CN105456273A

CN105456273A - 奈韦拉平在制备抗炎药物中的应用

Info

Publication number: CN105456273A
Application number: CN201410441876.XA
Authority: CN
Inventors: 李春启; 周娟; 宋如顺; 高羽军; 吴耀东
Original assignee: HANGZHOU LEISUO PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HANGZHOU LEISUO PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2016-04-06

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及奈韦拉平在制备预防和治疗炎症相关疾病药物中的应用，所述的炎症为无菌性炎症和免疫性炎症。本发明涉及的奈韦拉平在制备抗炎药物中的用途属于首次公开，通过硫酸铜诱导斑马鱼炎症模型实验研究，结果表明奈韦拉平能促进炎症部位中性粒细胞的消退，具有抗炎、消炎作用。因此，所述奈韦拉平对炎症相关疾病具有明显的抗炎作用，可用于制备防治炎症相关疾病的药物。

Description

奈韦拉平在制备抗炎药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及奈韦拉平在制备预防和治疗炎症相关疾病药物中的应用。

背景技术

炎症是一种对入侵的病原体或无菌性组织损伤的一种有益的宿主反应。炎症反应是一种由细胞和炎性介质在时间和空间上共同作用的结果，达到中和或者消除损伤刺激来维持内环境稳态的结果。虽然炎症主要是一种生理和有益的过程，但是不能消退的炎症过程将导致许多炎症疾病的发生，如类风湿性关节炎、炎症性肠病、哮喘、牛皮癣、系统性红斑狼疮、多发性硬化、全身性脉管炎、动脉粥样硬化、鼻炎等。

对于炎症的治疗，早期曾广泛使用糖皮质激素类抗炎药（地塞米松、强的松和可的松等），但长期使用会产生依赖性，易引起肾上腺皮质功能衰退等副作用。自20世纪50~60年代出现阿司匹林、保泰松、吲哚美辛、和布洛芬等药物后，非甾体抗炎药（NonsteroidalAntiinflammatoryDrugs，NSAIDs）引起了人们的关注，并逐渐成为抗炎药研究和开发的重点。传统的NSAIDs通过抑制COX，抑制炎症部位前列腺素PG的合成，产生抗炎作用，由于胃肠道PG合成也受到了抑制，副作用较多。到20世纪90年代，发现COX存在两种亚型：COX-1和COX-2。COX-1存在于大多数组织中，其功能是合成前列腺素来调节细胞的正常生理功能，对胃肠道黏膜起保护作用。COX-2是一个诱导酶，在正常生理状态下，其水平很低，但在炎症细胞中，被有丝分裂原（如LPS）和炎症细胞因子（如TNF、IL-1、PAF）、内毒素等刺激，可导致COX-2的大量产生，表达水平升高数十倍，促进炎症反应和组织损伤。选择性的抑制COX-2的抑制剂成为研究热点，现在上市的有塞来昔布（Celecoxib）、罗非昔布（Rofecoxib）、伐地昔布（Valdecoxib）和帕瑞昔布（Precoxib）等。但是由于选择性COX-2抑制剂抑制血管内皮的前列腺素生成，使血管内的前列腺素和血小板中的血栓素动态平衡失调，导致血栓素升高，促进血栓形成。这也是COX-2的抑制剂引起心血管风险发生的一个主要原因。与此同时，随着人们对促炎症消退因子认识的深入，针对此策略的靶点研究越来越多。迄今为止发现的促炎症消退介质有Cyclopentenoneprostaglandins、Lipoxins/resolvins、NF-κB、Mediatorsofapoptosis(caspases,CD44,etc.)、Annexin-1，针对上述靶点的药物研发如火如荼的进行中。寻求新的化合物来治疗无菌性炎症和免疫性炎症疾病已成为研发热点和难点，开发自主知识产权的抗炎药物迫在眉睫。

炎症反应的最重要功能是将炎症细胞输送到炎症局部，白细胞的渗出是炎症反应最重要的特征。炎症的不同阶段，游出的白细胞也不同。在急性炎症的早期，中性粒细胞首先游出，48小时后组织内则以单核细胞浸润为主。中性粒细胞和单核细胞渗出可吞噬和降解细菌、免疫复合物和坏死组织碎片，构成炎症反应的主要防御环节。但白细胞也可通过释放酶、化学介质和毒性自由基等，引起组织损伤并可能延长炎症过程。因此，促进炎症部位中性粒细胞的消退是评价抗炎药效的一个指标。

斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因同源性高达85%，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，具有体积小（可用微孔板分析）、发育周期短、体外受精、透明（可直接用肉眼和解剖显微镜观察）、单次产卵数较高等特点。斑马鱼模型既具有体外实验快速、高效、低廉、用药量小等优势，又具有哺乳类动物实验预测性强、可比度高、可观察多个器官等优点，近年已在化合物药效、毒性评价中得到广泛应用。研究者建立了中性粒细胞特异发荧光的斑马鱼，利用硫酸铜特异的损伤斑马鱼侧线附近的神经丘，引起中性粒细胞从血管中游出，向神经丘部位聚集，利用这一原理，研究者在此模型中进行了抗炎化合物的高通量筛选，直接定量观察体内的炎症反应，这一模型促进了抗炎药物的筛选过程。

综上所述，本研究利用硫酸铜诱导斑马鱼炎症模型高通量筛选抗炎药物，寻求新的化合物来有效抗炎，从而开发具有自主知识产权的抗炎药物，为人类健康带来福音。

奈韦拉平（英文名称：nevirapine；化学结构名称：11-环丙基-5，11-二氢-4-甲基-6氢-双吡啶-[3，2-b：2，3-e][1，4]二氮杂卓-6-酮，分子式为C₁₅H₁₄N₄O，分子量为266.3。）是HIV-1的非核苷类逆转录酶抑制剂，奈韦拉平与HIV-1的逆转录酶直接连接并且通过使此酶的催化端破裂来阻断RNA依赖和DNA依赖的DNA聚合酶活性。奈韦拉平与其它抗逆转录病毒药物合用治疗HIV-1感染。

至今尚未见有关奈韦拉平抗炎活性及抗炎靶点活性的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供奈韦拉平在制备防治炎症相关疾病药物中的新用途。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：现有化合物奈韦拉平，其结构式如下：

。

本发明中利用硫酸铜诱导斑马鱼炎症模型，硫酸铜特异的损伤侧线附近的神经丘，可以观察到标记绿色荧光蛋白的中性粒细胞从血管中向损伤的神经丘游出或聚集。给予奈韦拉平治疗后，可以显著促进神经丘部位的中性粒细胞消退，具有明显的抗炎作用。

本发明中奈韦拉平及其衍生物在制备抗炎药物中的用途属于首次公开，可以用于炎症相关性疾病包括无菌性炎症和免疫性炎症的防治。无菌性炎症包括：骨性关节炎、炎症性肠病、前列腺炎、支气管炎、鼻炎、咽炎、慢性结肠炎、胰腺炎等。免疫性炎症包括：类风湿性关节炎、哮喘、牛皮癣、系统性红斑狼疮、多发性硬化、全身性脉管炎等。

奈韦拉平价格低廉、安全性高、原料来源广泛，辅以药学上可接受的辅料，采用常规制剂技术即可制成各种口服、注射，外用制剂等剂型，具有良好的开发前景。

附图说明

图1奈韦拉平在硫酸铜诱导斑马鱼炎症模型的抗炎药效图。在空白组中，中性粒细胞大多数分布在血液系统中；硫酸铜诱导后，侧线神经丘损伤，引起中性粒细胞的聚集，模型组中性粒细胞个数可达13.5个，与空白组相比，差异显著（p<0.01），表明模型建立成功。阳性组吲哚美辛处理后，中性粒细胞个数为4个，与模型组相比，差异显著（p<0.01），表明吲哚美辛有显著抗炎药效，治疗效率为70.3%；奈韦拉平处理后，中性粒细胞为4.4个，与模型组相比，差异显著（p<0.01），表明其有显著抗炎药效，治疗效率为67.4%。红色箭头所示为斑马鱼侧线附近中心粒细胞。

图2奈韦拉平在硫酸铜诱导斑马鱼炎症模型的抗炎药效柱状图。奈韦拉平在10、30、100μM浓度下，在硫酸铜诱导斑马鱼炎症模型中的抗炎药效，抗炎治疗效率分别为20.3%、36.8%（p<0.01）、53.1%（p<0.01），各浓度组中未观察到毒性表型，表明奈韦拉平在无毒性浓度内有显著抗炎药效，且量效关系明确。

图3奈韦拉平在硫酸铜诱导斑马鱼炎症模型的抗炎药效图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步阐述，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例一定量观察单浓度奈韦拉平在斑马鱼炎症模型中的抗炎药效

斑马鱼：

本实施例使用的斑马鱼为MPO-GFP斑马鱼，饲养和使用标准严格参照美国实验动物管理和使用委员会(IACUC)的要求进行。

养鱼水(Fishwater)：

配置方法：1L反渗透水(reverseosmosis(RO)water)加入0.3g海盐(InstantOceansalts)。

二甲基亚砜(DMSO，分析纯)：

购买于阿拉丁(货号#1095515，批号#30573)。1%DMSO溶液(阴性对照)配置：使用时，用养鱼水配置成浓度为1.0%的工作液，现配现用。

硫酸铜(诱导剂)：

购自西陇化工股份有限公司，批号069H155。使用时，用0.1%DMSO溶液配置成实验所需的浓度，本实验中硫酸铜的使用浓度为50μM。

吲哚美辛（阳性对照药）：

购自阿拉丁，批号：13931。使用时，用1.0%DMSO溶液配置成实验所需的浓度，本实验中吲哚美辛的使用浓度为100μM。

奈韦拉平(nevirapine)：

购买于Sigma-Aldrich公司，使用时用1.0%DMSO溶液配置成100μM进行实验。

实验方法：

(1)实验分组及幼鱼处理：取96尾发育良好的斑马鱼幼鱼，幼鱼发育时相为受精后3dpf(day-postfertilization，dpf)，随机分为12组(模型组、溶剂组、阳性药物组、药物组)，每组胚胎数量为5只。操作时将幼鱼随机分配至96孔细胞培养平板(Greiner，德国)中，每孔5尾幼鱼，每孔饲养用水200μL。

(2)药物预处理：用移液器(量程100～1000μL，Eppendorf)迅速将预先配置好的药物加入96孔细胞培养平板对应的孔中，每孔180μL，终浓度为100μM。加药液之前，用移液器(量程10～1000μL，Eppendorf)将96孔板中孵育胚胎的饲养用水尽力移出，此操作需在短时间内预先完成，以防止胚胎干燥。实验环境温度控制在28.5℃左右，相对湿度40～70%。然后用锡箔纸将96孔板包裹好，做好实验标记，迅速放置于斑马鱼培养箱中继续培养1h(培养箱温度控制在28.5±0.5℃)。

(3)硫酸铜诱导：药物预处理1h后，加入硫酸铜溶液20μL，使终浓度为50μM，共同孵育2h。

(4)共同孵育2h后，移除溶液，用鱼水清洗3次，在荧光显微镜下拍照，对斑马鱼侧线附近的中性粒细胞进行定量分析，计算药物的抗炎治疗效率，公式如下：

（5）统计学处理结果以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用Dunnett’sT-检验进行统计学处理，p<0.05为差异性显著。

结果见表1、图1。在空白组中，中性粒细胞大多数分布在血液系统中；硫酸铜诱导后，侧线神经丘损伤，引起中性粒细胞的聚集，模型组中性粒细胞个数可达13.5个，与空白组相比，差异显著（p<0.01），表明模型建立成功。阳性组吲哚美辛处理后，中性粒细胞个数为4个，与模型组相比，差异显著（p<0.01），表明吲哚美辛有显著抗炎药效，治疗效率为70.3%；奈韦拉平处理后，中性粒细胞为4.4个，与模型组相比，差异显著（p<0.01），表明其有显著抗炎药效，治疗效率为67.4%。

表1奈韦拉平在硫酸铜诱导斑马鱼炎症模型的抗炎药效（mean±sem）

与空白组相比，#，p<0.01；与溶剂组相比，*，p<0.01，**，p<0.01

实施例二定量观察多浓度奈韦拉平在斑马鱼炎症模型中的抗炎药效

实验方法同实施例一，在12孔板中，每孔15尾鱼，1ml鱼水，观察奈韦拉平在10、30、100μM浓度下，在硫酸铜诱导斑马鱼炎症模型中的抗炎药效，抗炎治疗效率分别为20.3%、36.8%（p<0.01）、53.1%（p<0.01），各浓度组中未观察到毒性表型，表明奈韦拉平在无毒性浓度内有显著抗炎药效，且量效关系明确。

表2奈韦拉平在硫酸铜诱导斑马鱼炎症模型的抗炎药效（mean±sem）

与空白组相比，#，p<0.01；与溶剂组相比，*，p<0.01，**，p<0.01。

Claims

1.奈韦拉平在制备预防和治疗炎症相关性疾病药物中的用途，其特征在于炎症相关性疾病包括无菌性炎症和免疫性炎症，所述化合物奈韦拉平结构式如下：

。

2.根据权利要求1，其特征在于，所述的无菌性炎症包括：骨性关节炎、炎症性肠病、前列腺炎、支气管炎、鼻炎、咽炎、慢性结肠炎、胰腺炎等。

3.根据权利要求1，其特征是，所述的免疫性炎症包括：类风湿性关节炎、哮喘、牛皮癣、系统性红斑狼疮、多发性硬化、全身性脉管炎等。

4.根据权利要求3所述的无菌性炎症包括上述疾病，但不限于上述疾病。

5.根据权利要求4所述的免疫性炎症包括上述疾病，但不限于上述疾病。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为口服给药剂型、注射给药剂型、粘膜给药剂型或经皮给药剂型。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射液、贴剂或凝胶剂形式。