KR20020017676A - 대식세포특이과립에 대한 자가항체, 대식세포 관련 질환의진단방법 및 대식세포 관련 질환의 피검대상의 예후판정방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대식세포특이과립(granules in macrophage ; GiM)에 특이적인 항체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 대식세포 관련 질환의 진단방법에 있어서, 피검대상으로부터 분리한 생물학적 시료를 항원인 대식세포특이과립(GiM)과 접촉시키는 단계; 및 항원항체반응을 이용하여 상기 생물학적 시료에 대식세포특이과립(GiM)에 특이적인 자가항체("항 GiM 항체")가 존재하는지 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

나아가, 본 발명은 대식세포관련 질환의 피검대상의 예후 판정 방법에 있어서, 상기 피검대상으로부터 채취한 생물학적 시료로부터 항GiM항체의 역가를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

Description

대식세포특이과립에 대한 자가항체, 대식세포 관련 질환의 진단방법 및 대식세포관련 질환의 피검대상의 예후 판정방법{auto-antibody of granules in macrophage, a method for diagonosing associated with macrophage and a method for diagonosing prognosis of patient having diseases associated with macrophage}

본 발명은 대식세포특이과립 (granules in macrophage ; GiM)에 대한 항체, 피검대상의 생물학적 시료 중 대식세포특이과립에 대한 자가항체의 존재여부를 면역학적 검사법으로 판단하여 류마티스 관절염을 비롯한 여러 대식세포관련 질환을 진단하는 방법 및 대식세포특이과립에 대한 자가항체를 예후판정에 이용하는 방법에 관한 것이다.

대식세포는 골수의 단구아세포(monoblast)로부터 전단핵세포(promonocyte) 및 말초혈액 단핵구(monocyte)의 성숙과정을 통해 조직(tissue)내의 대식세포로 분화하게 된다. 이 대식세포는 간, 폐, 소화기, 뇌, 뼈, 활액막, 피부 등 우리신체 대부분의 조직 내에 거주한다.

한편, 전단핵세포와 단핵구내에는 두 종류의 과립이 소수 흩어져 존재하는데, 첫 번째 과립은 변형된 라이소솜(lysosome)으로서 호중구(neutrophil)내에 풍부한 일차과립(아주르친화성 과립, azurophilic granule)과 동일한 과립으로 과산화효소(peroxidase)를 비롯한 여러 종류의 효소들을 함유하여 이물질 등에 대한 분해 및 소화 기능을 한다. 두 번째 과립은 호중구에 존재하는 어떤 과립과도 다른 것으로서 그 성분이나 기능은 알려진 바 없다. 따라서, 본 발명자는 이하 상기 두 번째 과립을 대식세포특이과립(granules in macrophage ; GiM)이라고 명명하고자 한다.

그런데, 단핵구에서 대식세포로 분화되는 과정에서 일차과립은 거의 소실되지만 두 번째 과립인 대식세포특이과립(GiM)이 소실 또는 증가된다는 등에 대한 보고는 아직 없다.

한편, 우리 몸에 있는 면역계는 외부의 적으로부터 국가를 보호하는 군대에 비유될 수 있다. 그러나, 자가면역 질환은 외적을 무찌르지 않고 아군을 해치는 쿠데타와 같은 상황으로 자가면역항체는 혈액 속에 있는 일종의 반란군에 해당된다.

자가항체를 검출하는 대표적인 검사법은 간접면역형광법으로서 이는 반란군(자가항체)이 주로 공략하는 아군(항원)이 풍부한 세포나 조직을 기질로 하고 여기에 환자의 혈청을 반응시키면 이들은 서로 결합하게 된다. 다음 단계로 항체를 구성하는 인간의 면역글로불린을 동물에 주사하여 얻어진 2차 항체에 형광물질을 붙인 후 다시 반응시키면 자가항체가 결합된 부위에서만 반응이 일어난다. 이를 형광현미경으로 관찰하면 세포내의 형광의 위치나 양상에 따라 특정 자가항체의 존재유무를 판독할 수 있다.

한편, 비교적 최근에 알려진 항호중구세포질 항체(anti-neutrophil cytoplasmic antibody: ANCA)는 호중구와 단핵구에 존재하는 일차과립에 대한 자가항체로서 각종 혈관염 등의 진단에 유용하게 이용되고 있다.

본 발명자는, 상기 일차과립에 대한 자가항체가 존재한다는 사실로부터, 전술한 대식세포특이과립에 대한 자가항체도 존재할 가능성이 있을 것이라고 예상하였다. 따라서, 자가면역질환을 갖는 환자의 혈청으로부터 상기 대식세포특이과립에 대한 자가항체를 찾고자 하였다.

도 1은 대식세포주인 IT-1세포를 이용하여 항GiM항체를 간접면역형광법에 의해 검출한 형광현미경사진이다. 핵의 한쪽 주변부에 다수의 과립이 관찰된다.

대식세포특이과립은 일반 염색으로는 관찰이 용이하지 않으므로 일차과립이 소실되는 대식세포를 기질로 하여 대식세포특이과립에 대한 자가항체를 찾고자 하였다. 자가면역질환을 갖고 있는 환자의 혈청들을 이용하여 상기 대식세포에 대한 간접면역형광법을 시도하였다. 그 결과, 핵주변 한편에 다수의 과립(juxtanuclear granular unilaterally)의 형광 양상이 관찰되었다. 또한, 대식세포에서 유래된 IT-1 세포주(KFCC 10772)를 이용한 결과 동일한 형광양상의 양성소견이 관찰되었다(도 1). 이는 최초의 발견으로, 대식세포에서 상기 대식세포특이과립이 증가한다는 점과 자가면역질환을 갖고 있는 환자들의 혈청에 대식세포특이과립에대한 자가항체가 존재한다는 사실이 동시에 입증된 것이다.

상기 새롭게 발견된 자가항체가 항호중구세포질 항체(ANCA)일 가능성을 배제하기 위하여 호중구를 기질로 하고 동일한 혈청을 이용하여 간접면역형광법을 시행하였으나 결과는 ANCA음성이었다. 또한, 대식세포특이과립의 세포형태학적 위치가 골지복합체(Golgi complex)와 유사하여, 상피세포주인 HEp-2 (ATCC CCL 23)세포주를 기질로 하고 동일한 혈청을 이용하여 간접면역형광법을 수행하였으나 그 결과도 음성이었다.

골지복합체에 대한 자가항체의 형광양상은 핵의 한쪽편에 위치하는 점은 GiM 항체와 유사하나 과립이 아니라 무정형의 불규칙한 덩어리의 형태이며 그 양도 적다.

따라서, 본 발명자는 이 새로운 자가항체가 ANCA 및 항 골지복합체 항체와 구분되는 것임을 발견하고, 이를 항 대식세포 과립 항체(anti-GiM)로 명명하였다.

항GiM항체의 임상적 적용을 위하여 다수의 환자들을 대상으로 항GiM항체의 존재여부 검사를 시행해본 결과, 주로 대식세포와 밀접한 연관이 있는 류마티스 관절염을 포함한 자가면역질환, 신장질환(신장염, 사구체신염, 신증후군, IgA신증 등), 호흡기 질환(기관지폐렴, 기관지 확장증 등), 순환기 질환(동맥경화, 헨녹-쉔라인 자반증, 베체씨 병 등), 간질환(B형 간염, 간경화 등), 호산구증가를 동반한 기생충감염(간디스토마 등), 내분비 질환(그레이브씨병 등), 각종 악성종양 등의 질환을 갖는 환자들에서 항GiM 자가항체가 관찰되었다. 따라서, 환자의 생물학적 시료로부터 항GiM 자가항체의 존재여부의 검사는 상기 질환에 대한 진단에 적용할수 있다.

한편, 대식세포는 직간접적으로 왕성한 항암작용을 하는 대표적인 세포로 알려져 있다. 따라서, 항 GiM항체가 나타날 가능성과 이 항체의 역가 변화에 따라 예후를 추정할 수 있을 것으로 생각되었다. 악성종양환자를 대상으로 항GiM항체검사를 시행한 결과 일부 악성종양환자에서 항GiM항체가 검출되었다. 나아가, 흥미롭게도 일부 추적이 가능한 환자를 관찰한 결과, 치료에 따른 호전과 함께 항GiM항체의 역가가 감소한다는 것을 발견하였다. 따라서, 악성종양의 치료가 화학요법에서 면역요법으로 전환되고 있는 추세이므로 향후 악성종양의 재발, 전이, 병기의 진행 및 암세포의 성공적 제거 여부를 나타내는 예후지표로 항GiM 자가항체의 역가 변화를 사용할 수 있다. 즉, 이 항체의 역가 변화에 따라 예후를 추정할 수 있다.

한편, 본 발명자에 의해 발견된 항GiM항체는 바이러스 및 세균등에 의한 감염성 질환, 중추 신경계 질환, 피부 질환 및 비뇨생식기 질환등에도 적용될 수 있고, 아울러 세포생물학이나 면역학 연구에도 이용할 수 있다.

항GiM항체는 A 단백 혹은 G 단백친화콜룸(A or G protein affinity column)을 이용하여 정제할 수 있고, 항원친화콜룸(antigen-affinity column)을 이용하면 순수한 항원특이항체를 분리할 수 있다(Using Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp 70-73). 분리된 항GiM항체는 배양된 대식세포로부터 과립을 분리하여 이를 이용한 효소면역법 등으로 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 대식세포 관련 질환의 진단방법은 다음과 같은 단계를 포함한다: 피검대상으로부터 분리한 생물학적 시료를 항원인 대식세포특이과립(GiM)과접촉시키는 단계; 및 항원항체반응을 이용하여 상기 생물학적 시료에 대식세포특이과립(GiM)에 특이적인 자가항체(항 GiM 항체)가 존재하는지 확인하는 단계.

상기 항원으로서 대식세포특이과립은 대식세포특이과립을 함유하는 대식세포 또는 대식세포주를 사용할 수 있고, 상기 대식세포로부터 분리된 순수한 대식세포특이과립을 사용할 수 있다.

피검대상의 생물학적 시료 중 항GiM항체가 존재하는지 여부를 판단할 항원항체반응의 기질로서 대식세포를 사용하는 경우, 대식세포는 전술한 바처럼 신체의 거의 모든 장기에 존재하나 주로 골수액, 관절액, 복막액, 늑막액, 기관지 세척액 등에서 검출이 가능하고 가장 용이한 것은 말초혈액에서 단핵구를 분리한 후 이를 배양하여 이용할 수 있다.

대식세포로부터 대식세포특이과립을 순수분리하는 방법은 포르말린으로 고정시킨 후 초고속원심분리법을 적용하면 된다.

한편, 본 발명자가 새로이 대식세포로부터 확립한 IT-1 세포주(KFCC 10772)는, 항 마이크로튜블조직화중심(microtubule organizing center : MTOC)에 대한 자가항체의 발견(한국특허제182853호) 및 항핵항체 검사(한국특허제093758호, 제103157호)의 새로운 기질에 이용된 바 있다. IT-1 세포주는 항GiM항체, 항핵항체 및 항세포질항체를 동시에 검사할 수도 있다.

피검대상의 생물학적 시료로는 전혈, 혈청, 혈장 등의 혈액, 관절액, 또는 늑막액 등이 사용될 수 있다.

피검대상으로부터 유래된 생물학적 시료 중 있을 수 있는 자가항체가 대식세포특이과립과 반응했는지 여부는 간접면역형광법, 방사능면역분석법 또는 효소면역분석법을 이용하여 확인할 수 있지만, 이 방법에 국한되는 것은 아니다.

예후지표로 사용하기 위해 항GiM 자가항체의 역가 변화는 인산완충액으로 시료를 2배수 희석하여 적용한다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

헤파린이 첨가된 튜브에 건강인의 말초혈액 8㎖를 채취하여 Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech, Sweden)를 이용한 density gradient 원심분리법으로 단핵세포층을 분리하였다. 10% 송아지 혈청을 첨가한 RPMI-1640 배지에서 상기 분리된 세포를 24시간 배양(37℃, 5% 탄산가스)한 후 배양액을 제거하였다. 이때 혼입된 임파구등은 배양액과 함께 제거되고 대식세포만 배양 플라스크 표면에 접착하여 남게 되었다.

동일한 배지를 다시 첨가하여 10일간 같은 조건에서 배양한 후 trypsin-EDTA 용액으로 부착된 대식세포를 떼어내어 다수의 구멍이 그려져 있는 면역형광검사용 슬라이드로 옮기고 같은 조건에서 24시간 이상 배양하였다. 각 슬라이드로부터 배양액을 제거하고 인산완충액으로 세척한 후 아세톤-메탄올 혼합액에 담궈 고정하였다.

류마티스 관절염 환자 20명의 혈청을 1:20으로 희석하여 준비된 슬라이드에 30㎕씩 떨어뜨리고 습윤 상자 내에서 30분간 반응시킨 후 인산완충액이 채워진 코프란병에 넣고 진탕하여 세척하였다.

FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트: Fluorescein isothiocyanate)로 라벨화된 인간 감마 글로불린에 대한 토끼 항체(DAKO, Denmark) 30㎕를 각 슬라이드에 적용하여 30분간 습윤상자 내에서 반응시킨 후 인산 완충액으로 세척하고 에반스블루 용액으로 배염색 한 후 인산완충액-글리세롤 용액으로 마운팅하여 형광현미경 상에서 관찰하였다.

그 결과 대식세포 핵의 한쪽 편에 다수의 과립이 관찰되었고 20명 중 12명에서 항GiM항체 양성 소견을 보였다.

[실시예 2]

실시예 1에서 확인한 항GiM항체가 항호중구세포질 항체(ANCA)일 가능성을 배제하기 위해 다음과 같은 시험을 수행하였다.

건강한 O형 말초혈액을 헤파린이 첨가된 튜브에 8㎖ 채취하여 원심분리 한 후 백혈구 층을 분리하였다. 혼입된 적혈구를 제거하기 위해 용혈완충액(lysis buffer) 5㎖을 넣고 다시 원심분리하여 상층액을 제거하였다.

Ficoll-Hypaque을 이용한 density gradient 원심분리법으로 단핵세포층을 분리 제거한 후 순수분리된 호중구 세포를 인산 완충액 10㎖에 재부유시킨 후 면역형광검사용 슬라이드에 30㎕씩 접종한 후 세포원심분리(cytocentrifugation)시켰다. 실온에서 건조시킨후 99% 에탄올로 5분간 고정시켰다.

항GiM 항체가 검출된 12명의 혈청을 1:20으로 희석하여 준비된 슬라이드에 30㎕씩 떨어뜨리고 실시예 1과 동일한 방법으로 간접면역형광법 검사를 시행하였다. 그 결과 상기 혈청에 존재하는 항체가 호중구세포질이나 핵주변에 결합하지 아니한다는 것을 관찰하였다. 따라서, 상기 항GiM 항체는 ANCA 가 아님을 알 수 있었다.

[실시예 3]

실시예 1에서 확인한 항GiM항체가 항 골지복합체 항체일 가능성을 배제하기 위해 다음과 같은 시험을 수행하였다.

항핵항체 검사를 위해 시판중인 HEp-2 세포주 부착 슬라이드(미국 Hemagen 사, 일본MBL사 제품)를 사용하고, 항GiM 항체가 검출된 12명의 혈청을 1:20으로 희석하여 준비된 슬라이드에 30㎕씩 떨어뜨리고 실시예 1과 동일한 방법으로 간접면역형광법 검사를 시행하였다. 그 결과 두 회사제품 모두에서 상기 혈청에 존재하는 항체가 골지복합체에 결합하지 아니한다는 것을 관찰하였다. 따라서, 상기 항GiM 항체는 항 골지복합체 항체가 아님을 알 수 있었다.

[실시예 4: 대식세포주 IT-1을 이용한 확인시험]

IT-1 세포주를 배양하여 IT-1 세포주 부착 슬라이드를 만들고 실시예 1과 동일한 간접면역형광법 검사를 시행하였다.

그 결과 12명 모두에서 특징적인 항GiM항체 양성소견이 관찰되었다(도 1 참조).

[비교예 1]

정상인 52명의 혈액에 대하여 실시예 1과 동일한 방법으로 검사를 시행하였으나 양성자는 관찰되지 않았다.

[실시예 5: 류마티스 관절염 및 자가 면역 관련 질환에 대한 항GiM항체의 임상적 적용]

검사상의 편의와 재현성 등을 고려하여 이미 확립되어 있는 대식세포주 IT-1을 기질로 하여 항핵항체 검사가 의뢰된 환자의 혈청을 대상으로 항GiM 항체 검사를 시행하였다.

그 결과 223명의 환자에서 항GiM항체가 검출되었고 이중 141명(63.2%)이 류마티스 관절염(10명의 소아 류마티스 관절염 포함) 환자였다.

이들을 대상으로 현재 류마티스 관절염 환자의 진단에 이용되는 류마티스 인자, 항핵주변인자 및 항MTOC검사를 시행하여 비교하였다.

(1) 류마티스 인자 검사

Nephelometry(Beckman, USA)를 이용한 류마티스 인자 검사(Manual of Clinical Laboratory Immunology, 5th Ed., ASM, pp942-948)에서 상기 223명의 환자 중 75명(33.6%)이 양성으로 판명되었다.

(2) 항핵주변인자 검사

사람의 구강내 점막세포를 채취하여 인산완충액으로 세척하고 면역 형광 검사용 슬라이드에 고정시켜 실시예 1과 같은 간접면역형광법을 시행하였다(김신규등, 류마티스 관절염의 새로운 표지자 항체 Antiperinuclear factor(APF)에 관한 연구, 대한면역학회지(1994) 16;pp109-113). 총 223명의 환자 중 41명(18.4%)에서 항핵주변인자 검사가 양성으로 관찰되었다.

(3) 항MTOC 항체 검사

대식세포주 IT-1을 기질로 하여 실시예 5와 동시에 간접면역형광법을 시행하였다. 총 223 명의 환자중 43명(19.3%)에서 항MTOC항체가 양성소견을 보였다.

상기 류마티스 인자 검사, 항핵주변인자 검사, 항MTOC 항체 검사를 통해서, 특히 기존의 검사법으로 진단이 어려운 경우, 항GiM항체는 류마티스 관절염의 진단에 유용하게 쓰일 수 있다는 것을 알 수 있다.

[실시예 6: 기타 면역 관련 질환에 대한 항GiM항체의 임상적 적용]

면역 관련 질환자 34명의 혈청을 채취하여 실시예 1과 같은 실험을 수행하였다. 그 결과 14명의 환자들에서 항GiM항체가 관찰되었고, 이들은 각각 신장염, 사구체신염, 신증후군, IgA신증, 기관지폐렴, 기관지 확장증, 헨녹-쉔라인 자반증, 베체씨 병, B형 간염, 간경화, 간디스토마병, 그레이브씨병에 걸린 환자들이었다.

[실시예 7]

총79명의 악성종양환자(난소암 3명, 자궁경부암 3명, 간암 6명, 위암 20명, 폐암 12명, 유방암 6명, 대장항문암 5명, 식도암 2명, 신장방광암 4명, 췌장담도계암 3명, 급성백혈병 10명, 림프종 5명)를 대상으로 항GiM항체검사를 시행하였다.

그 결과 27명의 환자에서 항GiM항체가 검출되었고 특정암에 편중되어 나타나지는 않았다.

일부 추적이 가능한 환자에서 치료에 따른 호전과 함께 항GiM항체의 역가가 감소한다는 점을 발견하였다.

본 발명은 대식세포 관련 질환을 갖는 환자들이 대식세포특이과립에 대한 자가항체(항 GiM 항체)를 갖는다는 것을 발견함으로서, 생물학적 시료 내 항 GiM 항체존재여부를 검사함으로서 대식세포 관련 질환의 진단할 수 있으며, 생물학적 시료 내 항GiM항체의 역가를 측정함으로서 대식세포관련 질환의 피검대상의 예후 판정을 할 수 있다. 또한, 항 GiM 항체는 세포생물학이나 면역학 연구에 이용할 수 있다.

Claims (9)

1. 대식세포특이과립(granules in macrophage ; GiM)에 특이적인 항체.
2. 대식세포 관련 질환의 진단방법에 있어서,

   피검대상으로부터 분리한 생물학적 시료를 항원인 대식세포특이과립(GiM)과 접촉시키는 단계; 및

   항원항체반응을 이용하여 상기 생물학적 시료에 대식세포특이과립(GiM)에 특이적인 자가항체("항 GiM 항체")가 존재하는지 확인하는 단계

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 대식세포관련 질환은 자가면역질환, 신장 질환, 호흡기 질환, 순환기 질환, 간질환, 기생충 감염 및 악성종양으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마치스 관절염임을 특징으로 하는 방법.
5. 제 2항에 있어서, 상기 대식세포특이과립은 순수분리된 대식세포과립이거나 대식세포특이과립을 함유하는 대식세포 또는 대식세포주인 것임을 특징으로 하는방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 대식세포주는 IT-1 세포주(KFCC 10772)임을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항에 있어서, 상기 항원항체반응은 간접면역형광법을 이용한 것임을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 간접면역형광법은 항 GiM항체와 함께 항핵항체, 항MTOC 항체 또는 항세포질 항체를 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 대식세포관련 질환의 피검대상의 예후 판정 방법에 있어서, 상기 피검대상으로부터 채취한 생물학적 시료로부터 항GiM항체의 역가를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.