KR20020024587A - 염증 매개성 감염에 대한 항염증 치료 - Google Patents

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린다 에스. 스티븐슨
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Abstract

염증 매개성 점막 감염의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 유효량의 항염증제를 투여하는 단계를 포함한다. 또, 점막 감염의 활성화 및 진행을 예방하고 억제하는 조성물 및 제품을 제공한다.

Description

염증 매개성 감염에 대한 항염증 치료{ANTI-INFLAMMATORY THERAPY FOR INFLAMMATORY MEDIATED INFECTION}
HIV 감염 사이클은 바이러스를 표적 세포 내로 입장시킴으로써 시작된다. 사람 CD4는 HIV에 의해 인식되는 T 세포 상의 주요 수용체로 여겨진다. HIV 엔벨로프 당단백질(env)이 CD4 수용체에 결합하면 바이러스와 세포막이 융합되어, 차례로 바리러스를 숙주 내로 용이하게 입장시킨다. HIV 감염 숙주 세포의 표면에 env가 궁극적으로 발현되면 이 세포는 비감염 CD4-양성 세포와 융합할 수 있으며, 이로인해 바이러스를 확산시킬 수 있다. 그러나, HIV는 또한 단핵구, B세포 및 수상돌기 세포 같은 다른 세포에도 입장할 수 있으며, 이들 세포는 CD4를 발현할 수 없더라도 바이러스 저장고로서 작용할 수 있다. 사이토킨은 HIV 복제에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 프로-염증성 사이토킨은 HIV 복제를 촉진시키나(Fauci, Nature 3842:529-534, 1996), β-사이토킨은 절대 CCR5를 이용하는 바이러스의 복제를 억제하고(Moore, et al., J. Virol. 70:551-562, 1996), CXCR 4를 이용하는 바이러스 격리체의 복제를 강화한다(Dolei, et al., AIDS 12:183-190, 1998).
헬퍼 T 세포와 B 세포 사이의 생체내 물리적 접촉은 CD4, T 세포 수용체 및 MHC 클래스 Ⅱ와 같은 분자에 의해 매개되며, 흉선-의존 채액성 면역의 발달에 중요하다. CD40과 CD40 리간드 사이의 상호작용은 면역의 발달 및 유지에 있어서 중심이 된다. CD40은 45kDa의 막관통 당단백질이며 신경 성장 인자 수용체, TNF 수용체, Fas, CD17 및 CD30에 대해 세포내 도메인과 상동성을 갖는 표면 단백질 부류의 일원이다(Armitage et al., Nature 357:80-82, 1992). CD40은 미성숙 및 성숙 B 림프구 상에서 동정되었으며, 항체에 의해 교차결합될 때 단핵구, 수상돌기 세포, 흉선 상피 세포 상에서 B 세포 증식을 유도한다(Vall et al., Eur.J.Immunol. 19:1464-1467, 1989). 항원 제시 세포(APC) 상에서 CD40은 항원-특이 T 세포 활성화를 촉진하는 동시 자극성 수용체로서 기능한다(Clark et al., Adv. Immunol. 63:43-68, 1996). gp39, CD40 리간드 또는 CD40L로 지칭되는 CD40의 리간드도 분자적 특성이 규명되었으며(Armitage et al., 1992, 상기 문헌), 활성화된 CD4+ Th 세포 상에서 발현되는 것으로 밝혀졌다(Spriggs et al., J.Exp.Med.176:1543-1550, 1992). gp39 단백질을 발현하는 세포는 B 세포 증식을 촉발시킬 수 있으며, 다른 자극 신호를 통해 항체 증식을 유도할 수 있다(Armitage et al., 1992, 상기문헌). 또한, CD40L에 의한 CD40의 관여는 CD80 및 CD86의 발현을 강화시키며 프로-염증성 사이토킨을 분비시킨다고 보고되어 왔다.
정상적인 장관은 낮은 수준의 온화한 염증에 의해 특징지워지며, 염증은 국부적으로 분비된 케모킨 및 사이토킨의 구성성 수준에 의해 자극된다(Shanahan and Anton, Gut Peptides, J.Walsh eds.(Raven Press, Ltd, New York, 1994, p851;Schreiber et al., Gastroenterology 101:1020(1991); MacDermott et al., Inflammatory Bowel Diseases 4, 54(1998); Luster, N.Engl.J.Med. 338:436 (1998)). 건강한 대조군에서, 위장 림프구는 기능적으로 그리고 표현형적으로 이들의 말초 혈액 림프구와 상이한 것으로 알려져 있다(Allison et al., Gastroenterology 99:421(1990); Jarry et al., Eur. J.Immunol.20:1097(1990); McGowan et al., Neuroimmunomodulaiton 4:70(1997)). 사실상 모든 점막 CD4+림프구는 활성화 마커를 발현하고 CD45RO+메모리 서브세트 중에 있다(Schieferdecker et al., J.Virol. 149:2816(1992)). HIV-1 감염 셋팅에서, 장 T 림프구의 각종 표현형상 비정상성은 자주 CD4+ 림프구의 고갈과 관련이 있는 것으로 기재되어 왔다(Schnieder et al., Clin. Exp. Immunol. 95:430(1994)).
효과적인 백신 없으면, HIV에 의해 감염된 개체 수는 실질적으로 증가할 것이다. 게다가, 효과적인 치료법이 부재한 경우, HIV에 의해 감염된 대부분의 개체는 후천성 면역부전 증후군(AIDS)을 나타낼 것이며, 면역 시스템 저하의 결과로 기회 감염 및 악성 종양, 또는 바이러스의 직접적인 병발생 효과로 인해 죽는다. 질환 진행 속도를 늦추는 몇몇 항-HIV 약제를 현재 사용할 수 있음에도 불구하고, 더욱 효과적인 치료법 및 약물 조합물들에 대한 간절한 필요성이 존재한다.
본 발명은 레트로바이러스 감염을 치료하기 위해 항염증제를 사용하는 것에 관한 것이다. 구체적으로는 본 발명은 HIV 감염의 치료에 관한 것이다.
도 1은 혈액 및 장 점막 유래의 CD4+림프구 상에서의 CCR5 수용체 발현을 보여준다. 유동 세포계측 산점도(A, B)는 혈액(A) 및 장(B)에 대한 대표적인 피험체에서 CCR5 및/또는 CD4을 발현하는 세포의 퍼센트를 정량하기 위한 림프구 서스세트 분석을 보여준다. 각 플롯 중 상단 우측 사분면 상의 수는 CCR5를 발현한 피험체에서의 CD4+ 림프구의 퍼센트를 나타낸다. (C) 개별적인 데이타는 6명의 피험체에 대한 것이다; 데이타는 각 피험체의 혈액 및 장에서 나온 것이다. 6명의 모든 피험체의 장 샘플은 혈액과 비교하여 CCR5+CD4+세포의 퍼센트가 훨씬 더 컸다(P=.03); 차이 범위는 2.0 내지 5.4 배이다.
도 2는 혈액 및 장 점막 유래의 CD4+림프구 상에서의 세포당 CCR5 수용체 수를 보여준다. 유동 세포계산 도수분포도(A, B)는 혈액(A) 및 장관(B)에 대한 6명의 피험체 중 한 명의 CD4+ 림프구 상 CCR5 발현의 정량화를 보여준다. CCR5+CD4+점막 세포에 있어서 평균 형광 지수가 우측으로 이동한 것은 CD4+림프구 당 CCR5 수용체들의 수가 증가된 것을 나타낸다. A 및 B에서 막대기 상단의 수는 개체의 혈액 및 장 내 CCR5+CD4+림프구 당 발현된 CCR5 분자의 수를 나타낸다. (C) 6명의 모든 피험체의 장 샘플은 혈액과 비교하여 CCR5 발현이 훨씬 더 컸다(P=.03); 차이 범위는 1.4 내지 3.5 배이다. 각 개인에 대한 표시는 도 1에 나타난 것과 동일하다.
도 3은 혈액 및 장 점막 유래의 CD4+ 림프구 상 CXCR4 수용체 발현을 보여준다. 유동 세포계측 산점도(A, B)는 혈액(A) 및 장(B)에 대한 대표적인 피험체에서 CXCR4 및/또는 CD4을 발현하는 세포 퍼센트를 정량하기 위한 림프구 서스세트 분석을 보여준다. 각 플롯 중 상단 우측 사분면 상의 수는 CXCR4를 발현한 피험체에서의 CD4+ 림프구의 퍼센트를 나타낸다. (C) 개별적인 데이타는 6명의 피험체에 대한 것이다. 퍼센트는 두 구획 사이에서 상이하지 않다(P=0.3). 각 개인에 대한 표시는 도 1에 나타난 것과 동일하다.
도 4는 HIVSX 또는 HIVNL4-3으로 감염시킨 후 MMC 및 PBMC에 의해 생산된 p24의 피코그램 수를 보여준다. 선 그래프는 M-자극반응성 HIVSX(A) 또는 T-자극반응성 HIVNL4-3(B)로 3시간 감염시키고 18, 72 및 130 시간 후 p24 생산(104 CD4+림프구 당 p24의 피코그램)을 나타낸다. 72 및 130시간 후, 20IU/㎖의 IL-2(●) 존재하에 배양된 MMC 유래의 상청액은 20IU/㎖의 IL-2 존재(○) 및 부재(▼)하에 성장된 PBMC 유래의 상청액보다 더 높은 농도의 p24를 함유하였다. 배양된 점막 세포로부터 p24 생산이 더 크다는 것은 이들 세포가 PBMC보다 M- 또는 T-자극반응성 HIV-1의 복제에 더 민감하다는 것을 암시한다.
도 5는 점막 단핵 세포의 분리를 위한 3일/IL-2 배양물에서 통상의 콜라게나제/디스파제 절단과 비교하여 CD45+, CD3+ CD4+ 및 CD8+의 수가 증가되었다는 것을 보여준다. 각 기법에 의해 분리된 단핵 세포 집단은 T 세포 서브세트 조립에 상당한 차이를 나타내지 않았다.
도 6은 생검 조직 샘플을 다루는 사전 증폭이 그 결과 5-10% RNA 손실을 산출한다는 것을 보여준다. 혈청음성 샘플은 250 카피의 표준 LTR 서열 사전-추출(좌측)로 그리고 대응하는 샘플 사후-추출(우측)에서 "스파이크(spiked)"되었다. 32P 방출을 디지털로 정량화한 것은 동일량의 LTR RNA의 사전 추출 부가 및 사후 추출 부가 사이의 차이가 5-10%임을 보여주었다. 표준은 10카피의 분석 민감도를 나타낸다.
도 7은 결장 내 동일한 주변 수준(30cm)에서 상이한 부위로부터 수득한 샘플들 사이의 내부적 일치를 보여준다. 각 샘플은 2번씩 실행한다. 평균, 각 개체로부터 나온 샘플들 사이에 0.2logSD가 존재한다. 모든 피험체는 검출할 수 없는 혈장 바이러스 적재량을 갖는다.
도 8은 직장 생검 조직편 내 HIV의 정량적 측정을 보여준다. DNA는 검출할 수 없는 혈장 HIV RNA를 갖는 2개의 피험체 생검 조직편으로부터 추출하였다. HIV LTR의 qPCR를 수행하였고, 기록된 각 피험체로부터 나온 2개의 샘플 각각으로부터 나온 실재 카피수를 검출하였다(하단 패널). (4명의 상이한 피험체는 "샘플 #1-4"로 표지한다). β-글로빈 정량화 및 표준 곡선을 각 피험체의 2개의 샘플 상에서 3번 수행하였다(오직 하나의 생검 결과가 상단 패널에 표시되어 있다). HIV DNA 카피의 계산된 수는 2×106β-글로빈 카피 당 기록하였다(1×106세포).
도 9는 분리 프로세스가 관련 수용체 발현을 변경시키지 않는다는 것을 보여준다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 유동 도표는 수평축 및 수직축 상에 정의한 바와 같은 CD4, CD8, CCR5 또는 CXCR4의 항체[상단 패널]로 직접 염색하였다. 하단 패널은 점막 단핵 세포에 사용한 분리 프로세스에 노출시킨 후 동일한 개체의 PBMC와 동일한 염색 결과를 보여준다.
도 10은 CCR5 수용체가 혈액과 비교하여 점막 CD4+ T 세포에서 훨씬 더 큰 퍼센트로 발현된다는 것을 보여준다. 건강한 혈청음성의 대조군으로부터 나온 샘플(n=6)을 CD4 및 CCR5(점막 샘플의 초기 게이팅(gating): CD45 대 사이드 스캐터(SSC) 범위)에 대해 염색하였다. 상단 우측 사분면에 있는 수는 CCR5 수용체를 발현하는 CD4 T 세포의 퍼센트를 나타낸다.
도 11은 세포 당 CCR5 수용체 수가 도 10에 도시된 동일한 피험체의 샘플 내 혈액 CD4 T 세포와 비교하여 점막 CD4 T 세포상에서 상당히 증가한 것을 보여준다. 도수분포도는 점막 표본에서 세포당 수용체의 증가된 수와 관련이 있는 평균 채널 형광이 현저하게 우측으로 이동한 것을 보여준다.
도 12는 CD4+ T 세포상 CCR5 발현이 혈액에 비교하여 증가된 점막이 정상 샘플, 염증성 샘플 및 HIV-감염 샘플에서 검출된다는 것을 보여준다. 혈청음성의 건강한 대조군(n=6), 염증성 대조군(n=4) 및 HIV-감염군(n=8)으로부터 나온 CD4+ 및 CCR5+ 이중 염색된 세포의 평균 퍼센트를 보여준다. X축 상 피험체의 카테코리 하P 값은 임상 그룹 안에서 혈액 세포 및 장 세포 사이의 유의성을 나타낸다. 그래프 상단의 P값은 임상 그룹 사이에서 점막 구획 내 CCR-5 발현 CD4 T 세포 간의 유의성 수준을 나타낸다.
도 13A 및 13B는 (A) 혈액 및 (B)장에서 CCR5+ CD4:CD8 비율이 IBD 및 HIV에서 감소한다는 것을 보여준다. 좌측 패널은 건강한 혈청음성의 대조군, 혈청음성의 염증성 대조군 및 안정된 HIV 감염 피험체로부터 나온 혈액에서의 상대적인 CCR5 발현을 보여준다. CCR5-발현 CD4+ T 세포 대 CCR5-발현 CD8+ T세포의 변화된 비율은 바로 밑에 박스로 표시되어 있다. 점막 림프구에 대한 유사한 표시가 (A)에 나타나 있다.
도 14는 p24(HIV 생산의 지시제)의 양이 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 보다 점막 단핵 세포(MMC)에서 훨씬 더 높다는 것을 보여준다.
도 15A 및 15B는 CD8+ 세포가 HIV 감염 환자에서 나온 결장에서 증가한다는 것을 보여준다. (A) HIV(-) 및 (B) HIV(+) 결장으로부터 나온 생검. CD8+ 세포는 갈색(흑색 사진에서는 희끄무레함)으로 표시된다.
도 16A 및 16B는 CCR5+ 세포가 HIV 감염 환자의 결장에서 증가한다는 것을 보여준다. (A) HIV(-) 및 (B) HIV(+) 결장으로부터 나온 생검. CCR5+ 세포는 갈색(흑색 사진에서는 희끄무레함)으로 표시된다.
도 17A 내지 17D는 비감염된 군, 낮은 점막 바이러스 적재량을 갖는 HIV(+) 군 및 높은 점막 바이러스 적재량을 갖는 HIV(+)군에서 (A) RANTES; (B) IFNγ; 및 (C) TNF의 양을 보여준다. (D)는 프로-염증성 사이토킨의 HIV-유도성 증가 때문에발생하는 (증가된 HLA-DR에 의해 표시되는) CD4 세포 활성화의 증가된 양을 보여준다. Y-축은 활성화된 CD4 세포의 %를 나타내고, X-축은 바이러스 적재량을 나타낸다.
도 18은 Nlegfp가 세포에서 복제될 때 녹색 형광 단백질의 증가된 발현에 의해 표시되는, 점막 세포(MMC) 대 혈액 세포(PBMC)에 의해 생산된 바이러스(Nlegfp)의 증가된 양을 보여준다.
도 19는 HIV 복제에 대한 아사콜(메살아민)의 효과를 보여준다. HIV에 감염된 배양 세포를 표시된 양의 5-ASA 또는 AZT로 처리하였다. HIV 복제 양을 나타내는 루시퍼라제 발현은 광도계로 정량하였다. 도시된 데이타는 9개의 분리된 연구를 나타낸다.
발명의 요약
본 발명은, HIV이 정지상태의 또는 진행성 면역부전 상태라는 이전의 검토와 대조적으로, 사람 면역부전 바이러스(HIV)와 같은 레트로바이러스가 염증 상태를자극한다는 발견에 기초한다. 이러한 염증 상태는 감염을 위해 HIV가 사용하는 수용체를 보유하는 염증 부위에서의 부가적인 염증성 세포를 모집하게 함으로써 HIV에 대한 기회 감염의 우위를 제공할 뿐만아니라, 바이러스성 입자들을 생산하는 감염된 염증성 세포를 활성화시킨다.
제1 구체예에서, 본 발명은 억제 유효량의 항염증제를 단독으로 또는 항바이러스제와 병용하여 점막 조직과 접촉시킴으로써, 점막 조직의 염증 매개성 감염을 억제하는 방법을 제공한다. 염증 매개성 감염은 레트로바이러스(예, 사람 면역부전 바이러스(HIV) 유형 1, HIV-유형 2 및 원숭이 면역부전 바이러스(SIV)로 구성된 군에서 선택된 면역부전 바이러스와 같은 렌티바이러스)와 같은 바이러스에 의해 야기될 수 있다. 항염증제는 단독으로 또는 항바이러스제와 병용하여 생체내, 시험관내 또는 탈체로 조직과 접촉시킬 수 있다. 점막 조직은 통상 포유류 조직이고 사람 조직이 바람직하다. 이러한 점막 조직의 예로 몇몇 이름을 들자면 비뇨생식기 조직(예, 질 조직), 위장 조직, 하부 GI 관 조직 및 코-후두 조직을 포함한다. 항염증제는, 각각 국소 투여, 정맥, 경구 또는 비경구적 투여와 같이 국부적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 항염증제는 항바이러스제와 병용할 경우 항바이러스제 투여전, 동시에, 또는 투여후에 투여될 수 있다. 항염증제는 염증성 세포 모집을 감소시키거나, 케모킨 생산을 감소시키거나, 프로-염증성 사이토킨 생산을 감소시키거나, 케노킨 또는 사이토킨 수용체의 리간드와의 상호작용을 억제하는 임의의 항염증제일 수 있다. 이러한 항염증제는 단독(siglet)으로 또는 조합물로 투여될 수 있으며 또한 단독 또는 조합물로 다른 항-바이러스성 화합물과 함께 투여될수 있다.
제2 구체예에서, 본 발명은 바이러스에 감염된 세포와, 바이러스 활성화 억제 유효량의 항염증제를 단독으로 또는 항바이러스제와 병용하여 접촉시킴으로써 레트로바이러스의 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. 프로-염증성 매개인자의 오토크린(autocrine) 및 파라크린(paracrine) 효과에 의해 염증성 세포의 활성화는 염증 부위에서 염증성 세포의 전사 조절에 변화를 야기한다. 이러한 프로세스를 통해 염증성 세포의 활성화는 차례로 레트로바이러스의 잠재적인 감염을 활성화시킨다. 이러한 레트로바이러스는 면역부전 바이러스 HIV 유형 1, HIV-유형 2 및 원숭이 면역부전 바이러스(SIV)와 같은 렌티바이러스를 포함한다. 항염증제는 단독으로 또는 항바이러스제와 병용하여 생체내, 시험관내 또는 탈체로 세포와 접촉할 수 있다. 항염증제는 항바이러스제와 병용할 경우 항바이러스제 투여전, 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 세포는 점막 세포일 수 있고 통상 포유류 세포이며 사람 세포가 바람직하다. 이러한 점막 세포의 예로 몇몇 이름을 들자면 비뇨생식기 조직(예, 질 조직), 위장 조직, 하부 GI 관의 조직, 구강-볼 조직 및 코-후두 조직으로부터 유래된 세포들을 포함한다.
제3 구체예에서, 본 발명은 유효량의 항염증제를 단독으로 또는 항바이러스제와 병용하여 피험체와 접촉시킴으로써, 피험체에게 염증 매개성 점막 감염을 억제하는 방법을 제공한다. 염증 매개성 점막 감염은 바이러스 또는 다른 병원체에 의해 야기될 수 있다. 바이러스는 레트로바이러스(예, 면역부전 바이러스(HIV) 유형 1, HIV-유형 2 및 원숭이 면역부전 바이러스(SIV)와 같은 렌티바이러스)일 수있다. 생체내 접촉의 경우, 이러한 접촉은 항염증제를 국부적으로 또는 전신적으로 투여하는 것에 의할 수 있으며, 예를들면, 각각 국소 투여, 정맥, 경구 또는 비경구 투여가 있다. 항염증제는 항바이러스제와 병용할 경우 항바이러스제 투여전, 동시, 또는 투여후에 투여될 수 있다. 피험체는 통상 포유류이고 사람이 바람직하다.
제4 구체예에서, 본 발명은 유효량의 항염증제를 단독으로 또는 항바이러스제와 병용하여 사용하여 염증 매개성 점막 감염에 걸리거나 걸릴 위험성이 있는 피험체와 접촉시키고 이로인해 염증 매개성 점막 감염이 다른 피험체에게 전파되는 것을 억제함으로써, 염증 매개성 점막 감염에 걸리거나 위험성이 있는 피험체로부터 다른 피험체에게 염증 매개성 점막 감염이 전파되는 것을 억제하는 방법을 제공한다. 염증 매개성 점막 감염은 바이러스에 의해 또는 다른 병원체에 의해 야기될 수 있다. 바이러스는 레트로바이러스(예, 면역부전 바이러스 HIV 유형 1, HIV-유형 2 및 원숭이 면역부전 바이러스(SIV)와 같은 렌티바이러스)일 수 있다. 염증 매개성 점막 감염에 걸리거나 위험성이 있는 피험체와의 접촉이 생체내인 경우, 이러한 접촉은 국부적으로 또는 전신적으로, 예를들면, 각각 국소 투여, 정맥, 경구 또는 비경구 투여에 의해 항염증제를 투여하는 것에 의할 수 있다. 항염증제는 항바이러스제와 병용할 경우 항바이러스제 투여전, 동시, 또는 투여후에 투여될 수 있다. 염증 매개성 점막 감염에 걸리거나 위험성이 있는 피험체는 통상 포유류이고 사람이 바람직하다.
제5 구체예에서, 본 발명은 유효량의 항염증제를 단독으로 또는 항바이러스제와 병용하여 사용하여 피험체와 접촉시킴으로써, 피험체내 염증 매개성 감염의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 염증 매개성 점막 감염은 바이러스 또는 다른 병원체에 의해 야기되거나, 바이러스 또는 다른 병원체에 의한 감염과 관련될 수 있다. 바이러스는 레트로바이러스(예, 면역부전 바이러스 HIV 유형 1, HIV-유형 2 및 원숭이 면역부전 바이러스(SIV)와 같은 렌티바이러스)일 수 있다. 생체내 접촉의 경우, 이러한 접촉은 국부적으로 또는 전신적으로, 예를들면, 각각 국소 투여, 정맥, 경구 또는 비경구 투여에 의해 항염증제를 투여하는 것에 의할 수 있다. 항염증제는 항바이러스제와 병용할 경우 항바이러스제 투여전, 동시, 또는 투여후에 투여될 수 있다. 피험체는 통상 포유류이고 사람이 바람직하다.
제6 구체예에서, 본 발명은 예방 유효량의 항염증제를 단독으로 또는 항바이러스제와 병용하여 사용하여 HIV 감염의 위험성이 있는 피험체에 투여함으로써, 피험체가 사람 면역부전 바이러스에 감염될 가능성을 예방 또는 감소시키는 방법을 제공하며, 항염증제는 비뇨-생식기, 위장, 또는 기타 점막 조직과 같은 임의의 주어진 조직에 존재하는 염증성 세포의 수를 감소시킴으로써 HIV 복제, 활성화 또는 진행을 억제한다.
제7 구체예에서, 본 발명은 유효량의 항염증제를 단독으로 또는 항바이러스제와 병용하여 사용하여 감염된 피험체에 투여하고, 감염된 피험체로부터 다른 피험체으로의 HIV 전파의 가능성을 예방 또는 감소시킴으로써, HIV 감염된 피험체로부터 다른 피험체에게 사람 면역부전 바이러스가 전파될 가능성을 예방 또는 감소시키는 방법을 제공하며, 항염증제는 비뇨-생식기, 위장, 또는 기타 점막 조직과같은 임의의 주어진 조직에 존재하는 염증성 세포의 수를 감소시킴으로써 HIV 복제, 활성화 또는 진행을 억제한다.
제8 구체예에서, 점막 조직으로 전달되도록 고안된 약학적 허용 담체 내에 1회 이상의 투여량으로 치료학적 유효량의 항염증제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 여기서 투여량은 면역부전 바이러스 진행, 감염 또는 전염의 가능성을 억제 또는 감소시키기에 유효한 함량이다.
제9 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 항염증제 및 면역부전 바이러스 감염을 억제하는 약제의 사용에 대한 설명서를 포함하는 제품을 제공한다. 제품은 단독으로 또는 항-바이러스제와의 조합물로 하나 이상의 항염증제를 포함할 수 있다. 제품은 예를들면, 콘돔, 스폰지, 페사리, 자궁용 캡, 질용 링, 좌약 및 관장제를 포함한다. 사용에 대한 설명은 제품과 함께 포함될 수 있으며, 예를 들면 면역부전 바이러스 감염의 예방에 있어서의 사용 설명서 또는 한 피험체로부터 다른 피험체로의 면역부전 바이러스의 전파를 예방 또는 억제하는데 있어서의 사용 설명서가 있다.
본 발명의 하나이상의 구체예는 하기 도면 및 발명의 상세한 설명과 함께 더욱 자세히 설명되어 있다. 본 발명의 또다른 특징, 목적 및 잇점은 상세한 설명란 및 도면, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다.
상세한 설명
본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "a", "and"과 "the"는 달리 명백한 지시가 없는 한 복수를 포함한다는 점에 유의하여야 한다. 따라서, 예를 들면 "세포"에 대한 언급은 이러한 세포들이 다수 있음을 포함한다.
달리 정의하지 아니하는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 통상 이해되는 의미과 동일하다. 비록, 본 명세서에서 기술한 것과 유사 또는 동등한 임의의 방법, 장치 및 재료가 본 발명을 수행 또는 시험하는데 사용될 수 있더라도, 바람직한 방법, 장치 및 재료는 지금 기술되어 있다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌들은 세포주, 항체 및 방법론을 기술하고 공개할 목적으로 전체로서 본 명세서에 인용되며, 이들은 본 발명과 관련하여 사용되는 문헌에 기재되어 있다. 충돌되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서는 조절할 것이다. 상기 및 본 명세서 전반에서 논의한 문헌은 본 출원의 출원일 이전 "디스클로져(disclosure)"용으로만 제공된다. 본 명세서 중 어느 것도 본 발명가가 선행 발명이라는 이유로 상기 디스클로져를 예상할 권리가 없다는 점을 용인한 것으로 암시되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 "억제하다"는 용어는 30% 이상의 감소와 같이 측정가능한 양에 의해 언급된 활성, 기능 또는 특성을 감소시키는 것을 의미한다. 억제될 수 있는 다수의 상이한 활성이 있는 경우(예, 세포 모집, 프로-염증성 매개인자의 생산, 세포 또는 바이러스 활성화, 바이러스 복제 또는 바이러스 진행/증식을 방해함), (다른 활성과 함께 또는 다른 활성 없이) 어느 하나의 활성을 감소시키는 것으로도 이 정의의 범주에 속하는데 충분하다. 게다가, 하나 또는 다수의 작용제가 활성을 억제하기 위해 투여되는 경우, 임의의 단독 활성의 단독 작용제에 의한 감소 또는 임의의 단독 활성의 작용제들의 배합물에 의한 감소도 이 정의의 범주에 속하기에 충분하다. "염증 억제량"은 염증반응 또는 증후를 조절, 억제 또는 억압하는데 필요한 염증제의 양을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "활성화" 용어는, 바이러스에 대한 언급에서 사용될 때, 전신적으로 또는 국부적으로 바이러스 입자의 수 또는 바이러스 적재량의 증가, 또는 세포 내 바이러스 단백질 또는 핵산 합성의 증가를 의미한다. 증가는 통상 감염된 세포의 전사 상태에서의 변화에 의해 유도되고, 그 결과 세포에 의해 바이러스 생산이 증가된다. 또한, 증가는 전사 상태의 변화와 무관하게 발생할 수 있다. 감염된 세포의 전사 상태의 변화는 사이토킨, 케모킨 및, 세포 증식, 분화 또는 유동(주화성)을 조절하는 기타 분자에 의해 유도될 수 있다. 감염된 세포의 전사 상태의 변화는 바이러스 또는 다른 병원체(박테리아, 곰팡이, 미코박테리아 등)에 의한 감염에 의해 유도될 수 있거나, 면역-조절 항원(예, LPS)으로의 노출에 의해 유도될 수 있다. 활성화는 통상 그 결과 바이러스 양을 증가시키며, 차례로 바이러스에 의해 감염된 세포의 수를 증가시킬 수 있으며, 이를 "바이러스 전파"라로 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "염증 매개성" 용어는, 감염, 질환, 장애 또는 증세에 대한 언급에 사용될 때, 진행 또는 확산되거나 피험체의 염증반응에 반응하여 가속 또는 악화되는 감염, 질환, 장애 또는 증세를 의미한다. HIV 같은 레트로바이러스 감염의 예에서, 진행은 예를들면 감염된 세포 및 바이러스가 존재하는 염증 부위로 이동하는 표적 (비감염된) 세포가 증가함으로써 발생할 수 있다. 모집된 세포는 바이러스 감염에 대한 새로운 표적을 제공하고, 그 결과 바이러스가 확산되고 이로인해 감염이 진행된다. 또한, 염증 매개성은 감염 세포(예, 후기 상태에서)가 면역 조절성 분자 또는 기타 신호 분자(예, 프로-염증성 사이토킨 또는 염증 반응을 증가시키는 기타 분자)에 노출되었을 때 세포의 전사 상태를 조절하고 이로인해 세포에 의한 바이러스의 생산을 자극 또는 증가시키는 경우를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "점막 조직"은 점막 세포가 발견되는 임의의 조직을 의미하고, 이러한 조직은 예를들면 위장 조직(예, 위, 소장, 대장, 직장), 비뇨생식기 조직(예, 질 조직, 페니스 조직, 요도), 코-후두 조직(코 조직, 후두 조직), 입(구강 조직)을 포함한다. 기타 점막 조직이 알려져 있으며 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
본 발명자는 레트로바이러스 감염(예, HIV 감염 같은 면역부전 바이러스 감염)은 피험체의 조직(예, 점막 조직)에 존재하는 염증성 증세라는 것을 밝혀냈다. 대부분의 보고서들은 감염된 피험체의 혈액 내에서 점차로 나타나는 것에 대응하는 점막 내 림프구감소증 또는 "항염증" 상태를 강조하였다. 건강한 비감염 개체에서 활성화되고 공동 수용체를 발현하는 기억 CD4+T세포들이 증가된 수로 점막 조직에 정주하기 때문에, 이들 조직을 통한 감염 취약성이 높다. 감염에 대한 통상의 반응에서, 점막 면역 세포(가장 유사한 CD8 + T 림프구 및 대식세포)는 부가적인 T 림프구를 점막 감염 부위에 모집시킬 목적으로 프로-염증성 케모킨 및 사이토킨을 증가된 수준으로 분비한다. 비록 감염을 제한할 목적으로 선동시켰으나, 증가된 반응 또는 "염증반응"은 바이러스 확산에 조력하면서 감염에 대한 새로운 가능성있는 표적의 수를 상당히 증가시킨다. 따라서, 본 발명은 광범위한 레트로바이러스 감염, 레트로바이러스 관련 질환 및 장애를 치료하는 방법에 관한 것으로, 임의의 수의 항염증제를 단독 또는 임의의 수의 항바이러스제와 병용하여 사용함으로써 피험체의 부어오른 조직으로 부가적으로 감염되기 쉬운 세포들을 모집하는 것을 방해 또는 억제하고, 이로인해 이들 경로를 억제함으로써 사이토킨 및 기타 프로-염증성 매개인자에 의한 활성화와 같은 염증 작용기작을 통한 염증성 세포의 활성화를 방해할 뿐만아니라, 점막 조직에 노출된 다른 (비감염 또는 감염된) 피험체에게 전파되는 것을 예방한다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 레트로바이러스는 다수의 레트로바이러스에 의해 야기되는 레트로바이러스성 장애를 포함한다.
예를들면, SIV-감염 마카크의 경우, 위장 관은 SIV 감염이 주로 점막 면역계의 질환일 수 있다고 제안된 정도로 초기 CD4+ 림프구 고갈 및 바이러스 복제의 주요 부위이다(Veazey et al., Science 280:427 (1998); MacDonald and Spencer, Gastrointestinal and Hepatic Immunology, R.H. Heatley, Ed. Cambridge University Press, 1994). 사람의 경우, HIV 감염은 또한 점막 면역계를 연루시키며, 감염성 바이러스 입자는 점막 샘플로부터 직접 수집하였고, 원위치 연구에 의해 고유판 T 림프구가 감염되는 최초 세포들 중에 있다는 것을 밝혔다(Koteler et al., Am.J.Pathol. 139:823(1991); Heise et al., J.Infect. Dis. 169:1116(1994); Heise et al., Am.J.Pathol. 142:1759(1993); Smit-McBride et al., J.Virol. 72:6646(1998); Clayton et al., Gastroenterology 103:919(1992); Ellakay et al., Am.J.Clin. Pathol., 87:356(1987); Jarry et al., Histopathology16:133(1990); Lacner at al., Am.J.Pathol. 153:481(1998)). 게다가, 직장 S상 결장의 점막 내층은 항문 삽입 성교 동안 바이러스 입장의 주요 부위이다(Patterson et al., Am.J.Pathol. 153:481(1998)).
염증
염증은 사이토킨, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 케모킨, 부착 분자(예, LFA-1) 및 당업자에게 알려진 기타 분자를 포함하는 프로-염증성 매개인자에 의해 야기되는 다수의 개별적이고 관련된 캐스캐이드 또는 반응으로부터 야기된다. 예를들면, 케모킨 수용체는 CD4+세포 안으로 바이러스가 입장되도록 하는데 중추적인 역할을 한다. 케모킨으로 불리는 이들 수용체의 리간드도 중요하다. 이들 케모킨은 프로-염증성 사이토킨과 함께 세포의 주요 자극인자이고 또한 염증성 캐스캐이드의 증폭에 또다른 역할을 한다. 이들 가용가능한 염증성 매개인자는 CD8+T세포에서 주로 유도된다. 일단 생산되면, 이들은 파라크린 및 오토크린 형식으로 작용하여, 나아가 그 근처의 세포들을 활성화시키고 염증 부위에 부가적인 T세포를 모집할 수 있다. 이들 부가적인 림프구 자신이 활성화되어, 염증성 캐스캐이드를 증폭시키는데 기여한다.
염증으로 인해, 림프구 및 대식세포(CD4+세포)가 자극된다. HIV가 정착하는 이들 염증성 세포는 자극될 때 다량의 바이러스를 생산하도록 유도될 것이다. 건강한 HIV-비감염 환자의 경우에서도 장은 낮은 수준의 생리학적 염증 상태를 유지하며, 이것은 그 표면과 접촉하는 가능성있는 병원체 바스(bath)로부터 내부 환경을 보호하는데 필요하다. 따라서, 이러한 침윤물 급송을 구성하는 대다수의 림프구 및대식세포가 자극된다. 바이러스가 가장 효과적으로 복제되는 HIV의 주요 표적은 자극된 CD4+세포이다. 이런 유형의 세포는 위장 점막을 채운다. 증가된 바이러스 복제는 점막을 통해 HIV를 더 크게 확산시키며, HIV 바이러스 적재량을 더 높게 한다. 항-HIV 치료법의 주요 목적은 HIV가 복제되고 종국적으로는 바이러스에 의해 파괴되는 CD4+세포 사이에서 확산되는 능력을 감소시키는 것이다. HIV의 복제가 효과적으로 감소될 경우, 또한 항바이러스 의약에 대한 내성을 산출할 수 있는 유전자 물질 내 돌연변이를 전개시키는 바이러스의 능력도 감소될 수 있다. 본 명세서에 사용된 면역억제 활성은 B세포 및 T세포가 반응하여 염증 부위로 모집되거나 활성화되는 능력을 억제 또는 감소시키는 것을 의미한다. NSAID는 프로스타글란딘 (PG) 합성을 감소시켜야 한다. PG는 세포성장억제제이다.
염증 세포를 활성화하는 다른 신호는, LFA-1(CD11a 및 CD18)과 같은 부착 수용체가 ICAM-1(CD54)과 같은 대응(counter)-수용체 중 하나와 결합하는 것을 포함한다(Staunton et al., 1990, Cell 61:243-254). 제2 신호가 차단되는 경우, 항원-특이 T 세포는 아폽토시스에 의해 사멸되거나 세포성 아너지 상태로 들어가도록 유도된다. LFA-1 및 ICAM-1의 단클론성 항체에 의해 이러한 상호작용을 차단하면 심장 동종이계이식편을 받은 마우스에 대하여 생존 시간을 증가시킨다(Isobe et al., 1992, Science 255:I 125-1 127).
위장 점막은 이러한 림프 조직의 한 구성요소이며, 증가하는 증거는 질환의 모든 단계에서 HIV가 점막을 연루시킨다는 것을 제시한다. 위장관은 대부분의 환자의 경우 전파 경로일 뿐만아니라, 가장 큰 림프 기관이다. 전술한 바와 같이, 위장점막은 낮은 수준의 생리학적 염증 상태가 특징이며, 대다수의 그 림프구가 활성화되어 있다. 점막에 존재하는 프로-염증성 사이토킨의 농도가 자연적으로 높은 것에 의해 상기 부위에서 HIV 복제를 강화시키고 그 결과 높은 점막 HIV 바이러스 적재량 및 새로운 표적 위장 CD4+ 세포의 계속적인 감염 순회를 산출한다.
본 발명자들은 대부분의 위장 CD4+T세포가 HIV 입장에 필요한 케모킨 수용체를 발현한다는 것을 밝혀냈다. 대부분의 위장 점막 림프구는 CCR5 및 CXCR4 모두를 발현하다. CCR5의 경우, 또한 점막 단핵 세포(MMC)는 세포 하나를 기준으로 혈액 유래의 단핵구 보다 이 수용체의 발현 수준이 더 높은 것으로 나타난다. 본 발명자는 점막 세포가 시험관내 말초 혈액 세포 보다 HIV에 더 민감하다는 것을 밝혀냈다.
HIV 핵산은 대다수의 HIV-감염 개체의 점막에서 발견할 수 있다; Kotler등은 조사한 20명의 환자 중 70%에서 gag-특이 프라이머를 사용한 PCR를 통해 HIV DNA를 검출하였다. 본 발명자는 검출할 수 없는 혈장 바이러스 적재량을 갖는 환자 조차도 점막에서 복제하는 바이러스를 보유한다는 것을 발견하였다. 마카크가 내장을 통해 또는 비경구적인 경로를 통해 감염되었는지에 상관없이 위장 점막내에서 높은 SIV 바이러스 적재량이 보여지며, 이는 점막이 HIV에 대해 본질적으로 높은 민감성을 갖는다는 것을 제시한다. 감염 후, 이들 마카크는 심각한 초기(7일 내지 21일 내) 위장 점막 CD4+ 세포 손실을 나타낸다. 격렬한 HIV 활성의 이러한 징조는 다른 림프계 부위에 반영되지 않았다. 사람의 경우, 점막 CD4+ 세포 고갈은 만성 감염의 초기 비자각증상의 상태 동안 그리고 임상적 AIDS의 개시 이후 결장 및 십이지장에서 묘사되어 왔다.
본 발명자는 레트로바이러스 감염, 예컨대, 면역부전 바이러스, 더욱 구체적으로 HIV와 관련된 감염이 염증 상태와 관련이 있다는 것을 발견하였다. 염증은 세포성, 가용성 또는 둘다 일 수 있다. 염증은 바이러스에 의해 감염되기 쉬운 임의의 다수 조직(예, 점막 조직)에 있을 수 있다. HIV 감염과 관련된 염증 과정 및 케모킨과 케모킨 수용체(HIV의 공동 수용체로 작용함)의 역할을 밝혀냄으로써, 면역부전-관련 바이러스, 예컨대, HIV-1/2에 의해 야기된 레트로바이러스성 감염 등의 신규의 치료법을 제공한다.
점막 염증 영역에서 발견된 염증성 세포는 다수의 CD4-양성 T-림푸구를 포함하고, 활성화된 기억 표현형이며, 높은 수준으로 HIV에 대한 필수적인 공동 수용체를 발현하며, HIV가 선호하는 표적 세포이다. 케모킨 수용체를 비롯한 공동 수용체는 β-케모킨의 수용체로 작용하는 내인성 염증 면역 반응의 일반적인 일부이다. 이들 케모킨 및 그 수용체들은 활성화되는 경우 순환하는 염증성 세포를 점막 부위로 현저하게 모집시키는 것을 개시하며, 그결과 세포성 및 가용성 염증을 일으킨다. 염증 존재하에 강화된 점막 조직 감염을 항염증제를 제공함으로써 억제하는 것은 이러한 점막 조직 질환의 활성화, 진행 및 확산을 감소시키는 효과적인 방법을 제공할 것이다.
따라서, 항 염증제를 사용하면, 레트로바이러스 감염에 의해 야기되는 염증 반응을 완화, 제어 또는 감소시키는 유용한 방법을 제공한다. 통상 염증은 비제한적으로 프로스타글란딘, 류코트리엔, 사이토킨, 케모킨 및 당업자에 의해 인식되는기타 분자들을 포함하는 프로-염증성 매개인자를 통해 다른 염증성 세포를 모집 및 활성화시키기 때문에, 이러한 모집 및 활성화를 감소시키는 것은 HIV 감염에 유용한 CD4-양성 세포의 유효 수를 감소시킬 것이다.
따라서, 본 발명에 유용한 항염증제는 염증성 세포의 모집을 감소시키는 약제, 케모킨의 생산을 감소시키는 약제, 염증성 캐스캐이드의 지속을 촉진시키는 프로-염증성 사이토킨의 생산을 감소시키는 약제, 케모킨 또는 사이토킨 수용체를 (예, 케모킨 수용체가 그 리간드와 상호작용하는 것을 억제함으로써) 억제하여 염증 메세지의 전파를 방해하는 약제를 포함한다. 이들 약제들은 전술한 단백질 분자에 결합하고 그 생물학적 활성을 방해하는 "항 염증성 항체"를 포함한다. 이들 항체는 사이토킨, 사이토킨 수용체, 케모킨, 케모킨 수용체와 상호작용하도록 설계된 항체들을 포함하며, 이들 항체들을 염증 반응을 감소 또는 방해하도록 피험체(예, 사람)에 대해 설계하거나 피험체에게 제공한다.
또한, 본 발명은 레트로바이러스성 및 면역부전성 바이러스의 복제 또는 면역부전 복제에 반응하는 사이토킨 분비를 차단하는 다양한 약학 조성물을 포함한다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명에 따른 항체, 분리된 펩티드, 핵산 서열 또는 기타 항염증제 또는 항염증성 약물을, 담체, 부형제 및 첨가제 또는 보조제를 사용하여 피험체에게 투여하기 적절한 형태(예, 약학적 허용 담체)로 제조한다. 자주 사용되는 담체 또는 보조제는 탄산마그네슘, 이산화티탄, 락토즈, 만니톨 및 기타 당류, 탈크, 우유 단백질, 젤라틴, 전분, 비타민, 셀룰로즈 및 그 유도체, 동물성 및 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜 및 용매(예, 멸균수, 알콜, 글리세롤및 다가 알콜)을 포함한다. 정맥내 부형제는 유체 및 영양 보충액을 포함한다. 보존제는 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스를 포함한다. 기타 약학적 허용 담체는 예를들면 전술한 수용액, 비독성 부형제(예, 염, 보존제, 완충액 등)를 포함한다[Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed. Easton: Mack Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487, 1975 및 The National Formulary XIV., 14th ed. Washington: American Pharmaceutical Association, 1975; 상기 문헌들은 본 명세서에 인용되어 있음]. 약학 조성물 내 pH 및 각종 성분의 정확한 농도는 당업계에서 통상적인 방법에 따라 조정된다. 문헌[Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics, 7th ed]을 참조하라. 이러한 약학 조성물은 하나이상의 항염증제 및 하나이상의 항바이러스제를 배합하여 포함할 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 면역부전 바이러스의 복제 또는 확산, 또는 면역부전 바이러스에 반응한 사이토킨의 분비를 제어 또는 억제하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 피험체에게 본 발명의 화합물 및 약학적 허용담체를 함유하는 약학조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물을 "투여"한다는 것은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. "피험체"는 임의의 포유류를 의미하며, 바람직하게는 사람이다.
바람직하게 약학 조성물은 단일 투여 단위로 제조 및 투여된다. 고형의 단일 투여 단위는 정제, 캡슐 및 좌약이다. 환자 치료의 경우, 화합물의 활성, 투여 형식, 장애의 속성 및 심각성, 연령 및 환자의 몸무게에 따라, 상이한 일일 투여량이필요하다. 그러나, 특정 환경하에서는, 더 높거나 더 낮은 일일 투여량이 적절할 수 있다. 일일 투여량의 투여는 하나의 개별적인 투여 단위 또는 수개의 더작은 투여 단위의 형식으로 단일 투여함으로써 또는 특정 간격으로 나누어진 투여량으로 여러번 투여함으로써 수행될 수 있다.
투여량은 부작용(예, 원하지 않는 교차반응, 과민 반응 등)을 야기하지 않을 정도의 크기이어야 한다. 통상, 투여량은 연령, 상태, 성 및 환자 내 질환 또는 감염의 정도에 따라 달라질 것이며 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 임의의 모순(contradication)되는 사건의 경우 개별적인 의사에 의해 조정될 수 있으며, 과도의 실험 없이도 용이하게 확인할 수 있다. 임의의 사건에서, 치료의 유효성은 예를들면, 면역부전 바이러스에 감염된 환자내 염증부위(예, 점막 조직)에서 HIV RNA 또는 DNA 바이러스 적재량의 수준을 모니터링하거나, 염증성 매개인자, 사이토킨, 케모킨 및/또는 CD4+ T세포를 측정하는 기타 방법에 의해 결정될 수 있다. CD4+세포의 상대수, 조직 내 사이토킨, 프로-염증성 매개인자 또는 케모킨의 수준의 감소 또는 안정화는 개체 또는 조직에 있어서 염증의 수준과 서로 관련이 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 통상 국소적으로, 정맥내, 경구적 또는 비경구적으로 또는 이식에 의해 투여된다. 직장 및 질은 통상 점막 조직 중 최초 접촉 및 염증 부위이기 때문에, 직장 및 질 투여가 더욱 효과적이라고 증명될 수 있다. 이들 부위가 접촉되어 감염 또는 전파를 방해 또는 억제할 수 있다. 적절한 고형 또는 액상 약학 조성물 형식은 예를들면, 과립, 분말, 정제, 피복된 정제, (미세)캡슐, 좌약, 시럽, 에멀젼, 서스펜젼, 크림, 젤, 에어로졸, 점적제 또는 앰풀 내주입액, 및 활성 화합물의 서방성 방출 제제가 있으며, 이 제제 내에는 부형제 및 첨가제 및/또는 보조제(예, 정제분해물질, 결합제, 피복제, 팽윤제, 윤활제, 향신료, 감미료 또는 용해제)를 전술한 바와 같이 관례적으로 사용한다. 약학 조성물은 다양한 약물 전달 시스템 내에서 사용하는 것이 적절하다. 약물 전달에 대한 현재 방법들에 대한 개론에 대해 문헌[Langer, Science, 249:1527-1533, 1990, 본 명세서에 인용되어 있음]을 참조하라.
본 발명에 따른 약학 조성물은 국부적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. "치료 유효 투여량"은 질환의 증상 및 그 합병증을 예방, 치료 또는 적어도 부분적으로 지연 또는 감소시키는데 필요한 본 발명에 따른 화합물의 양을 의미한다. 이런 용도의 유효량은 물론 질환 또는 감염의 심각성 그리고 피험체의 몸무게 및 일반적인 상태에 따라 달라진다. 통상, 시험관내 사용되는 투여량은 약학 조성물의 원위치 투여에 유용한 양에 대한 유용한 안내를 제공할 수 있으며, 동물 모델을 사용하여 특정 장애의 치료에 대한 유효 투여량을 결정할 수 있다. 다양한 고려사항은 문헌[Gilman et al., eds., Goodman and Gilman's: the Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990; 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, 각 문헌은 본 명세서에 인용되어 있음]에 기재되어 있다. 투여량의 유효성은 예를들면, HIV RNA 또는 DNA 수준, 면역부전 바이러스로 감염된 환자 내 염증 부위(예, 점막 조직)에서 바이러스 적재량을 측정함으로써, 감염과 관련된 하나이상의 증상의 감소에 의해, 또는 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용한 염증성 매개인자, 사이토킨, 케모킨 및/또는 CD4+ 세포의 양 측정을 비롯한 기타 방법에 의해 모니터링될 수 있다.
본 발명의 면역치료 방법은 면역부전 바이러스 감염의 위험성이 있는 숙주에 대한 예방법을 포함한다. 예를들면, 이 방법은 HIV감염 위험성이 있는 사람에게 유용하다. 항염증제의 "예방 유효량"은 예를들면 염증 반응을 감소, 억제 또는 방해함으로써 HIV 복제, 활성화 또는 전파를 억제할 수 있는 양을 의미한다. HIV 전파는 3개 이상의 알려진 경로에 의해 발생한다: 성관계, 혈액(또는 혈액 생성물) 주입 및 태반을 통해. 혈액을 통한 감염은 정맥주사용 약물 사용자들 사이에서의 전파를 포함한다. HIV와의 접촉이 필연적으로 혈청변화(seroconversion)에 의해 측정되는 바와 같은 증상을 나타내는 감염을 산출하는 것이 아니기 때문에, 모든 사람은 잠재적으로 위험 가능성이 있으며, 따라서 본 발명의 치료법에 의한 예방 치료를 고려하여야 한다.
예방적 활성 또는 전파 방해를 위해 본 발명에 유용한 항염증성 조성물은 예를들면, 항 염증제로 피복 또는 윤활된 콘돔, 사용시 항염증제를 방출하도록 파열되는 콘돔 상 존재하는 캡슐을 포함하는 콘돔, 항염제로 피복 또는 윤활된 피임용 페사리, 자궁용 캡, 스펀지 및 링을 포함하는 질 제품; 항염증제를 포함하는 질 세척제, 크림, 젤 윤활제, 좌약, 포옴 또는 정자파괴(spermicidal) 젤, 및 성교 중 접촉되는 점막 조직에 항염증제를 국부적으로 전달하기 위해 당업자에게 알려진 기타 조성물 및 제품을 포함한다. 이러한 제품은 감염된 피험체로부터 다른 피험체로 감염 또는 전파되는 것을 방해 또는 억제하는데 유용하다.
본 명세서에 기술되고 본 발명의 방법에 유용한 조성물은 면역부전 바이러스에 감염되기 전에(예, 예방적으로) 또는 하기 기술하는 임의의 단계에서, 초기 감염된 후 또는 차후 전파를 방해하기 위해 감염후, 환자에게 투여될 수 있다. 예를들면, HIV 감염은 하기 임의의 경로로 전해질 수 있다.
(1) 약 15%의 감염 개체는 급성 질환을 보유하며, HIV 접촉 후 6주 내 발열, 발진 및 확장된 림프절 및 수막염에 의해 특징지워진다. 이러한 급성 감염 이후 이들 개체는 증상이 없어진다.
(2) HIV 감염된 나머지 개체들은 수년 동안 증상이 없다.
(3) 몇몇 개체들은 지속성 일반화 림프절장애(persistent generalized lymphadenopathy, PGL)를 나타내며, 목, 서혜부 및 액와 내 팽창된 림프절이 특징이다. PGL의 개체 중 5% 내지 10%는 무증상 상태로 되돌아 간다.
(4) 임의의 이들 개체는 AIDS-관련 컴플렉스(ARC)를 나타낼 수 있으며; ARC 환자는 무증상 상태로 돌아가지 않는다.
(5) ARC 및 PGL에 걸린 개체 뿐만아니라, 무증상 개채는 결국(수개월 내지 수년 후에) 가차없이 죽음으로 이르는 AIDS를 나타낸다.
항염증제
본 명세서에서 "항염증제"는 예를들면 염증성 세포의 모집을 감소시키거나, 케모킨 생성을 감소시키거나, 프로-염증성 케모킨 생성을 감소시키거나, 프로-염증성 사이토킨 생성을 감소시키거나, 케모킨 또는 사이토킨과 그 수용체와의 상호작용을 억제함으로써, 염증 반응을 감소, 방해 또는 조절할 수 있는 약제를 의미한다. 이러한 약제는 예를들면, 항염증성 항체(예, 항-사이토킨 항체, 항-수용체 항체), 펩티드(예, 염증성 매개인자, IL-1 같은 사이토킨, 또는 IL-1 수용체 같은 수용체의 작동제 또는 길항제, 가용성 TNF 수용체의 길항제), 핵산(예, 항염증성 펩티드 같은 항염증제, 리보자임 또는 안티센스 분자를 암호화하는 핵산), 스테로이드(예, 프레드니손), 비스테로이드성 항염증성 약물(예, 아스피린), 5-ASA 생성물, 통상 사용되는 항염증성 약물 및 그 조합물을 포함한다.
본 발명에 유용한 항염증성 항체의 예는, 항-인터루킨 수용체 같은 사이토킨 및 그 수용체의 항체, 항-사이토킨 항체(예, Centocor 제품인 REMICADER같은 항-TNF 항체), 항-케모킨 항체(예컨대, Olson et al, J. of Virol. 73(5):4145-4155(1999) 참조하라. 본 명세서에 인용되어 있음), 항-케모킨 수용체 항체(예, 항-CCR5 항체 또는 항-CXCR4 수용체 항체) 및 이들의 조합물을 포함한다. 기타 항체들은 프로-염증성 매개인자를 생선하는 효소학적 경로들 중 효소에 대한 항체를 포함하며, 그 예로서 미국 특허 제5,767,249호(본 명세서에 인용되어 있음)에 기재된 유형-1 포스포리파제 A2에 대한 항체가 있다.
본 발명에 유용한 항-염증성 핵산의 예로는 항 염증성 펩티드, 프로-염증성 폴리펩티드(예, 사이토킨 또는 케모킨)를 암호화하는 RNA를 절단하는 리보자임, 사이토킨, 사이토킨 수용체, 케모킨, 케모킨 수용체, 본 명세서에 기재된 기타 염증성 펩티드 또는 수용체를 암호화하는 핵산 서열과 하이브리드화할 수 있는 안티센스 분자를 암호화하는 핵산들 및 이들의 조합 또는 당업자에게 용이하게 동정될 수 있는 조합을 포함한다.
항-염증성 펩티드의 예로는 LFA 부착 분자 길항제, 사이토킨 수용체 길항제, 전사 인자, 가용성 TNF-α수용체 폴리펩티드를 포함한다. 기타 항염증성 펩티드는 예컨대, NF-카파 B 같은 전사 인자(Schottelius AJ et al., Int J Colorectal Dis 1999 Feb; 14(1): 18-28), 혈소판 인자 4에 대한 펩티드(미국특허 제5,776,892호, 본 명세서에 인용되어 있음), 및 미국특허 제5,766,593호(본 명세서에 인용되어 있음)에 기재된 CD14에 기초한 펩티드를 포함한다.
항 염증성 사이토킨의 예로는 사이토킨 및 전사인자를 포함한다. 항 염증성 사이토킨은 예를들면 IL-13(Watsen ML, Am J Respir Cell Mol Biol 1999 May 1; 20(5): 1007-1012), IL-4 및 IL-10(Jarvelainen HA et al., Hepatology 1999 May; 29(5): 1503-10), IL-16(Klimiuk PA, et al., J Immunol. 1999 Apr 1:162(7): 4293-4299) 및 당업자에게 알려진 기타 항염증성 사이토킨을 포함한다.
본 발명에 유용한 항염증제의 예로는 스테로이드성, 비스테로이드성 및 살리실레이트 수용성 및 불수용성의 각종 약물 및 이들의 산 부가 또는 금속 염으로부터 나온 약제를 포함한다. 유기염 및 무기염 모두는 항염증제가 그 의약적 가치를 유지하는 한 사용될 수 있다. 항염증제는 다양한 범위의 치료제 및 서방성 방출 또는 연장된 작용 형식으로 투여될 수 있는 치료제들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.
비스테로이드성 항염증제(NSAID)는 다양한 화학 구조의 다수 화합물을 포함한다. 전부는 아니나 대부분은 작용 기작이 공통되는 것으로 여겨지고 있으며, 거의 대부분은 약한 유기산이다. 이렇게 큰 그룹의 화합물을 2개의 주요 그룹, 카르복실산(R--COOH) 및 에놀산(R--COH)으로 나눌 수 있다. 또, 화학구조에 기초한 하위구분을 만들 수 있다. 에놀산의 주요 그룹들은 피라졸론(예, 페닐부타존, 옥시펜부타존, 디피론 및 이소피린)과 크시캄(xicam)(피록시캄 및 밀록시캄)이 있다. 카르복실산의 서브그룹은 살리실레이트(예, 아세틸살리실레이트(아스피린)); 프로피온산(예, 이부프로펜 및 나프록센); 안트라닐산(예, 메클로페남산); 페닐아세트산(예, 아세트아미노펜; 아미노니코틴산(예, 플루닉신); 및 인돌린(예, 인도메타신)을 포함한다.
작용기작이 알려진 NSAID의 경우, 대부분은 시클로옥시게나제 및 리폭시게나제 경로를 억제함으로써 아라키돈산 대사물질의 형성을 억제하고 이로인해 이들 대사물질에 의해 매개된 염증을 감소시킨다고 밝혀졌다. 시클로옥시게나제는 아라키돈산을 고리형 엔도퍼옥시드, PGG2 및 PGH2(PG로 알려짐)로 전환시킨다. 또다른 특이 효소의 작용에 의해, 이들 화합물은 염증성 매개인자 패밀리의 다른 일원, 에이코사노이드(PGE2 및 PGI2를 포함함)으로 전환된다. 그러나, 시클로옥시게나제의 구조는 조직 중에서 다양하고, NSAID는 이들 효소 각각과 결합하는 능력이 상이하며, 이는 효능 및 종 반응에서의 차이를 설명한다.
상표, 일반명, 투여량의 표준 크기 및 화학 구조를 갖는 비스테로이드성 함염증제의 비제한적인 구체적인 예는 하기 의약을 포함한다: 이부프로펜(예, MOTRINR300, 400, 600, 800㎎, ADVILR200㎎)(±)-2-(p-이소부틸페닐)프로피온산; 톨메틴(TOLECTIN(등록상표)) 5-(p-톨루오일)-1-메틸피롤-2-아세트산; 나프록센(예,ALEVER, ANAPREXR, 또는 NAPROSYNR250, 375, 및 500㎎, 6-메톡시-α-메틸-2-나프탈렌아세트산, (+); 플루르비프로펜(ANSAIDR), 50 및 100㎎, 2-플루오로-α-메틸-[1,1'-비페닐]-4-아세트산, (±); 술린닥(CLINORNR150 및 250 ㎎, 5-플루오로-2-메틸-1-[[p-(메틸설피닐)페닐]-메틸렌]-1H-인덴-3-아세트산; 디풀루니살(FLOVACILR) 250 및 500 ㎎, 2'4'-디플루오로-4-히드록시-[1,1'-비페닐]-3-카르복실산; 피록시캄(FELDENER) 4-히드록시-2-메틸-N-2-피리디닐-2H-1,2-벤조티아진-3-카르복사미드 1,1-디옥시드; 인도메타신(INDOCINR), 25 및 50㎎, 1-(4-클로로벤조일)-5-메톡시-2-메틸-1H-인돌-3-아세트산; 에토돌락(ULTRADOLR) 1,8-데에틸-1,3,4,9-테트라히드로피라노-[3,4-b]인돌-1-아세트산; 메클로페나메이트 나트륨(MECLOMENR), 50 및 100㎎, N-(2,6-디클로로-M-톨릴)안트라닐산, 나트륨 염, 일수화물; 이수화물로써 페노프로펜 및 페노프로펜 칼슘(NALFONR) 200㎎ 및 300㎎, 아릴아세트산의 유도체, α-메틸-3-페녹시벤젠아세트산; 케토프로펜(ORUDISR), 25, 50 및 75㎎, 2-(3-벤조일페닐)프로피온산; 메클로파나메이트 나트륨; 메페남산(BONABOLR) N-(2,3-크실릴) 안트라닐산; 나부메톤; 케토롤락 트로메타민; 디클로페낙 나트륨(PROPHENATINR) 2-[(2,6-디클로로페닐)아미노]벤젠아세트산 모노나트륨 염; 브롬페낙 나트륨; 페닐부타존(BUTAZOLIDINR) 100㎎, 4-부틸-1,2-디페닐-3,5-피라졸리디네디온; 기타 COX-2 억제제(예, 셀로콕시브, 멜록시캄, 니메술리드 및 로페콕시브); 수프로펜; 펜부프로펜; 플루프로펜; Midol-PMS, 아세트아미노펜, 500㎎; 타이레놀 엑스트라 스트렝스, 아세트아미노펜, 500㎎; 탈리도미드; 옥사프로진; 살리실레이트 함유 화합물 및 달맞이꽃 오일(약 72% 리놀산 및 약 9% 감마-리놀렌산 함유), 이들의 단일 이성질체 및 그 조합물.
살리실레이트 항염증제의 비제한적 특정 예는 하기 의약을 포함한다: 비스머스 서브살리실레이트; 살살레이트; 살리실산 및 살리실산 유도체(예, 나트륨 티오살리실레이트, 콜린 살리실레이트, 마그네슘 살리실레이트, 디플루니살, 이부프로펜, 나프록센, 술린닥, 디플루니살, 살리실살리실산, 콜린 마그네슘 트리살리실레이트, 아세틸살리실산, 살살레이트, 나트륨 살리실레이트 및 이들의 조합물); 5-아미노살리실산(5-ASA) 및 5-ASA 함유 생성물 또는 화합물(예, 오랄 메살아민 (ASACOLR, Procter & Gamble Pharmaceuticals 제조; PENTASAR, Roberts Pharmaceuticals 제조), 메살아민 직장 관장제 또는 포옴 또는 좌약, 술파살라진, 발살라지드, 이프살라지드 및 올살라진(DEPENTUMR, Pharmacia Upjohn 제조) 및 이들의 혼합물.
스테로이드성 항염증제는 글루코코르티코이드를 포함한다. 스테로이드성 항염증제의 비제한적 특정 예는 하기 의약을 포함한다: 플루니솔리드, 트리암시놀린, 트리암시놀린 아세토니드, 베클로메타손 디프로프리오네이트, 베타메타손 디프로프리오네이트, 하이드로코르티손, 코르티손, 덱사메타손, 부데소니드, 프레드니손, 메틸 프레드니솔론, 프레드니솔론, 임의의 이들 화합물의 에스테르 및 이의 조합물. 항염증제의 기타 비제한적 예는 탈리도미드(Celgene 제조)를 포함한다.
레트로바이러스
레트로바이러스는 바이러스 지놈이 RNA인 RNA 바이러스이다. 숙주 세포가 레트로바이러스에 의해 감염될 때 지놈성 RNA는 DNA 중간물로 역전사되고 이 DNA는 감염 세포의 염색체 DNA 안으로 매우 효과적으로 삽입된다. 삽입된 DNA 중간물은 프로바이러스로 지칭된다. 레트로비리대(Retroviridae)가 엔벨로프화된 단일 가닥의 RNA 바이러스인 패밀리는 통상 소, 원숭이, 양 및 사람을 비롯한 포유류를 감염시킨다. 레트로바이러스는 그들의 증식에 감염 세포의 지놈으로 삽입될 RNA의 DNA 카피를 합성하는 것을 포함하기 때문에 RNA 바이러스 중 독특하다.
레트로비리대 패밀리는 3개의 그룹으로 구성되어 있다: 사람 거품 바이러스 (HFV)를 비롯한 스푸마바이러스(또는 거품 바이러스); 렌티바이러스 뿐만아니라 양의 비스나 바이러스; 및 온코바이러스(그러나 이 그룹내 모든 바이러스가 암유발성이지는 않음). "렌티바이러스" 용어는 역전사효소를 함유하는 바이러스 부류를 기술하기 위한 관례적인 의미로 사용된다. 렌티바이러스는 사람 면역부전 바이러스(HIV) 유형 1 및 유형 2(HIV-1 및 HIV-2) 및 원숭이 면역부전 바이러스 (SIV)를 포함하는 "면역부전 바이러스"를 포함한다. 효과적인 치료법이 없는 경우, 사람 면역부전 바이러스에 감염된 대부분의 개체는 후천성 면역 부전 증후군(AIDS)을 나타내며 면역계의 파괴로부터 야기된 기회 감염 및 악성종양 또는 바이러스의직접적인 효과에 의해 죽는다. 온코바이러스는, 바이러스 성숙 과정동안 전자 현미경으로 관찰되는 입자 입체형상에 기초하여 그룹 A, B, C 및 D로 더 나눈다. A-유형 입자는 감염 세포의 세포질에서 관찰되는 B- 및 D-유형 바이러스의 미성숙 입자를 나타낸다. 이 입자는 감염성이 없다. 세포질내 A-유형 입자의 엔벨로핑에 의해 세포질 막으로부터 성숙 비리온으로서 B-유형 입자가 출아한다. 막에서 이들은 ∼75mm의 환상 코어를 보유하며, 이로부터 긴 당단백질 스파이크가 돌출되어 나온다. 출아 이후, B-유형 입자는 비정상적으로 위치한 전자-밀집 코어를 함유한다. 원형 B-유형 바이러스는 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV)이다. 어떠한 세포질내 입자도 C-유형 바이러스에 감염된 세포에서 관찰될 수 없다. 대신, 성숙한 입자는 초승달모양의 'C'-형태 농축물을 통해 세포 표면으로부터 직접 출아되며, 이 농축물은 이어서 그 자체 상에 밀집해 있고 세포막에 의해 포위되어 있다. 엔벨로프 당단백질 스파이크는 균일한 전자-밀집 코어와 함께 관찰할 수 있다. 출아는 표면 세포막의 표면으로부터 또는 직접 세포내 액포안으로 발생할 수 있다. C-유형 바이러스는 가장 일반적으로 연구되어 있으며 다수의 조류 및 쥐 백혈병 바이러스를 포함한다. 소 백혈병 바이러스(BLV) 및 사람 T-세포 백혈병 바이러스 유형 I 및 II (HTLV-I/II)은 세포 표면으로부터 이들 출아의 입체형태 때문에 유사하게 C-유형 입자로 분류된다. 그러나, 이들은 또한 규칙적인 육각형 입체형태를 보유하고 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 같은 원형 C-유형 바이러스 보다 더 복잡한 지놈 구조를 갖는다. D-유형 입자는 감염 세포 세포질 내에서 고리 -유사 구조로서 나타나는 점에서 B-유형 입자와 유사하며, D-유형 입자는 세포표면으로부터 출아한다. 그러나,비리온은 짧은 표면 당단백질 스파이크를 합체한다. 전자-밀집 코어도 입자들 내에서 비정상적으로 위치한다. Mason Pfizer 원숭이 바이러스(MPMV)는 원형 D-유형 바이러스이다.
레트로바이러스는 이들이 그 유전 물질을 복제하는 방법에 의해 정의된다. 복제동안, RNA는 DNA로 전환된다. 세포 감염 이후, 2중 가닥 분자의 DNA는 바이러스 입자 내에 운반된 두 분자의 RNA로부터 역전사로 알려진 분자수준의 프로세스에 의해 생성된다. DNA 형태는 프로바이러스로서 숙주 세포 지놈에 공유결합으로 삽입되며, 프로바이러스로부터 바이러스 RNA가 세포성 및/또는 바이러스성 인자의 도움으로 발현된다. 발현된 바이러스성 RNA는 입자들로 팩키지되고 감염성 비리온으로 방출된다.
레트로바이러스 입자는 두개의 동일한 RNA 분자를 구성하고 있다. 각 지놈은 파지티브 센스인 단일가닥의 RNA 분자이며, 이 분자는 5 단부가 캡핑되어 있으며 3'꼬리가 폴리아데닐화되어 있다. 이배성의 바이러스 입자는 gag단백질, 바이러스성 효소(pol유전자산물) 및 숙주 tRNA 분자(gag 단백질의 '코어' 구조 안에 있음)로 복합구성된 2개의 RNA 가닥을 함유한다. 숙주 세포 막으로부터 유래하고 바이러스 엔벨로프 단백질을 함유하는 지질 이층구조체는 이 캡시드를 포위하고 보호한다. evn 단백질은 바이러스를 위해 세포성 수용체에 결합하고 이 입자는 통상 수용체-매개성 세포내이입 및/또는 막 융합에 의해 숙주 세포 안으로 들어간다.
바깥쪽 엔벨로프가 벗겨지면, 바이러스 RNA는 역전사에 의해 DNA로 복사된다. 이것은 pol 영역에 의해 암호화되어 있는 역전사효소에 의해 촉매되고, 숙주세포 tRNA를 사용하여 DNA 합성용 프라이머로서 비리온으로 팩키지된다. 이러한 경로에서 RNA 지놈은 DNA지놈으로 전환되다.
역전사에 의해 생성된 2중 가닥의 직쇄 DNA는 숙주 세포 지놈으로 삽입되기 이전에 환형이 될 수도 그러지 않을 수도 있다. 프로바이러스는 이제 양 단부에 LTR(long terminal repeat)로 알려진 2개의 동일한 반복체를 보유한다. 두개의 연결된 LTR 서열들 사이의 연결은 pol 산물(인테그라제 단백질)에 의해 인식되는 부위를 생성한다. 이 단백질은 삽입을 촉매하여 프로바이러스가 항상 LTR의 단부들로부터 숙주 DNA 2 염기쌍(bp)에 연결되도록한다. 세포성 서열 중복이 양 LTR의 단부에서 관찰되는데, 이는 전위가능한 유전 요소의 삽입 패턴을 연상시킨다. 삽입은 표적 세포 지놈 안에 거의 무작위로 일어나는 것으로 여겨진다.
삽입된 바이러스성 DNA의 전사, RNA 스플라이싱 및 번역은 숙주 세포 단백질에 의해 매개된다. 다양하게 스플라이스된 전사체가 생성된다. 사람의 경우 레트로바이러스 HIV-1/2 및 HTLV-I/II 바이러스성 단백질은 또한 유전자 발현을 조절하는데 사용된다. 세포성 인자 및 바이러스성 인자 사이의 상호작용은 바이러스 잠복 및 바이러스 유전자가 발현되는 일시적인 서열을 제어하는데 중요하다.
레트로바이러스는 수평 전파 및 수직 전파할 수 있다. 레트로바이러스의 효과적인 감염 전파에는 수용체가 표적 세포 상에 발현되는 것을 필요로 하며, 이 수용체는 바이러스성 엔벨로프 단백질을 특이적으로 인식하나 바이러스는 수용체-비의존성 비특이적 경로를 사용하여 낮는 효율로 입장할 수도 있다. 또한, 표적 세포 유형은 바이러스가 결합하여 관통(바이러스의 핵산이 세포에 입장하는 것)한 이후복제 사이클 중 모든 단계를 지원할 수 있어야 한다. 수직 전파는 바이러스 지놈이 숙주의 생식세포계에 삽입된 경우 발생한다. 이어서, 프로바이러스는 마치 세포성 유전자인양 한 세대로부터 다음 세대로 전달될 것이다. 따라서, 자주 잠복하는 내인성 프로바이러스가 수립되고, 숙주가 적절한 작용제에 노출될 때 활성화될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 항바이러스제는 바이러스 생활환 중 임의의 단계를 표적으로 할 수 있다.
온코바이러스(RNA 종양 바이러스로 자주 지칭됨)는 2 그룹의 병원체, 즉 급성 형질전환 레트로바이러스와 저속 형질전환 레트로바이러스로 하위분류된다.
급성 형질전환 레트로바이러스는 배양된 세포를 형질전환시킬 수 있으며 민감한 동물에서 신속하게 질환을 야기할 수 있다. 이들 바이러스는 보통 바이러스성 지놈 내에 암유전자(v-onc)를 운반하며, 암유전자는 이들의 종양형성에 직접적인 책임이 있으며 각 유형의 바이러스에서 상이하다. 바이러스성 암유전자는 아마도 바이러스성 입자 내 세포성 RNA를 함유한 결과, 바이러스가 획득한 세포성 유전자로부터 유래되어 왔다. 역전사 동안 바이러스 RNA와 세포성 RNA의 차후 재조합에 의해 세포성 서열을 바이러스 지놈으로 삽입하고 이러한 새로운 단위체를 숙주 세포 DNA에 배달한다. 형질도입된 유전자가 세포 성장 및 분화를 제어하는데 중추적인 역할을 한다면, 바이러스 지놈으로의 삽입 동안 겪는 암호화 서열 및/또는 발현 제어의 변화는 그 유전자를 종양원성으로 만든다. 이러한 세포성 원형-암유전자(c-onc)는 바이러스에 의해 결정되는 새로운 전사 제어(양적으로 그리고 일시적으로 모두) 하에 놓임으로써 및/또는 암호화 서열에 결정적인 돌연변이를 받음으로써 종양원성이 될 수 있다. 그러나, 완전한 세포성 형질전환은 보통 표적 세포 내 다른 유전적 그리고 후성설적인 변화와 함께 v-onc의 발현을 필요로 한다.
저속 형질전환 레트로바이러스는 통상 '전통적인' 암유전자를 함유하지 않는다. 형질전환의 작용기작은 오히려 세포성 원형-암유전자의 암호화 영역 안 또는 그 근처에 프로바이러스의 삽입(삽입 돌연변이형성으로 지칭됨)이 관여되는 것으로 여겨진다. 바이러스성 LTR 내 강력한 프로모터 및 인헨서 서열은 원형-암유전자로부터 수천 염기쌍까지 떨어진 위치에서 전사 효과를 발휘할 수 있다. 세포성 유전자 발현의 정상적인 조절이 파괴되고, 과발현 또는 부적절한 시기의 발현에 의해 형질전환될 수 있다.
HTLV-I는 통상 성인 T-세포 백혈병(ATL)과 관련이 있는 저속-형질전환 바이러스이나, 아마도 바이러스에 의해 암호화된 조절성 단백질, 특히 p40tax가 관여하는 상이한 경로에 의해 T-세포 형질전환을 촉진할지도 모른다. 이 단백질은 세포성 프로토-암유전자의 발현을 활성화(transactivate)한다. HIV-1 및 2는 각종 유형의 악성 종양(예, 키포시 육종)의 직접 및 간접적인 촉진에 관여하였으며, 일반 개체군에서보다 AIDS 환자에서 훨씬 더 자주 존재한다. 그러나, 악성 종양의 형질전환에서 HIV의 직접적인 역할은 회의적이다. 왜냐하면 다른 감염 또는 처리의 결과 면역억제된 많은 환자들(예, 이식 수용체) 또한 증가되는 속도로 종양을 나타내기 때문이다.
D-유형 바이러스는 후성설적으로 악성종양과 관련이 없으나, MPMV는 처음에 붉은털 원숭이 경우 유선 종양과 관련이 있었다. D-유형 바이러스는 알려지지 않은작용기작에 의해 유인원 영장목에서 면역 억제를 야기한다. 또한, 면역억제는 렌티바이러스(예, HIV 및 SIV) 및 고양이과 백혈병 바이러스(FeLV) 변이체 균주에 의한 감염의 특징이다. HIV 및 FeLV 대량의 비삽입 프로바이러스성 DNA의 n 감염이 관찰되어 왔으며 이것은 병발생과 관련이 있을 수 있다.
HIV-1/2를 포함한 렌티바이러스와 양의 비스나 바이러스는 면역억제 및 신경 장애를 야기하는 저속 진행성 질환과 관련이 있다. HIV는 후천성 면역부전 질환 증후군(AIDS)에 대한 광범위하게 인지된 원인성 작용제이다.
항염증제(항체, 펩티드, 펩티드모방체, 화학 조성물 등)를 단독 또는 항바이러스제(항체, 펩티드, 바이러스 단백질/효소 억제제 등)와 병용하여 사용하는 것을 포함하는 본 발명의 약학 조성물 및 방법은 모두 면역부전 바이러스(예, HIV) 관련 장애에 걸리거나 걸릴 위험성이 있는 환자 또는 HIV 관련 장애를 전파하거나 전파할 위험성이 있는 환자를 치료하는데 유용하다. AIDS 및 ARC는 이들 장애의 특정 예이다. HIV-관련 장애는 주로 "위험에 직면한" 그룹에서 인식되어 왔으며, 이 그룹에는 동성애 남자, 정맥내 약물 사용자, 혈액 또는 혈액 산물의 수용자, 및 중앙 아프리가 및 카리비안에서 온 특정 집단을 포함한다. 이 증후군은 또한 "위험에 직면한" 모든 그룹 내 개인들의 이성간 성교 파트너 및 감염된 엄마의 유아에서도 인지된다.
레트로바이러스는 광범위한 질환과 관련이 있어 왔으며, 그 예로는 빈혈, 신경 장애, 면역 억제 및 악성종양이 있다. 예컨대, HTLV-I는 다발성 경화증과 다소 비슷한 상태인 열대 경련성 마비와 관련이 있다.
항바이러스제
본 명세서에서 "항바이러스제"는 바이러스 생활환 중 임의의 단계에서 바이러스 감염 또는 생산을 억제, 감소, 방해 또는 조절할 수 있는 약제를 의미한다. 예를들면, 바이러스가 세포 표면 수용체를 통해 또는 세포 표면 수용체와 무관하게 세포에 융합되는 것과 같은 바이러스 감염의 초기 단계; 이어지는 바이러스 핵산의 세포 내로의 입장("입장 억제제"); 바이러스 핵산의 역전사("역전사 억제제"); 역전사된 바이러스 핵산의 세포 지놈 내로의 삽입("인테그라제 억제제"); 프로바이러스 핵산 전사 또는 복제; 성숙한 바이러스 단백질의 번역 또는 형성; 감염성 바이러스 입자의 형성/조립; 성숙 비리온의 세포로부터의 감소된 출아 또는 방출; 및 바이러스 융합 또는 감염, 복제, 성숙화 또는 세포로부터의 출아 또는 방출과 관련된 효소의 감소된 활성 또는 함량을 억제, 감소, 방해하는 것이 있다.
항바이러스제의 예로는 폴리펩티드 또는 기능적 모방체를 포함하며, 그 예로는 바이러스가 결합하는 가용성 세포 표면 수용체 펩티드, 세포 표면 수용체의 리간드, 세포 표면 수용체 또는 바이러스 입자에 결합하여 바이러스와 세포 상 존재하는 세포 표면 수용체 사이의 결합을 방해하는 항체 또는 항체 단편이 있다. 특히 항바이러스제 표적화로 흥미있는 바이러스성 단백질은 엔벨로프 폴리펩티드, gp120 또는 gp41을 포함한다. 특히 항바이러스제 표적화로 흥미있는 세포 표면 수용체는 X4 및 R5 수용체를 포함한다.
본 명세서에서, "기능적 모방체"는 화학적으로 또는 구조적으로 변형된 분자를 의미하나, 변형되지 않은 분자의 하나이상의 활성(예, 기능) 또는 보다 더욱 증가된 활성을 갖는다. 따라서, 항바이러스제의 기능적 모방체의 경우, 모방체는 항바이러스제의 하나이상의 항바이러성 활성을 유지한다. 특정 유형의 기능적 모방체는 모방체가 모방하고자 하는 펩티드의 3차원 구조를 모방하는 화합물인 폴리펩티드 또는 펩티드 모방체("펩티드 모방체")이다. 펩티드 모방체 설계는 3차원 컴퓨터 모델링 기법을 통해 보조를 받을 수 있으며, 치료 용도를 강화하는 부가적인 특성을 갖도록 고안될 수 있다. 예를들면, 안티센스 분자는 비천연 뉴클레오티드와 함께 고안될 수 있거나 화학적으로 변형하여 생체내 안티센스의 뉴클레아제 분해를 억제할 수 있다.
항바이러스제의 부가적인 예는 바이러스성 생활환에 중요한 세포성 또는 바이러스성 효소(예, 바이러스성 단백분해효소, 역전사효소 또는 인테그라제)를 억제하는 경우이다. 항바이러스제의 특정예는 예컨데, 바이러스 융합 억제제, 예, T20 및 T20 유사체(Trimeris, Inc.); 입장 억제제; 인테그라제 억제제; 단백분해효소 억제제(예, 사퀴나비르(saquinavir), 리토나비르(ritonavir), 인디나비르 (indinavir), 넬피나비르(nelfinavir), 암프레나비르(amprenavir)); 뉴클레오시드 역전사 효소 억제제(예, 지도부딘(zidovudine, AZT), 스타부딘(stavudine, d4T), 라르니부딘(larnivudine, 3TC), 디다노신(didanosine, DDI), 잘시타빈 (zalcitabine, ddC), 아바카비르(abacavir)); 비-뉴클레오시드 역전사 효소 억제제 (예, 네비라핀(nevirapine), 델라비르딘(delavirdine), 에파비렌즈(efavirenz)); 감염성 바이러스로의 바이러스 성숙(예, "Zn 핑거 주입기", 적당한 바이러스성 α핵 캡시드 단백질 조립을 억제하여 감염성 바이러스 입자의 형성을 방해하는 억제제 부류); 및 이들의 혼합물을 포함한다. 세포로부터의 바이러스 출아 또는 방출은 바이러스 성숙화 또는 바이러스성 단백질 성숙화를 억제하는 작용제에 의해 억제될 수 있다.
점막 염증의 제어
다수의 HIV-감염 환자에 높은 활성의 항-레트로바이러스성 치료법(HAART)을 사용하면, 그 결과 HIV-감염 환자의 예상 수명이 연장된다. 불행하게도, 검출할 수 없는 수준으로의 혈장 적재량 감소에도 불구하고, 림프기관에서의 계속적인 HIV 복제가 다수의 연구에서 확인되었다. 연구에 의하면, 검출가능하지 않을 정도의 혈장 바이러스 적재량을 갖는 환자 중 88%는 위장 점막 내 정량화가능한 HIV 핵산을 가지고 있음이 밝혀졌다.
따라서, HAART는 혈장 내 바이러스 적재량을 검출할 수 없는 수준으로 감소시킬 수 있으나, 대부분의 환자는 치료법이 중지될 때 다시 증가된 혈장 바이러스 혈증을 겪을 수 있으며, 그 원인은 아마도 혈류 밖에 존재하는 바이러스 저장고 때문인 것 같다. 이 바이러스 저장고는 대부분의 신체 림프구(98%)가 거주하는 림프 조직에서 발견되었다. 위장 점막은 대부분의 신체 림프구(40-65%)를 함유하기 때문에 가장 큰 HIV 저장고를 대표하는 것처럼 보이며, 따라서 항-HIV 치료법의 주요 표적이다. HIV 질환에서 점막의 염증 상태가 증가된 경우, 본 발명의 초점 중 하나는 점막 염증을 감소시키는 방법을 필요로 한다. 점막 구획 내 프로-염증성 사이토킨 및 케모킨의 수준을 감소시키는 치료법은 복제 강화 및 아마도 바이러스의 내성 돌연변이유발의 전개를 방해한다. 게다가, 감소된 가용성 염증은 또한 HIV를 감염시키기 위해 새로운 CD4+세포가 점막으로 모집되는 것을 감소시켜 신체 중 림프구 풀 사이에서 HIV의 방계 확산을 방해 또는 억제한다.
효과적인 항염증제의 확인
당업계에 알려진 다수의 기법을 사용하여 점막 세포, 조직 및 피험체에 레트로바이러스 감염의 활성화 및 진행을 억제, 치료 또는 감소시키는 능력에 대한 항염증제의 시험관내 및 생체내 효과를 평가할 수 있다. 이러한 기법은 광범위한 항염증제 및 점막 세포 감염에 응용할 수 있다. 예를들면, 하기 기술된 기법을 사용하여 당업자는 점막 조직 내 HIV 감염 및 피험체 내 점막 조직 상 항염증제의 효과를 평가할 수 있다. 단순한 예시로서, 탈리도미드 및 5-ASA 함유 화합물 또는 산물의 효과를 평가하는 방법이 하기에 요약되어 있으나, 이러한 예는 본 발명의 범위를 예시하고자 할 뿐 제한하는 것은 아니다. 또한, 메살아민(Asacol)을 사용하여 세포 내 HIV 복제를 억제하는 것을 보여주는 데이타가 기술되어 있다.
탈리도미드
탈리도미드는 강력한 항염증성 의약이다. 면역 조절 효과는 주로 TNFα생산을 하향조절하는 능력에 달려 있으며, 염증성 캐스캐이드 중 다수의 부위에 영향을 주는 것으로 보인다. 다른 추정의 항염증 작용기작은 T 세포 증식의 약화, 림프구 활성화 수준의 하향조절, 림프구 주화성의 억제 및 프로-염증성 사이토킨 수준의 변경에서의 역할을 포함한다. 탈리도미드는 전신적으로 그리고 위장 점막 내에서 HIV 복제를 감소시킴으로써 HIV 치료법의 유익한 성분으로 입증될 수 있다. 이점에 있어서, 탈리도미드는 검출할 수 없는 혈장 바이러스 적재량을 갖는 환자에게서HAART에 대한 첨가물로 사용될 수 있다.
탈리도미드 치료법은 치료된 피험체 내 HIV RNA 적재량의 조직 수준이 더 낮아지는 것으로 입증되는 바와 같이 HIV 복제에 유리한 림프 환경에서 복제할 수 있는 HIV 능력을 감소시키는 결과를 나타낸다.
HIV에 의한 세포 감염성에 대한 탈리도미드의 효과에 대한 시험관내 연구를 수행한다. 활성 크론 질환(결장염)이 온화한 환자부터 심각한 환자에 이르기까지 탈리도미드 치료를 시작한 환자를 확인하고 모집하여 감염성 효과와 비특이 염증 반응을 구별하는 것을 도와줄 것이다. 이들 피험체 유래의 점막 및 혈액 세포를 사용하여 감염성을 감소시키는 탈리도미드의 시험관내 능력을 평가할 것이다.
염증의 상태는 HIV 감염의 존재하에 증강되고, 프로-염증성 사이토킨 및 케모킨의 수준이 상승되는 것을 특징으로 한다. 이들 가용성 매개인자는 케모킨-보유 CD4+ 세포의 점막으로의 화학주성에 결정적인 역할을 한다. HIV에 대한 이러한 표적은 가용성 매개인자에 의해 점막 환경에서 더 활성화되어 이로인해 HIV 복제를 강화시키는 것이다. 점막의 염증 상태를 더 정의하기 위해, 다수의 프로-염증성 사이토킨(TNFα, IL-1, IL-6, γ-IFN) 및 케모킨(MIP 1a, MIP 1b, RANTES)을 측정할 것이다.
음성 혈장 바이러스 적재량을 갖으나 양성 점막 바이러스 적재량을 갖는 HIV 혈청양성 환자를 모집할 것이다. 이들 피험체는 안정된 질환을 가지며, CD4 세포가 250 이상이고 심한 점막 염증 또는 위장 증후가 없을 것이다. 피험체는 기본선 내시경검사 평가될 것이다. 표준화된 수준(30㎝)으로부터의 내시경 생검을 이들 환자로부터 얻을 것이다. 점막 생검을 사용하여 점막 단핵세포(MMC) 분리, RNase 보호 분석(RPA), HIV RNA 및 프로바이러스성 DNA용 PCR 뿐만아니라 정량적 이미지 분석(QIA)를 수행할 것이다. 유동 세포측정법용 MMC는 CD45, CD4, CD8, HLA-DR, CD45RO, CXCR4, CCR5, LFA-1 및 ICAM-1에 대해 염색될 것이다.
유동 세포측정법은 점막에서 분리한 MMC 상에서 그리고 혈액에서 분리한 PBMC 상에서 수행하여 기본선에서 이들 구획 내 림프구 집단의 조성을 결정한다. 림프구의 활성화 상태 및 기억 상태를 유의하면서 케모킨 수용체의 발현 및 부착 마커에 대해서도 유의할 것이다. 이들 기본선 파라미터는 탈리도미드로 치료한 후에 다시 분석될 것이다.
β-케모킨 및 사이토킨은 다중-프로브 RPA(Riboquant, Pharmingen)를 사용하여 정량화한다. 이러한 특이적인 민감성 분석을 통해 냉동 생검 조직편으로부터 추출한 RNA에서 케모킨 및 사이토킨 mRNA를 정량할 수 있다. 개별적인 mRNA 종의 양은 하우스키핑 유전자인 GADPH와 비교할 것이다. 만일 케모킨과 사이토킨이 RPA로 정량화할 수 없다면, 이들은 자극된 배양 MMC의 상청액에서 ELISA에 의해 측정될 수 있다.
QIA는 파라핀에 박혀있는 조직의 면역조직화학적 염색법을 사용하여 생검 조직편 내 CD4, CD8, CD38, HLA-DR, CD45RO CXCR4 및 CCR를 보유하는 림프구의 수 및 해부조직상 위치를 정확하게 측정한다. 게다가, 생검 조직편 내 세포가 사이토킨 및 β-케모킨을 생산하는지를 결정할 수 있으며 이들 인자들의 조직 농도를 측정할 수 있다. HIV 혈청양성 생검 조직편에서, p24의 조직 수준도 측정할 수 있다. 컴퓨터화된 이미지 분석기 및 특정화된 소프트웨어는 염색된 세포에 대한 총 조직 면적, 케모킨, 사이토킨 및 p24 수준을 평가하는데 유용하다.
결과는 HIV에 대한 점막 반응이 증가된 조직 케모킨 및 사이토킨 수준에 의해 특징지워진다는 것을 확인시킬 것이다. 이것은 차례로 점막 염증성 침윤물의 온화한 증가를 그 결과로 산출할 것이다. 케모킨 및 사이토킨을 조사함으로써, 단순히 세포성 지표를 검사함으로써 간과되는 "가용성" 염증을 확인할 것이다.
강력한 면역조절인자인 탈리도미드에 의한 치료법은 HIV 감염된 환자에서 점막 염증을 감소시킬 것이다. 이것은 마치 HIV가 여기 최대의 림프기관에서 복제하는 능력을 감소시키는 것에 의해 명백해질 것이다. 점막 내 복제 감소 및 탈리도미드에 의한 전신적인 효과는 항바이러스 내성 HIV 변이체의 출현을 방해하고 장기간의 HAART 효능을 향상시킬 것이다. HAART 치료법과 공동으로, 탈리도미드는 또한 이 바이러스에 감염된 세계 수백만명의 환자의 예상 수명을 향상시킬 수 있다.
검출할 수 없는 혈장 HIV를 가지면서 기본선 생검을 겪은 피험체는 16주 동안 일일 200g의 투여량으로 경구적 탈리도미드 치료법을 받는다. 치료하고 4주 및 16주 후에, 피험체는 반복 내시경 생검 및 반복 정맥절개술을 받아 PBMC를 획득할 것이며 전술한 동일한 생분자 실험을 수행한다. 게다가 각 시점에서 생검은 환자의 점막 바이러스 적재량의 분석에 사용될 것이고, 각 시점에서 정맥절개술에 의해 수득된 혈장은 로슈 초민감성 분석법(검출수준=HIV RNA 40 카피)에 의해 분석될 것이다. RT-PCR 및 DNA-RCR을 수행하여 기본선과 치료후 점막 및 혈장 바이러스 적재량 사이의 변화를 분석한다. 통계학적 평가의 경우, 효율의 단일 지표는 혈장 바이러스 적재량의 동반 증가 없이 점막 HIV 바이러스 적재량의 감소일 것이다.
게다가, 결장염을 갖는 크론 질환 환자로부터 분리한 MMC 및 PBMC의 M-자극반응성 그리고 T-자극반응성 HIV에 대한 시험관내 민감성에 대한 탈리도미드 치료법의 효과를 탈리도미드로 치료하기 이전 및 이후에 검사한다. 이러한 연구를 통해 다른 염증성 점막 질환으로부터 얻은 림프구를 감염시키는 HIV의 시험관내 능력에 대한 탈리도미드의 효과를 평가할 수 있다. 이러한 데이타는 케모킨 발현과 관련된 유동 세포측정법의 결과물 및 활성화 수준을 점막 바이러스 적재량의 변화와 더 잘 연결시킬 수 있다. 감염성 분석의 경우, 기본선 및 탈리도미드 치료 이후 4주 및 16주에서 수득한 MMC 및 PBMC를 공지 역가의 M-자극반응성 HIVsx와 T-자극반응성 HIVNL4-3과 배양한다. ELISA를 위해 상청액을 수집하고 0시간, 36시간, 3일 및 7일에서 p24를 정량한다. 치료이전 및 이후 IBD 환자 유래의 MMC의 민감도 변화를 분석하기 위해 쌍을 이룬 T 시험을 수행한다.
탈리도미드로 HIV환자를 치료하면 위장 점막의 염증환경을 변화시켜 결국 가용성 염증 매개인자(예, 프로-염증성 사이토킨, 케모킨)를 감소시킬 것이며, 차례로 HIV이 감염할 수 있는 면역 세포의 모집을 감소시킬 것이다. 탈리도미드 치료법에 의한 염증 감소는 시험관내 감염 실험에서 PBMC 및 MMC의 p24 생산에 영향을 줄 것이다. 탈리도미드의 주요한 잇점은 점막 내 감소된 가용성 염증 매개인자로 인해 바이러스 표적으로서 부가적인 공동-수용체-보유 CD4+ T세포 모집의 감소에 의할 것이나, 부착 분자의 발현 감소 또한 역할할 수 있다.
5-ASA 화합물 또는 산물
메살아민(예, 아사콜)은 경구적으로 또는 국소적인 치료법에 유용한 관장제, 포옴, 또는 좌약에 의해 투여되는 점막 항염증성 의약이다. 이것은 위장 점막 내 HIV 복제를 감소시킴으로써 HIV 치료법의 유익한 성분일 것이다. 메살아민으로 점막 염증을 최소화시키고자 하는 노력은 점막 구획 내 프로-염증성 사이토킨 및 케모틴의 농도를 감소시키고, 이에의해 HIV의 부가적인 세포성 표적의 모집 및 활성화를 감소시킴으로써 치료학적으로 유용할 것이다. 복제하는 HIV의 농도 및 활성을 감소시킴으로써, 또한 통상 사용되는 항바이러스 의약에 대한 HIV 내성 발현을 낮출 수 있다. 따라서, 메살아민은 HIV를 갖는 피험체 내 증식/확산을 치료, 억제할 수 있는 강력하고 국부적으로 활성인 첨가제일 수 있다. 또한, 감염 위험성이 있는 피험체의 HIV 감염을 억제 또는 예방할 수 있고 HIV 감염 피험체로부터 (비감염 또는 감염된) 다른 피험체로의 전파를 억제 또는 예방할 수 있다.
임상 내시경 조직학적 검사에 기초하여 공지의 온화하게 활성이 있는 감염에 걸렸으며 4주동안 메살아민 또는 기타 5-ASA 의약을 수용하지 않았으며 3개월간 면역조절 의약 또는 스테로이드를 (경구적으로 또는 국소적으로) 수용하지 아니한 피험체를 연구할 것이다. 비-결장염 대조군 환자는 결장염 환자와 연령을 일치시킬 것이며 이들의 결장을 탓할 수 있는 증후군이 없으며 염증에 대한 내시경 검사에 의한 증거도 없을 것이다. 결장염 피험체는 치료 1주일전 및 치료 개시일에 수행된 2개의 기본선 내시경 검사 평가될 것이다. 비-결장염 대조군 환자는 또한 1주일 격리된 두개의 내시경 검사를 받을 것이다. 궤양성 결장염 및 비-결장염 대조군으로부터 나온 점막 샘플의 가용성 및 세포성 염증 상태를 비교할 것이다.
표준화된 수준(30㎝)으로부터 15개의 내시경 생검 조직편(3.3㎜ OD)를 각 환자로부터 수득할 것이다. 생검 중 12개는 MMC 분리용으로, 1개는 RPA용으로 2개는 QIA용으로 사용할 것이다. 유동 세포측정법을 위해 MMC는 CD45, CD4, CD8, CD38, HLA-DR, CD45RO, CCR5 및 CXCR4를 염색할 것이다.
β-케모킨 및 사이토킨은 IL-2 함유 배지 내 MMC 및 PBMC의 배양 후 수득한 상청액에서 ELISA에 의해 정량될 것이다. 6개의 웰 플래이트에 있는 1㎖ 배지 내 백만개 세포를 사용할 것이다. 배양 18시간 후, 200㎖의 배지를 취하여 RANTES, MIP-1a, MIP-1b, IL-1b, IL-12, TNF-α 및 IFN-γ를 측정할 것이다. 필요한 경우, 핵산을 액체 질소 냉동 생검 조직편으로부터 추출하고, 다중-프로브 RPA (Riboquant, Pharmingen)를 사용하여 사이토킨 및 케모킨 종에 대한 mRNA의 수준을 측정할 것이다. 개별적인 mRNA 종의 정량은 하우스키핑 유전자인 GADPH와 비교할 것이다.
QIA는 새로운 냉동 또는 파라핀-침지된 조직의 면역조직화학적 염색법을 사용하여 생검 조직편 내 CD4, CD8, CD38, HLA-DR, CD45RO 및 CCR5를 보유하는 림프구의 수 및 해부학적 위치를 정확하게 측정한다. 게다가, 이것을 통해 생검 조직편 중 어느 세포가 시토킨 및 β-케모킨을 생산하는지, 이들 인자의 조직 농도 및 추론상 이웃 세포의 케모킨 수용체 발현에 대한 이들 리간들의 효과를 결정할 수 있다. 컴퓨터화된 이미지 분석 및 특정화된 소프트웨어가 염색된 세포에 대한 전체 조직 면적, 케모킨 및 사이토킨을 평가하는데 유용하다(%면적으로 표현됨).
온화하게 심각한 궤양성 결장염은 케모킨 및 사이토킨 "가용성 염증"의 수준상승 뿐만아니라 공지된 세포성 염증의 증가가 특징이다. 궤양성 결장염 내 점막은 비-결장염 대조군보다 훨씬 더 큰 가용성 및 세포성 염증이 특징일 것이다. 가용성 및 세포성 염증 매개인자를 감소시키는 메살아민의 능력을 검사한다.
메살아민에 의한 치료법은 그 결과 사이토킨 및 케모킨 수준을 감소시키며, CCR5 보유 CD4+세포 모집 및 점막 림프구 내 HIV의 방계확산을 감소화할 것이다; 메살아민-유도에 의한 β-케모킨 분비의 감소는 HIV 확산에 유리한 바이러스 공동 수용체를 차단할 수 있는 리간의의 양을 감소시킬 수 있다; 메살아민은 T 세포 모집을 억제하도록 프로-염증성 사이토킨을 우선적으로 억제하나 케모킨 수용체 차단에를 심각하게 손상시키지 않는다. 이것은 HIV 감염 환자를 치료할 때 최선의 결과처럼 보인다. 가능한 결과는 온화하게 활성이 있는 염증성 장 질환(IBD)에 걸린 환자를 메살아민으로 16주간 치료하고, 점막 림프구 서브세트, 케모킨 수용체의 발현 및 점막 사이토킨과 β-케모킨 수준의 변화를 검사함으로써 검토된다.
온화하게 활성이 있는 궤양성 결장염에 걸렸으며 2번의 기본선 생검을 받은 피험체를 16주간 일일 4.8g 투여량의 메살아민으로 치료한다. 4주 치료 받은 후 그리고 다시 16주 치료가 완성된 후, 이들은 반복 내시경 생검을 수행하였으며 치료후 표본 상에서 실험을 계속한다. 이들 연구는 림프구 서브세트 및 케모킨 수용체 발현을 정량화하는 유동 세포측정법 수행을 포함하며, β-케모킨 mRNA를 정량하기 위해 RPA를, 원위치 분석용으로 QIA를 수행한다. 환자는 계속해서 메살아민을 이용하거나 임상적으로 의사에 의해 지시될 것이다.
메살아민으로 IBD환자를 치료하면 위장 점막의 염증성 환경을 변경하여 그결과 가용성 및 세포성 염증 매개인자를 감소시킬 것이다.
활성화된 CD4+, 케모킨 수용체 보유 세포의 HIV 감염은 그 결과 HIV 복제를 증가시킨다. 위장 점막을 특징지워주는 염증 환경은 왕성한 HIV 복제를 유도할 것처럼 보인다. 메살아민에 의한 치료법은, 염증을 감소시킴으로써 염증이 일어난 위장 점막 내 HIV의 복제 능력을 하향조절할 것이다.
점막 단핵세포 내 HIV 복제에 대한 메살아민 치료법의 효과를 검사하기 위해, 치료되지 않은 궤양성 결장염 환자 유래의 MMC 및 PBMC의 M-자극반응성 및 T-자극반응성 HIV 감염에 대한 민감성을 등급화된 투여량의 메살아민의 존재 및 부재하의 배양액에서 검사한다. 유사한 감염성 실험을 메살아민 치료를 4주 및 6주 받은 후 환자의 세포에서 수행할 것이다.
감염성 분석의 경우, 기본선 시점에서 수득된 MMC 및 PBMC를 알려진 점막 조직 농도에 기초하여 등급화된 생물학적 농도의 메살아민의 존재 및 부재하에 공지 역가의 M-자극반응성 HIVSX 및 T-자극반응성 HIVNL4-3와 함께 배양할 것이다. HIV 복제는 배양 상청액 내 HIV 단백질 p24의 생산을 측정함으로써 이들 샘플 각각에서 비교될 것이다. 치료 4주 및 16주후 피험체로부터 나온 MMC 및 PBMC를 메살아민을 첨가하지 않은채 M-자극반응성 및 T-자극반응성 HIV와 배양할 것이다. 이들 샘플로부터 수집한 p24 결과물은 기본선 샘플과 비교할 것이다. 이들 실험 각각에서, 상청액을 ELISA용으로 수집하여 0시간, 36시간, 3일 및 7일에서 p24를 정량한다. 쌍을 이룬 T 시험을 사용하여 이들 세포의 HIV에 대한 민감성 변화를 분석할 것이다.
본 발명자가 이미 보여준 바와 같이 활성화된 CCR5+ 표현형 때문에 MMC는PBMC보다 HIV에 더 민감할 것이다. IBD 내 증가된 점막 염증은 MMC의 HIV 감염을 더욱 용이하게 할 것이다. 메살아민 치료법에 의한 염증의 감소는 PBMC보다 MMC에서 더 많이 p24 생산에 영향을 줄 것이다.
HIV 내 점막 환경은 증가된 농도의 프로-염증성 사이토킨 및 케모킨에 의해 입증된 바와 같이 염증성이다. 메살아민은 이들 가용성 매개인자를 상당히 감소시킬 것이며, 이렇게 함으로써 점막으로의 이동 및, 점막으로의 HIV 감염을 위한 또다른 세포성 표적의 활성을 감소시킬 것이다.
HIV-1이 사용할 수 있는 다중의 공동-수용체들 중, CCR5 및 CXCR4는 초기 감염 동안 우세한 CCR5-자극반응성 바이러스와 함께 주요한 역할을 하며, CXCR4-자극반응성 바이러스는 진행된 질환에서 더욱 만연해지며, CCR5의 이형접합성은 더 긴 생존에 기여한다. 점막 CD4+T 림프구 상 CCR5의 특이한 발현은 M-자극반응성 바이러스의 우선적인 전파에 기여할 수 있다. 점막 상 공동 수용체 대 순환성 림프구의 발현을 비교하기 위해, 점막 단핵세포(MMC)를 직장 S 상결장 내시경 생검 조직편으로부터 분리하고, 자극되지 않은 정맥절개술 샘플을 HIV-1 혈청음성의 건강한 개체로부터 수득하였다. 유동 세포측정법으로 CD4+ 세포 상 공동 수용체의 발현을 정량하였다.
공개된 연구와 일치하여, 혈액 내 모든 CD4+ 림프구 중 중간값인 23%(사분위수 내[i.q.] 범위는 18-30%임)가 CCR5를 발현하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 장 내 CD4+ 림프구 중 중간값인 71%(i.q.범위 50-87%)가 CCR5를 발현했으며, 이는 혈액내의 경우보다 2.8배 큰 퍼센트이다(P=0.03). 점막 CD4+ 림프구는 또한 CCR5-발현 CD4+ 림프구 혈액 대응물보다 세포당 훨씬 더 많은 CCR5 수용체를 발현하였으며, 이는 구획 차이를 확장한다. 도 2에 도시된 바와 같이, CD4+ 점막 림프구 당 CCR5 수용체 수의 중간값은 6,946개의 분자이고(i.q. 범위 6,306-10,416), 이에 비해 CD4+ 혈액 림프구 당 CCR5 수용체는 대략 3,841개이다(i.q. 범위 3,259-4,441). 따라서, 전자는 2.2배 증가를 보여준다(P=.03). 취합하면, 이는 혈액에 비해 장에서 CD4+ 림프구 상으로의 바이러스 접근에 잠재적으로 유용한 총 발현된 CCR5 수용체가 6.2배 증가한 것으로 해석된다. 이러한 발견에 의해 점막 CD4+ 림프구가 혈액 대응물보다 M-자극반응성 HIV-1에 의한 감염 취약성이 훨씬 더 클 수 있다는 것을 제시한다.
혈액 및 장 모두에서 CD4+ 림프구 상 CCR5 발현의 거의 모두(97%)는 기억 CD45RO+ 표현형의 세포상에서 일어난다. 공개된 연구와 일치하여, 본 발명자는 혈액(중간값 46%; i.q. 범위 38-53%)에 비해 장 CD4+ 림프구(중간값 95%; i.q.범위 90-97%)에서 CD45RO+ 기억 세포 집단이 증가한 것을 발견하였다.
대부분의 말초 T 세포 CXCR4가 기억 CD4+RO+T세포가 아닌 경험없는 CD45RO 상에서 발현한다고 이전에 알려졌다. 그러므로, 초기 예상한 바와 같이, 높은 수준의 CCR5 발현 및 MMC의 우세한 CD45RO+ 표현형은 적어도 항문-수용 성교 동안 M-자극반응성 바이러스의 선호적인 전파를 설명할 수 있는 해부학상 그리고 세포성 작용기작을 제공할 수 있다. 그러나, 또한 도 3에 도시된 바와 같이, 혈액(중간값 83%; i.q. 범위 75-87%) 및 장(중간값 64%; i.q. 범위 59-79%) 모두에서 CXCR4 발현 세포의 수준이 높다고 밝혀졌다. 항-CXCR4 항체에 의한 염색법 중 상대적인 형광 강도 또는 퍼센트(P=.03)에 있어서 두 구획 간의 상당한 차이가 없었다. 3명의 공여체의 경우, 충분한 세포 수율을 얻어 기억 CD4+ 림프구 상에서의 CXCR4 발현을 분석하였고 혈액 기억 세포(중간값 69%;i.q.범위 57-73%) 및 장 기억 세포(중간값 62%; i.q. 범위 57-65%) 모두 중 실질적인 분획이 검출가능한 수준의 CXCR4를 발현하였다는 것을 확인하였다. 혈액 기억(CD45RO+)CD4+ 세포 및 경험이 없는(CD45RO-)CD4+세포 상에서의 CXCR4의 발현에 대한 상대적인 형광 강도를 비교함으로써, 평가에 의해 기억 CD4+ 세포 상의 CXCR4의 발현 수준이 경험이 없는 CD4+세포 상의 수준보다 오직 다소 낮은 것을 보여준다. 본 발명자의 이러한 결과는 기억 CD45RO+ 세포가 감염하기게 가장 적합하도록 CCR5 뿐만아니라 CXCR4를 발현할 수 있다는 것을 제시한다.
사람의 경우 HIV-1 감염을 위한 공동 수용체의 발현 수준이 높다는 본 발명자에 의한 발견은 직장 및 결장 조직 섹션 상에서 낮은 수의 CXCR4-발현 세포가 발견된 마카스에 대한 연구와 대조적이다. CCR5-보유 T세포 및 대식세포는 마카스 연구에서 더욱 보기 드물다. 이러한 차이들은 종에 의한 차이 또는 조직 획득에 있어서 차이를 반영할 수 있다. 본 발명자의 발견은 CCR5 및 CXCR4의 세포 표면 발현을 보존하기 위해 발견된 방법을 사용하여 분리된 생존성 세포에 기초한 것이다.
점막 단핵세포의 HIV-1 감염 민감성을 평가하기 위해, 본 발명자는 내시경 생검 조직편에서 분리된 MMC와 건강한 HIV-혈청음성 지원자로부터 분리된 PBMC를 시험관내 HIV 감염시켰다. 실험실 균주인 HIV(M-자극반응성 HIVSX 또는 T-자극반응성 HIVNL4-3)으로 점막 세포를 20IU의 인터류킨-2(IL-2) 존재하에 수행하였으며 데이타에 의하면 IL-2가 점막 세포 집단의 생존력을 유지하는데 필요하였다는 것을 보여주었다. 대조군으로, IL-2는 CCR5를 상향조절하는 것으로 알려져 있고 바이러스 복제를 강화할 수 있기 때문에, IL-2 존재 및 부재하에 동일한 환자로부터 나온 PBMC도 또한 감염시켰다. 감염은 상청액 내 p24 생산에 의해 18 시간, 72시간 및 130시간에서 정량하였으며, 104 CD4+ 림프구 당 생성된 피코그램(pg)의 p24로 표시하였다. 대표적인 실험(2개 중 1개)에서 도 4에 도시된 바와 같이, IL-2의 존재 또는 부재하에 PBMC와 비교시 점막 단핵 세포는 배양액 내에서 왕성한 바이러스 복제를 지원할 수 있었다. IL-2부재하 감염된 PBMC는 HIVSX 또는 HIVNL4-3 어느 것에 의해서도 HIV 복제를 지원할 수 없었다. IL-2존재하 유사하게 배양된 PBMC와 비교한 경우, 점막 세포는 PBMC 보다 M-자극반응성 및 T-자극반응성 HIV에 의해 현저하게 더 많이 공격받기 쉬웠다. 예를들면, 72시간에서, MMC 배양액 내 M-자극반응성 HIVSX의 상청액 p24 수준은 104 CD4+ 림프구 당 164pg/㎖이었고, 이는 PBMC 배양액의 경우 51pg/㎖과 비교된다. T-자극반응성 HIVNL4-3의 경우, 바이러스 성장이 전 시간에 걸쳐 그리고 130시간에서 가속되었으며, MMC 배양액 중 상청액 p24 수준은 104 CD4+ 림프구 당 1194pg/㎖이었고, 이는 PBMC 배양액의 경우 검출할 수 없는 수준과 비교된다. 이들 데이타에 의하면, 점막 CD4+ 림프구 공동 수용체 표현형에 의해 제시되는 감염에 대한 증가된 민감성이 HIV-1의 M 및 T-반응자극성 균주 모두에 의해 기능적으로 시험관내 감염가능하게 한다는 것을 제시한다.
이들 데이터로부터 3개의 관심있는 요점이 부각된다. 첫째, 조직에 기초한 면역 세포는 재생가능한 조직 공급원인 장의 점막 내층으로부터 용이하고 안전하게 수득 및 분리할 수 있다. HIV-1 발병학의 연구가 점점 더 영속 및 전파 연구 모두를 위해 조직 구획들에 초점을 맞춤에 따라, 림프 조직에 용이하고 안전하게 접근하는 기법이 필수적이다. 림프절 및 편도선의 절제/흡인이 가장 일반적으로 알려진 방법이었다. 이들 접근법을 사용한 연구는 이미 계몽적이고 개념-변화하는 발견을 제공하며, 여기에는 혈장 수준이 안정하거나 검출할 수 없는 때 림프 조직에서 HIV-1 활성이 지속한다는 증거를 포함한다. 이러한 조직 공급원은 HIV-1 감염 동안 이차 조직화된 림프 구조에서 발생하며 조직 획득을 위해 침해성 외과 지원을 필요로 하는 생물학적 사건을 밝힌다. 대조적으로, 장 점막 림프 조직은 풍부하며 쉽게 접근가능하고 신속하게 치유되며 자가-보충하고 직접 관찰가능하다. 내시경 생검은 안전하고 신속하며 고통이 없으며, 100%의 림프구 함유 샘플을 갖는 림프 구획으로 접근하게 한다. 생검은 건축학상 배향을 유지하며 조직적으로 검사될 수 있거나, 본 명세서에서 기술한 바와 같이 유동 세포측정 및 조직 배양 평가를 위해 연결시킬 수 있다.
이들 연구에 의해 부각된 제2의 관심있는 요점은 말초 혈액 세포와 비교하여 총 CD4+ 림프구의 퍼센트로서 그리고 단위 세포를 기초로 하더라도 모두 CCR5 발현이 사람 점막 CD4+ 림프구에서 현저하게 증가한다는 것이다. 이들 점막 T 세포는혈액 유래의 CD4+ 림푸구 보다 더 높은 수준의 바이러스성 복제를 지원하다(도 4). CCR5는 초기 감염시 HIV-1과 가장 관련이 있는 공동 수용체이며, 위장관은 가장 일반적인 전파 부위 중 하나일 뿐만아니라 신체 주요 림프 기관이고, 검출된 CCR5 발현량은 전파, 1차 감염, 진행성 국부적 확산 및 치료에 대해 중요한 의미를 갖는다. 혈액 내 CCR5 발현에 기초하여, M-자극반응성 HIV-1에 의한 T 세포 감염가능성을 계획하는 것은 질환 진행을 극적으로 상이하게 수학적으로 모델링하게 한다. CD4가 제한 인자가 아닌 경우, 세포 당 최소 700-2000개 CCR5 수용체는 감염에 대한 최대 민감성으로 충분하였다. 본 발명자의 계산에 의해, 혈액 T 세포 상 CCR5 수용체 수(대략 중간값이 세포 당 3000개 수용체)는 이러한 범위의 시험관내 전염가능성 내에 있다. 점막 수준(대략 중간값이 세포 당 7000개 수용체)은 이러한 최초 범위를 훨씬 초과한다. b-케모틴 생산 수준을 포함하는 인자들 및 MMC 내 세포성 활성화 인자들의 존재는 또한 이들 세포가 복제를 지원할 수 있는 능력에 영향을 줄 수 있다. TNF-a 및 IL-2를 포함하는 사이토킨은 장 점막에서 높은 수준으로 발견되며, 또한 이 부위에서 바이러스성 복제를 강화하는데 기여할 수 있다.
제3의 관심있는 요점은 PBMC와 비교하여 HIV-1의 CCR5- 및 CXCR4-자극반응성 균주 모두에 대한 점막 림프구의 감염 민감성이 증가한다는 점이다. IL-2 존재하 그리고 세포에 다른 자극이 없는 상태에서 MMC 배양액 내 HIVNL4-3 생산이 몹시 높은 수준이라는 것은 점막 T 세포가 입장을 위해 주요 공동 수용체를 사용하는 HIV-1 변이체의 복제에 풍부한 환경을 제공한다는 것을 제시한다. HIV-1의 점막 전파 부위에서 CD4+ 림푸구가 풍부하고 이들 림프구가 바이러스의 두 유형 모두에 의해감염되기 쉬움에도 불구하고 CCR5-사용 변이체가 선호적으로 전파되는 이유는 대답하여야 할 중요한 문제이다. 본 발명자의 발견은 공동 수용체로서 CXCR4를 사용하는 HIV-1 변이체가 초기 전파되나 면역 작용기작에 의해 제거되는지에 대한 문제를 부각시킨다. 달리, CCR5 사용 바이러스가 PBMC로 확산되지만 CXCR4-사용 변이체는 전파 부위에서 유지될 수 있다.
본 발명자의 결과물은 장 점막의 조직 생검을 사용하여 HIV-1 전파 및 병발생에 영향을 줄 수 있는 면역학적 및 바이러스학적 결정요인에 대한 양적 정보를 얻을 수 있다는 것을 보여준다. 성교에 의해 노출되고 외상받기 쉬운 내층인 위장관 점막의 1차 및 지속성 HIV-1 감염에 대한 잠재적인 취약성은 극적이다. 이러한 취약성은 이러한 점막 부위에서 활성화된 기억 CD4+ 림프구가 우세하다는 것을 포함한다. 또한, 본 발명자의 결과물은 CCR5 및 CXCR4 모두가 건강한 HIV-1-혈청음성 개체의 위장관으로부터 나온 점막 CD4+ 림프구에서 높게 발현되며 이들 점막 세포는 혈액으로부터 나온 세포보다 훨씬 더 큰 시험관내 감염 민감성이 있다는 것을 보여준다.
환자 집단: 6명의 건강한 개인(3명은 남자, 3명은 여자, 평균 연령 45세, 연령 범위 24세 내지 68세)을 림프구 표현형 연구를 위해 모집하였다. 바이러스 배양 실험을 위해 2명의 남자를 더 모집하였다(하기 참조). 정보를 알려주고 동의를 얻은 후 배변 내 혈액의 병력에 대한 임의의 내시경 검사 또는 일상적인 폴립 스크리닝을 수행하였다. 어떠한 피험체도 설사증후군 또는 장 염증 장애 또는 감염성 자애의 병력을 갖지 않았다. 생검 조사와 동일 영역에서 취한 생검 조직편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 결과 어떠한 병 발생도 나타내지 않았으며, 위장 외과 의사에 의해 알 수 없게 한 상태에서 검사할 때 모두 정상적으로 나타났다. 연구는 UCLA Human Subjects Protection Committe에 의해 승인받았다. 모든 샘플링을 위해 직장 S상 결장 내 30㎝ 부위를 사용하여 외상성 또는 감염성 직장염 유래의 가능성있는 지독한 염증을 회피하였다. 점막 단핵 세포(MMC)를 각 공여체의 4개 내시경 생검 조직편으로부터 분리하였다. 3.3 OD 핀셋(forceps)을 사용하여 생검 조직편을 15㎖의 조직 배양 배지 내로 수집하였다(RPMI 1640, Irvine Scientific). 분리될 때까지(약 20-60분) 생검 조직편을 실온 회전 플랫폼 상에 유지하고 나서, 1mM EDTA 및 50mM 2-머캅토에탄올을 갖는 인산 완충 식염수를 함유하는 10×35㎜ 패트리디쉬로 옮기고, 18G 바늘로 샘플을 가늘게 찢었다. 파괴된 조직은 37℃에서 20분동안 교반 수조 내에서 항온처리하였다. 원심분리 후, 조직 샘플을 콜라게나제 및 디스파제(Boehringer Mannheim #269638; RPMI 중 0.1mg/mL)의 혼합물로 소화시켰다. 일련의 감소되는 바늘 게이지를 갖는 주사기에 샘플을 통과시킴으로써 더 파괴시켰다. 70 마이크론 세포 여과기(Falcon #2350)을 사용하여 잔해를 제거하였다. 그 결과 형성된 세포를 10% 소 태아 혈청 함유 RPMI에 재현탁하였다. 주로 상피세포 및 백혈구에 포함되어 있는 단핵세포를 혈구계수기로 육안 계수하고 백혈구인 단핵 세포 집단을 측정하였다. 약 20%의 단핵 세포는 4개의 생검 조직편 당 평균 1.3×106±1.1×106S.D.(n=6)의 수율로부터 나온 백혈구이다. 트리판 블루의 배제에 의해 측정된 생존력은 >90%이었다. 공여자로부터 나온 혈액은 EDTA내 수집하고전체 혈액 염색법으로 염색하였다.
구입된 단클론성 항체는 CD4-형광 이소티오시아네이트 및 CD45-페리딘 클로로필 단백질(BDIS), CD8-알로피코시아닌(Caltag), 및 항-CXCR4-R-피코에리트린(PE; Pharmingen)을 포함하였다. 항-CCR5은 류코사이트(Leukosite)의 Walter Newman 박사에 의해 제공되었으며(Cambridge, MA), BDIS의 Kenneth Davis 박사와 Noel Warner 박사에 의해 PE와 함께 1:1 접합체로 준비하였다. Cell QuestO 소프트웨어를 이용한 분석과 함께 FACSCaliburO(BDIS) 상에서 분석을 수행하였다. 분리된 MMC 상 초기 게이팅을 측면 살포법 및 CD45 형광법을 이용해서 수행하고 이어서 전방 및 측면 살포 게이팅하였다. 잘 정의되고 분리된 점막 백혈구 집단은 CD45브라이트로 규명하고 약 10-50%의 초기 단핵 샘플 집단을 대표한다. 이들 중 20-40%는 CD4+ 림프구이고 26-41%는 CD8+ T 세포이었다.
CD4+ 림프구 당 CCR5 분자의 수를 측정하기 위해, 관찰된 CCR5 상대적 형광 강도(RFI)에 교정 인자, 특히 본 실험의 FACSCalibur의 경우 결정된 44를 곱하였다. 이 교정 인자는 RFI 채널 수 당 검출된 PE 분자의 수이다. PE와의 1:1 접합체로 제조된 mAb의 경우, RFI 채널 수를 교정 인자와 곱하여 세포 당 결합된 mAb의 수를 계산할 수 있다. 이 계산은 1:1 접합체로써 유용하지 않기 때문에 CXCR4에 대해 수행하지 않았다.
장 생검 조직편 상에 사용된 콜라게나제/디스파제 분리 공정은 표면 항체를 손상시키지도 제거시키지도 않았다는 것을 확실히 하기 위해, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll-Hypaque 분리법으로 분리하고, 이어서 염색한 후 CD45, CD4,CD8, CCR5 및 CXCR4 발현 퍼센트에 대한 유동 세포측정법으로 직접 분석하거나, 점막 분리 공정(콜라게나제/디스파제 처리)을 통해 프로세싱한 후 염색하고 항원에 대해 분석하였다. 통상적으로 분리된 PBMC와 점막 분리 효소에 노출된 PBMC는 연구된 모든 항체에 대한 사분면 퍼센트에서 분명한 차이를 나타내지 않았다. 따라서, 콜라게나제/디스파제 처리에 의해 CCR5 발현이 증가하기 않았기 때문에, 혈액과 비교하여 장 유래 세포 상 CCR5의 증가된 퍼센트 및 발현에 대한 관찰은 분리 공정에서 야기된 것이 아니다.
건강한 HIV-혈청음성 지원자 각각으로부터 나온 MMC를 기계적 파괴 후 4개의 내시경 생검 점막 조직편으로부터 분리하고, 10% 사람 혈청으로 보충되었으며 10mg/ml 젠타마이신, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민을 함유하는 Iscove's DMEM에서 3일간 배양하였다. 인터류킨-2(IL-2, Amgen)를 20 IU/mL로 첨가하였다. 총 105개 점막 단핵 세포 및 PBMC를 3시간동안 50mg의 HIVSX 또는 HIVNL4-3으로 감염시킨 후, 100 미세역가의 배지에 있는 96-웰 플레이트에 도포하였다. 도포하기 이전에, 세포를 2번 세척하여 유리 바이러스 및 부착된 p24를 제거하였다. 30 미세역가의 상청액을 18시간, 3일(72시간) 및 5일(130시간) 시점에서 각각 샘플링하여 ELISA(Coulter)로 p24를 측정하였다. CD4+ 페센트를 유동 세포측정기로 측정하고 이를 사용하여 배양액 내 CD4+ 림프구의 수를 측정하였다. 장 세포 상 공동 수용체 발현은 세포 수율이 충분하지 않기 때문에 이들 공여체에서 시험하지 않았다.
기능적인 감염성 및 유동 연구를 위해 점막 단핵 세포의 수율을 증가시킬 목적으로, 또다른 분리 방법을 수행하였다. 새로이 수집한 내시경적 생검 조직편을잘게 썰어 100×300mm 페트리디쉬 내 20 유니트/ml의 IL-2로 보충된 10ml의 Iscoves 배지에 직접 넣고 3일간 5% CO2, 37도에서 배양하였다. 세포를 70㎛ 세포 여과기로 수집하고 총 단핵 세포 수율을 혈구계수기로 육안으로 하나씩 세었다. CD45+, CD3+, CD4+ 및 CD8+ 세포의 수율은 TruCount 비드를 사용하여 측정하였고, 통상의 콜라게나제/디스파제 프로토콜을 이용하여 분리된 동일한 개체로부터 수집한 생검 조직편으로부터 나온 수율과 비교하였다. 점막 림프구 수율이 6배 증가하였다(도 5).
조직 내 HIV-1의 정량화
직장 S상 결장 생검 조직편으로부터 RNA를 추출한 결과 조직 RNA >95%가 회수되었다. 본 발명자는 Chen 실험에 의해 이전에 기술된 것을 응용하여 조직 RNA에 대한 정량적 RT PCR 분석 및 조직 DNA에 대한 정량적 PCR을 개발하였다. 본 발명자의 초기 결과는 HIV-1 RNA가 RT PCR에 의해 정량화될 수 있으며 그 수준이 10카피로 낮다는 것을 보여주었다(도 6).
샘플을 냉동 상태로부터 즉시 균질화하고(Powergen 125 조직 균질기를 사용), RNA 및 DNA 함유 상을 분리하면서 트리졸-추출한다. Rneasy 컬럼을 이용하여 RNA를 더 추출한다. 특질 대조군 연구에 의해 최소한의 RNA 손상(아가로즈 겔 전기영동) 및 DNA 비오염(RNA 주형의 PCR)을 확인하였다. HIV RNA 카피 수는 스플라이싱되지 않거나 다중으로 스플라이싱된 HIV RNA를 획득하고자 고안된 HIV LTR 특이 프라이머 667/AA55와 함께 rTTH RNA PCR 키트(Perkin-Elmer)를 응용하여 정량화하였다. 직선 표준 곡선은 667/AA55 프라이머 쌍에 의해 인식되는 127 bp 서열을 사용하여 만들었다. 0.1M 나트륨 시트레이트/10% 에탄올 완충액으로 2번이상 세척하면서 에탄올 침전으로 DNA를 분리하였다. HIV DNA의 경우, 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증촉하였다(667/AA55). 직선 표준 곡선을 β-글로빈 프라이머를 사용하여 만들었다.
본 발명의 접근법을 표준화하고 HIV RNA의 시험관내 양을 가장 근접하게 반영하는 결과적인 수율은 얻기 위해, 알려진 양의 HIV LTR RNA를 핵산 분리 이전 및 이후 모두에서 혈청음성 생검 조직편에 첨가하였다. 0.5ug/ul의 헬라 세포 총 RNA에 희석된 정제된 HIV LTR RNA를 사용하여 직선 표준화 곡선을 만들었다. 이전에 기술한 바와 같이 RT-PCR을 수행하였다. 사전 및 사후 LTR-보충된 샘플의 차이를 정량하였으며, 최소라고 밝혀졌다(>95% 회수).
회수된 것을 정량적으로 평가하기 위해, 알려진 양의 루시퍼라제 DNA(공지의 사람 상동성이 전혀 없는 박테리아 서열)로 조직 DNA 회수율(보통 >75%)을 정량화한다; 혈청음성 샘플은 알려진 양의 LTR HIV 서열을 수용하고 RNA 회수율을 정량화한다(>95%).
HIV-RNA는 검출할 수 없는 혈장 바이러스 적재량을 갖는 피험체로부터 나온 직장 S상 결장 생검 조직편에서 재현가능성있게 검출된다.
동일한 환자로부터 동일한 주변 수준(30cm)에서 동시에 획득된 다른 것과 비교함으로써 하나의 생검 조직편으로부터 나온 결과의 반복성을 입증하고자 노력하였다. 검출할 수 없는 혈장 바이러스 적재량을 갖는 피험체로부터 나온 단일의 생검 조직편(각각 10mg)을 냉동하고, RNA 추출하고 LTR-특이 프라이머 667/AA55를 사용하여 상기와 같이 증폭하였다. 각 생검 조직편은 평균 25㎍ RNA를 산출하였으며, 보통 이중 1/100이 정량화에 사용되었다. 도 7의 결과는 고감도 분석에서 직장 S상 결장 생검 조직편을 사용하여 정량화된 RNA 바이러스 적재량의 재현성을 입증한다. 데이터는 검출가능하기 않는 혈장 바이러스 적재량을 갖는 피험체의 경우 기본선 S상 결장경 동안 수득한 2 생검 조직편으로부터의 조직 HIV RNA 바이러스 적재량을 나타낸다. 이들 개체는 >1년 동안 검출할 수 없는 혈장 바이러스 적재량을 보여준다. 평균 동일한 피험체 내 샘플들 간에 <0.2log10 차이가 있다. 이러한 데이타는 재현성 및, 조직 바이러스 적재량을 정량하기 위해 생검 조직편을 사용하는데 있어서 샘플 차이에 따른 최소한의 샘플을 보여준다. 검출할 수 없는 혈장 HIV RNA를 갖는 피험체 내 조직 HIV RNA의 검출가능한 수준(보통 102 내지 103 /㎍ RNA)을 확인하는 것도 동등하게 중요하다.
HIV-DNA는 검출할 수 없는 혈장 바이러스 적재량을 갖는 피험체로부터 직장 S상 결장 생검 조직편에서 재현성있게 검출된다.
검출할 수 없는 혈장 바이러스 적재량을 갖는 분리된 피험체 그룹 내에서, HIV DNA는 LTR 영역에 대한 특이 667//AA55 프라이머 및 내부 직선 표준화용으로 사용되는 b-글로빈 특이 프라이머와 함께 정량화 PCR을 사용하여 증폭하였다. b-글로빈 특이 프라이머 경우 3번 분석하였다; HIV 프로바이러스성 DNA를 2회 정량화한 것이 도 8에 도시되어 있다. 비록 검출 하한값이 3 카피수이나, 10 카피수를 본 발명의 하한 마감점으로 사용하였다. 도면은 정량화된 실제 카피 수 및 b-글로빈-의존성 세포 계수에 기초하여 계산된 카피 수 모두를 보여주고 있다. 이들 결과에 의하면 본 발명의 기법은 검출할 수 없는 혈장 바이러스 적재량을 갖는 피험체에서 10 정도의 낮은 프로바이러스성 DNA 카피 수를 검출할 수 있음을 보여준다.
점막 CD4 T 세포 상 CCR5 공동 수용체 발현
점막 단핵 세포의 분리는 CD4, CD8, CCR5 및 CXCR4의 표현형적 발현을 변경하지 않는다.
건강한 혈청음성 대조군의 혈액(말초 혈액 단핵 세포:PBMC) 및 장 점막(점막 단핵 세포:MMC)으로부터 샘플을 분리하고 양 구획에서의 기본선 CCR5 및 CXCR4발현을 확립하였다. 도 9는 본 발명의 분리 공정이 관련 수용체(CD4, CD8, CCR5, CXCR4)를 제거하지도 그들의 표면 발현을 변경시키지도 않는 않음을 보여준다.
CD4 T 세포 상 CCR5 점막 발현은 PBMC와 비교하여 훨씬 크게 증가하였다. 분리된 점막 단핵 세포 및 말초 혈액 단핵 세포를 건강한 혈청음성의 대조군 피험체로부터 수득하고, 평가하여 CCR5 수용체를 발현하는 각 구획에서의 CD4 T 림프구의 상대적인 퍼센트를 결정하였다. 2D7 CCR5 항체를 1:1 비율로 피코에리트린과 접합시키고; 사용하는 유동 세포측정 장치를 (세포 당 표준화된 CD4 발현 및 결합된 항체 수에 기초하여) RFI 채널 당 44개 피코에리트린 분자를 검출하도록 교정하였다. 결국, 세포 당 결합된 항-CCR5 항체 수는 수용체에 대해 항체의 1가 결합을 가정하면 세포 당 수용체 수로 해석될 수 있다.
CCR5-발현 CD4+ T세포의 퍼센트는 혈액(11%)과 비교하여 장(87%)에서 상당히 증가하였다(p=0.0019)(도 10).
HIV 감염에 대한 취약성을 증가시키면서, 도 11은 점막 CD4 T 세포도 혈액 CD4 T 세포(평균 2700)와 비교하여 세포당 훨씬 더 많은 수용체(평균 8500)를 발현한다는 것을 보여준다(p=0.007).
점막 CD4 T 세포 상 CCR5 발현은 거의 전적으로 기억 서브세트 상에서 일어난다. 동일한 혈청음성의 건강한 대조군으로부터 나온 혈액 및 점막 샘플을 기억 서브유닛의 지표로서 CD45RO 항체로 카우터(counter) 염색하여 CCR5 염색의 상대적인 분포를 측정하였다. CD4+ 형광 상에서의 게이팅 후, CD4+ CD45RO+ 점막 세포 91%가 혈액내 동일한 그룹 24%와 비교하여 CCR5를 발현한다(p=0.017).
점막 CD4 T 세포 상 CCR5 발현은 HIV-감염된 샘플 및 염증성 샘플 내 PBMC와 비교하여 증가된 상태를 유지한다.
건강한 혈청음성의 피험체에서 점막 및 혈액 CD4 T 세포 내 CCR5 발현의 예비 기본선을 확정하고, CCR5 발현이 HIV 감염에 조력하면서 혈액과 비교하여 점막 내에서 증가된 상태를 유지한다는 가설을 시험하기 위해 만성 HIV 감염의 세팅에서 CD4 T 세포 상 발현을 평가하였다. HIV-감염에 직접 관련이 없는 변화를 구별하기 위해 염증성 대조군을 포함시켰다. 염증성 대조군은 염증성 장 질환(IBD), 특히 궤양성 결장염에 걸렸으며 그 특징이 잘 규명된 피험체이다. 피험체는 5-ASA 항-염증제에 이해서만 임상적으로 회복되었으며(유지되지만 제어되는 점막 염증 상태임) 이때 스테로이드 또는 면역억제 매개인자를 전혀 사용하지 않았다. HIV-감염 개체는 일정범위의 혈장 바이러스 적재량(초고감도 분석에 의해서는 검출가능하지 않음: n=2; 200-2000 카피/ml 사이의 혈장 바이러스 적재량: n=2; 20,000-40,000 카피/ml 사이의 혈장 바이러스 적재량: n=4)과 함께 200 내지 700 세포/㎣ 사이의 말초 CD4 계수를 갖았다.
혈청음성 대조군에서 관찰된 점막 및 혈액 CD4 T 세포 사이에서의 상이한 CCR5 발현은 염증성 대조군(p=0.012) 및 HIV-감염 피험체(p=0.04)에서 유지되었다(도 12). 본 발명자의 가설과 일치하여, 이 도면에 도시된 바와 같이 정상 대조군과 비교하여 HIV 내 CD4 T 세포 상 점막 CCR5 발현이 감소되는 것과 일치하는 유의성으로의 경향이 있다.
혈액 및 장 모두에서의 HIV 및 IBD 내 CCR5-발현 T 세포 감소에 대한 CD4:CD8 비율
CD4 T 세포 상 CCR5 수용체도 CD8+ T 세포에서 발현된다. 점막 CD4 T 세포 상 CCR5 발현이 실재 감소되었는지를 더 평가하기 위해, 3개의 임상 조건 하 양 구획에서의 CD4 및 CD8T 림프구 사이의 CCR5 수용체의 상대적인 분포를 평가하였다. 도 13은 CCR5 발현 세포의 CD4:CD8 비율이 극적으로 하방 이동한 것을 보여주며, 대체적으로 IBD에서 50%, HIV에서 70-90% 정도 혈액 및 장 샘플이 감소하였다. 이는 HIV 확산을 억제하는 CCR5의 보호성 하향 조절을 의미한다. 염증성 대조군에서 유사한 경향이 주어지는 경우, 감소된 표면 발현의 주요 자극은 염증성 환경과 관련이 있는 것처럼 보인다. 샘플을 처리하여, b-케모킨 수준이 양쪽 조건에서 상승되었으나 IBD 샘플에서 보다 HIV 샘플에서 훨씬 더 상승되었다는 것을 확인하였다. 본 발명자의 가설을 지지하는 이러한 결과물은 상대적인 림프구감소증의 조직학적 보고에도 불구하고 HIV에서 극도록 활성이 있는 염증성 점막 상태(케모킨 활성에의해 정의된 바와 같음)를 제시한다.
QIA를 사용한 β-케모킨 조직 농도의 정량화
HIV 감염은 심각한 점막 염증 반응을 자극한다는 본 발명자의 가설을 더 평가하기 위해, Karolinska 기관에 있는 Jan Andersson 박사와 함께 예비 연구를 수행하여 조직 내 케모킨 농도를 정량화하였다. 호일 상에 즉시 배향시키고 재빨리 냉동시킨 내시경 생검 조직편(7㎛)을 드라이 아이스 상에서 스웨덴으로 보내어, 동결절편하고 항체로 정량적인 면역조직화학적 염색을 하여, RNATES, MIP-1a 및 MIP-1b를 확인하였다. CD4, CD8 및 CCR5 항체를 사용하여 정량적 이미지 분석법(QIA)를 수행하였다. 건강한 혈청음성의 대조군 및 검출가능한 혈장 바이러스 적재량을 갖는 HIV-감염 개체로부터 나온 샘플을 연구하였다. 결과는 퍼옥시다제-표지된 항체로 양성적으로 염색된 총 조직 면적 단위로 표현되어 있다. RANTES, MIP-1a 및 MIP-1b에 대한 건강한 대조군의 결과는 각각 2.04%, 1.39% 및 1.65%이다. HIV-감염된 피험체 샘플에서, 각 수치는 15.1%, 6.2% 및 12.1%로 증가하였다. 이들 케모킨은 추가 염증성 세포를 이미 염증반응이 일어난 점막으로 모집하는 기능을 한다. HIV 감염이 점막 염증과 관련이 있는 이렇게 극적인 증가는 표 1에 제공되어 있다.
케모킨 정상 대조군 HIV-감염군
RANTES 2.04% 15.1%
MIP-1a 1.39% 6.2%
MIP-1b 1.65% 12.1%
점막 단핵 세포(MMC)는 PBMC보다 시험관내 감염성이 훨씬 더 크다.
초기 관찰에 의하면, 부분적으로 증가된 공동 수용체 발현에의해 점막 세포의 HIV 감염 취약성이 증가한다는 것이 확인되었다. 이러한 가설은 동일한 개체로부터 나온 분리된 MMC 및 PBMC를 사용하여 시험관내 시험하였으며, 2시간 동안 M-자극반응성 HIVSX와 항온배양하고 세척하고 3-10일간 배양하였다. 상청액의 분취액들을 확인된 시간에서 수집하고 감염의 증거로서 p24 생산을 분석하였다. 제1 시점(3일)에서 p24 생산은 동시에 항온배양한 PBMC와 비교하여 상당히 증가하였다 (MMC의 경우 4000ng p24/ml, PBMC의 경우 550ng p24/ml. 이 데이타는 도 14에 요약되어 있으며, 점막 CD4 T 세포 상 증가된 공동 수용체 발현이 HIV에 의한 감염성을 강화시킨다는 가설을 지지한다.
결장 내 CD8+ 및 CCR5세포의 분석
통상 상피내 구획에 있는 대부분의 세포는 CD8+이나, 대부분의 고유판 림프구는 CD4+이다. 결장 내 CD8+ 세포의 상대적인 양을 측정하기 위해, 결장 점막의 생검 조직편에서의 CD8+ 세포 존재를 시험하였다. 도 15의 결과는 HIV-감염 환자로부터 나온 생검 조직편에 있는 CD8+ 염색의 정도(흑백 이미지에서 거무스름한 갈색 세포)는 HIV 음성 생검 조직편보다 더 크다(패널 A 및 B를 비교하라)는 것을 보여준다. 특히, 고유판에 있는 대부분의 세포는 HIV-감염된 환자에서 CD4+가 아닌 CD8+이다. 게다가, CD4+ 세포의 수는 HIV-감염된 환자의 결장 점막(mucosum)에서 심각하게 고갈되어 있다. 이 경우, 생검 조직편이 현미경으로 검사되면, CD8 세포의 증가가 HIV-감염된 CD4 세포의 치사에 의해 야기된 CD4 세포의 손실과 균형을 이루기 때문에 염증반응이 일어났다기 보다는 정상세포성(normocellular)이라고 말하여진다. 이는 점막에 대한 초기 관찰이 HIV에 의해 영향을 받은 점막 조직에서의 염증을 검출하는데 실패한 이유를 설명할 수 있을 것이다. CD8 세포와 관련된 실질적인 세포성 염증이 있다.
상기 논의한 b-케모킨은, 이전에 HIV에 의해 상승된다고 보여졌으며, CCR5 수용체를 보유한 세포를 점막으로 모집시킨다(도 16). CCR5 수용체는 HIV가 이들 세포로 입장하기 위해 사용하는 주요 공동 수용체이다. 따라서, HIV는 이러한 환경에서 적어도 부분적으로 프로-염증성 사이토킨의 생산을 통해 염증을 유도하고 이로인해 감염을 위해 더 많은 표적 세포를 모집함으로써 더 증식시킬 수 있을 것이라는 것을 확인시킨다.
PCR 분석을 사용한 β-케모킨 조직 농도의 정량화
HIV가 점막의 염증성 질환이고 따라서 항염증제에 의해 치료될 수 있다는 또다른 증거는 도 17(A-C)에 도시되어 있다. 데이타는, 정상적인 건강한 대조군 환자, 점막 내 저함량의 바이러스를 갖는 HIV 환자 및 점막 내 고 함량의 HIV를 갖는 환자의 점막 생검 조직편에 존재하는 프로-염증성 사아토킨 및 케모킨(mRNT), RANTES, IFNγ 및 TNF(RNA)의 농도를 보여준다. 이들 연구에서 명확하게 볼 수 있는 바와 같이, 점막 내 HIV를 갖는 환자는 건강한 환자 보다 더 높은 수준의 프로-염증성 케모킨 RANTES, 인터페론-감마(IFNγ), 및 TNF를 갖는다. 게다가, 더 높은 점막 바이러스 적재량을 갖는 HIV 환자는 낮은 점막 바이러스 적재량을 갖는 HIV 환자보다 훨씬 더 높은 수준의 RANTES, IFNγ 및 TNF를 갖는다. 양쪽 경우에서, 건강한 정상인과 HIV 환자의 비교는 통계학적으로 상당하였다(RANTES, 각각 p=0.0008및 0.001; IFNγ, 각각 p=0.0008 및 0.002; 및 TNF, 각각 p=0.002 및 0.01).
HIV 적재량은 CD4+ 세포의 활성화 및 바이러스 자손의 생산을 증가시킨다.
도 17D는 점막 바이러스 적재량이 증가함에 따라 활성화된(HLA-DR의 증가된 발현에 의해 표시됨) 점막 내 CD4+ 세포의 퍼센트가 증가한다는 것을 보여준다. 도 18에 나타난 바와 같이, 일단 감염된 점막 세포는 더 많은 바이러스를 생산할 것이다. 이것은 세포에서 복제될 때 T-자극반응성 리포터 바이러스(NIegfp)에 의한 녹색 형광 단백질의 발현 증가에 의해 표시된다. 결과에 의하면, 바이러스를 생산하는 점막 세포의 퍼센트는 혈액 세포 보다 300배 더 크다는 것을 보여준다.
따라서, 이러한 결과는 HIV가 CD4+ 세포(HIV에 의해 감염될 수 있는 정확한 세포 유형)의 활성화를 유도하는 프로-염증성 사이토킨의 수준을 증가시킨다는 것을 입증한다. 감염된 CD4+ 세포는 차례로 다른 CR4+ 세포를 감염시키는데 유용한 자손 바이러스를 생산하고, 다양한 프로-염증성 사이토킨 및 케모킨의 생산에 의해 세포를 모집하여 감염을 확산시킨다.
항염증제 5-ASA는 세포 내 바이러스 복제를 억제한다.
시험관내 HIV 복제를 억제하는 5-ASA의 능력을 평가하기 위해, 등급화된 투여량(3, 30, 300, 3000μM)의 5-ASA 하에 1×106활성화된 PBMC를 사용하여 HIV 감염 연구를 수행하였다. PBMC는 배지에 케모킨 및 사이토킨이 존재하며 CD4 및 CD8 세포의 이질성 집단을 구성한다. 사용된 5-ASA 범위는 일일 4.8g의 5-ASA를 경구적으로 처리한 환자의 위장 점막에서 보여지는 생리학적 범위를 나타낸다고 여겨진다. M-자극반응성 JRFL 또는 T-자극반응성 LAI 엔벤로프를 갖는 복제불능의 위형의 HIV pNLlucΔBgl를 감염을 위해 사용하였다. 루시퍼라제 발현을 사용하여 배양 4일 후 HIV 복제 정도를 평가하였다. 의약 처리된 배양액을 약물을 받지 않은 샘플과 비교하였다. 7-AAD로 염색함으로써 4일 후 세포 사멸에 대한 유동 세포측정법으로 세포를 분석하였다.
표 2의 결과는 5-ASA 치료가 루시퍼라제 발현을 3 내지 67% 억제하였으며, 억제는 최고 투여량에서 상당하였다(P<0.005)(N=치료 그룹 당 7개 감염)는 것을 보여준다. 세포 사멸은 관찰된 억제의 원인이 되는 것으로 나타나지 않았다(비처리된 대조군 내 % 사멸=7.8%, 30μM 5-ASA=7.3%, 300μM 5-ASA=9.4% 및 3000μM 5-ASA=13.3%).
M-자극반응성 HIV 처리되지 않은 배양액에서의 % 변화 T-자극반응성 HIV 처리되지 않은 배양액에서의 % 변화
ASA 3 μM 46.2 ASA 2 μM 3.2
ASA 30 μM 50.3 ASA 20 μM 22.4
ASA 300 μM 48.9 ASA 200 μM 26.0
ASA 3000 μM 67.6* ASA 2000 μM 66.7*
AZT 5 μM 80.0* AZT 5 μM 99.3*
*P<.05
도 19는 국소 항염증제인 아사콜(메살아민)을 사용하면 HIV 복제를 억제한다는 것을 보여준다. 복제될 때 루시퍼라제를 발현하는 HIV 바이러스에 감염된 세포의 배양액을 사용하면, 또 대조군으로서 임의의 처리도 하지 않으면, 2개의 최저 투여량(30 및 300㎍)의 아미콜이 대략 20%정도 HIV 복제를 억제할 수 있다. 3000㎍투여량에서 억제 정도는 더 크나, 이것은 부분적으로 이 투여량에서의 약물의 세포 독성에 의한 것이다(약 30% 세포 사멸 대 13-15% 세포사멸(30 및 300㎍ 투여량의 경우); AZT는 5㎍에서 약 16% 세포 사멸을 산출한다). 이들 결과는 더 효과적이고 공지된 직접적인 항바이러스성 AZT와 비교하여 나타나 있으며, AZT는 세포의 DNA 내로 차후 삽입하기 위해 유전물질(RNA)을 DNA로 역전사하는 바이러스 능력을 차단한다. 아사콜의 항염증성 활성이 AZT 만큼 HIV 복제를 억제하는데 강력하지 않으나, 그럼에도 불구하고 그 활성은 통계학적으로 상당하다.
요컨대, 데이터는 추정된 생리학적 농도의 5-ASA(아사콜)이 최고 투여량에서 HIV 복제를 억제하였으며 억제성 활성이 약물-유도성 세포 독성과 무관한 것처럼 보인다는 것을 보여준다. 5-ASA의 억제성 활성은 적어도 부분적으로 항염증성 활성 때문인 것 같다. 따라서, 이들 결과는 HIV 치료를 위해 항염증제를 광범위하게 사용할 수 있다는 것을 보여준다.
다수의 본 발명의 구체예가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 본 발명의 정신 및 범위로부터 이탈하지 않은 채 이루어질 수 있다는 것으로 이해된다.

Claims (129)

  1. 항염증제 및 항바이러스제를 바이러스 활성화 억제량으로 바이러스 감염된 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 레트로바이러스 활성화 억제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 레트로바이러스는 렌티바이러스인 것이 특징인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 렌티바이러스는 면역부전 바이러스인 것이 특징인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 면역부전 바이러스는 사람 면역부전 바이러스(HIV) 유형 1, HIV-유형 2 및 원숭이 면역부전 바이러스(SIV)로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 생체내 접촉시키는 것이 특징인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 시험관내 접촉시키는 것이 특징인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 세포는 포유류 세포인 것이 특징인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 포유류 세포는 사람 세포인 것이 특징인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 항바이러스제는 바이러스 융합 또는 세포 입장, 바이러스 역전사 또는 핵산의 복제, 세포성 DNA 내로의 바이러스 삽입, 세포로부터의 바이러스 출아 또는 방출, 감염성 바이러스의 생산, 또는, 바이러스 융합 또는 감염, 역전사 또는 핵산 복제, 세포성 DNA내로의 바이러스 삽입, 세포로부터의 바이러스 출아 또는 방출, 또는 감염성 바이러스의 생산에 관여하는 효소를 억제하는 것이 특징인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 항바이러스제는 폴리펩티드 또는 기능적 모방체인 것이 특징인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 폴리펩티드 또는 기능적 모방체는 바이러스 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 것이 특징인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 폴리펩티드는 리간드, 바이러스성 수용체, 항체 또는 이의 단편인 것이 특징인 방법.
  13. 제9항에 있어서, 효소는 단백분해효소, 역전사효소 또는 인테그라제인 것이 특징인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 항바이러스제는 단백분해효소 억제제, 뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 인테그라제 억제제 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 뉴클레오시드 억제제는 지도부딘(zidovudine, AZT), 스타부딘(stavudine, d4T), 라르니부딘(larnivudine, 3TC), 디다노신(didanosine, DDI), 잘시타빈(zalcitabine, ddC), 아바카비르(abacavir) 및 이들의 혼합물인 것이 특징인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 비뉴클레오시드 억제제는 네비라핀(nevirapine), 델라비르딘(delavirdine) 및 에파비렌즈(efavirenz)로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 항바이러스제는 단백분해효소 억제제인 것이 특징인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 단백분해효소 억제제는 사퀴나비르(saquinavir), 리토나비르(ritonavir), 인디나비르(indinavir), 넬피나비르(nelfinavir) 또는 암프레나비르(amprenavir)인 것이 특징인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 항염증제는 염증성 세포 모집을 감소시키거나, 케모킨 생산을 감소시키거나, 프로-염증성 사이토킨 생산을 감소시키거나, 또는 케모킨 수용체와 그 리간드의 상호작용을 방해하는 것이 특징인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 항염증제는 항염증성 항체, 항염증성 펩티드, 항염증성 사이토킨, 항염증성 케모킨, 항염증성 핵산, 스테로이드, 비스테로이드성 항염증성 약물, 5-ASA 산물, 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 항염증성 항체는 항-사이토킨 항체, 항-사이토킨 수용체 항체, 항-케모킨 항체, 항-케모킨 수용체 항체, 항-프로염증성 펩티드 항체, 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 항염증성 펩티드는 LFA 부착 분자 길항제, 사이토킨 수용체 길항제, 전사인자 및 가용성 TNF-α 수용체 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 항염증성 사이토킨은 IL-4, IL-10, IL-13, IL-16 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  24. 제20항에 있어서, 항염증성 핵산은 리보자임, 항염증성 펩티드를 암호화하는 핵산, 안티센스 핵산 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 안티센스 핵산은 사이토킨 수용체, 염증성 사이토킨, 케모킨 수용체 또는 케모킨을 암호화하는 핵산과 하이브리드하는 것이 특징인 방법.
  26. 제20항에 있어서, 스테로이드는 글루코코르티코이드인 것이 특징인 방법.
  27. 제20항에 있어서, 스테로이드는 플루니솔리드, 트리암시놀린, 트리암시놀린 아세토니드, 베클로메타손 디프로프리오네이트, 베타메타손 디프로프리오네이트, 하이드로코르티손, 코르티손, 덱사메타손, 부데소니드, 프레드니손, 메틸 프레드니솔론, 프레드니솔론 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  28. 제20항에 있어서, 비스테로이드성 항염증성 약물은 살리실산, 나트륨 티오살리실레이트, 콜린 살리실레이트, 마그네슘 살리실레이트, 디플루니살, 이부프로펜, 나프록센, 술린닥, 디플루니살, 살리실살리실산, 콜린 마그네슘 트리살리실레이트, 아세틸살리실산, 살살레이트, 나트륨 살리실레이트 및 이들의 조합물로 구성된 살리실산 유도체 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  29. 제20항에 있어서, 비스테로이드성 항염증성 약물은 플루르비프로펜, 페노프로펜, 나부르네톤, 케토프로펜, 피록시캄, 인도메타신, 톨메틴, 메클로파나메이트 나트륨, 메페남산, 에토돌락, 케토롤락 트로메타민, 디클로페낙, 옥사프로진, 브롬페낙 나트륨, 로페콕시브, 수프로펜, 펜부프로펜, 플루프로펜, 탈리도미드, 달맞이꽃 오일, 이들의 단일 이성질체 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  30. 제20항에 있어서, 5-ASA 산물은 메살아민, 발살라지드, 이프살라지드, 올살라진, 술파살라진 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  31. 항염증제 및 항바이러스제를 억제 유효량으로 점막 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는 점막 조직의 염증 매개성 감염의 억제 방법.
  32. 제31항에 있어서, 염증 매개성 감염은 바이러스에 의해 야기된 것이 특징인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 바이러스는 레트로바이러스인 것이 특징인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 레트로바이러스는 렌티바이러스인 것이 특징인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 렌티바이러스는 면역부전 바이러스인 것이 특징인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 면역부전 바이러스는 사람 면역부전 바이러스(HIV) 유형1, HIV-유형 2 및 원숭이 면역부전 바이러스(SIV)로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  37. 제31항에 있어서, 생체내 접촉시키는 것이 특징인 방법.
  38. 제31항에 있어서, 시험관내 접촉시키는 것이 특징인 방법.
  39. 제31항에 있어서, 탈체로 접촉시키는 것이 특징인 방법.
  40. 제31항에 있어서, 조직은 포유류 조직인 것이 특징인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 포유류 조직은 사람 조직인 것이 특징인 방법.
  42. 제31항에 있어서, 점막 조직은 질 조직, 위장 조직, 코조직 또는 하부 GI 관의 조직인 것이 특징인 방법.
  43. 제31항에 있어서, 접촉은 항바이러스제 투여전, 동시 또는 투여후 항염증제의 국부적 또는 전신적 투여에 의한 것이 특징인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 투여는 국소적 투여에 의한 국부적인 접촉에 의한 것이 특징인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 전신적 투여는 정맥내, 경구적 또는 비경구적 투여에 의한 것이 특징인 방법.
  46. 제31항에 있어서, 항바이러스제는 바이러스 융합 또는 세포 입장, 바이러스 역전사 또는 핵산의 복제, 세포성 DNA 내로의 바이러스 삽입, 세포로부터의 바이러스 출아 또는 방출, 감염성 바이러스의 생산, 또는, 바이러스 융합 또는 감염, 역전사 또는 핵산 복제, 세포성 DNA내로의 바이러스 삽입, 세포로부터의 바이러스 출아 또는 방출, 또는 감염성 바이러스의 생산에 관여하는 효소를 억제하는 것이 특징인 방법.
  47. 제31항에 있어서, 항바이러스제는 폴리펩티드 또는 기능적 모방체인 것이 특징인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 폴리펩티드 또는 기능적 모방체는 바이러스 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 것이 특징인 방법.
  49. 제47항에 있어서, 폴리펩티드는 리간드, 바이러스성 수용체, 항체 또는 이의 단편인 것이 특징인 방법.
  50. 제46항에 있어서, 효소는 단백분해효소, 역전사효소 또는 인테그라제인 것이 특징인 방법.
  51. 제31항에 있어서, 항바이러스제는 단백분해효소 억제제, 뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 인테그라제 억제제 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 뉴클레오시드 억제제는 지도부딘(AZT), 스타부딘(d4T), 라르니부딘(3TC), 디다노신(DDI), 잘시타빈(ddC), 아바카비르 및 이들의 혼합물인 것이 특징인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 비뉴클레오시드 억제제는 네비라핀, 델라비르딘, 에파비렌즈인 것이 특징인 방법.
  54. 제31항에 있어서, 항바이러스제는 단백분해효소 억제제, 역전사효소 억제제 또는 인테그라제 억제제인 것이 특징인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 단백분해효소 억제제는 사퀴나비르, 리토나비르, 인디나비르, 넬피나비르 또는 암프레나비르인 것이 특징인 방법.
  56. 제31항에 있어서, 항염증제는 염증성 세포 모집을 감소시키거나, 케모킨 생산을 감소시키거나, 프로-염증성 사이토킨 생산을 감소시키거나, 또는 케모킨 수용체와 그 리간드의 상호작용을 방해하는 것이 특징인 하는 방법.
  57. 제31항에 있어서, 항염증제는 항염증성 항체, 항염증성 펩티드, 항염증성 사이토킨, 항염증성 케모킨, 항염증성 핵산, 스테로이드, 비스테로이드성 항염증성 약물, 5-ASA 산물, 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 항염증성 항체는 항-사이토킨 항체, 항-사이토킨 수용체 항체, 항-케모킨 항체, 항-케모킨 수용체 항체, 항-프로염증성 펩티드 항체, 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 항염증성 펩티드는 LFA-1 길항제, 사이토킨 수용체 길항제, 전사인자 및 가용성 TNF-α 수용체로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  60. 제57항에 있어서, 항염증성 사이토킨은 IL-4, IL-10, IL-13, IL-16 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  61. 제57항에 있어서, 항염증성 핵산은 리보자임, 항염증성 펩티드를 암호화하는핵산, 안티센스 핵산 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 안티센스 핵산은 사이토킨 수용체, 염증성 사이토킨, 케모킨 또는 케모킨 수용체를 암호화하는 핵산과 하이브리드하는 것이 특징인 방법.
  63. 제57항에 있어서, 스테로이드는 글루코코르티코이드인 것이 특징인 방법.
  64. 제57항에 있어서, 스테로이드는 플루니솔리드, 트리암시놀린, 트리암시놀린 아세토니드, 베클로메타손 디프로프리오네이트, 베타메타손 디프로프리오네이트, 하이드로코르티손, 코르티손, 덱사메타손, 부데소니드, 프레드니손, 메틸 프레드니솔론, 프레드니솔론 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  65. 제57항에 있어서, 비스테로이드성 항염증성 약물은 살리실산, 나트륨 티오살리실레이트, 콜린 살리실레이트, 마그네슘 살리실레이트, 디플루니살, 이부프로펜, 나프록센, 술린닥, 디플루니살, 살리실살리실산, 콜린 마그네슘 트리살리실레이트, 아세틸살리실산, 살살레이트, 나트륨 살리실레이트 및 이들의 조합물로 구성된 살리실산 유도체 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  66. 제57항에 있어서, 비스테로이드성 항염증성 약물은 플루르비프로펜, 페노프로펜, 나부르네톤, 케토프로펜, 피록시캄, 인도메타신, 톨메틴, 메클로파나메이트나트륨, 메페남산, 에토돌락, 케토롤락 트로메타민, 디클로페낙, 옥사프로진, 브롬페낙 나트륨, 로페콕시브, 수프로펜, 펜부프로펜, 플루프로펜, 탈리도미드, 달맞이꽃 오일, 이들의 단일 이성질체 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  67. 제57항에 있어서, 5-ASA 산물은 메살아민, 발살라지드, 이프살라지드, 올살라진, 술파살라진 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  68. 항염증제 및 항바이러스제를 유효량으로 피험체와 접촉시키는 단계를 포함하여, 염증 매개성 점막 감염의 위험성이 있는 피험체에서 염증 매개성 점막 감염의 가능성을 감소시키는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 염증 매개성 점막 감염은 바이러스에 의해 야기된 것이 특징인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 바이러스는 레트로바이러스인 것이 특징인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 레트로바이러스는 렌티바이러스인 것이 특징인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 렌티바이러스는 면역부전 바이러스인 것이 특징인 방법.
  73. 제70항에 있어서, 면역부전 바이러스는 사람 면역부전 바이러스(HIV) 유형 1, HIV-유형 2 및 원숭이 면역부전 바이러스(SIV)로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  74. 제68항에 있어서, 생체내 접촉시키는 것이 특징인 방법.
  75. 제68항에 있어서, 생체내 접촉은 항바이러스제 투여전, 동시 또는 투여후 항염증제의 국부적 또는 전신적 투여에 의한 것이 특징인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 투여는 국소적 투여에 의한 국부적인 접촉에 의한 것이 특징인 방법.
  77. 제75항에 있어서, 전신적 접촉은 정맥내, 경구적 또는 비경구적 투여에 의한 것이 특징인 방법.
  78. 제68항에 있어서, 피험체는 포유류인 것이 특징인 방법.
  79. 제78항에 있어서, 포유류는 사람인 것이 특징인 방법.
  80. 제68항에 있어서, 항바이러스제는 바이러스 융합 또는 세포 입장, 바이러스 역전사 또는 핵산의 복제, 세포성 DNA 내로의 바이러스 삽입, 세포로부터의 바이러스 출아 또는 방출, 감염성 바이러스의 생산, 또는, 바이러스 융합 또는 감염, 역전사 또는 핵산 복제, 세포성 DNA내로의 바이러스 삽입, 세포로부터의 바이러스 출아 또는 방출, 또는 감염성 바이러스의 생산에 관여하는 효소를 억제하는 것이 특징인 방법.
  81. 제68항에 있어서, 항바이러스제는 폴리펩티드 또는 기능적 모방체인 것이 특징인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 폴리펩티드 또는 기능적 모방체는 바이러스 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 것이 특징인 방법.
  83. 제81항에 있어서, 폴리펩티드는 리간드, 바이러스성 수용체, 항체 또는 이의 단편인 것이 특징인 방법.
  84. 제80항에 있어서, 효소는 단백분해효소, 역전사효소 또는 인테그라제인 것이 특징인 방법.
  85. 제68항에 있어서, 항바이러스제는 단백분해효소 억제제, 뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제, 인테그라제 억제제 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 뉴클레오시드 억제제는 지도부딘(AZT), 스타부딘(d4T), 라르니부딘(3TC), 디다노신(DDI), 잘시타빈(ddC), 아바카비르 및 이들의 혼합물인 것이 특징인 방법.
  87. 제85항에 있어서, 비뉴클레오시드 억제제는 네비라핀, 델라비르딘 또는 에파비렌즈로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  88. 제68항에 있어서, 항바이러스제는 단백분해효소 억제제, 역전사효소 억제제 또는 인테그라제 억제제인 것이 특징인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 단백분해효소 억제제는 사퀴나비르, 리토나비르, 인디나비르, 넬피나비르 또는 암프레나비르인 것이 특징인 방법.
  90. 제68항에 있어서, 항염증제는 염증성 세포 모집의 감소, 케모킨 생산의 감소, 프로-염증성 사이토킨 생산의 감소, 또는 케모킨 수용체와 그 리간드의 상호작용의 방해를 야기하는 것이 특징인 방법.
  91. 제68항에 있어서, 항염증제는 항염증성 항체, 항염증성 펩티드, 항염증성 사이토킨, 항염증성 케모킨, 항염증성 핵산, 스테로이드, 비스테로이드성 항염증성 약물, 5-ASA 산물, 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 항염증성 항체는 항-사이토킨 항체, 항-사이토킨 수용체 항체, 항-케모킨 항체, 항-케모킨 수용체 항체, 항-프로염증성 펩티드 항체, 및 이들의 조합물로 구성된 선택된 군에서 것이 특징인 방법.
  93. 제91항에 있어서, 항염증성 펩티드는 LFA-1 길항제, 사이토킨 수용체 길항제, 전사인자 및 가용성 TNF-α 수용체로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  94. 제91항에 있어서, 항염증성 사이토킨은 IL-4, IL-10, IL-13, IL-16 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  95. 제91항에 있어서, 항염증성 핵산은 리보자임, 항염증성 펩티드를 암호화하는 핵산, 안티센스 핵산 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  96. 제95항에 있어서, 안티센스 핵산은 사이토킨 수용체, 염증성 사이토킨, 케모킨 또는 케모킨 수용체를 암호화하는 핵산과 하이브리드하는 것이 특징인 방법.
  97. 제91항에 있어서, 스테로이드는 플루니솔리드, 트리암시놀린, 트리암시놀린 아세토니드, 베클로메타손 디프로프리오네이트, 베타메타손 디프로프리오네이트, 하이드로코르티손, 코르티손, 덱사메타손, 부데소니드, 프레드니손, 메틸 프레드니솔론, 프레드니솔론 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  98. 제91항에 있어서, 비스테로이드성 항염증성 약물은 살리실산, 나트륨 티오살리실레이트, 콜린 살리실레이트, 마그네슘 살리실레이트, 디플루니살, 이부프로펜, 나프록센, 술린닥, 디플루니살, 살리실살리실산, 콜린 마그네슘 트리살리실레이트, 아세틸살리실산, 살살레이트, 나트륨 살리실레이트 및 이들의 조합물로 구성된 살리실산 유도체 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  99. 제91항에 있어서, 비스테로이드성 항염증성 약물은 플루르비프로펜, 페노프로펜, 나부르네톤, 케토프로펜, 피록시캄, 인도메타신, 톨메틴, 메클로파나메이트 나트륨, 메페남산, 에토돌락, 케토롤락 트로메타민, 디클로페낙, 옥사프로진, 브롬페낙 나트륨, 로페콕시브, 수프로펜, 펜부프로펜, 플루프로펜, 탈리도미드, 달맞이꽃 오일, 이들의 단일 이성질체 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  100. 제91항에 있어서, 5-ASA 산물 메살아민, 발살라지드, 이프살라지드, 올살라진, 술파살라진 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  101. 활성화 억제량의 항염증제를 바이러스 감염된 세포와 접촉시키는 단계를 포함하며, 항염증제는 5-ASA 또는 ASA와 구별되는 것이 특징인 레트로바이러스 활성화를 억제하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 항염증제는 항염증성 항체, 항염증성 펩티드, 항염증성 사이토킨, 항염증성 케모킨, 항염증성 핵산, 스테로이드, 비스테로이드성 항염증성 약물 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  103. 억제 유효량의 항염증제를 점막 조직과 접촉시키는 단계를 포함하며, 항염증제는 5-ASA 또는 ASA와 구별되는 것이 특징인 점막 조직의 염증 매개성 감염을 억제하는 방법.
  104. 제103항에 있어서, 항염증제는 항염증성 항체, 항염증성 펩티드, 항염증성 사이토킨, 항염증성 케모킨, 항염증성 핵산, 스테로이드, 비스테로이드성 항염증성 약물 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  105. 유효량의 항염증제를 피험체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 항염증제는 5-ASA 또는 ASA와 구별되는 것이 특징인, 염증 매개성 점막 감염에 걸리거나 걸릴 위험성이 있는 피험체에서 염증 매개성 점막 감염을 억제하는 방법.
  106. 제105항에 있어서, 항염증제는 항염증성 항체, 항염증성 펩티드, 항염증성 사이토킨, 항염증성 케모킨, 항염증성 핵산, 스테로이드, 비스테로이드성 항염증성 약물 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  107. HIV 바이러스 진행을 억제하는 항염증제를 치료 유효량으로 HIV 바이러스 감염된 피험체에 투여하는 단계를 포함하여, 사람 면역부전 바이러스 감염에 걸린 피험체 내 HIV-관련 장애의 진행을 억제하는 방법.
  108. 제107항에 있어서, 항염증제는 5-ASA 또는 ASA와 구별되는 것이 특징인 방법.
  109. 제107항에 있어서, 항바이러스제를 투여하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 방법.
  110. 피험체의 HIV 감염 가능성을 감소시키거나 억제하는 항염증제를 예방 유효량으로 피험체에 투여하는 단계를 포함하여, HIV 감염 위험성이 있는 피험체의 감염 가능성을 예방 또는 감소시키는 방법.
  111. 제110항에 있어서, 항염증제는 ASA 또는 5-ASA와 구별되는 것이 특징인 방법.
  112. 제110항에 있어서, 항염증제 투여전, 동시, 또는 투여후 항바이러스제를 투여하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 방법.
  113. 제107항 또는 제110항에 있어서, 항염증제는 국소적으로 투여되는 것이 특징인 방법.
  114. 제107항 또는 제110항에 있어서, 항염증제는 전신적으로 투여되는 것이 특징인 방법.
  115. 1회 이상 투여량의 치료 유효량의 항염증제를 약학적 허용 담체 내에 포함하는 약학 조성물로서, 투여량은 면역부전 바이러스 감염의 가능성을 억제 또는 감소시키는 유효량인 것이 특징인 약학 조성물.
  116. 제115항에 있어서, 항바이러스제를 더 포함하는 것이 특징인 약학 조성물.
  117. 제115항에 있어서, 약학적 허용 젤, 크림, 포옴 또는 좌약을 더 포함하는 것이 특징인 약학 조성물.
  118. 1종 이상의 항염증제 및 면역부전 바이러스 감염의 가능성을 치료, 예방 또는 감소시키는데 있어서 약제의 사용 설명서를 포함하는 제품.
  119. 제118항에 있어서, 항바이러스제를 더 포함하는 것이 특징인 제품.
  120. 제118항에 있어서, 콘돔, 스폰지, 페사리, 자궁용 캡, 질용 링, 좌약 및 관장제로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 제품
  121. 활성화 억제 유효량의 항염증제를 조직과 접촉시키는 단계를 포함하여, 바이러스 감염된 조직 내 레트로바이러스 활성화를 억제하는 방법.
  122. 제121항에 있어서, 항염증제는 ASA 또는 5-ASA와 구별되는 것이 특징인 방법.
  123. 제121항에 있어서, 항염증제 투여전, 동시, 또는 투여후 항바이러스제를 조직과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 방법.
  124. 활성화 억제 유효량의 항염증제를 피험체와 접촉시키는 단계를 포함하여, 바이러스 감염된 피험체 내 레트로바이러스 활성화를 억제하는 방법.
  125. 제124항에 있어서, 항염증제는 ASA 또는 5-ASA와 구별되는 것이 특징인 방법.
  126. 제124항에 있어서, 항염증제 투여전, 동시, 또는 투여후 항바이러스제를 피험체와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 방법.
  127. 1종 이상의 항염증제 및 면역부전 바이러스 감염의 예방에 있어서 약제의 사용 설명서를 포함하는 제품.
  128. 제127항에 있어서, 항바이러스제를 더 포함하는 것이 특징인 제품.
  129. 제127항에 있어서, 콘돔, 스폰지, 페사리, 자궁용 캡, 질용 링, 좌약 및 관장제로 구성된 군에서 선택된 것이 특징이 제품
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