 신호전달과정을 거쳐 계속적으로 갑상선 호르몬을 합성하게 되는데서 기인한다.
그레이브스 질환을 완전히 치유하는(curable) 것은 불가능하지만, 완전하게 치료할(treatable) 수는 있다. 일반적으로 그레이브스 질환의 치료를 위하여 비선별적인 갑상선 기능 저하제를 사용하거나 방사성 동위원소인 I-131 또는 외과적인 수술로서 갑상선 조직을 제거하는 등의 방법이 사용되고 있으나, 비선별적 갑상선 기능 저하제를 사용할 경우에는 재발의 우려가 높으며 갑상선 조직을 제거할 경우에는 지속적으로 갑상선 호르몬을 투여해야 하고 비정상적인 신체 항상성을 나타내게 되는 문제점이 있다.
또한, 그레이브스 질환 환자의 갑상선 자극 자가면역항체는 환자 내에서 다양한 클론들이 존재하기 때문에 그레이브스 질환의 병리기작 등을 이해하고 그 진단 및 치료에 필수적인 이러한 자가면역항체들의 항원결정기를 결정하는 데에는 많은 어려움이 있었다.
이에 본 발명자들은 상기한 기존의 그레이브스 질환의 진단 및 치료방법이 안고 있던 문제점을 극복하기 위하여, 그레이브스 질환 환자의 갑상선 자극 자가면역항체의 단일클론인 B6B7과 101-2 (Akamizu T.,J Immunol.157,3148,1996)에 결합하는 펩타이드를 파지(phage)발현 펩타이드 혼합물로부터 분리하였고, 상기 펩타이드가 그레이브스 질환 환자에서 갑상선 자극 호르몬에 의한 갑상선 호르몬의 생성에는 영향을 미치지 않으면서 갑상선 자극 자가면역항체의 단일클론이 갑상선 자극 호르몬 수용체에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하여 결국 자가면역항체에 의한 갑상선 호르몬 합성을 억제한다는 사실을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 그레이브스 질환을 효과적으로 진단 및 치료하기 위하여, 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 그레이브스 질환의 진단 및 치료에 사용하는 용도를 제공하는 것이다.
도 1은 파지발현 펩타이드 혼합물에서 그레이브스 질환 환자의 단일클론 자가면역항체 B6B7과 결합하는 펩타이드를 검색한 결과이고,
도 2는 파지발현 펩타이드 혼합물에서 그레이브스 질환 환자의 단일클론 자가면역항체 101-2와 결합하는 펩타이드를 검색한 결과이고,
도 3은 파지발현 펩타이드 혼합물로부터 검색되어 각각의 단일클론 자가면역항체와 결합하는 것으로 밝혀진 펩타이드의 서열을 나타낸 것이고,
도 4는 갑상선 자극 호르몬 수용체를 발현하는 CHO 세포에서 본 발명의 펩타이드가 그레이브스 질환 환자의 단일클론 자가면역항체 B6B7에 의한 cAMP의 합성을 억제시키는 결과를 나타내는 그래프이고,
● ;서열번호 1로 기재되는 펩타이드
■ ;서열번호 4로 기재되는 펩타이드
도 5는 갑상선 자극 호르몬 수용체가 발현되는 CHO 세포에서 본 발명의 펩타이드가 그레이브스 질환 환자의 단일클론 자가면역항체 101-2에 의한 cAMP의 합성을 억제시키는 결과를 나타내는 그래프이다.
● ;서열번호 1로 기재되는 펩타이드
■ ;서열번호 4로 기재되는 펩타이드
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 그레이브스 질환 특이적인 갑상선 자극 단일클론 자가면역항체에 결합하여 각 항체의 기능을 억제함으로써 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 유도체를 제공한다.
또한, 본 발명은 그레이브스 질환을 진단하기 위하여 상기 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 유도체를 이용하여 그레이브스 질환의 항체를 측정하는 방법 및 그레이브스 질환용 진단 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기의 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 이용하는 그레이브스 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 그레이브스 질환 특이적인 갑상선 자극 단일클론 자가면역항체에 결합하여 각 항체의 기능을 억제함으로써 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 유도체를 제공한다.
본 발명자들은 먼저 바이오패닝(biopanning)을 이용해서 그레이브스 질환 환자의 자가면역항체 단일 클론인 B6B7과 101-2에 결합하는 펩타이드를 파지발현 펩타이드 혼합물에서 검색하였다. 이로부터 검색된 파지클론 중 그레이브스 질환 환자의 자가면역항체 단일클론에 실제로 결합하는 파지 클론을 선별하기 위하여 ELISA를 수행하였다.
그 결과, 자가면역항체 B6B7과 101-2에 결합하여 흡광도를 나타내는 각각 총 72개씩의 파지클론을 확인하였다. 이로부터 자가면역항체 B6B7과 101-2 각각에 높은 결합력을 가지는 15개와 30개의 파지클론을 선별하였고 이들 파지 DNA의 염기서열을 확인하여 해당 클론들이 발현하는 펩타이드 서열을 결정하였다. 그 결과, 자가면역항체 B6B7에 대한 파지클론은 3종의 펩타이드 서열로 구분되는데, 15개 파지클론 중 8개 클론이서열번호 1로 기재되는 SPWTLGA 펩타이드 서열을 가지고 있었고 5개 클론이서열번호 2로 기재되는 SPWSIGA 펩타이드 서열을, 나머지 2개 클론이서열번호 3으로 기재되는 GPLQLGM 펩타이드 서열을 가지고 있었다. 또한, 자가면역항체 101-2는 4종의 펩타이드 서열로 구분되는데 30개 파지클론 중 26개 클론이서열번호 4로 기재되는 TQWNMQH 펩타이드 서열을 가지고 있었고 2개 클론이서열번호 5로 기재되는 SQFNHSY 펩타이드 서열을, 나머지 2개 클론이 각각서열번호 6과서열번호 7로 기재되는 PSPRSQT 및 SPLSLGR 펩타이드 서열을 가지고 있었다.
이로부터 본 발명자들은 각각의 자가면역항체 B6B7과 101-2에 가장 높은 빈도와 결합력을 보인서열번호 1및서열번호 4의 펩타이드를 갑상선 자극 단일클론자가면역 항체에 결합하여 항체의 기능을 억제하는 길항 펩타이드로서 선별하였다.
상기 과정에서 선별된 펩타이드가 실제로 자가면역항체의 활성을 억제하는 길항작용을 나타내는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 상기 두 펩타이드를 자가면역항체 B6B7과 101-2에 첨가한 후 합성되는 cAMP의 양을 측정하였다. 이를 위하여서열번호 1및서열번호 4로 기재되는 펩타이드를 합성한 후, 갑상선 자극 호르몬 수용체를 발현하는 세포에서 각각의 펩타이드가 cAMP의 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 그레이브스 질환 자가면역항체 B6B7의 경우에는서열번호 1의 펩타이드가 0.1 μM 농도에서 B6B7에 의한 cAMP 합성을 50% 이상 감소시키고 10 μM 농도에서는 cAMP 합성을 완전히 억제하였으나서열번호 4의 펩타이드는 거의 억제 활성을 나타내지 않았다. 자가면역항체 101-2의 경우에는서열번호 4의 펩타이드가 0.1 μM 농도에서 101-2에 의한 cAMP 합성을 50% 이상 감소시키고 10 μM 농도에서는 cAMP 합성을 완전히 억제하였으나서열번호 1의 펩타이드는 거의 억제 활성을 나타내지 않았다.
이러한 결과를 통하여, B6B7과 101-2의 그레이브스 질환의 두 자가면역항체에 대해 선별된서열번호 1및서열번호 4의 펩타이드가 서로 다른 항원 결정기를 가지고 있어서 각각의 자가면역항체에 특이적으로 결합하여 이들의 활성을 억제하는 반면 갑상선 자극 호르몬에 의한 cAMP 합성에는 큰 영향을 미치지 않음을 나타내며, 이들이 그레이브스 질환 환자에서 갑상선 자극 호르몬 수용체와 자가면역항체와의 결합을 경쟁적으로 저해해서 길항작용을 하는 억제 펩타이드임을 확인하였다.
또한, 본 발명은 그레이브스 질환을 진단하기 위하여 상기 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 유도체를 이용하여 그레이브스 질환의 항체를 측정하는 방법을 제공한다.
상기 그레이브스 질환의 항체 측정방법은 그레이브스 질환 환자로부터 시료를 채취하는 단계(단계 1) 및 상기 시료를 대상으로 본 발명의 펩타이드에 대한 항체를 검출하는 단계(단계 2)로 이루어진다.
단계 1의 시료 채취 단계는 바람직하게는 일반적인 혈청 분리방법을 통해 이루어질 수 있다.
상기 그레이브스 질환의 항체 측정방법의 단계 2에서 이용되는 구체적인 항체 검출방법으로는 항원-항체 결합을 원리로 하는 모든 분석방법이 사용될 수 있다. 그 중에서도, 항원-항체 결합의 분석에 흔히 사용되는 ELISA 방법과 면역 블롯(immunoblot) 방법이 바람직하다.
그레이브스 질환의 항체를 측정하기 위하여 일예로서 본 발명의 펩타이드를 기질에 흡착시켜 항체를 측정하는 면역블롯 방법이 하기와 같이 구성될 수 있다.
상기의 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드를 기질에 흡착시켜 항체를 측정하는 방법은
1) 기질에 펩타이드를 흡착시키는 단계;
2) 펩타이드가 흡착된 막에 검체의 혈청을 첨가하여 반응시킨 후 세척하는 단계;
3) 상기 막에 발색효소 또는 형광물질이 결합된 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
4) 상기 막에 발색제를 첨가하여 발색을 유도한 후 항체반응의 특이도를 관찰하는 단계로 구성된다.
단계 1의 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 96-웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있다.
단계 3에서 항체에 결합된 발색효소는 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, TRITC 등이 사용될 수 있다.
단계 4에서 발색제는 4CN(4-chloro-1-naphtol), DAB(diaminobenzidine), AEC(aminoethyl carbazole), ABTS [2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine) 또는 TMB (tetramethyl benzidine)가 사용될 수 있다.
본 발명의 그레이브스 질환의 항체 측정방법에서는, 본 발명의 펩타이드를 생물학적 마이크로칩(biological microchip) 상에 고정시킴으로써 상기 펩타이드에 대한 항체를 검출할 수 있다. 이를테면, 면역블롯 방법과 더불어 공지의 생물학적 마이크로칩(biological microchip) 및 자동화된 미세배열 시스템(microarray system)을 이용하여 대량으로 시료를 분석할 수 있다.
아울러, 본 발명은 그레이브스 질환용 진단 키트를 제공한다.
상기 그레이브스 질환용 진단키트가 포함하는 그레이브스 질환에 특이적인 펩타이드는 파지발현 펩타이드 혼합물에서 그레이브스 질환 환자의 자가면역항체에 결합하는 펩타이드를 바이오패닝을 이용해서 검색할 수 있다.
상기 진단키트는 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드에 대한 항체를 정량분석 또는 정성분석함으로써 그레이브스 질환을 진단할 수 있으며, 상기 항체의 분석을 위해 면역블롯 방법을 이용할 수 있다. 앞서 예를 든 바와 같이, 상기 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드를 기질에 흡착시켜 면역블롯 방법을 수행하도록 상기 진단키트를 제공할 수 있다. 이와 같은 진단키트는 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드, 적당한 완충용액, 표준 항체, 발색 효소 또는 형광 물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 진단키트는 그레이브스 질환 진단을 위해 생물학적 마이크로칩을 이용한 자동화된 분석 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 그레이브스 질환 길항 펩타이드를 표면에 코팅시킨 글래스 슬라이드 등의 칩을 이용하여 면역블롯을 수행하도록 상기 진단키트를 구성할 수 있다. 이와 같은 진단키트는 그레이브스 질환 길항 펩타이드가 표면에 고정된 생물학적 마이크로칩, 적당한 완충용액, 표준항체, 2차 항체 등을 포함한다.
마지막으로, 본 발명은 상기의 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 유도체를 유효성분으로 이용하는 그레이브스 질환 치료용 약학적 조성물을제공한다.
상기 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 유도체는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 그레이브스 질환 길항 펩타이드 및 그의 유도체는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.
또한, 상기 그레이브스 질환 길항 펩타이드 및 그의 유도체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 펩타이드의 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르빅산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제, 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 펩타이드의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(singledose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 그레이브스 질환 길항 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 그레이브스 질환 환자의 자가면역항체 단일클론에 결합하는 펩타이드를 가진 파지클론의 분리
본 발명자들은 갑상선 자극 호르몬 수용체에 대한 자가면역항체 단일클론인 B6B7과 101-2에 대한 억제 펩타이드를 검색하기 위하여 파지 발현 펩타이드 혼합물을 이용한 바이오패닝 검색을 수행하였다.
구체적으로, 바이오패닝 검색방법은 단백질 A(protein A)를 사용하여 정제한 자가면역항체 단일클론 B6B7과 101-2를 각각 0.1 ㎍ 포함하는 인산염 완충용액을 96-웰 플레이트에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 방치하여 단일클론항체를 웰 플레이트에 고정시킨 후, 상기 웰 플레이트에 3% 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 포함하는 인산염 완충용액을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 상기 웰 플레이트를 0.1% Tween 20/인산염 완충용액으로 3번 세척하였다.
그 다음 각 웰에 2.5×1011플라크 형성단위(pfu)의 파지발현 펩타이드 혼합물(New England BioLabs Inc.)을 가해주고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 웰 플레이트를 0.1% Tween 20/인산염 완충용액으로 10번 세척한 후 0.1 M 글라이신(pH 2.2) 용액으로 자가면역항체와 결합한 파지를 분리해 내고, 분리한 파지를 대장균 내에서 증폭시켰다. 이로부터 얻은 증폭된 파지를 다시 자가면역항체를 고정시킨 웰에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 웰 플레이트를 0.5% Tween 20/인산염 완충액으로 30번 세척한 후 0.1 M 글라이신으로 자가면역 항체와 결합한 파지를 분리하였다. 세척 횟수를 45번으로 증가시켜 총 세 번의 파지 결합·분리 후 증폭 과정을 반복함으로써 각각의 자가면역항체와 결합하는 파지클론을 확보하였다.
<실시예 2> 그레이브스 질환 환자의 자가면역항체 단일클론에 결합하는 파지 클론의 엘라이자(ELISA) 검색
상기실시예 1로부터 분리된 파지 클론들이 그레이브스 질환의 자가면역항체와 실제로 결합하는지 조사하기 위하여 엘라이자를 수행하였다. 구체적으로, 상기실시예 1과 동일하게 자가면역항체를 고정시킨 웰 플레이트에 선별된 파지클론들을첨가하고 37℃에서 4시간 동안 방치한 후 웰 플레이트를 0.5% Tween 20/인산염 완충용액으로 3번 세척하였다. 여기에 퍼옥시다제(peroxidase)가 결합된 파지에 대한 생쥐 항체(Amersham Pharmacia Biotech Inc.)를 2만배로 희석하여 첨가한 후 37℃에서 2시간 동안 방치하였다. 상기 웰 플레이트를 0.1% Tween 20/인산염 완충용액으로 3번 세척한 후 퍼옥시다아제의 기질인 ABTS(2,2'-azidobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt, Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.)를 처리하고 3분이 경과한 후 1% 소디움 도데실 설페이트(SDS)로 반응을 정지시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 자가면역항체 B6B7에 대한 파지클론은 3종의 펩타이드 서열로 구분되는데, 15개 파지클론 중 8개 클론이서열번호 1로 기재되는 SPWTLGA 펩타이드 서열을 가지고 있었고 5개 클론이서열번호 2로 기재되는 SPWSIGA 펩타이드 서열을, 나머지 2개 클론이서열번호 3으로 기재되는 GPLQLGM 펩타이드 서열을 가지고 있었다. 또한, 자가면역항체 101-2는 4종의 펩타이드 서열로 구분되는데 30개 파지클론 중 26개 클론이서열번호 4로 기재되는 TQWNMQH 펩타이드 서열을 가지고 있었고 2개 클론이서열번호 5로 기재되는 SQFNHSY 펩타이드 서열을, 나머지 2개 클론이 각각서열번호 6과서열번호 7로 기재되는 PSPRSQT 및 SPLSLGR 펩타이드 서열을 가지고 있었다. 이로부터 본 발명자들은 각각의 자가면역항체 B6B7과 101-2에 가장 높은 빈도와 결합력을 보인서열번호 1및서열번호 4로 기재되는 단일클론 당 하나씩의 펩타이드 서열을 선택하였다.
<실시예 3> 펩타이드의 자가면역항체 억제활성 측정
본 발명자들은 상기실시예 2로부터 선별된 펩타이드가 실제로 그레이브스 질환 자가면역항체의 활성을 억제하는 길항작용을 나타내는지 확인하기 위하여, 상기 두 펩타이드를 자가면역항체 B6B7과 101-2에 첨가한 후 합성되는 cAMP의 양을 측정하였다.
우선, 본 발명자들은서열번호 1및서열번호 4의 펩타이드를 펩티도제닉 리서치 사(PeptidoGenic Research & Co.)에서 구입하여 사용하였다.
한편, 갑상선 자극 호르몬 수용체를 발현하는 CHO 세포를 2×105cell/ml 농도로 24-웰 플레이트에 첨가하고 37℃, CO2배양기에서 하루동안 배양하였다. 상기 웰 플레이트에 자가면역항체 단일클론 B6B7과 101-2 각각을 이소부틸메틸크산틴(IBMX : 3-isobutyl-L-methylxanthine)을 포함하는 염화염이 없는 등장의 HEPES 완충액을 처리하여 혼합한 후 37℃, CO2배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 상기 웰 플레이트에 100% 에탄올을 가하여 세포를 터뜨린 후 원심분리하여 상층액을 얻은 후, 상기 상층액을 가열하여 에탄올을 완전히 증발시키고 남은 시료를 트리스 완충액으로 녹였다.
cAMP 양을 측정하기 위하여, 트리스 완충액으로 녹인 시료 50 ㎕, 3중수소 (3H)로 표지된 cAMP 및 cAMP 결합단백질을 혼합하여 전체 부피를 200 ㎕로 하고 4℃에서 2시간 동안 방치하였다. 상기 혼합용액에 활성탄을 넣고 12000g에서 3분간 원심분리하여 상층액을 얻은 후 여기에 칵테일 용액(Burget Solve, RPI Corp.)을 첨가하고 베타선 측정기(Liquid Scintillation counter, Canvara Packard)를 사용하여 시료내 cAMP 양을 측정하였고 그 결과를도 4와도 5에 나타내었다. 여기에서 억제상수(%)는 항체 자극시 cAMP 생성량을 A pmol, 항체와 펩타이드 동시 처리시 cAMP 생성량을 B pmol이라 했을 때 1-B/A로 표현되며, 각 수치는 항체나 펩타이드를 처리하지 않고 완충액만 처리한 대조군의 값을 빼준 결과이다.
그 결과, 그레이브스 질환 자가면역항체 B6B7의 경우에는서열번호 1의 펩타이드가 0.1 μM 농도에서 B6B7에 의한 cAMP 합성을 50% 이상 감소시키고 10 μM 농도에서는 cAMP 합성을 완전히 억제하였으나서열번호 4의 펩타이드는 거의 억제 활성을 나타내지 않았다(도 4). 그레이브스 질환 자가면역항체 101-2의 경우에는서열번호 4의 펩타이드가 0.1 μM 농도에서 101-2에 의한 cAMP 합성을 50% 이상 감소시키고 10 μM 농도에서는 cAMP 합성을 완전히 억제하였으나서열번호 1의 펩타이드는 거의 억제 활성을 나타내지 않았다(도 5). 이상의 결과는 B6B7과 101-2의 그레이브스 질환의 두 자가면역항체에 대해 선별된서열번호 1및서열번호 4의 펩타이드가 서로 다른 항원 결정기를 가지고 있어서 각각의 자가면역항체에 특이적으로 결합하여 이들의 활성을 억제하는 반면 갑상선 자극 호르몬에 의한 cAMP 합성에는 큰 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
<실시예 4> 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성실험
6주령의 특정병원체부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의서열번호 1과서열번호 4로 기재되는 펩타이드를 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1g/kg/15mL의 용량으로 단회 비경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 본 발명의서열번호 1과서열번호 4로 기재되는 펩타이드는 모두 랫트에서 독성변화를 나타내지 않는 안전한 물질로 판단되었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의서열번호 1 및 서열번호 4로 기재되는 펩타이드는 각각 그레이브스 질환 특이적인 갑상선 자극 단일클론 자가면역항체 B6B7 및 101-2에 특이적으로 결합하여 갑상선 자극 호르몬에 의한 갑상선 호르몬의 합성에는 영향을 미치지 않으면서 갑상선 자극 호르몬의 수용체를 가진 세포의 생화학적인 변화를 억제하여 상기 자가면역항체에 의한 갑상선 호르몬의 합성을 효과적으로 억제함으로써 그레이브스 질환의 진단과 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (12)

  1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 유도체.
  2. 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 그레이브스 질환에 길항작용을 하는 펩타이드 및 그의 유도체.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 펩타이드 및 그의 유도체를 이용하여 그레이브스 질환을 진단하기 위한 항체 측정방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    1) 기질에 펩타이드를 흡착시키는 단계;
    2) 상기 펩타이드가 흡착된 막에 검체의 혈청을 첨가하여 반응시킨 후 세척하는 단계;
    3) 상기 기질에 발색효소 또는 형광물질이 결합된 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
    4) 상기 기질에 발색제를 첨가하여 발색을 유도한 후 흡광도를 측정하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체 측정방법.
  5. 제 4항에 있어서, 단계 1의 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 측정방법.
  6. 제 4항에 있어서, 단계 3에서 항체에 결합된 발색효소는 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 측정방법.
  7. 제 4항에 있어서, 단계 3에서 항체에 결합된 형광물질은 FITC, TRITC로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 측정방법.
  8. 제 4항에 있어서, 단계 4에서 발색제는 4CN (4-chloro-1-naphtol), DAB (diaminobenzidine), AEC (aminoethyl carbazole), ABTS [2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine), TMB(tetramethyl benzidine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 측정방법.
  9. 제 1항 또는 제 2항의 펩타이드 및 그의 유도체를 이용하는 그레이브스 질환용 진단키트.
  10. 제 9항에 있어서, 상기에 더하여 마이크로타이터 프레이트, 분석용 완충용액, 표준항체, 2차 항체 및 발색기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 그레이브스 질환용 진단키트.
  11. 제 10항에 있어서, 2차 항체는 발색효소 또는 형광물질이 결합되는 것을 특징으로 하는 그레이브스 질환용 진단키트.
  12. 제 1항 또는 제 2항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 그레이브스 질환 치료용 약학적 조성물.
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