KR20020016773A

KR20020016773A - 울혈성 심부전을 치료하는 방법

Info

Publication number: KR20020016773A
Application number: KR1020017013409A
Authority: KR
Inventors: 마르치오니마크; 켈리랄프; 로렐버버리; 소어더글라스비.
Original assignee: 세네스 파마슈티칼스 인코포레이티드; 쉘비 캘버트 모스; 브라이엄 앤드 위민즈 하스피틀; 추후제출; 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터
Priority date: 1999-04-23
Filing date: 2000-04-20
Publication date: 2002-03-06
Also published as: JP2002542270A; US6635249B1; US8076283B2; EP3087997A1; CA2368357A1; JP2013136638A; JP2017071649A; WO2000064400A2; JP2018083850A; AU4974400A; US20100267618A1; US10232016B2; JP2015034174A; US7662772B2; WO2000064400A9; EP3087997B1; US20120065130A1; US20160113998A1; AU777300B2; EP1180040A4

Abstract

본 발명은 뉴레구린 유전자에 의해 코드화된 내피 성장 인자-유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 투여함으로써 울혈성 심부전을 치료 또는 예방하는 방법을 특징으로 한다.

Description

울혈성 심부전을 치료하는 방법{METHODS FOR TREATING CONGESTIVE HEART FAILURE}

연방 정부 지원 연구에 관한 성명

본 연구의 일부는 NIH 양도 HL-28189, HL-36141, 및 NASA 재정금의 지원을 받았다. 정부는 본 발명에 대한 어떤 권리를 가진다.

산업국가에서 사망의 주요 원인의 하나인 울혈성 심부전은 심장에 대한 증가된 부담 및 심장의 펌핑력의 점진적 감소에 기인한다. 초기에, 고혈압 또는 수축성 조직의 손실에 기인한 증가된 부담은 대상 심근세포 비후성 및 좌심실 벽의 비후성을 유발함으로써 심기능의 수축성 및 유지성을 향상시킨다. 그러나, 시간의 경과에 따라서, 좌심실 챔버는 팽창하고, 수축성 펌프 기능은 악화되고, 심근세포는 아포프토시스성 세포 사멸을 겪고, 심근 기능은 점진적으로 악화된다.

울혈성 심부전을 겪는 인자는 고혈압, 허혈성 심질환, 안트라사이클린 항체와 같은 심장독성 화합물에의 노출, 및 심부전의 위험을 증가시키는 것으로 알려진 유전적 결함을 포함한다.

뉴레구린(NRG) 및 NRG 수용체는 신경, 근육, 상피 및 다른 조직에 포함된 세포-세포 신경전달용 성장 인자-수용체 티로신 키나제 시스템을 포함한다(Lemke, Mol. Cell. Neurosci. 7: 247-262, 1996 and Burden et al., Neuron 18: 847-855, 1997). NRG 부류는 내피 성장 인자(EGF)-유사, 면역글로블린(Ig), 및 다른 인식가능한 도메인을 포함하는 다양한 리간드를 코드화하는 3 개의 유전자로 구성된다. 적어도 20(아마도 50 이상)개의 분비 및 멤브레인-부착 이소형은 신호전달 시스템에서 리간드로 기능할 수 있다. NRG 리간드에 대한 수용체는 EGF 수용체(EGFR) 부류의 모든 요소이고, EGFR(또는 ErbB1), ErbB2, ErbB3, 및 ErbB4 를 포함하고, 사람에서 각각 HER1 내지 HER4 로 알려진다(Meyer et al., Development 124: 3575-3586, 1997; Orr-Urtreger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1867-71, 1993; Marchionni et al., Nature 362: 312-8, 1993; Chen et al., J. Comp. Neurol. 349: 389-400, 1994; Corfas et al., Neuron 14: 103-115, 1995; Meyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1064-1068, 1994; 및 Pinkas-Kramarski et al., Oncogene 15: 2803-2815, 1997).

3 개의 NRG 유전자,Erg-1, Nrg-2, 및Nrg-3는 먼 염색체 위치에 맵핑하고(Pinkas-Kramarski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9387-91, 1994; Carraway et al., Nature 387: 512-516, 1997; Chang et al., Nature 387: 509-511, 1997; and Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 9562-9567, 1997), NRG 단백질의 다양한 배열을 집합적으로 코드화한다. 가장 최근에 연구된 것은 약 15 개의 구별되는 구조적으로 관련된 이소형 군을 포함하는Nrg-1의 유전자 산물이다(Lemke, Mol. Cell. Neurosci. 7: 247-262, 1996 and Peles andYarden, BioEssays 15: 815-824, 1993). NRG-1 의 1 차적으로 확인된 이소형은 Neu 분화 인자(NDF; Peles et al., Cell 69, 205-216, 1992 and Wen et al., Cell 69, 559-572, 1992), 헤레구린(HRG; Holmes et al., Science 256: 1205-1210, 1992), 아세틸콜린 수용체 유발 활성(ARIA; Falls et al., Cell 72: 801-815, 1993), 및 신경교 성장 인자 GGF1, GGF2, 및 GGF3(Marchionni et al. Nature 362: 312-8, 1993)를 포함했다.

Nrg-2유전자는 상동성 클로닝(Chang et al., Nature 387: 509-512, 1997; Carraway et al., Nature 387: 512-516, 1997; 및 Higashiyama et al., J. Biochem. 122: 675-680, 1997) 및 게놈 접근법으로(Busfield et al., Mol. Cell. Biol. 17: 4007-4014, 1997) 확인되었다. NRG-2 cDNA 는 또한 ErbB 키나제의 신경성 및 갑상선 유발 활성제 (NTAK; Genbank Accession No. AB005060), 뉴레구린의 개산(Don-1), 및 소뇌-유발 성장 인자(CDGF; PCT 출원 WO 97/09425)로 알려진다. 실험적인 증거는 ErbB4 또는 ErbB2/ErbB4 조합을 발현하는 세포의 NRG-2 에 특이적으로 왕성한 반응 가능성을 증명한다(Pinkas-Kramarski et al., Mol. Cell. Biol. 18: 6090-6101, 1998).Nrg-3유전자 산물(Zhang et al., supra)은 또한 ErbB4 수용체에 결합하여 활성화시키는 것으로 알려진다(Hijazi et al., Int. J. Oncol. 13: 1061-1067, 1998).

EGF-유사 도메인은 NRG 의 모든 형태의 코어에 존재하고, ErbB 수용체에 결합하고 활성화시키는 데 요구된다 3 개의 유전자에서 코드화된 EGF-유사 도메인의 추론된 아미노산 서열은 약 30-40 % 동일하다(염기쌍형성식 비교). 더욱이, NRG-1및 NRG-2 에서 서로 다른 생물학적 활성 및 조직-특이적 가능성을 부여할 수 있는 적어도 2 가지의 아-형태의 EGF-유사 도메인이 존재하는 것 같다.

NRG 에 대한 세포성 반응은 내피 성장 인자 수용체 부류의 NRG 수용체 티로신 키나제 EGFR, ErbB2, ErbB3, 및 ErbB4 를 통해 매개된다. 모든 NRG 의 고친화성 결합은 원칙적으로 ErbB3 또는 ErbB4 에 의해 매개된다. NRG 리간드의 결합은 다른 ErbB 서브유닛과의 이량체화를 초래하여 특정 티로신 잔기에 대한 인산화에 의해 상호활성된다. 어떤 실험적인 셋팅에서, ErbB 수용체의 거의 모든 조합은 NRG-1 이소형의 결합에 반응하여 이량체를 형성할 수 있을 것으로 보인다. 그러나, ErbB2 가 리간드-수용체 복합체를 안정화시키는 데 중요한 역할을 할 수 있는 바람직한 이량체화 파트너인 것 같다. 최근의 증거는 NRG-1, ErbB2, 및 ErbB4 가 마우스 발생동안 심실 심근층의 육주형성에 필요하다는 것을 증명했다.

일반적인 개체군에서 울혈성 심부전의 고 유병율의 관점에서, 심기능의 손실을 억제하고, 이상적으로, 울혈성 심부전의 위험을 가지거나, 위험이 현존하는 자의 심기능을 개선시킴으로써 질병의 진행을 예방 또는 최소화하는 데 매우 유익할 것이다.

본 발명의 기술분야는 울혈성 심부전의 치료 및 예방이다.

도 1A 는 심장 발생동안 및 성숙한 래트 심근세포에서 뉴레구린 수용체의 발현을 나타내는 반정량적인 RT-PCR 분석의 대표도이다.

도 1B 는 재조합 사람의 신경교 성장 인자(rhGGF2)로 치료받은 심근세포에서 ErbB4 수용체의 트로신 인산화를 나타내는 분석 대표도이다.

도 2A 및 도 2B 는 미오신 중쇄(도 2A) 및 BrdU-양성 핵(도 2B)에 대한 신생 래트 심실 근세포의 염색을 보여주는 현미경사진의 대표도이다.

도 2C 는 rhGGF2 가 신생 래트 심실 근세포에서 DNA 합성(% BrdU-양성 근세포로 표시)을 자극하는 것을 보여주는 그래프이다.

도 3A 및 도3B 는 rhGGF2 가 신생 래트 심실 근세포에서 DNA 합성(% 상대³H-티미딘 흡수로 표시)을 자극하는 것을 보여주는 그래프이다.

도 4 는 ErbB2 및 ErbB4 가 신생 래트 심실 근세포에서 상대³H-티미딘 흡수에 대한 GGF2 의 효과를 매개하는 것을 보여주는 그래프이다.

도 5 는 GGF2 가 신생 래트 심실 근세포의 제 1 차 배양물에서 생존을 촉진한다는 것을 보여주는 그래프이다.

도 6A-6C 및 6E-6G 는 GGF2 가 신생 래트 심실 근세포의 제 1 차 배양물에서 아포프토시스성 세포 사멸을 감소시키는 것을 보여주는 현미경 사진의 대표도이다.

도 6D 는 rhGGF2 가 신생 래트 심실 근세포의 제 1 차 배양물에서 아포프토시스성 세포 사멸을 감소시킨다는 것을 보여주는 그래프이다(TUNEL-양성 근세포 비율의 감소로 표시).

도 6H 는 rhGG2 가 신생 래트 심실 근세포의 제 1 차 배양물에서 아포프토시스성 세포 사멸을 감소시키는 것을 보여주는 그래프이다(rhGGF2-처리 세포의 프로피듐 요오드 염색 후에 아-G1 분획의 유동 혈구계산에 의해 결정됨).

도 7A 빛 도 7B 는 rhGGF2 가 생존을 증가시키고 성숙한 래트 심실 근세포의 제 1 차 배양물에서 아포프토시스성 세포 사멸을 감소시킨다는 것을 보여주는 그래프이다.

도 8A 및 8B 는 GGF2 가 신생 래트 심실 근세포의 비후성 성장을 유발한다는 것을 보여주는 현미경 사진의 대표도이다.

도 8C 는 전전구 심방성 나트륨뇨배설촉진 인자(전전구-ANF), 심실 비후성의 마커, 및 α-골격 액틴이 GGF2 로 치료받은 신생 래트 심실 근세포에서 상향 조정된다는 것을 보여주는 대표도이다.

도 8D 는 GGF2 가 신생 래트 심실 근세포에서 단백질 합성(상대적인³H 류신 흡수로 표시)을 자극한다는 것을 보여주는 그래프이다.

도 9A-9C 는 GGF2 가 성숙한 래트 심실 근세포의 제 1 차 배양물에서 비후성 성장을 유발한다는 것을 보여주는 현미경사진이다.

도 9D 는 전전구 ANF 및 α-골격 액틴이 GGF2 로 치료된 성숙한 래트 심실 근세포에서 상향 조정된다는 것을 보여주는 노던 블럿의 대표도이다.

도 9E 는 GGF2 가 성숙한 래트 심실 근세포에서 단백질 합성(상대적인³H 류신 흡수로 표시)을 자극한다는 것을 보여주는 그래프이다.

도 10A 및 10B 는 대조군 및 대동맥 협착 래트 심장의 좌심실에서 ErbB2(도 10A), ErbB4(도 10B), 및 β-액틴의 발현 수준을 보여주는 리보뉴클레아제 보호 분석의 대표도이다.

도 11 은 대조군 및 대동맥 협착 심장의 좌심실로부터의 근세포에서 ANF 및 글리세르알데히드 포스페이트 디히드로게나제(GAPDH, 하우스키핑 유전자)의 발현을 보여주는 노던 블럿의 대표도이다.

도 12A 및 12B 는 대조군 및 대동맥 협착 심장의 좌심실로부터의 근세포에서 ErbB2(도 12A), ErbB4(도 12B), 및 β-액틴의 발현 수준을 보여주는 리보뉴클레아제 보호 분석의 대표도이다.

도 13A 및 13B 는 6 주(도 13A) 및 22 주(도 13B) 대동맥 협착 및 대조군 래트 심장에서 ErbB2 의 발현 수준을 보여주는 웨스턴 블럿의 대표도이다.

도 13C 및 13D 는 6 주(도 13C) 및 22 주(도 13D) 대동맥 협착 및 대조군 래트 심장에서 ErbB2 의 발현 수준을 보여주는 웨스턴 블럿의 대표도이다.

도 14 는 IGF-1 또는 NRG-1 으로 예비치료된 래트 심근세포 배양물이 다우노루비신-유발 아포프토시스에 덜 영향을 받는 것을 보여주는 그래프이다.

도 15A 는 Akt 의 IGF-및 NRG-1 자극 인산화는 PI-3 키나제 억제제 워트만닌으로 억제된다는 것을 보여주는 인산화 분석의 대표도이다.

도 15B 는 다우노루비신에 노출된 세포에서 카스파제 3 활성의 IGF-1 및 NRG-1 억제는 PI-3 키나제 의존적임을 보여주는 그래프이다.

발명의 상세한 설명

뉴레구린은 ErbB2 및 ErbB4 수용체의 활성을 통해 배양된 심근세포의 생존 및 비후성 성장을 촉진시킨다는 것을 발견했다.

게다가, 실험적으로 유발된 심장간 압력 과부하를 가진 동물에서 심근세포 ErbB2 및 ErbB4 수준은 초기의 대상 비후성 동안은 정상적이고 초기 심부전으로 전이 동안 감소한다는 것을 관찰했다.

생체외 및 생체내 실험은 뉴레구린이 증가된 생리적인 스트레스에 반응하여 대상 비후성 성장을 자극할 뿐만 아니라 이러한 스트레스에 놓인 심근세포 아포프토시스를 억제하는데 관여한다는 것을 증명한다. 이러한 관찰은 뉴레구린 치료가 울혈성 심질환의 예방, 최소화, 또는 회복에 유용할 것이다는 것을 나타낸다. 이론에 의해 뒷받침되지는 않지만, 뉴레구린 치료는 심근세포 비후성을 자극함으로써 심장의 펌핑력을 강화시키고, 심근세포 아포프토시스를 억제함으로써 심장의 더이상의 악화를 억제할 것이다.

뉴레구린

NRG-1, NRG-2, 및 NRG-3 유전자에 의해 코드화된 폴리펩티드는 폴리펩티드를 ErbB 수용체에 결합하여 활성화시키도록 허용하는 EGF-유사 도메인을 포함한다. Holmes et al.(Science 256: 1205-1210, 1992)는 EGF-유사 도메인이 p185erbB2 수용체에 결합하여 활성화시키기에 충분하다는 것을 제시했다. 따라서, NRG-1, NRG-2 또는 NRG-3 유전자에 의해 코드화된 어떤 폴리펩티드 산물, 예를 들어, 뉴레구린 유전자 또는 cDNA 에 의해 코드화된 EGF-유사 도메인을 가지는 폴리펩티드와 같은 어떤 뉴레구린-유사 폴리펩티드(예를 들어, USPN 5,530,109, USPN 5,716,930, 및 USSN 08/461,097에 개시된 NRG-1 펩티드 아도메인 C-C/D 또는 C-C/D' 를 포함하는 EGF-유사 도메인; 또는 WO 97/09425 에 개시된 EGF-유사 도메인)는 울혈성 심부전을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

위험 인자

개인별 울혈성 심부전의 발생 가능성을 증가시키는 위험 인자가 잘 알려져 있다. 이것은 흡연, 비만, 고혈압, 허혈성 심질환, 혈관질환, 관상동맥 바이패스 수술, 심근경색, 좌심실수축 기능장애, 심근독성 화합물(알코올, 코카인과 같은 약물, 및 독소루비신 및 다우노루비신과 같은 안트라사이클린 항생제)에의 노출, 바이러스 감염, 심장주의염, 심근염, 치은염, 갑상선 질환, 심질환의 위험을 증가시키는 것으로 알려진 유전적 결함(Bachinski and Roberts, Cardiol. Clin. 16: 603-610, 1998; Siu et al., Circulation 8: 1022-1026, 1999; 및 Arbustini et al., Heart 80: 548-558, 1998), 기아, 식욕부진 및 식욕과항진과 같은 이상 식욕증진증, 심부전의 가계, 및 심근 비후성을 제한없이 포함한다.

따라서, 뉴레구린은 위험상태에 있는 것으로 확인된 울혈성 심질환 진행율을 예방 또는 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 초기 대상 비후성 환자에게 뉴레구린 투여는 비후성 상태를 유지시켜서 심부전으로의 진행을 방지할 수 있다. 게다가, 상기와 같은 위험상태에 있는 것으로 확인된 자들은 대상 비후성의 발생 전에 심장보호 뉴레구린 치료를 허여받을 수 있다.

안트라시클린 화학요법 또는 안트라사이클린/항-ErbB2(항-HER2)항체(예를 들어, HERCEPTIN) 조합 요법 전에, 및 그 동안 뉴레구린을 암환자에게 투여하는 것은 환자의 심근세포가 아포프토시스에 이르는 것을 방지함으로서 심기능을 유지할 수 있도록 한다. 이미 심근세포 손실을 겪은 환자 또한 뉴레구린 치료의 잇점이있는데, 잔여 심근 조직이 비후성 성장 및 증가된 수축성을 나타내면서 뉴레구린 노출에 반응할 것이기 때문이다.

요법

뉴레구린 유전자에 의해 코드화된 EGF-유사 도메인을 포함하는 뉴레구린 및 폴리펩티드는 제약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 부형제, 단위 투여량 형태로 환자 또는 실험 동물에 투여될 수 있다. 종래의 제약학적 실험이 환자 또는 실험 동물에 이러한 조성물을 투여하기 위한 적당한 조제물 또는 조성물을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 정맥내 투여가 바람직하지만, 예를 들어, 비경구적, 피하, 근육내, 두개내, 안와내, 눈의, 심실내, 포내, 척수강내, 뇌내, 복강내, 비강내, 에어로졸, 경구, 또는 국부적(예를 들어, 진피를 통해 혈류로 들어갈 수 있는 조성물을 운반하는 유착성 패치 사용) 투여와 같은 어떤 적당한 투여경료가 사용될 수 있다. 치료적 조성물은 구강 투여용 액체 용액 또는 현탁액의 형태; 비강내 조성물용 분말, 점비제, 또는 에어로졸 형태의 정제 또는 캡슐일 수 있다. 상기 어떤 조성물은 지효성 조성물일 수 있다.

조성물 제조를 위해 당업계에서 잘 알려진 방법은 예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Science." 에서 발견된다. 예를 들어, 비경구적 투여는 부형제, 무균수, 또는 식염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물성원의 오일, 또는 수화 나프탈렌을 포함할 수 있다. 지효성, 생물학적 양립가능하고, 생물학적 분해가능한 락티드 폴리머, 락티드/글리코리드 코폴리머, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머가 화합물의 해리를 조절하기 위해 사용될 수 있다.본 발명의 분자 투여용의 다른 잠재적으로 유용한 비경구 송달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 코폴리머 입자, 삼투성 펌프, 매립식 주입 시스템, 및 리포좀을 포함한다. 흡입용 조성물은 락토스와 같은 부형제를 포함하거나, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 데옥시콜레이트를 포함하는 수성 용액, 또는 점비제, 또는 겔로서 투여용 오일 용액일 수 있다.

유전자 요법

뉴레구린 EGF-유사 도메인을 포함하는 뉴레구린 및 뉴레구린-유사 폴리펩티드는 또한 체내 유전자 요법에 의해 투여될 수 있다. 뉴레구린 유전자 요법용 발현 벡터(예를 들어, 플라스미드, 인공 염색체, 또는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 또는 허프스바이러스로부터 유래된 것과 같은 바이러스 벡터)는 적당한 프로모터의 전사 조절하에 뉴레구린-코드화(또는 뉴레구린-유사 폴리펩티드-코드화)DNA 를 운반한다. 프로모터는 당업계에 공지된 어떤 비-조직-특이적 프로모터(예를 들어, SV-40 또는 시토메갈로바이러스 프로모터)일 수 있다. 택일적으로, 프로모터는 횡문근-특이적, 심방 또는 심실 심근세포-특이적(예를 들어, Franz et al., Cardiovasc. Res. 35: 560-566, 1997 에 개시)인 것과 같은 조직-특이적 프로모터, 또는 내피 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터는 Prentice et al.(Cardiovasc. Res. 35: 567-574, 1997) 에 개시된 허혈-유도 프로모터와 같은 유도 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 내인성 뉴레구린 프로모터일 수 있다.

발현 벡터는 예를 들어, Lipofectin^TM, Lipofectamine^TM(Gibco/BRL,Bethesda, MD), DOTAP^TM(Boeringer-Mannheim, Indianapolis, IN)과 같은 양이온 지질 또는 유사체 화합물, 리포좀, 또는 심근세포 또는 내피세포와 같은 특정 세포 형태에 DNA 를 표적화시키는 항체와 같은 DNA 의 세포내 도입을 향상시키는 약제와 함께 또는 이와 결합하여 나 DNA 로 투여될 수 있다. 투여의 방법은 상기의 요법 단락에 개시된 것일 수 있다. 특히, 체내 유전자 요법용 DNA 는 정맥내 주사, 심장 관류, 및 심근층에의 직접 주입에 의해 심장에 성공적으로 송달되었다(예를 들어, Losordo et al., Circulation 98: 2800-2804, 1998; Lin et al., Hypertension 33: 219-224, 1999; Labhasetwar et al., J. Pharm. Sci. 87: 1347-1350, 1998; Yayama et al., Hypertension 31: 1104-1110, 1998). 치료적 DNA 는 환자의 세포에 삽입되어 발현되고, 벡터-코드 치료적 폴리펩티드가 심근세포 ErbB 수용체에 결합하고 활성화되도록 투여된다.

하기의 실시예는 당업자가 본 발명 및 그것의 원칙 및 잇점을 더욱 잘 이해하도록 할 것이다. 이러한 실시예는 본 발명의 예시이며 그것의 범위를 한정하지 않는 것으로 해석된다.

(발명의 개요)

뉴레구린은 대상 비후성 성장을 자극하고 생리적 스트레스를 받은 심근세포의 아포프토시스를 저해한다는 것을 발견했다. 관찰은 뉴레구린 치료가 고혈압, 허혈성 심질환, 및 심장독성과 같은 근원적인 인자에서 야기된 울혈성 심질환의 예방, 최소화, 또는 회복에 유용할 것이라는 것을 나타낸다.

본 발명은 포유동물에서 울혈성 심부전을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 포유동물에서 심부전을 치료 또는 예방하기에 적합한 유효량으로 포유동물에 뉴레구린 유전자에 의해 코드화된 표피 성장 인자-유사(EGF-유사) 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 뉴레구린 유전자는 NRG-1 유전자, NRG-2 유전자, 또는 NRG-3 유전자일 수 있다. 더욱이, 폴리펩티드는 이러한 3 가지 뉴레구린 유전자 중 하나에 의해 코드화될 수 있다. 더욱 더, 본 발명의 방법에 사용된 폴리펩티드는 재조합 사람 GGF2 일 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 포유동물은 사람이다.

본 발명의 다른 구체예에서, 울혈성 심부전은 고혈압, 허혈성 심질환, 심장독성 화합물에의 노출(예를 들어, 코카인, 알코올, HERCEPTIN과 같은 항-ErbB2 항체 또는 항-HER2 항체, 또는 독소루비신 또는 다우노마이신과 같은 안트라사이클린 항생제), 심근염, 갑상선 질환, 바이러스 감염, 치은염, 약물 오용; 알코올 중독, 심장 주위염, 죽상경화증, 혈관 질환, 비후성 심근병증, 급성 심근 경색 또는 심근 경색 경험, 좌심실수축 기능장애, 관상동맥 바이패스 수술, 기아, 이상 식욕 항진증, 또는 유전적 결함으로부터 초래될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, HERCEPTIN과 같은 항-ErB2 또는 항-HER2 항체는 안트라시클린 투여전, 투여 동안, 또는 그 후의 어느 때이든 포유동물에 투여된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 뉴레구린 유전자에 의해 코드화된 EGF-유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 심장독성 화합물에의 노출 전, 노출 동안, 노출 후에 투여된다. 더이상의 구체예에서, EGF-유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 이 기간동안 2, 또는 3 번 모두 투여된다.

본 발명의 더 이상의 구체예에서, 폴리펩티드는 포유동물에서 울혈성 심부전의 진단 전 또는 그 후에 투여된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 대상성 심장 비후성을 겪는 포유동물에 투여된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드의 투여는 좌심실 비후성을 유지하고, 심근 비박화의 진행을 예방하거나, 심근세포 아포토시스를 억제한다.

본 발명의 더 이상의 구체예에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 코드화하는 발현 벡터를 투여함으로써 포유동물에 투여될 수 있다.

"울혈성 심부전"은 휴식시 또는 운동시에 심장의 정상적인 혈액 박출량을 유지할 수 없거나, 정상적인 심장 충만압의 조정에서 정상적인 심장 박출량을 유지할 수 없는 심기능부전을 의미한다. 약 40 % 이하의 좌심실 박출계수가 울혈성 심부전의 지표이다(비교로, 약 60 % 의 박출계수가 정상이다). 울혈성 심부전인 환자는 빠른 호흡, 흉막 유출, 휴식 또는 운동시 피로, 수축성 기능장애, 및 부종과 같은 잘 알려진 임상학적 징후를 나타낸다. 울혈성 심부전은 공지된 방법에 의해서 쉽게 진단된다(예를 들어, "Consensus recommendations for the management of chronic heart failure." Am. J. Cardiol., 83 (2A): 1A-38-A, 1999 참조).

상대적인 심각성 및 질환 진행을 물리적인 검사, 초음파심장조영술, 방사성 핵종 이메이징, 관혈적 혈역학적 감시, 자기공명 혈관조영술, 및 산소 흡수 연구와 조합된 답차운동검사와 같은 공지된 방법을 사용하여 평가한다.

"허혈성 심질환"은 심근의 산소 요구 및 적당한 산소 공급 간의 불균형으로인한 어떤 질병을 의미한다. 대부분의 경우에 허혈성 심질환은 죽상경화증 또는 다른 혈관 장애에서 발생하는 것과 같은 관상동맥의 협착에 기인한다.

"심근 경색"은 허혈성 심질환이 반흔 조직으로 대체된 심근층 영역을 초래하는 과정을 의미한다.

"심장 독성"은 심근세포를 직접적으로 또는 간접적으로 손상시키거나 죽임으로써 심기능을 감소시키는 화합물을 의미한다.

"고혈압"은 의료 전문가(예를 들어, 의사 또는 간호사)가 울혈성 심질환으로 발전될 증가된 위험을 가지는 것으로 여기는 정상보다 더 높은 혈압을 의미한다.

"치료"는 치료의 부재동안 발생할 수 있는 질환 진행과 비교하여 치료 동안 통계학적으로 중요한 방식으로 울혈성 심질환의 진행을 늦추거나 억제하는 뉴레구린 또는 뉴레구린-유사의 투여를 의미한다. 좌심실 박출계수, 운동 성능, 및 상기의 산출된 다른 임상 시험뿐만 아니라 생존율 및 입원율과 같은 공지된 지표가 질환 진행을 평가하기 위해서 사용될 수 있다. 치료가 통계학적으로 중요한 방식으로 질환 진행을 늦추거나 억제하는지 여부는 당업계에 주지된 방법으로 결정될 수 있다(예를 들어, SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med. 327: 685-691, 1992 and Cohn et al., N. Engl. J. Med. 339: 1810-1816, 1998 참조).

"예방"은 울혈성 심부전으로 발전될 위험성이 있는 포유동물에서 울혈성 심부전의 발전을 최소화하거나 부분적 또는 완전히 억제하는 것을 의미한다("Consensus recommendations for the management of chronic heart failure"에 정의된 바와 같음. Am. J. Cardiol., 83 (2A): 1A-38-A, 1999). 울혈성 심부전이 뉴레구린 또는 뉴레구린-유사 폴리펩티드의 투여에 의해 최소화 또는 예방되는 지의 결정은 SOLVD Investigators, 상기참조, 및 Cohn et al., 상기참조에 개시된 것과 같은 공지된 방법에 의해 이루어진다.

"울혈성 심부전의 위험"은 흡연자, 비만자(즉, 이상적인 체중의 20 % 이상), 심장독성 화합물(예를 들어, 안트라사이클린 항생제)에 노출되었거나 노출될 수 있는 자, 고혈압, 허혈성 심질환, 심근경색, 심부전의 위험을 증가시키는 것으로 알려진 유전적 결함, 심부전의 가계, 심근 비후성, 비후성 심근병증, 좌심실 수축성 기능장애, 관상동맥 바이패스 수술, 혈관 질환, 죽상경화증, 알코올 중독증, 심장주위염, 바이러스 감염, 치은염, 또는 이상 식욕 증진증(예를 들어, 신경성 식욕부진 또는 식욕과항진), 또는 알코올 또는 코카인 중독을 가지는(가졌던) 자를 의미한다.

"심근 비박화 진행의 감소"는 심실 심근세포의 비후성을 유지하여 심실벽의 비후성이 유지되고 증가되는 것을 의미한다.

"심근 아포프토시스의 억제"는 비치료 심근세포와 비교하여 적어도 10 %, 더욱 바람직하게는 적어도 15 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 25%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 더 바람직하게는 75 %, 그리고 가장 바람직하게는 적어도90 % 로 심근세포의 치사를 억제하는 뉴레구린 치료를 의미한다.

"뉴레구린" 또는 "NRG"는 NRG-1, NRG-2, 또는 NRG-3 유전자 또는 핵산(예를 들어, cDNA)에 의해 코드화되고, ErbB2, ErbB3, 또는 ErbB4 수용체, 또는 그것의 조합에 결합하여 활성화시키는 폴리펩티드를 의미한다.

"뉴레구린-1", "NRG-1", "헤레구린", "GGF2", 또는 "p185erbB2 리간드"는 ErbB2 수용체에 결합하고 USPN 5,530,109; USPN 5,716,930; 및 USSN 08/461,097 에 개시된 p185erbB2 리간드 유전자에 의해 코드화되는 폴리펩티드를 의미한다.

"뉴레구린-유사 폴리펩티드"는 뉴레구린 유전자에 의해 코드화된 EGF-유사 도메인을 포함하고, ErbB-2, ErbB-3, ErbB-4, 또는 그것의 조합에 결합하여 활성화시키는 폴리펩티드를 의미한다.

"내피 성장 인자-유사 도메인" 또는 "EGF-유사 도메인"은 ErbB2, ErbB3, ErbB4, 또는 그것의 조합에 결합하여 활성화시키는 NRG-1, NRG-2, 또는 NRG-3 유전자에 의해 코드화된 폴리펩티드 모티프를 의미하고, Holmes et al., Science 256: 1205-1210, 1992; USPN 5,530,109; USPN 5,716,930; USSN 08/461,097; Hijazi et al., Int. J. Oncol. 13: 1061-1067, 1998; Chang et al., Nature 387: 509-512, 1997; Carraway et al., Nature 387: 512-516, 1997; Higashiyama et al., J. Biochern. 122: 675-680, 1997; 및 WO 97/09425 에 개시된 EGF 수용체-결합 도메인과 구조적인 유사성을 가진다.

"항-ErbB2 항체" 또는 "항-HER2 항체"는 ErbB2(또한 사람에서는 HER2 로도 알려짐)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하여 뉴레구린 결합에 의해 개시되는ErbB2(HER2)-의존적 신호 전달을 방해하는 항체를 의미한다.

"형질전환된 세포" 는 재조합 DNA 기법 또는 공지된 유전자 요법에 의해서 뉴레구린 또는 뉴레구린 EGF 유사 도메인을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 분자가 도입된 세포(또는 세포의 자손)을 의미한다.

"프로모터"는 전사 지시에 충분한 최소한의 서열을 의미한다. 세포 형태 또는 생리적인 상태(예를 들어, 저산소성 대 정상산소성 상태)에 따라 프로모터-의존성 유전자 발현을 외부 신호 또는 약제에 의해 조절가능하거나 유도가능하게 하는 데 충분한 프로모터 원소를 또한 포함하며; 이러한 원소는 천연 유전자의 5' 또는 3' 또는 내부 영역에 위치할 수 있다.

"작동가능한 연결"은 폴리펩티드(예를 들어, cDNA)를 코드화하는 핵산 및 하나 이상의 조절 서열이 적당한 분자(예를 들어, 전사 활성 단백질)가 조절 서열에 결합한 경우에 유전자 발현을 허용하는 방식으로 연결된 것을 의미한다.

"발현 벡터"는 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열을 코드하는 폴리펩티드(예를 들어, 뉴레구린)를 전달하는 데 사용되어 코드화 펩티드 또는 폴리펩티드가 숙주 세포에서 발현되도록 허용하는 예를 들어, 박테리오파지, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스, 허프스바이러스, 또는 인공 염색체로부터 유래된 유전학적으로 설계된 플라스미드 또는 바이러스를 의미한다.

실시예 I: 일반적인 방법.

심근 세포 및 비심근 제 1 차 배양물의 제조

갓 태어난 래트 심실 근세포(NRVM) 제 1 차 배양을 이미 개시된 대로 (Springhorn et al., J. Biol. Chem. 267: 14360-14365, 1992) 준비했다. 근세포를선택적으로 강화하기 위해서, 해리성 세포를 5 분동안 500 rpm 으로 2 번 원심분리, 75 분동안 2 번 예비-플레이팅하고, 최종적으로 7% 태아 소 혈청(FBS)(Sigma, St. Louis, MO)으로 보충된 둘베코(Dulbecco) 변형 이글(DME) 배지 (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD)에서 저밀도(0.7-1 X 10⁴세포/cm²)로 플레이팅했다. 시토신 아라비노사이드(AraC; 10 μM; Sigma)를 티미딘 흡수 측정용으로 사용된 배양물을 제외한 비-근세포의 증식을 방지하기 위해서 처음의 24-48 시간동안 배양물에 첨가했다. 다른 언급이 없는 한, 모든 실험을 무혈청 배지, DME + ITS(인슐린, 트랜스페린, 및 셀레늄; Sigma)로 변형시킨 후에 36-48 시간동안 수행했다. 본 방법을 사용하여, 자발적인 수축의 현미경 관찰 및 단일클론 항-심장 미오신 중쇄 항체(항-MHC; Biogenesis, Sandown, NH)로 염색된 면역형광검사에 의해서 평가한 대로 ＞95% 근세포를 가지는 제 1 의 배양물을 얻었다.

비-근세포에서 강화된 신생 심장으로부터 분리된 세포 분획의 제 1 의 배양물을 예비플레이팅 과정동안 조직 배양물 디쉬에 유착된 세포를 2 번 계대배양함으로써 제조했다. DME-ITS 로 전환하기 전에 36 내지 48 시간동안 연속적으로 항-MHC-양성 세포를 거의 포함하지 않는 비-근세포 배양물을 20% FBS 로 보충된 DME 에서 아합류점으로 배양되도록 허용했다.

래트 심실 근세포(ARVM)의 분리 및 제조

제 1 차 배양을 이미 개시된 기법을 사용하여 수행했다(Berger et al., Am. J. Physiol. 266: H341-H349, 1994). 막대-모양 심근세포를 60 분동안 라미닌(10μg/ml; Collaborative Research, Bedford, MA) 예비코팅 디쉬상에서 60 분동안 배지에 플레이팅한 다음, 헐겁게 부착된 세포를 제거하기 위해서 배지를 한 번 교환했다. 비-근세포에 의한 ARVM 제 1 차 배양물의 오염을 혈색소계로 계수하여 결정했고, 전형적으로 5% 미만이었다. 모든 ARVM 제 1 차 배양물을 2mg/ml BSA, 2mM L-카르니틴, 5mM 크레아틴, 5mM 타우린, 0.1μM 인슐린, 및 100IU/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 가진 10 nM 트리이오도티로닌으로 보충된 DME 로 구성된 "ACCITT" (Ellingsen et al., Am. J. Physiol. 265: H747-H754, 1993)라고 하는 제한 배지에서 유지했다. 근세포 생존 및/또는 아포프토시스를 검사하기 위해 설계된 실험 프로토콜에서, 제한 배지에서 인슐린을 제외함으로써, "ACCTT"라고 말한다.

래트 심장에서 ErbB 수용체의 PCR 분석

ErbB 수용체의 C-말단 부분을 코드화하는 cDNA 서열을 다음의 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭했다: ErbB2 코돈 위치 857 내지 1207의 증폭용 ErbB2A (5'-TGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCAC-3': 센스; SEQ ID NO: 1) 및 ErbB2B (5'-CCTTCTCTCGGTAC TAAGTATTCAG-3': 안티센스; SEQ ID NO: 2)(Bargmann et al., Nature 319: 226-230, 1986); ErbB3 코돈 위치 712 내지 1085 의 증폭용 ErbB3A (5'-GCTTAAAGTGCTTGGCTCGGGTGTC-3': 센스; SEQ ID NO: 3) 및 ErbB3B (5'-TCCTACACACTGACACTTTCTCTT-3': 안티센스; SEQ ID NO: 4) (Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9193-9197, 1989); ErbB4 코돈 위치 896 내지 1262 의 증폭용 ErbB4A (5'-AATTCACCCATCAGAGTGACGTTTGG-3': 센스; SEQ ID NO: 5) 및ErbB4B (5'-TCCTGCAGGTAGTCTGGGTGCTG: 안티센스; SEQ ID NO: 6)(Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1746-1750, 1993). 래트 심장 또는 방금 분리된 신생 및 성숙한 래트 심실 근세포로부터 RNA 샘플 (1 μg) 을 첫번째 가닥 cDNA 를 생성하도록 역전사했다. PCR 반응을 PTC-100TM 프로그램가능한 열 조절기(MJ Research, Inc.; Watertown, MA)에서 약 50 ng 의 첫번째 가닥 cDNA 를 포함하는 50 ㎕ 의 최종 부피로 30 순환동안 수행했다. 각 순환은 94 ℃ 에서 30 초, 63 ℃에서 75 초, 및 72 ℃ 에서 120 초를 포함했다. 각 반응 혼합물의 30 ㎕ 앨리쿼트를 1 % 아가로스 겔에서 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색에 의해 분석했다. PCR 산물을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen Co., San Diego, CA)에 직접 클론했고, 자동 DNA 서열결정으로 확증했다.

ErbB 수용체 인산화의 분석

수용체 아형태가 티로신-인산화되었는지를 분석하기 위해서, 신생기 및 성숙한 심실 근세포를 무혈청 배지에서 24 내지 48 시간동안 유지한 다음, 37 ℃ 에서 5 분동안 20 ng/ml 에서 재조합 사람의 신경교 성장 인자 2(rhGGF2)로 치료했다. 세포를 아이스-냉각 인산염- 완충 식염수(PBS) 로 2 번 빠르게 린스했고, 1% NP40,50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM 에틸렌 글리콜-비스 (β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA), 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 1 mM 나트륨 오르토바나데이트, 10 mM 나트륨 몰리브데이트, 8.8 g/L 나트륨 피로포스페이트, 4 g/L NaFl, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오르화물(PMSF), 10 μg/ml 아프로티닌, 및 20 μM 류펩틴을 포함하는 냉각 용균 완충액에서 융균했다. 용해질을 4 ℃ 에서 20 분동안 12,000 Xg 로 원심분리했고, 상청액의 500 μg(신생기 근세포)또는 2000 μg (성숙한 근세포)의 앨리쿼트를 4 ℃ 에서 하룻밤동안 ErbB2 또는 ErbB4(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)에 특이적인 항체와 함께 인큐베이션했고, 단백질 A-아가로스 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)와 함께 침전시켰다. 면역 침전물을 수거했고, 나트륨 도데실 술페이트(SDS) 샘플 완충액에서 끓임으로써 해리했다. 샘플을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분획했고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Biorad Laboratories, Hercules, CA)에 옮겼고, PY20 항포스포티로신 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 가지고 프로브했다. ErbB2 를 검출하기 위해서, 상청액을 또한 비오틴화 RC20 항포스포티로신 항체(Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, NY)로 면역침전했고, ErbB2 에 대한 단일클론 항체(Ab-2; Oncogene Research Products, Cambridge, MA)를 가지고 블럿팅했다.

[ ³ H] 티미딘 및 [ ³ H]류신의 삽입

DNA 합성의 지표로서, [³H] 티미딘 삽입을 이미 개시된 대로 측정했다(Berk et al., Hypertension 13: 305-314, 1989). 무혈청 배지(DME + ITS)에서 36 내지 48 시간동안 인큐베이션한 후에, 세포를 20 시간동안 다른 농도의 rhGGF2 (Cambridge NeuroScience Co., Cambridge, MA)로 자극했다. 그 다음, [³H] 티미딘 (0.7 Ci/mmol; Dupont)을 5 μCi/ml 의 농도로 배지에 첨가했고, 세포를 8 시간동안 한번 더 배양했다. 세포를 PBS 로 2 번, 10 % TCA 로 한 번 세척했고, 10 % TCA를 4 ℃ 에서 45 분동안 단백질을 침전하기 위해 첨가했다. rhGGF2 에 노출되지 않은 근세포의 평행 배양물을 대조군과 같은 조건에서 얻었다. 침전물을 95 % 에탄올로 2 번 세척했고, 0.15 N NaOH 에서 재현탁했고, 1M HCL 로 포화시킨 다음, 신틸레이션 계수기로 앨리쿼트를 계수했다. 각 실험에서 대조군 세포의 평균 cpm 으로 표준화된 상대 cpm/디쉬로 나타냈다. 항체 차단 실험에 대해, rhGGF2 또는 rhFGF2 의 첨가전에 2 시간동안 세포를 각 뉴레구린 수용체 (c-neu Ab-2, 종양유전자 연구 산물; 및 ErbB3 또는 ErbB4, Santa Cruz Biotechnology)에 특이적인 항체(0.5g/ml)와 함께 예비침전시키는 것을 제외하고는 같은 과정을 적용했다.

[³H] 류신 흡수의 비율을 단백질 합성의 지표로 사용했다. 실험을 위해서, 10 μM 시토신 아라비노사이드를 배지에 첨가했다. 세포를 36 내지 48 시간동안 무혈청 배지에서 배양한 다음, 다른 양의 rhGGF2 를 가지고 자극했다. 40 시간 후에, [³H] 류신(5μCi/ml) 을 8 시간동안 첨가했고, 세포를 PBS 로 세척했고, 10 % TCA 로 얻었다. TCA-침전가능한 방사능을 상기와 같이 신틸레이션 계수로서 결정했다.

5-브로모-2'-데옥시-우리딘 삽입 및 면역형광 염색

핵 5-브로모-2' 데옥시-우리딘(BrdU) 삽입 및 심장 근육-특이적 항원, 미오신 중쇄(MHC)를 이중-간접 면역형광법을 사용하여 동시에 가시화했다. 제 1 의 NRVM 배양물을 48 시간동안 DME 및 ITS 에 유지한 다음 30 시간동안 rhGGF2(40 ng/ml) 로 자극했다. 대조 배양물을 rhGGF2 가 없는 것을 제외하고는 유사하게 제조했다. BrdU(10 μM)를 최종 24 시간동안 첨가했다. 세포를 pH 2.0, 50 mM 글리신완충액에서 -20 ℃ 로 30 분동안 70 % 에탄올 용액에서 고정했고, PBS 에서 재수화시켰고, 4N HCL 에서 20 분동안 인큐베이션했다. 그 다음 세포를 PBS 에서 3 번 세척으로 중성화했고, 1 % FBS 로 15 분 인큐베이션한 다음 37 ℃ 에서 60 분동안 마우스 단일클론 항-MHC(1: 300; Biogenesis, Sandown, NH)를 처리했다. 제 1 차 항체를 TRITC-결합 염소 항-마우스 IgG(1: 300, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)로 검출했고, 핵 BrdU 삽입을 제자리 세포 증식 키트(Boehringer Mannheim Co. Indianapolis, IN)의 플루오레세인-결합 항-BrdU 항체로 검출했다. 커버슬립을 Flu-마운트로 적재했고(Fisher Scientific; Pittsburgh, PA), 면역형광 현미경으로 검사했다. 약 500 근세포를 각 커버슬립에서 계수했고, BrdU-양성 근세포의 비율을 계산했다.

rhGGF2 를 가진 근세포 표현형의 변화를 검사하기 위해서, 세포를 실내온도에서 30 분동안 4%(w/v) 파라포름알데히드에서 고정했고, PBS 로 린스했고, 15 분동안 0.1 % Triton X-100 으로 침투시킨 다음, 1% FBS 로 15 분동안 한번 더 인큐베이션한 후에 항-MHC(1:300) 으로 인큐베이션하고 TRITC-결합(NRVM) 또는 FITC-결합(ARVM) 2 차 항체와 함께 가시화했다. ARVM 을 Kr/Ar 레이저를 가지는 MRC 600 초점을 공유하는 현미경(BioRad; Hercules, CA)을 사용하여 검사했다.

세포 생존 분석 및 아포프토시스의 검출

세포 생존력을 살아있는 세포에서 미생물 활성에 의존하는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(MTT, Sigma) 세포 호흡 분석법으로 측정했다(Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983). 무혈청 배지에서 2 일배양된 NRVM 의 제 1 차 배양물을 4 일 또는 6 일동안 서로 다른 농도의 rhGGF2 로 자극했다. ARVM 을 6 일동안 ACCTT 배지 또는 ACCTT 배지 및 다른 농도의 rhGGF2 에서 유지했다. 그 다음, MTT 를 37℃ 에서 3 시간동안 세포와 함께 인큐베이션했다. 살아있는 세포는 테트라졸륨 링을 디메틸술폭사이드(DMSO; Sigma)를 가지고 세포를 용균 한 후에 570 nm 에서 광밀도를 해독함으로써 정량화할 수 있는 진푸른 포르마잔 결정으로 전환시킨다.

아포프토시스를 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제(TdT)-매개 dUTP 닉 말단-표지(TUNEL) 분석법을 사용하여 신생기 및 성숙한 근세포에서 검출했다. 플로오레세인-결합 dUTP 를 가지는 DNA 의 3'-말단을 제조자의 지시에 따라서, 제자리 세포 사멸 검출 키트(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 표지했다. 세포를 상기에 개시된 대로 항-MHC 항체로 역염색했고, 핵 역시 5 분동안 Hoescht 33258(10 μM, Sigma)로 염색했다. 500 이상의 근세포를 각 커버슬립에서 계수했고, TUNEL 양성 근세포의 비율을 계산했다. 아포프토시스를 겪는 세포의 비율을 정량화하기 위해서 70 % 에탄올/PBS 에 고정되고 프로피듐 요오드로 염색된 신생기 근세포의 유동 혈구계산 분석을 수행했다. 이 방법은 아포프토시스를 겪는 세포는 DNA 저이배체 양을 가지고, DNA 막대그래프상의 G0/G1 피크 이하의 넓은 면적에 위치한다는 관찰에 기초한다. 요약하면, 세포를 트립신화로 수거했고, 비부착 세포를 모았고, 70 % 에탄올에 고정했다. PBS 로 한 번 린스한 후에, 세포를 실내온도에서 30 분동안 RNaseA(5 Kunitz 단위/ml)를 포함하는 프로피듐 요오드(20 μg/ml, Sigma) 용액과 함께 인큐베이션했다. 데이터를 FACScan(Becton-Dickinson, SanJose, CA)를 사용하여 수거했다. 각 샘플에 대해서, 10,000 세포를 수거했다. 응집된 세포 및 매우 작은 세포 파편을 제거했다.

RNA 의 분리 및 혼성화

총 세포 RNA 를 TRIZOL 시약(Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD)을 사용하여 산 구아니디늄/티오시아네이트 페놀/클로로폼 추출 방법(Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987)의 변형으로 분리했다. RNA 를 포름알데히드 아가로스 겔 전기영동으로 크기-분획했고, 하룻밤동안 모세혈관 블럿팅에 의해 나일론 필터(Dupont, Boston, MA)에 옮겼고, 무작위 프라이밍의 의해 [α-³²P]dCTP (Life Technologies Inc.)로 표지된 cDNA 프로브와 함께 혼성화했다. 필터를 긴축 조건하에서 세척했고, X-레이 필름(Kodak X-Omat AR, Rochester, NY)에 노출시켰다. 신호 강도를 농도계측기(Ultrascan XL, Pharmacia) 로 측정했다. 다음의 cDNA 프로브를 사용했다: 래트 프레프로-심방 나트륨뇨배설촉진 인자(프레프로-ANF; 심장근세포 비후성 마커)(코드 영역의 0.6 kb)(Seidman, et al., Science 225; 324-326, 1984), 및 래트 골격 α-액틴(3'-비번역 영역의 240 bp)(Shani et al., Nucleic Acids Res. 9: 579-589, 1981). 래트 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(GAPDH; 하우스키핑 유전자) cDNA 프로브(코드 영역의 240 bp)(Tso et al., Nucleic Acids Res. 13: 2485-2502, 1985)를 로딩 및 전달 효험용 대조군으로 사용했다.

대동맥 협착 모델

증가하는 대동맥 협착을 상기에 개시된 대로(Schunkert et al., Circulation, 87; 1328-1339, 1993; Weinberg et al. Circulation, 90: 1410-1442, 1994; Feldman et al., Circ. Res., 73; 184-192, 1993; Schunkert et al., J. Clin. Inbest. 96: 2768-2774, 1995; Weinberg et al., Circulation, 95; 1592-1600, 1997; Litwin et al., Circulation, 91; 2642-2654; 1995), 수컷 비스타르 갓 이유한 래트(체중 50-70 g, 3-4 주, Charles River Breeding 실험실, Wilmington, Mass로부터 얻음)에서 수행했다. 허위-수술 동물을 연령별 대조군으로 했다. 대동맥 협착 동물 및 연령별 허위-수술 대조군을 외과수술 후 (군당 n=20-29) 6 및 22 주에서 복강내 펜토바르비탈 65 mg/kg 으로 마취시킨 후 죽였다. 이 모델에서 혈역학적 및 초음파심장조영술 연구는 정상의 좌심실(LV) 강 범위를 가진 대상 비후성 및 수축성 지표가 밴딩 후 6 주까지 존재하지만, 동물은 밴딩 후 22 주 쯤에 LV 강 확장의 개시 및 방출 지표의 온화한 감소 및 그람 LV 질량당 압력 발생을 특징으로 하는 초기 질환을 나타낸다는 것을 제시했다. 본 연구에서, 이미 개시된 대로(Schunkert et al., Circulation, 87: 1328-1339, 1993; Weinberg et al. Circulation, 90: 1410-1422, 1994; Feldman et al., Circ. Res., 73: 184-192, 1993; Schunkert et al., J. Clin. Invest. 96: 2768-2774, 1995; Weinberg et al., Circulation, 95: 1592-1600, 1997; Litwin et al., Circulation, 91: 2642-2654; 1995), 생체내 LV 압력 측정을 희생시키기 전에 수행했다. 동물에서 빠른 호흡, 복수 및 흉막 유출의 존재를 포함하는 심부전의 임상적 마커를 조사했다. 체중 및 LV 중량을 기록했다.

RNA 추출물로부터 LV 근세포 분리

동물의 서브셋(군당 n=10)에서, 심장을 빠르게 절개했고, 대동맥 캐뉼러에 부착시켰다. 콜라게나제 관류에 의한 근세포 해리를 이미 개시된 대로 수행했다(Kagaya et al., Circulation, 94:2915-2922, 1996; Ito et al, J. Clin. Invest. 99: 125-135, 1997; Tajima et al., Circulation, 99: 127-135, 1999). 최종 세포 현탁액에서 근세포의 비율을 평가하기 위해서, 근세포의 앨리쿼트를 고정했고, 침투가능하게 하여 차단했다. 그 다음, 세포 현탁액을 근세포 및 내피 세포와 구별하기 위해서 α-육종 액틴(mAb, Sigma, 1:20) 및 Willebrand 인자(pAb, Sigma, 1:200)에 대한 항체와 함께 인큐베이션했다. 텍사스 레드(또는 오레곤 그린) 결합체를 가지는 제 2 차 항체(염소 항-래빗, 염소 항-마우스 pAb, 분자 플로브, 1:400)를 검출 시스템으로 사용했다. 통상적으로, 98 % 근세포 및 내피 세포 또는 비염색 세포(섬유아세포)의 2% 미만의 단편을 얻었다.

RNA 분석

총 RNA 는 TRI 시약(Sigma)을 사용하여 대조군 및 비후성 근세포(각 군에서 n=10 심장), 및 LV 조직(각 군에서 n=10 심장)으로부터 분리되었다. 조직 및 근세포 RNA 에 다음의 프로토콜을 사용하였다. 근세포 RNA 를 사용하여, 노던 블럿을 GAPDH 로 표준화된 심방 나트륨뇨배설촉진 펩티드의 메세지 수준을 평가하기 위해 사용했다(Feldman et al., Circ. Res. 73: 184-192, 1993; Tajima et al., Circulation, 99: 127-135, 1999). 비후성 분자 마커를 사용하여 RNA 의 근세포 기원의 특이성을 확인하는데 본 실험을 이용했다.

다음의 프라이머 쌍을 사용하여 성숙한 래트 심장 및 성숙한 근세포로부터 얻은 샘플에서 ErbB2, ErbB4 및 뉴레구린 존재의 초기 측정을 위한 역전사-폴리머라제 사슬 반응(RT-PCR)을 수행했다: ErbB2 센스 5'GCT GGC TCC GAT GTA TTT GAT GGT 3' (SEQ ID NO: 7), ErbB2 안티센스 5'GTT CTC TGC CGT AGG TGT CCC TTT 3' (SEQ ID NO: 8) (Sarkar et al., Diagn. Mol. Pathol. 2: 210-218, 1993); ErbB3 센스 5'GCT TAA AGT GCT TGG CTC GGG TGT C 3' (SEQ ID NO: 3), ErbB3 안티센스 5'TCC TAC ACA CTG ACA CTT TCT CTT 3' (SEQ ID NO: 4) (Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9193-9197; 1989), ErbB4 센스 5'AAT TCA CCC ATC AGA GTG ACG TTT GG 3' (SEQ ID NO: 5), ErbB4 안티센스 5'TCC TGC AGG TAG TCT GGG TGC TG 3' (SEQ ID NO: 6) (Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1746-1750; 1993); 뉴레구린 센스 5'GCA TCA CTG GCT GAT TCT GGA G 3' (SEQ ID NO: 9), 뉴레구린 안티센스 5'CAC ATG CCG GTT ATG GTC AGC A 3' (SEQ ID NO: 10). 후자의 프라이머는 NRG-1 유전자에 의해 코드화된 핵산을 인식하지만, 그것의 이소형을 구별하지는 못한다. 증폭을 1 분의 변성에 의해 개시했고, 유전자 특이적 온도에서 2 분 어닐링했고, 72 ℃ 에서 2 분 연장했다. 전 PCR 반응을 1% 아가로스 겔상에서 전기영동했고, 기대된 크기의 PCT 산물을 겔-정제했다.

pGEM-T 벡터에(Promega, Madison, WI) 이 단편을 클로닝한 후에, 벡터내에 그러한 단편의 교정 및 방향을 서열결정에 의해 확인했다. 클론된 PCR 단편을 MAXI스크립트 시험관내 전사 키트(Ambion, Inc., Austin, TX) 및 α-³²P-UTP 를 사용하여 방사선표지 리보프로브를 생성시키는 데 사용했다. ErbB2, ErbB4 또는 뉴레구린 단편을 포함하는 플라스미드를 선형화하였고, 방사선표지 프로브를 T7 또는 T3 RNA 폴리머라제를 가지고 시험관 전사에 의해 합성했다. 키트에 의해 제공된 β-액틴 프로브를 T7 또는 T3 폴리머라제로 전사하였고, 각각 330 및 300 bp 의 단편을 생성했다. 20 μg 의 총 RNA 를 RPA II 키트(Ambion) 프로토콜에 따라서 후의 표준화를 위해서 2×10⁴cpm 의 β-액틴과 함께 5×10⁵cpm 의 ErbB2, ErbB4 또는 뉴레구린 c-RNA 에 혼성화했다.

RNase A/RNase T1 으로 분해한 후에, 샘플을 침전, 건조, 재분해하고 최종적으로 2 시간동안 5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리했다. 겔을 12-48 시간동안 Kodak MR 필름에 노출시키고, 분석을 이미지 Quant 소프트웨어 (Molecular Dynamics, Inc., Sunnyvale, CA)를 사용하여 자동-방사선사진의 농도측정 스캐닝에 의해 정량화했다. ErbB2, ErbB4 및 뉴레구린 mRNA 수준을 β-액틴으로 표준화했다.

ErbB2 및 ErbB4 의 웨스턴 블럿팅

LV 조직(군당 n=5 심장)을 50 mmol/L Tris HCI, pH 7.4, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.25% Na-데옥시콜레이트, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1 μg/ml 아프로티닌, l μg/ml 류펩틴, 1 μg/ml 펩스타틴 및 1mM Na₃PO₄를 포함하는 RIPA 완충액에서 빠르게 균질화했다. 단백질을 Lowry 분석 키트(Sigma)로 정량화했다. Laemmli SDS 샘플 완충액에서 50 μg 의 단백질을 5 분간 끓이고 원심분리 후에 10% SDS-PAGE 겔상에 로딩했다. 전기영동 후에, 단백질을 100 mA 로 하룻밤동안 니트로셀룰로스 멤브레인에 옮겼다. 필터를 0.05% Tween-20, 5% 비지방 우유로 차단한 다음, 항-ErbB2 또는 항-ErbB4(Santa Cruz Biotechnology, each diluted 1: 100, 1 μg/ml)와 함께 인큐베이션했다. 1:2000 으로 희석된 염소 항-래빗 과산화효소-결합 제 2 차 항체와 함께 인큐베이션한 후에, 블럿을 증가된 화학 발광(ECL) 검출 방법(Amersham, Life Science)에 놓은 후에 30-180 초 동안 코닥 MR 필름에 노출시켰다. 단백질 수준을 항-β-액틴(Sigma)으로 검출된 β-액틴의 단백질 수준으로 표준화했다.

뉴레구린에 대한 제자리 혼성화

좌심실 조직(n=2 대조군 및 6-주 대동맥 협착 심장)의 10 μm 저온조 절개를 제자리 혼성화를 위해 사용했다. 안티센스 및 센스 RNA 프로브를 T7 또는 T3 RNA 폴리머라제 및 디곡시게닌-표지 UTP(DIG RNA Labeling Mix, Boehringer Mannheim)로 pBluescript 에서 cDNA 단편으로부터 합성했다. 우선, 조직 절개를 20 분동안 4% 파라포름알데히드로 처리했고, 다음에 37 ℃ 에서 프로테인아제 K(10μg/ml)로 30 분동안 분해한 후에 4% 파라포름알데히드에서 5 분 더 고정했다.

고정 후에, 슬라이드를 5 분동안 PBS 에서 3 번 세척했고, 그 후에 절개상의 극성 및 하전기를 차단함으로써 비특이적 프로브 결합을 차단하기 위해서 절개를 10 분동안 0.25 % 아세트산 무수물을 가지는 0.1M 트리에탄올아민 클로라이드에 담구었다. 2 X SSC에서 슬라이드를 세척한 후에, 50 % 포름아미드/2X SSC 로 하전된 습윤 챔버에서 60 분동안 45 ℃ 에서 예비혼성화했다(50% 포름아미드, 2X SSC, 5% 덱스트란술페이트, 0.1% SDS, 1X Denhardt's, 400 μg/ml 변성 연어정자 DNA). 1시간 후에, 프로브를 예비혼성화 용액에 첨가했고, 슬라이드를 45 ℃ 에서 16-18 시간동안 혼성화했다.

하룻밤동안 혼성화한 다음에, 슬라이드를 45 ℃ 에서 30 분동안 진탕하면서 4 X SSC 에서 2 번 세척한 다음, 비혼성화 프로브를 제거하기 위해서 37 ℃ 에서 30 분동안 500 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0 에서 RNaseA(40 μg/ml) 와 함께 인큐베이션했다. RNase 처리 후에, 절개를 30 분동안 50 ℃ 에서 2X SSC 에 담군 다음, 같은 온도에서 0.2 X SSC 에 30 분 더 담구었다. 슬라이드를 TBSI 완충액 (100 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5)으로 앨리쿼트한 다음 제조자의 프로토콜에 따라서 실내온도에서 30 분동안 차단제로 차단했다(DIG Nucleic Acid Detection Kit, Boehringer Mannheim).

차단제를 제거한 후에, 슬라이드를 1 분동안 TBS I 에 담구었고, 그 다음 항-DIG-AP 결합 용액(DIG Nucleic Acid Detection Kit, Boehringer Mannheim)을 습윤 챔버에서 실내온도, 30 분동안 각 절개에 적용했다. 그 후에, 슬라이드를 과량의 항체를 제거하기 위해서 세척마다 10 분, TBS I 에서 3 번 세척했고, TBS II(100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 9.5, 50 mM MgCl₂·7H₂O) 에서 5 분동안 평형화했다. 제조자의 지시에 따라 색상 기질을 준비했고, 블루-색상 반응이 가시화될 때까지 각 절개에 적용했다. 반응을 멈추고 슬라이드를 각 5 분동안 PBS 및 증류수로 세척했다. 핵 역-염색 후에, 절개를 에탄올 시리즈로 탈수했고, 크실렌에 담구었고 Permount 에서 커버-슬리핑에 의해 적재했다.

통계학적 분석

모든 값은 평균±SEM 으로 나타냈다. 대동맥 협착 군(밴딩후에 6 및 22 주) 및 연령별 대조군 사이에 관찰된 차이의 통계학적 분석을 ANOVA 비교로 행했다. 쌍을 형성하지 않은 학생 시험을 밴딩후 같은 나이의 군 간의 차이에 사용했다. 통계학적 차이는 p＜0.05 수준으로 이해되었다.

실시예 II: 뉴레구린은 심장 근세포의 생존 및 성장을 촉진한다.

심장에서 뉴레구린 수용체의 발현

NRG 수용체(즉, ErbB2, ErbB3, ErbB4)의 발현을 결정하기 위해서, 일련의 발생 단계의 래트 심장 조직으로부터의 RNA, 및 방금 분리된 신생기 및 성숙한 심실 근세포로부터의 RNA 를 ErbB 수용체의 다양한 C-말단의 양쪽 측면에 위치한 프라이머를 사용하여 역전사하고 PCR 로 증폭했다. 도 1A 는 심장 발생동안 뉴레구린 수용체 mRNA 수준의 반정량적 RT-PCR 분석을 보여준다. 배아(E14, E16, 및 E19), 신생기(P1) 또는 성숙한(Ad) 래트 심장, 및 방금 분리된 신생기 래트 심실 근세포(NRVM) 또는 성숙한 래트 심실 근세포(ARVM)의 총 RNA FMF cDNA 에 역전사했고, 수용체 이소형-특이적 프라이머로 증폭했다(방법 참조). GAPDH 를 역전사, PCR 증폭, 및 겔 로딩을 위한 대조군으로 사용했다("M" 은 1 kb 또는 120 bp DNA 분자량 표준을 나타낸다). RT-PCR 산물은 DNA 서열결정으로 확증했다.

모든 3 개의 ErbB 수용체는 ErbB4 ＞ ErbB2 ＞ ErbB3 의 상대적인 mRNA 풍부의 순서로 배아발생의 중기의 발생하는 래트 심장에서 발현되었다. ErbB 수용체의 발현은 배아발생에서 후에 하향조절되었다. E16 및 E19, 및 신생 일 1 일 후(P1)에서는 ErbB2 및 ErbB4 mRNA 만이 검출되었다. 성숙한 래트 심장에서, ErbB4 는 여전히 검출가능하지만, 그것의 mRNA 풍부는 배아 및 신생 심장에서 검출된 것보다 낮은 반면에, ErbB2 mRNA 및, 드물게는 ErbB3 mRNA 는 성숙한 심근에서 단지 낮은 수준으로 검출될 수 있었다. 방금 분리된 신생기 및 성숙한 래트 심실 근세포 제 1 차 배양물에서, ErbB2 및 ErbB4 mRNA 모두 RT-PCR 로 쉽게 검출가능하지만, ErbB4 발현 수준은 ErbB2 의 발현 수준보다 일정하게 더 높았다. 더욱이, ErbB2 에 대한 수용체-특이적 cDNA 프로브를 사용하는 경우에, ErbB3 및 ErbB4, ErbB4 에 대한 전사체만이 노던 블럿에 의해서 방금 분리된 신생기 및 성숙한 래트 심실 근세포에서 쉽게 검출가능했다.

어떤 ErbB 수용체가 뉴레구린 치료 후에 티로신-인산화되었는지를 결정하기 위해서, 24 내지 48 시간동안 무혈청 배지에서 유지된 NRVM 또는 ARVM 의 제 1 차 배양물을 뉴레구린, 즉 재조합 사람의 신경교 성장 인자 2(rhGGF2)(20 ng/ml)의 존재 또는 부재로 5 분동안 처리했다. ErbB4 수용체 단백질을 500 μg 의 NRVM 용해질 또는 2000 μg 의 ARVM 용해질의 항-ErbB4 항체로 면역침전하고, ErbB4 의 인산화 형태를 항-포스포티로신 항체로 검출했다. 도 1B 에 도시된 블럿은 3 개의 독립적인 실험의 대표도이다. 도 1B 에 도시된 대로, 인산화 ErbB4 는 신생기 근세포에서 매우 현저하고, 성숙한 근세포에서는 검출가능하지만 덜 발현되고, 이것은 상기에서 관찰된 ErbB4 mRNA 풍부의 수준과 일치한다. ErbB2 및 ErbB3 의 인산화 형태는 신생기 후의 심근세포에서 2 개의 뉴레구린 수용체에 대한 상당히-감소된 mRNA 풍부와 일치하는 비오틴화-항포스포티로신 항체로 면역침전될 때 조차도 검출할 수없었다.

GGF2 는 신생 래트 심실 근세포에서 DNA 합성을 자극한다.

NRVM 제 1 차 배양물에서 DNA 합성을 자극하는 GGF2 의 능력을 조사하기 위해서, 2 일동안 무혈청 배지에서 유지된 근세포를 30 시간동안 연속적으로 40 ng/ml rhGGF2 로 처리했다. DNA 합성을 각 실험 종결전에 각각 24 시간 또는 8 시간에서 배지에 첨가된 BrdU (도 2B) 또는 [³H] 티미딘(도 3A 및 3B) 의 삽입을 측정함으로써 모티터했다.

도 2A 는 TRITC-결합 염소 항-마우스 항체(레드)로 가시화된 NRVM 에서 근세포 미오신 중쇄를 도시한다. 도 2B 는 BrdU-양성 핵이 플루오레세인-결합 마우스 항-BrdU-항체(그린)로 가시화된 것을 도시한다. 도 2A 및 도 2B 의 스케일 바는 10 ㎛ 이다. 도 2C 는 대조군 조건 및 GGF2의 존재하에 BrdU-양성 근세포의 비율을 도시한다(데이터는 3 실험에 대한 평균±SD 이고, *, p < 0.01). 도 2C 에 개시된 대로, 40 ng/ml(대략 0.7 nM)의 rhGGF2 가 BrdU-표지 근세포(신생일 후 1 일의 래트 심장 심실)의 비율을 약 80 % 의 비율로 증가시켰고, 증가의 정도는 [³H] 티미딘 삽입으로 관찰된 것과 유사한 정도였다(도 3A).

도 3A 및 3B 는 래트 심실 근세포 제 1 차 분리물로부터 근세포-강화 및 비근세포 분획에서 DNA 합성에 대한 GGF2 의 효과를 도시한다. 도 3A 에서, NRVM-강화 제 1 차 분리물 또는 "비-근세포"-강화 분획(방법 참조)을 단지 대조준(즉, 무혈청) 배지(Ctl)에 노출시키거나 40 ng/ml rhGGF2(GGF) 또는 7% 태아 소 혈청(FBS)을 포함하는 배지에 노출시켰다. 도 3B 에서, NRVM DNA 에 대한 GGF2 의 농도-의존 효과가 도시된다. DNA 합성을 [³H] 티미딘 삽입에 의해 평가했고, 데이터를 각 실험에서 대조군 세포의 평균 cpm 으로 표준화된 상대 cpm/디쉬로 나타냈다(3 개의 독립적인 실험으로부터 평균 ±SD 의 복제물 분석, *, p＜0.01 대 대조군). 20 ng/ml 의 rhGGF2 는 NRVM 에 약 60 % 의 [³H] 티미딘 결합 증가를 일으켰고, 이것은 7% FBS 로 관찰된 것의 반이었다. NRVM 에 대한 rhGGF2 의 분열유발성 효과는 농도 의존적이었고, 50 ng/ml(즉, 0.9 nM) 에서 약 80 % 증가였다(도 3B). GGF2 는 래트 배아 심실 근세포(E19) 및 신생후 심실 근세포(P5)에 BrdU 또는 [³H] 티미딘 결합에 대한 유사한 분열유발 효과를 가진 반면에, 100 ng/ml 의 GGF2 의 농도는 성숙한 래트 심실 근세포 제 1 차 배양물 DNA 합성에 대한 효과가 없었다.

신생기의 래트 심실 근세포 분리 과정의 예비플레이팅에 의해 얻어진 비근세포 분획에 대한 rhGGF2 의 효과가 조사되었다. 도 3A 에 도시된 대로, rhGGF2 는 비근세포에의 [³H] 티미딘 삽입에의 어떤 중요한 변화를 유발하지 않는다. 이것은 세포군에 [³H] 티미딘 삽입에서 거의 10 배 증가를 유발하는 7% FBS 에 대조적이었다. 그러므로, GGF2 는 본원에 사용된 근세포 분리 방법을 사용하여 대부분 섬유아세포 및 내피 세포로 구성되는 근세포-결핍 세포군에 비교되는 심근세포에 대한 상대적으로 특이적인 활성을 도시한다.

공지된 뉴레구린 수용체가 태아 및 신생기 심실 근세포에 대해 GGF2 의 분열유발 효과를 매개하는지를 결정하기 위해서, DNA 합성을 ErbB2, ErbB3 및 ErbB4 에 특이적인 항체와 함께 인큐베이션한 후에 제 1 차 NRVM 배양물에서 측정했다. 신생 근세포를 무(대조군), 또는 rhGGF2(10 ng/ml), 또는 rhFGF2(20 ng/ml), 또는 ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4 에 대한 GGF2/FGF2 로, 단독 또는 상기에 개시된 조합으로 30 시간동안 처리한 후에 무혈청 배지에서 2 일동안 배양했다. 항체(0.5 μg/ml/항체)를 GGF2 또는 FGF2 의 첨가전에 2 시간동안 세포와 함께 예비침전했다. [³H] 티미딘을 마지막 8 시간 동안 첨가하였다(데이터를 각 실험에서 대조군 세포의 평균 cpm 으로 표준화된 상대 cpm/디쉬로 나타낸다; *, p＜0.04 대 rhGGF2 단독; #, p＞0.1 대 rhGGF2 단독).

도 4 에 도시된 대로, c-neu/ErbB2 의 세포외 도메인에 대한 단일클론 항체는 GGF2가 억제됨으로써 [³H]티미딘의 NRVM 에의 삽입에서 GGF2-의존체 증가를 억제한다는 것을 도시했다. 유사하게, ErbB4 의 C-말단에 특이적인 항체 역시 GGF2 에 의해 유발된 약 50 % 의 [³H] 티미딘 삽입 증가를 차단했다. 2 항체의 조합은 항-ErbB2 또는 항-ErbB4 항체 단독과 같은 효과를 가졌다. 대조적으로, ErbB3 에 대한 항체는 GGF-2 유발 DNA 합성에 대한 효과가 없었다. ErbB2 및 ErbB4 항체로 보여진 효과가 GGF 에 특이적이라는 것을 증명하기 위해서, 시스터 NRVM 제 1 차 배양물을 20 ng/ml rhFGF2 로 처리했다(재조합 사람 bFGF). 어떤 항체도 rhFGF2 와 [³H] 티미딘 삽입에서 약 2-배 증가에 대한 어떤 효과도 없었다. 이러한 결과는 적어도 2 개의 공지된 뉴레구린 수용체 티로신 키나제가 존재하고 신생기 심실 근세포에서 하류 신호 전달에 결합된다는 것을 제시한다.

GGR2 프로모터는 시험관내에서 심근세포 생존을 촉진한다.

발생동안, 기능적 배아 근세포에서 순증가는 근세포 증식 능력 및 생존 모두에 의존적이다. 그러므로, GGF2 가 증식에 추가적으로 심장 근세포의 생존을 촉진시킬 수 있는지를 결정하는 것이 중요했다. 10 μM 의 시토신 아라비노사이드(AraC) 의 존재 또는 부재로 무혈청 배지에서 유지된 NRVM 의 제 1 차 배양물을 4 일동안 GGF2 의 지시 농도로 처리했고, 대사적으로 활성 세포의 상대 수를 MTT 세포 호흡 분석법(방법 참조)에 의해 결정했다. 데이터는 GGF2 의 첨가 0 일에서 복제 배양물 디쉬에서 근세포의 평균 MTT 활성의 비율로 나타난다. 데이터는 평균±SD 으로 제시된다(n=3 실험; *, p＜0.05 대 대조군). 대략 25 % 의 세포가 4 일까지 사멸한다는 것을 관찰했다. 대조적으로, GGF2 의 첨가는 대조군과 비교하여 MTT 활성에서 30 % 증가를 초래했다. 효과는 0.2 ng/ml 의 EC50 으로 농도-의존적이었다(도 5). 생존 효과는 7 일 이하의 NRVM 제 1 차 배양물에서 관찰했다; 또한 시토신 아라비노사이드(AraC), 항증식제의 존재가 관찰되었다. 도 5 에서 보여진 대로, GGF2 의 생존 효과는 시토신 아라비노사이드의 계속적인 존재에서 대조군 배양물에서 약 70 % 생존력에 비교되는 50 ng/ml rhFFF2 의 존재하에서 90 % 근세포 생존력을 가지고 4 일에 관찰되었다. 대조적으로, GGF2 는 4 일에서 근세포-결핍, "비근세포" 강화 제 1 차 분리물에 대한 중요한 효과가 없었다.

GGF2 의 생존 효과가 프로그램화 세포 사멸(아포프토시스)의 억제에 의해 조절될 수 있는 지를 검사했다. 무혈청 배지에서 NRVM2 의 제 1 차 배양물을 rhGGF2 의 부재 (도 6A-6C) 또는 20 ng/ml 의 rhGGF2 존재(도 6E-도 6G)에서 유지했다. 그 다음, 세포를 고정했고, 근세포를 가시화하기 위해서 항-MHC 항체 및 TRITC-결합 제 2 차 항체로 염색하거나(도 6A 및 도 6E), 아포프토시스성 세포를 제거하기 위해서 플루오레세인-결합 dUTP(즉, TUNEL)로 염색했다. TUNEL-양성 근세포는 세포 수축 및 염색질 응축을 나타냈고, 이것 역시 Hoescht 33258-염색(도 6C 및 도 6G) 에 의해 확인되었다. 아포프토시스를 TUNEL-양성 근세포의 수를 계수하거나(도 6D) rhGGF2(H)의 지시 농도로 4 일동안 처리된 제 1 차 NRVM의 프로피디움 요오드 염색 다음에 아-G1 분획의 유동 혈구계산에 의해 정량화했다. 도 6D 및 도 6H 에서 제시된 데이터는 3 개의 독립적인 실험에 비하여 평균±S.D 로서 제시된다. 도 6A-6C 및 도 6E-6G 의 스케일 바는 10 μM 을 나타낸다.

무혈청 배지에서 6 일 후에, 약 17% NRVM 은 저밀도(즉, 아합류)로 대조군 조건하에서 유지되었고 TUNEL 염색법에 의해 검출될 때, 아포프토시스 세포 사멸과 양립가능한 적은 농축 핵 및 세포 수축의 아포프토시스의 증후를 나타냈다(도 6A-6C 및 6E-6G). 20 ng/ml rhGGF2 의 존재하에서, TUNEL 양성 근세포의 수는 약 8% 감소했다(도 6D). 아포프토시스를 억제하는 GGF2 의 효과 역시 또한 프로피디움 요오드-표지 NRVM 제 1 차 배양물의 유동 혈구계산 분석을 사용하여 정량화했다. 무혈청 및 무인슐린 배지에서 4 일 배양 후에, 22 % 의 NRVM 은 저이배체였고, 프로그램화 세포 사멸의 개시와 일치했다. 10 ng/ml 이상의 농도로 rhGGF2 의 존재에서, 10 % 미만의 NRVM 은 아포프토시스의 증거를 나타냈다(도 6H).

성숙한 래트 심실 근세포(ARVM) 에 대한 GGF2 의 생존 및 항아포프토시스 효과 역시 MTT 세포 호흡 분석 및 TUNEL 염색에 의해 검사되었다. 도 7A 에서 도시된 실험에서, ARVM 의 제 1 차 배양물을 6 일동안 무혈청 및 무인슐린 배지(즉, "ACCTT", 방법 참조), 또는 ACCTT 배지 및 GGF2 에서 유지했다. 대사적으로 활성 세포의 수는 MTT 세포 호흡 분석법으로 결정했고, 데이터는 비처리, 대조군 세포의 평균 흡광도로 표준화된 상대 흡광도로 나타내었다. 각 바는 평균±S.D 를 나타낸다(n=3 실험; *, p＜0.05 대 대조군). 도 7B 에서 도시된 실험에서, ARVM 의 제 1 차 배양물을 3 일 동안 ACCTT 배지(대조) 또는 ACCTT 배지 및 rhGGF2 (25ng/ml)에서 유지했다. 4% 파라포름알데히드로 고정한 후에, 근세포를 항-MHC 항체 및 TRITC-결합 제 2 차 항체로 가시화했고, 아포프토시스 세포를 TUNEL 염색법에 의해 확인했다. 약 500 근세포를 각 커버슬립에서 계수했다(데이터는 3 개의 독립적인 실험의 평균 ±S.D 이다; *, p＜0.05 대 대조군). 비처리 ARVM 제 1 차 배양물과 비교할 때, 10 % 이상의 세포가 TUNEL 표지에 대해 양성이었고, rhGGF2(20 ng/ml)-처리 성숙한 근세포 배양물은 약 3% TUNEL-양성 염색만을 나타냈다(도 7B). 이러한 결과는 뉴레구린은 신생기 및 성숙한 심실 근세포 모두에서 프로그램화 세포 사멸을 예방함으로써 적어도 부분적으로 생존 인자로서 기능한다는 것을 나타낸다.

GGF2 는 심장 근세포의 비후성 성장을 유발한다.

뉴레구린 신호전달이 심근세포에서 비후성(성장) 반응을 유발할 수 있는지를 조사하기 위해서, 신생기 및 성숙한 래트 심실 근세포 제 1 차 배양물 모두에서 근세포 비후성 유발에 대한 GGF2 의 효과를 검사했다. 도 8A 및 8B 는 무혈청 배지에서 72 시간동안 rhGGF2 (20 ng/ml)의 부재(도 8A) 또는 존재(도 8B)로 인큐베이션한 후 세포를 고정하고 심장 MHC(레드, TRITC)에 대한 항체로 염색하고 간접적인 면역형광 현미경을 사용하여 검사된 아합류 NRVM 제 1 차 분리물의 광현미경사진을 도시한다. 도면에서 보여진 스케일 바는 10 μM 을 나타낸다. 20 ng/ml (즉, 0.36 nM)의 rhGGF2 와 함께 무혈청 배지에서 72 시간 인큐베이션한 후에, 신생기 심장 근세포(NRVM)는 세포 크기 및 근원섬유 발생에 상당한 증가를 나타냈다.

심근세포에서 비후성 반응은 많은 형태상의 변화뿐만 아니라 세포성 증식없이 수축성 단백질 함량의 증가와 같은 세포 크기의 증가 및 "배아성" 유전자 프로그램의 재-활성을 특징으로 한다. 그러므로, 프레프로-ANF 및 골격 α-액틴 mRNA (신생기 및 성숙한 심실 근세포에서 일반적으로 상대적으로 낮은 양으로 발견된 전사체)의 수준, 및 NRVM 제 1 차 배양물에서 단백질 합성의 지표로서 [³H] 류신 삽입에 대한 뉴레구린의 효과를 검사했다. 도 8C 는 지시된 시간동안 rhGGF2(20ng/ml) 의 존재 또는 부재로 인큐베이션된 NRVM 의 총 RNA(20 μg/래인)로부터 프레프로-ANF 및 골격 α-액틴 mRNA 에 대한 노던 블럿 분석을 도시한다. 동등한 로딩 및 RNA 의 전이는 GAPDH 혼성화로 확인되었다. RhGGF2 (20 ng/ml)는 60 분내에, 대략 16 시간내에 배가되면서 프레프로-ANF 및 골격 -액틴에 대한 mRNA 수준을 증가시켰다.

단백질 합성에 대한 GGF2 의 효과를 시험하기 위해서, NVRM 을 24 시간동안 무혈청 배지에서 배양한 후에 40 시간동안 rhGGF2 의 지시된 농도로 처리했고,GGF2 자극의 종결전에 8 시간동안 [³H] 류신으로 펄스했다. GGF2 의 각 농도마다 [³H] 류신의 삽입은 각 디쉬의 단백질 함량으로 표준화되었고, 데이터는 각 실험에서 비처리 대조군 세포의 평균 cpm 으로 표준화된 상대 cpm/디쉬로 나타낸다(평균 ±S.D.; n=3 실험; *, p＜0.01 대 대조군). 도 8D 는 GGF2 역시 5 ng/ml 의 농도로 약 48 시간에서 약 120 % 증가로 [³H] 류신 삽입을 자극했다는 것을 도시한다. 비근세포 염색 세포에의 [³H] 류신 흡수의 비율에 대한 GGF2 의 가능한 실패 효과를 최소화하기 위해서, 이러한 실험은 유사한 결과를 가지는 시토신 아라비노사이드의 연속적인 존재에서 반복했다.

GGF2 역시 배양된 성숙한 래트 심실 근세포(ARVM)에서 비후성 반응을 초래했다. ARVM 의 제 1 차 배양물을 24-웰 디쉬에서 커버슬립에 플레이팅했고, rhGGF2(20 ng/ml)의 부재(도 9A) 또는 존재(도 9B 및 9C)로 ACCITT 배지에서 5 일동안 유지했다. 세포를 4% 파라포름알데히드에서 고정했고, 미오신 중쇄에 대한 항체로 염색했고(그린, FITC), 촛점을 공유하는 현미경으로 검사했다. 스케일 바는 10 μM 을 나타낸다. 20 ng/ml 의 rhGGF2 의 연속적인 존재하에서 72 시간까지, 어떤 성숙한 근세포는 1 차적으로 삽입된 디스크 영역으로부터 "슈도포드"-유사 연장을 개시했고, 5 일까지, 60 % 의 GGF-처리 성숙한 심근세포는 도 9B 및 9C 에서 예시된 것과 일치하는 표현형 변화를 나타낸 반면에, 80 % 의 비처리 ARVM 은 도 9A 에 제시된 표현형을 유지했다.

GGF2 는 또한 ARVM 에서 프레프로-ANF 및 골격 α-액틴의 발현을 증가시켰다. ARVM 의 1 차 분비물은 지시된 시간동안 20 ng/ml rhGGF2 의 존재 또는 부재로 자극된다. 총 RNA 를 분리하여 프레프로-ANF 및 골격 α-액틴 cDNA 프로브를 사용하여 노던 블럿(25 μg/래인)으로 분석했다. 동량의 로딩 및 전이 조건이 GAPDH 혼성화로 확인되었다. 페닐레프린(PE, 10μg)을 비대성 성장에 대한 양성 대조군으로 사용했다. 도 9D 에 도시된 대로, rhGGF2(20ng/ml)는 8 시간 후에 ARVM 제 1 차 배양물에서 프레프로-ANF mRNA 풍부를 2 배 증가시켰고, 20 시간내에 3 내지 4 배 증가되었다. 골격 α-액틴 mRNA 풍부의 증가는 페닐레프린(10μg), 성숙한 래트 심실 근세포에서 비후성 성장 및 많은 태아 유전자의 발현을 유발하는 것으로 알려진 α-아드레날린 아고니스트와 함께 제시된 것 보다 훨씬 크다는 것이 관찰되었다. 7 시간내에, 골격 α-액틴 mRNA 수준은 쉽게 검출가능하고, 30 시간까지 GGF2 로 처리마다 추가적인 250 % 까지 증가했다. GGF2 또는 페닐레프린의 어떤 것도 본원에 사용된 조건하에서 GAPDH mRNA 풍부에 대한 효과가 없었다.

단백질 합성에 대항 GGF2 의 효과를 시험하기 위해서, ARVM(ACCITT 배지에서 2 일)는 40 시간동안 rhGGF2 의 농도를 증가시킴으로써 자극시켰고, [³H] 류신을 최종 14 시간동안 첨가했다. GGF2-처리 배양물에서 [³H] 류신 섭취는 비-자극 대조군 근세포에서 평균 [³H] 류신 섭취로 표준화되었다. 데이터는 디쉬간의 세포수의 어떤 가변성을 조정하기 위해서 또한 각 디쉬의 단백질 함량으로 표준화되었다(평균 ±S.D; n=4; *, p＜0.01 대 대조군). 도 9E 에 도시된 대로, GGF2 는 5 ng/ml 의농동에서 70 % 의 증가로 [³H] 류신 삽입의 투여량-의존 증가를 유발했다. 그러므로, 뉴레구린은 나노몰 이하 농도에서 신생기 및 성숙한 래트 심실 근세포 표현형 모두에서 비후성 채택과 일치하는 표현형 변화를 유발한다.

실시예 III: ErbB2 및 ErbB4 발현 수준은 만성 비후성에서 초기 심부전으로의 전이에서 대동맥 협착을 감소시킨다.

LV 비후성 및 혈액동력학

표 1 에 보여진 대로, 좌심실(LV)중량 및 LV/체중 비율은 연령별 대조군과 비교하여 6 주 및 22 주 대동맥 협착 동물에서 크게(p＜0.05) 증가했다. 생체내 LV 수축압은 연령별 대조군에 비교하여 6 주 및 22 주 대동맥 협착 동물에서 모두 크게 증가했다. 시험관내에서 LV 말단 확장 압력은 연령별 대조군에 비교하여 대동맥 협착 동물에서 훨씬 높았다. 이 모델에서 이전의 연구와 일치하여, 그람당 LV 수축 발생 압력은 연령별 대조군과 비교하여 6-주 대동맥 협착 동물에서 현저하게 높았지만, 22-주 대동맥 협착 동물에서 감소되었다. 밴딩 후 22 주에, 대동맥 협착 동물은 또한 빠른 호흡, 작은 흉막 및 심막액 유출을 포함하는 심부전의 임상적 징후를 나타냈다.

표 1 설명: LVH, 대동맥 협착 후에 6 및 22 주에서 좌심실 비후성을 가지는 심장; C, 연령별 대조군; BW, 체중; LV Wt, 좌심실 중량; LVEDP, LV 말단 확장 압력; LV devP, 그림당 LV 발생 압력. 값은 평균 ±SEM; *p＜0.05 대 연령별 대조군; p＜0.05 대 6 주 LVH. 군당 n=14-20.

대동맥 협착에서 LV ErbB3, ErbB4 및 뉴레구린의 발현

RT-PCR 을 사용하여, 좌심실 비후성이 존재 및 부재하는 성숙한 수컷 래트의 심장으로부터 유래한 LV 조직뿐만 아니라 정상 및 비후성 근세포에서 ErbB2, ErbB4 및 뉴레구린 mRNA 를 검출할 수 있었지만, ErbB3 mRNA 는 검출되지 않았다. 도 10A 는 6 주 대동맥 협착 심장 및 대조군, 및 22 주 대동맥 협착 심장 및 대조군에서 LV ErbB2 및 β-액틴 mRNA 발현을 증명하는 리보뉴클레아제 보호 분석법을 도시한다. 도 10B 는 6 주 대동맥 협착 심장 및 대조군, 및 22 주 대동맥 협착 심장 및 대조군에서 LV ErbB4 및 β-액틴 mRNA 발현을 증명하는 리보뉴클레아제 보호 분석법을 도시한다. 대동맥 협착 래트 및 대조군에서(군당 n=5 심장) LV ErbB2, ErbB4 및 뉴레구린 mRNA 수준의 일정한 상태 수준을 리보뉴클레아제 보호 분석법(RPA)으로 측정한 다음 β-액틴으로 표준화한다. LV 뉴레구린 mRNA 수준은 연령별 대조군(0.68±0.12 대 0.45±0.12 단위, NS)에 비교되는 6 주 대동맥 협착 래트 또는 연령별 대조군(0.78±0.21 대 0.51±0.21 단위, NS)에 비교되는 22 주 대동맥 협착 래트의 조직에서 크게 다르지 않았다. 더욱이, β-액틴 수준으로 표준화된 LV ErbB2 및 ErbB4 mRNA 수준이 대조군에 비하여 대상 비후성을 가지는 6 주 대동맥 협착 래트에서 유지되었다. 대조적으로, LV ErbB2 (p＜0.05) 및 ErbB4(p＜0.01) 메세지 수준은 초기 심부전 단계의 22 주 대동맥 협착 래트에서 크게 감소했다(도 10 및 표 2).

표 2 설명: LVH, 대동맥 협착 후에 6 및 22 주에서 좌심실 비후성을 가지는 심장; C, 연령별 대조군; 좌심실(LV) mRNA 수준은 리보뉴클레아제 보호 분석법으로측정했고, β-액틴으로 표준화했다; mRNA 수준을 LV 조직(mRNA, LV; 군당 n=5 심장) 및 LV 근세포(mRNA, 근세포; 군당 ErbB2 n=5; 군당 ErbB4 n=3-4 심장)의 RNA 에서 측정했다. LV 단백질 수준을 웨스턴 블럿팅에 의해 LV 조직(군당 n=5)에서 측정했고, β-액틴으로 표준화했다. 값은 평균±SEM; *p＜0.05 대 연령별 대조군; **p＜0.01 대 연령별 대조군.

다음에, 6-주 및 22 주 대동맥 협착 동물 및 대조군의 LV 근세포의 RNA 에서 유전자 발현을 검사했다. 근세포에서 발현 특이성을 근세포 RNA 및 GAPDH 수준으로의 표준화를 사용하여 심방 나트륨뇨배설 촉진 펩티드(ANP)의 메세지 수준, 압력 과부하 비후성의 양성 분자 마커를 검사함으로써 결정했다. 도 11 에 도시된 대로, ANP 는 대조군(군당 n=5)에 비교하여 6 주(710±16 대 230±40 단위, p＜0.05) 및 22 주 대동맥 협착 동물(898±52 대 339±13 단위, p＜0.05)의 근세포에서 상향조절되었다. 뉴레구린은 어떤 군에서 근세포로부터 유래된 RNA 에서 RPA 에 의해 검출할 수 없었다.

ErbB2(군당 n=5) 및 ErbB4(군당 n=3-4) 메세지 수준 역시 대동맥 협착 군의 근세포 RNA 에서 측정되었다(도 12 및 표 2). 도 12A 는 6-주 대동맥 협착 심장 및 대조군, 및 22 주 대동맥 협착 심장 및 대조군에서 LV 근세포 ErbB2 및 β-액틴 mRNA 발현을 증명하는 리보뉴클레아제 보호 분석법을 도시한다. 도 12B 는 6-주 대동맥 협착 심장 및 대조군, 및 22 주 대동맥 협착 심장 및 대조군에서 LV 근세포 ErbB4 및 β-액틴 mRNA 발현을 증명하는 리보뉴클레아제 보호 분석법을 도시한다. LV 조직 샘플에서의 측정과 일치하게, β-액틴 수준으로 표준화된 심근세포 ErbB2및 ErbB4 mRNA 수준은 대상 비후성 단계(NS)에서 6 주 대동맥 협착 동물의 대조군에 비하여 일정하였다. 그러나, ErbB2 및 ErbB4 발현은 심부전으로의 전이에서 22 주 대동맥 협착 동물에서 크게 하향조절된다(p＜0.01).

LV ErbB2 및 ErbB4 단백질 수준

ErbB2 및 ErbB4 에 대한 다클론 항체를 사용하는 웨스턴 블럿팅을 연령별 대조군과 비교하여(군당 n=5) 6 주 및 22 주 대동맥 협착 래트의 LV 조직으로부터 유래된 단백질 샘플을 사용하여 수행했다. 도 13A 및 13B 는 6 주(도 13A) 대동맥 협착 심장 및 대조군, 및 22- 주(도 13B) 대동맥 협착 심장 및 대조군에서 LV ErbB2 및 β-액틴 단백질을 나타내는 웨스턴 블럿을 도시한다. 도 13C 및 13D 는 6 주(도 13C) 대동맥 협착 심장 및 대조군, 및 22- 주(도 13D) 대동맥 협착 심장 및 대조군에서 LV ErbB2 및 β-액틴 단백질을 나타내는 웨스턴 블럿을 도시한다. 각 수용체의 밀도계 신호는 β-액틴을 시그널하도록 표준화되었다. 도 13A-도 13B 및 표 2 에 도시된 대로, ErbB2 및 ErbB4 mRNA 발현은 대상 비후성(NS) 단계의 6 주 대동맥 협착 동물에서 대조군에 비하여 보존되지만, ErbB2 (p＜0.05) 및 ErbB4 (p＜0.01) 는 초기 심부전동안 22 주 대동맥 협착 동물에서 하향조절된다.

그러므로, ErbB2 및 ErbB4 의 LV 메세지 및 단백질 수준 모두의 감소는 압력 과부하 모델에서 초기 심부전 단계에 존재한다.

뉴레구린에 대한 제자리 혼성화

뉴레구린의 안티센스 디곡시게닌-표지 mRNA 는 LV 냉동절개에 대한 재생가능한 혼성화 신호를 생산한 반면에, 상응하는 센스 전사체는 기저 이상의 어떤 신호도 나타내지 않았다. 성숙한 심장 냉동절개에서 뉴레구린 신호는 다른 세포 상응물에서 최소 또는 무신호를 가지는 심장 미세심실의 내피 세포에서 관찰되었다. 대조군 및 대동맥 협착 동물간의 차이가 없었다.

실시예 IV: 뉴레구린-1 EGF-유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 의한 대동맥 협착 마우스에서 심부전의 억제.

상기의 실시예는 rhGGF2 가 아포프토시스를 억제하고 ErbB2 및 ErbB4-의존성 형태로 심근세포 비후성을 자극한다는 것을 나타내는 데이터를 개시한다. 게다가, ErbB2 및 ErbB4 수용체는 압력 과부하-유발 심부전을 가지는 래트의 좌심실에서 하향조절된다. 심근세포 아포프토시스는 대동맥 협착 마우스에서 초기 대상 비후성 단계동안은 거의 없지만, 초기 심부전으로의 전이동안 일정하게 나타난다(즉, 대동맥 밴딩 후 7 주).

상기 관찰은 뉴레구린 유전자에 의해 코드화된 EGF-유사 도메인을 가지는 폴리펩티드의 투여는 울혈성 심부전으로의 진행을 억제하고/또는 예방하는데 유용할 것이다는 것을 나타낸다. 이론에 의해 뒷받침되지는 않지만, 뉴레구린 치료는 심근세포 비후성을 자극함으로써 심장의 펌핑력을 강화시키고, 심근세포 아포프토시스를 억제함으로써 심장의 더이상의 악화를 부분적 또는 완전히 예방할 것이다.

당업자는 당업계에 알려진 울혈성 심질환에 대한 많은 동물 모델 중 하나를 사용하여 울혈성 심질환에 대한 예방 또는 이미-존재하는 심질환의 진행을 늦추거나 멈추게 하기 위해 요구되는 최적의 투여량을 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 개시점으로부터, 대동맥 협착 동물 모델의 심질환의 초기 단계 및 말기 단계에서투여된 GGF2 의 상대 효험 0.3 mg/kg 투여량은 하기와 같이 평가될 수 있다.

군 1(n=6); 치료:rhGGF2 의 주입(2 틀에 한 번 0.3 mg/kg), 대동맥 밴딩 후 48 시간에서 개시되고 7 주 동안 계속됨.

군 2(n=6);치료: rhGGF2 의 주입(2 틀에 한 번 0.3 mg/kg), 대동맥 밴딩 후 4 주에서 개시되고 7 주 동안 계속됨.

군 3(n=6); 대조군: 허위 주입, 대동맥 밴딩 후 48 시간에서 개시되고 7 주 동안 계속됨.

군 4(n=6); 대조군: 허위 주입, 대동맥 밴딩 후 48 시간에서 개시되고 7 주 동안 계속됨.

동물을 7 주 말기에 죽인다. 희생 전에, 좌심실 혈동력학을 상기의 실시예 I 에 개시된 대로 또는 다른 표준 프로토콜을 사용하여 측정한다. 촛점이 같은 현미경을 표준 프로토콜 또는 실시예 I 에 개시된 것을 사용하여 세포 사멸 측정용 제자리 닉-말단 표지(TUNEL) 또는 유사한 기법에 의해서 근세포 성장(비후성) 및 근세포 아포프토시스를 정량화하기 위해서 사용할 수 있다.

당업자는 울혈성 심부전을 최소화, 예방, 또는 심지어 회복을 위해서 최적의 뉴레구린 투여량 섭생을(예를 들어, 투여량, 투여 빈도, 질환 과정 동안의 뉴레구린 치료 개시를 위한 최적의 시간) 결정하기 위해서 필요한 실험을 수행하는 방법을 완전히 이해할 것이다.

실시예 V: NRG-1 는 래트 심장 근세포에서 안트라사이클린-유발 아포프토시스를 억제한다.

안트라사이클린 항체(예를 들어, 다우노루비신, 및 독소루비신)는 20 년 이상 암 화학요법의 중요물이었다. 그러나, 이러한 약제의 짧고 긴 기간 심장독성은 환자에게 투여될 수 있는 개별적인 투여량 및 누적적 투여량 모두를 제한한다.

안트라사이클린-유발 심장독성의 2 가진 임상 형태가 있다. 안트라사이클린의 1 회 투여 후에 발생할 수 있는 급성 형태는 전기심장그래프의 변화, 마취, 및 심실 수축 기능에서 가역적인 감소를 특징으로 한다. 만성, 지효성 형태는 확장 심근병증 및 울혈성 심부전으로 진행하는 심실 수축 기능의 매우 불가역적인 감소를 특징으로 한다. 만성 심장독성의 발생은 누적적인 안트라사이클린 투여량에 직접 비례한다.

GGF2(NRG-1)은 래트 심근세포에서 안트라사이클린-유발 아포프토시스를 억제한다는 것을 밝혀냈다. 도 14 는 IGF-1 또는 NRG-1 으로 예비치료된 래트 심근세포 배양물은 1 μM 다우노루비신에 의해 유발된 아포프토시스(TUNEL 염색에 의해 나타남)에 덜 영향을 받는다는 것을 도시한다. IGF-1 의 경우에 보호적 효과는 빠르고, 예비인큐베이션의 30 분내에 달성될 수 있고, 태아 심근세포에 대해 보고된 것과 유사하다. 대조적으로, 본 효과는 NRG-1 과 함께 24 시간의 예비인큐베이션에서 발생한다.

도 15A 는 IGF-1 및 NRG-1 이 Akt 의 빠른 인산화를 초래하고(도 15A), 이것은 PI-3 키나제 억제제 워트만닌에 의해 억제된다는 것을 도시한다. Akt 는 프로-아포프토시스성 단백질 캐스케이드 3 의 인산화 및 불활성화를 통해 어떤 시스템의 생존 신호 매개에 관련되었다. IGF-1 과 함께 30 분 예비-인큐베이션 또는 NRG-1과 함께 24 시간 예비인큐베이션은 캐스케이드 3 의 안트라사이클린-유발 활성을 예방한다. 본 효과뿐만 아니라 IGF-1 의 효과는 워트만닌(도 15B) 에 의해서 완전히 예방된다. 그러므로, PI-3 키나제의 활성은 근세포에 대한 IGF 의 냉동보호 효과에 필요하다. 그러나, 같은 시간 코스에 걸쳐 NRG-1 에 의한 냉동보호의 결여는 PI-3 키나제 및 Akt 의 활성이 냉동보호에 충분하지 않다는 것을 나타낸다. 냉동보호에 상대적으로 긴 NRG-1 노출 기간이 필요하다는 것은 아포프토시스에 대한 심근세포의 NRG-1 의존적 예방이 새로운 단백질 합성을 요구한다는 것을 제시한다. 본 관찰과 일치하여, 사이클로헥사마이드에 의한 세포의 치료는 심근세포에 대한 NRG-1 의 항-아포프토시스 효과를 억제한다.

상기에 개시된 결과는 NRG-1 이 안트라사이클린-유발 아포프토시스를 효과적으로 억제한다는 것을 도시한다. 그러므로, NRG-1 은 안트라사이클린 화학요법을 받는 환자에게서 세포독성의 제한 또는 예방 및 안트라사이클린 또는 다른 심장독성 약제에 의해 유발된 심장독성으로 야기된 울혈성 심부전을 가지는 환자의 치료에 사용될 수 있다.

안트라사이클린-유발 심장독성의 다양한 주지된 동물 모델이 당업계에 현존한다. 안트라사이클린-유발 심장독성을 감소시키는 치료적 화합물의 상대적 효험 평가용의 마우스, 래트, 래빗, 햄스터, 개, 돼지, 및 원숭이 모델이 "화학요법 유발 심장독성의 감소" Semin. Oncol. 25(4) Suppl. 1998. 8,10 에 개시된다(예를 들어, Myers, Semin. Oncol. 25: 10-14, 1998; Herman and Ferrans, Semin. Oncol. 25: 15-21, 1998; 및 Imondi, Semin. Oncol. 25: 22-30, 1998). 이러한 모델은 안트라사이클린-유발 심장독성의 최소화, 예방, 또는 회복을 위한 최적의 뉴레구린 또는 뉴레구린-유사 폴리펩티드 치료 요법 결정에 사용될 수 있다(예를 들어, 투여량 및 투여 빈도, 및 안트라사이클린 투여 시간).

실시예 VI: 안트라사이클린/항-ErbB2(항-HER2)조합 요법에 의해 유발된 심부전의 뉴레구린-의존 억제.

다양한 형태의 암 세포는 ErbB 수용체의 증가된 발현 또는 증가된 생물학적 활성을 나타낸다. 트랜스멤브레인 수용체 티로신 키나제는 뉴레구린(헤레구린으로도 알려짐) 부류에 속하는 성장 인자에 결합한다. 암세포에서 ErbB2 수용체(HER2 및 neu 로도 알려짐)의 발현은 가슴, 난소, 전립선, 결장, 췌장 및 타액선을 제한없이 포함하는 다양한 조직으로부터 유래된 악성종양 세포 증식의 증가와 관련되었다.

최근에, 사람의 ErbB2 (HER2) 수용체의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 인간화된 단일클론 항체인 HERCEPTIN(Trastuzumab; Genentech, Inc., South San Francisco, CA)는 ErbB2 활성의 하향-조절에 의해서 시험관내 및 생체내 가슴 악성종양 세포의 성장을 억제한다는 것을 도시했다. 가슴 암 환자에서 종래의 안트라사이클린(독소루비신) 화학요법과 HERCEPTIN요법을 조합시키는 것의 안정성 및 효험을 평가하는 페이지 III 임상 실험은 어떤 요법을 단독으로 수용한 환자보다 조합 요법을 수용한 환자가 더 큰 종양 수축 및 암 진행의 억제를 나타냄을 도시했다. 그러나, 조합 요법을 수용하는 환자는 또한 안트라사이클린 요법을 단독으로수용하는 환자에 비하여 증가된 심장독성을 겪었고, HERCEPTIN와 같은 항-ErbB2(항-HER2) 항체가 안트라사이클린-유발 심장독성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 게다가, 독소루비신으로 이미 치료받은 환자 및 후에 또한 HERCEPTIN을 수용한 환자는 독소루비신 단독으로 치료된 환자에 비하여 심장독성의 발생의 증가를 나타내었다.

ErbB2-과발현 가슴 종양의 개선에서 HERCEPTIN/안트라사이클린 조합 요법의 최근에 보여진 성공을 고려하면, 유사한 조합 요법이 다른 ErbB2-과발현 종양 치료에 곧 사용될 것 같다. 그러나, 항-ErbB2 항체/안트라사이클린 조합 요법의 잇점/위험 비율은 그것의 결합 심장독성이 감소되거나 예방될 수 있다면 크게 개선될 수 있다.

안트라사이클린-유발 심장독성의 동물 모델(예를 들어, Herman and Ferrans, Semin. Oncol. 25: 15-21, 1998 및 Herman et al. Cancer Res. 58: 195-197, 1998 참조)은 당업계에 주지하다. 더욱이, 상기에 개시된 바와 같은 ErbB2 수용체에 결합하는 뉴레구린을 차단하는 항체는 잘 알려져 있다. 안트라사이클린 독성에 대한 공지된 동물 모델에서 안트라사이클린/항-ErbB2 항체-의존성 심부전을 유발함으로써, 당업자는 이러한 심부전을 최소화 또는 예방하는 데 요구되는 뉴레구린 투여법을 쉽게 결정할 것이다.

다른 구체예

본 명세서에 언급된 모든 공개 및 특허출원은 각각의 독립적인 공개 또는 특허출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 수록된 정도로 참고문헌으로 수록된다.

본원 발명은 그것의 구체예와 연결되어 개시되었지만, 더 이상의 변형을 할 수 있고, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원칙에 따르고, 발명이 속하는 분야의 당업계의 공지 범위내에서 본원의 개시로부터의 변형을 포함하면서 어떤 변형, 사용, 또는 채용을 포함하는 것으로 해석되며, 본원에 제시된 필수적인 특징에 이용될 수 있고, 이것은 수록된 청구항의 범위내로 이해될 것이다.

Claims

포유동물에 뉴레구린 유전자에 의해 코드화된 내피 성장 인자-유사(EGF-유사) 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포유동물에서 심부전을 치료 또는 예방하기에 적합한 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 상기 포유동물에서 울혈성 심부전을 치료 또는 예방하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 뉴레구린 유전자는 NRG-1 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 NRG-1 유전자에 의해 코드화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 재조합 사람 GGF2 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 뉴레구린 유전자는 NRG-2 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 NRG-2 유전자에 의해 코드화되는 것을특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 뉴레구린 유전자는 NRG-3 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 NRG-3 유전자에 의해 코드화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 포유동물은 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 울혈성 심부전은 고혈압; 허혈성 심질환; 심근독성 화합물에의 노출; 심근염; 갑상선 질환; 바이러스 감염; 치은염; 약물 오용; 알코올 중독; 심장 주위염; 죽상경화증; 혈관 질환; 비후성 심근병증; 급성 심근 경색; 좌심실수축 기능장애; 관상동맥 바이패스 수술; 기아; 이상 식욕 항진증, 또는 유전적 결함으로부터 초래되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 포유동물은 심근경색을 겪은 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 심장독성 화합물은 안트라시클린; 알코올; 또는 코카인인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 안트라시클린은 독소루비신, 또는 다우노마이신인 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 항-ErbB2 또는 항-HER2 항체는 안트라시클린 투여전, 투여 동안, 또는 그 후에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 심장독성 화합물은 항-ErbB2 또는 항-HER2 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 상기 항-ErbB2 또는 항-HER2 항체는 HERCEPTIN인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 심장독성 화합물에 노출되기 전에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 심장독성 화합물에 노출된 동안 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 심장독성 화합물에 노출된 후에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유동물에서 울혈성 심부전의 진단전에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 포유동물에서 울혈성 심부전의 진단 후에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 대상 심장 비후성을 겪은 포유동물에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 투여는 좌심실 비후성을 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 심근 비박화의 진행을 예방하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 투여는 심근세포 아포프토시스를 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드를 코드화하는 발현 벡터의 투여에 의해 상기 포유동물에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.