KR20020008154A - 프라이온의 멸균공정에 유용한 생물학적 지시제 - Google Patents

프라이온의 멸균공정에 유용한 생물학적 지시제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프라이언 단백질 지시제의 분해 정도를 측정함으로써 멸균 공정의 효율을 조절하는 방법에 관한 것이다. 멸균 조건하에 있어서, 프라이언 지시제가 의학 장비 또는 수술용 및 건강관리에 사용될 수 있는 기타 표면 상에서 프라이언 단백질 자체의 분해 정도를 비례적으로 표지하는 방식으로 분해된다.

Description

프라이온의 멸균공정에 유용한 생물학적 지시제{BIOLOGICAL INDICATORS FOR VALIDATING A PRION STERILIZATION PROCESS}
화학적 및 물리적인 모니터 방법을 전적으로 신뢰할 수 없기 때문에, 멸균 공정에서 효율을 조절하기 위해서 생물학적인 지시제의 필요성이 고려되고 있다. 화학적 및 물리적인 모니터 방법은 총 멸균을 감지하는데 유용하지만 포자 시험의 경우는 포자가 바이러스 및 식물성의 박테리아보다 열에 대해 큰 내성을 가지기 때문에 확실한 멸균이 절대적으로 요구된다. 생물학적인 지시제는 통상적으로 바실러스 스테로테모필러스 (Bacillus stearothermophilus) 또는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)의 세균성 포자로 구성되며, 바실러스 스테로테모필러스 (Bacillus stearothermophilus)는 멸균 및 화학적 증기 멸균제로 제거되고, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)는 건식 가열 및 에틸렌 옥사이드 멸균제로 멸균 처리 후 제거되며 미생물을 관찰하기 위해서 적정 온도에서 배양된다 (Dental Products Report, October 1995, 96-104). 그러나 근래에 와서는 프라이언의 발견으로 인하여, 세균성 포자가 더 이상 최고의 내성을 가진 생명체가 아니다.
Sup35 단백질 (이하 Sup35p 라고 약칭함) 수용체 [PSI+]는 프라이언에 대한 명백한 유사성때문에 유사 프라이언 단백질이다. 실제로, Sup35p의 N-말단은 비이온성 세제에 녹지 않고 단백질 분해 효소의 역할에 부분적으로 방해하며, α-사슬에 주로 형성된 단백질의 정상 isoform과는 대조적으로, β-시트로 주로 구성된 비정상적인 아밀로이드 필라멘트를 형성한다 (Glover. J. R., Kowal, A. S., Et al.Cell(1997) 89: 811-819; King, C., Tittmann, P. et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1997) 94: 6618-6622).
상기의 비정상적인 프라이언 필라멘트의 세포내 축적은 동물과 인간 간에 전염이 가능한 스폰지 형태의 뇌질환을 유발한다. 그래서 의사 진료로부터 병이 전염되는 것을 막기 위하여 필라멘트의 분해가 중요하다. 의사의 진료로부터 생기는 오염의 여러 경우 가령, EEG 전극이 앞서서 크레츄필드-자콥 (Creutzfeld-Jakob) 환자와 접촉하고 부적절하게 멸균된 것과 같이 오염된 의료 장비이용이 원인이 된다고 보고되었다. (Jarvis, W. R.Hospital Infection Control(1985) 12 (12): 145-148). 또한, 아직까지 배제되지 않은 혈액 오염의 가능성도 남을 수 있기 때문에 대부분의 의료 기기는 오염가능한 위험한 분류에 속한다. 다만 환자의 병력에 따라 다르게 분류된다.
프라이언 분해를 증명하기 위한 멸균 지시제가 실효성이 없기 때문에 다목적 용도의 장치는 부적절하고 심지어 위험하기까지 하다. 오늘날, 대부분의 국가는 오염된 기기의 멸균을 위해 유사한 요건을 채택하고 있다. 위험성이 높은 환자에게 사용된 의료 기기의 멸균을 위해서 권장된 방법으로는 한 명의 환자와 접촉되도록 일회용 장비 사용 및 소각 또는 금속 기기에 매우 부식성이 강한 1 N의 수산화 나트륨에 아주 최소한으로 담그거나 132℃/1기압에서 한시간동안 멸균하는 방법으로 폴리머와 같은 열감응성 물질을 변형시킬 수 있다 (Roseenberg, R. N. et al.,Annals of Neurology(1996) 19(1): Galtier, F.,J. Pharm. Clin.(1994) 13: 317-9).
아울러, 의료 장치의 완벽한 멸균을 위해 프라이온 분해의 새로운 지시제가 절실히 요구된다.
그러므로, 새로운 멸균 지시제 개발의 해답은 Sup35 단백질을 바탕으로 하여 프라이언의 분해를 증명함으로써, 모든 의료 장치가 철저히 멸균되고, 사용에 적합하도록 확신할 수 있을 것이다. 이러한 지시제는 일반적으로 사용되는 멸균 공정 뿐만 아니라 예를 들어, 저온 플라즈마 가스 또는 오존에 기초한 멸균제 같은 새로운 기술에 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 의료 장치의 완벽한 멸균을 위해 프라이온의 분해에 대한 새로운 지시제를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 a) 반응기 내에 최소 하나의 프라이언 단백질 분해 지시제의 충분한 양을 멸균 공정과정에 넣고, b) 상기 지시제의 분해 정도를 결정하는 것으로 이루어지는 멸균 공정의 효율 조절 방법을 제공하는 것이다.
발명에 따라 상기 지시제는 대부분 사카로미세스 세라비시애 (Sacchromyces cerevisiae) 또는 포도스포라 앤서리나 (Podospora anserina) 내인 진균(fungus)에서 자연 발생되는 유전자로부터 전사되는 것이다.
지시제는 SUP35, URE2 및 HET-s로 구성되는 군에서 선택된 유전자로부터 전사되는 것이다.
지시제는 Sup35p, Ure2p 및 Het-s 단백질 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 것이다.
지시제는 진균, 재조합 형태, 유사종, 변종, 또는 상기 지시제의 단편으로부터 자연 발생되는 정제된 형태가 될 수 있다.
지시제는 생물학적 지시제, 생화학적 지시제, 또는 화학적 지시제가 될 수 있다.
특히, 발명에 따라 지시제의 분해 측정은 무게 또는 질량의 결정, 라디칼, 색조계의 변화, 방사분석, 탁도계, 면역 효소방법, 웨스턴 블랏, 도트 블랏, 방사선 표지 면역 검정법, 원편광 이색성법, 전자 현미경, 형광 현미경, FTIR, 콩고 레드 결합도, 또는 단백질효소 분해의 정량화로 이루어질 수 있다.
멸균 공정은 멸균, 화학적 노출, 건식 가열, 저온 플라즈마 가스, 오존에 기초한 노출, 또는 알킬란트 및/또는 산화 멸균제를 이용한 멸균 기법으로 이루어지는 것이다.
상기 화학적 노출은 증기 또는 세제, 에틸렌 옥사이드, 단백질 분해효소, 수산화 나트륨 및 효소로 구성된 군에서 선택된 용액에 노출되는 것이다.
멸균공정에 사용된 지시제의 양은 0.1 ng 에서 100 g이 될 수 있다.
상기 반응기는 종이, 유리, 보로실리케이트, 금속, 폴리머, 합금, 및 이들의복합물로 구성된 군에서 선택된 물질로 이루어진다.
반응기는 또한 다공성, 투과성 또는 반투과성이다.
본 발명은 멸균 공정의 효율 조절 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다른 멸균 공정에 노출될 때, 프라이언 단백질 분해 지시제의 분해 정도를 측정하는 단계로 이루어진다.
도 1은 박테리아로 표현된 재조합된 SUP35p N-말단부의 생산량이고,
도 2는 다른 용액내에서 재조합된 SUP35p N-말단부의 투과 전자현미경의 결과이고,
도 3은 SUP35p N-말단 단백질의 원편광 이색성 분석에 따른 결과이고,
도 4는 SUP35p N-말단 단백질에 멸균 및 에틸렌 옥사이드 처리한 효과이고,
도 5는 SUP35p N-말단 단백질에 Sterradⓡ100으로 처리한 효과를 나타낸 것이다.
본 발명의 목적은 의료 기기의 완벽한 멸균을 실현하기 위하여 새로운 프라이언 분해 지시제를 제공한다.
특히 본 발명은 의료 기기 및 기타 모든 장치, 표면, 또는 수술과정과 건강관리에 사용된다고 생각되는 것의 멸균 단백질 분해 지시제로서, 발아효소인 사카로미세스 세라비시애 (Sacchromyces cerevisiae)의 SUP35 유전자에 의해 암호화된 비 멘델학적인 유전자 팩터인 [PSI+] 및 포도스포라 앤서리나 (Podospora anserina)에 의해 암호화된 Het-s를 사용한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 Sup35p, Ure2p, Het-s, 또는 사용이 상당히 간단한 Psi의 다양한 지시제를 사용한다. 상기 지시제는 유리 바이알 내의 용액에 있으므로 반응기는 어떠한 멸균 기술 즉 고열 및 고압을 이용한 멸균 방법 또는 플라즈마와 같은 저온 기법에서도 견뎌야 한다. 트리스/EDTA, TFA/아세토나이트릴, 또는 심지어 2 M 의 우레아와 같은 비-변성 완충용액은 Sup35p 필라멘트의 고유성을 유지하기 위하여 사용된다.
프라이언의 1 개당 감염시킬 수 있는 단위체로는 104∼ 105PrP 분자 또는 SDS-PAGE 겔의 검출한계 이하인 0.5 ∼ 5 fg에 해당된다고 알려져 있다 (Hill, A. F., Antoniou, M. and Collinge, J.,Journal of General Virology(1999) 80: 11-14).
본 발명의 또 다른 목적은 과량의 단백질 예를 들어, 완벽한 멸균이 일어났음을 확신할 수 있는 10 ㎍의 양에 대한 분해를 증명하는 것으로서, 의료기기를 안심하고 재사용하는 것이다. 만약 단백질의 구조변형이 생기면, 다시 말해, 단백질이 분자구조의 변화 또는 다음의 다양한 멸균 기술의 노출로 인한 분해를 거친다면, 비활성화되어 더 이상 간염성이 없다고 판단하는 것을 근거로 하고 있다.
더욱이, 지시제의 10 ㎍을 사용함으로써, 본 발명은 코마시(Coomassie) 밝은 청색으로 염색된 SDS-PAGE 겔에 의한 단백질의 분해를 용이하게 감지할 수 있다. 예를 들어, 일반 실험실 기술로서 상기의 방법은 단백질의 0.1 ㎍ 정도의 소량도 검출할 수 있기 때문이다 (Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning, a Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ndedition, 1989).
본 발명에 따라서, 목적 Sup35 단백질의 교대 (alternation)로 인해 유발되는 결핍 또는 변형된 검출 신호를 예측하기 위하여 표지된 단백질의 항체를 이용한 웨스텐 블랏 또는 도트 블랏에 의하여 분해 또는 교대를 예상할 수 있다. 또한, 지시제의 분해는 용액의 색 변화를 통해 감지하며 멸균을 확신할 수 있다. 멸균된 단백질이 β-시트에서 α-사슬로 분자구조의 변화를 감지하기 위하여, 필요에 따라 원편광 이색성, 전자현미경, 형광 현미경, FTIR, 콩고 레드 결합도 또는 단백질효소 K 분해같은 기법이 사용될 수 있으며, 단백질이 분해됨으로써 비활성을 보일 것이다.
유리 바이알, 용액 등의 지시제에 사용되는 물질은 비교적 일반적이고 값이싸기 때문에, 상기 지시제의 총 생산 경비는 충분히 낮은 가격이다. 그러므로 의료 기기의 안정성을 확보하기 위하여 구입해야 할 어느 기관이나 병원 또는 공장에 보급하기 매우 여유가 있을 것으로 생각된다.
또한 멸균 지시제가 다음의 멸균의 전 공정에 완벽한 비활성이 입증되거나 입증만 할 수 있다면, 모든 기기는 테스트를 받을 수 있고, 재사용에 대한 안전을 입증받을 수 있기 때문에 본 발명의 멸균 지시제의 가격은 효과적이다. 통상 포자(spore) 실험은 활성 잔류 단백질이 장비의 표면에 남아 있을 가능성을 완전히 배제 할 수 없다. 더욱이, 상기의 기술은 기기의 특성을 바꿀수 있기 때문에, 의료 관리의 질이 뒷받침되어야 한다. 실제로 의료기관은 가상의 모든 오염된 기기에 대한 교체로 매우 비싼 비용을 소비할 것이고, 재활용할 수 있는 기기는 오염에 대한 두려움으로 버려질 것이다.
박테리아 균주
복제 실험을 위해서. 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) SURE 균주는 일반적인 인비트로겐 (InVitrogenTM)을 사용하였다. 단백질 발현과 정제를 위하여, 발현 플라즈마는E. coliBL21 (pRep4) 균주인 노바겐 (Novagen)으로 변형되었다.
DNA 조작과 단백질 정제
표준 DNA 기술은 Sambrook et al., 1989에 이미 공지되었다. DNA 서열은 Armand Frappier DNA 서열 기관 (몬트리올 캐나다)에서 수행되었다. 단백질 발현/정제과정은 제조업자인 Clontech에 의해 기술된 대로 수행되었다.
박테리아 발현 벡터내에 Sup35의 집합적인 N-말단 영역의 복제
응집에 충분한 펩타이드 영역에 암호화된 Sup35의 초기 759bp 영역은 Ter-Avanesyan 박사에 의해 제공된 pEMBLyex4 내의 유전자 복제로부터 PCR 증폭되었다 (Moscow, Russia; (Glover. J. R., Kowal, A. S., Et al.Cell(1997) 89: 811-819). 다음의 (a) 밑줄 친 부분의 BamHI 제한 효소 사이트를 도입하기 위해 5'-AGTGGATCCTCGGATTCAAACCAAGGCAA-3' (b) 밑줄 친 부분의 SalI 제한 효소 사이트를 도입하기 위해 5'-CGCGTCGACATCGTTAACACCTCCGTC-3'의 프라이머를 사용하였다. 그리고, 플래그먼트는 pT7Blue3 (Blunt Cloning Kit-Novagen) 및 SUREE. coli균주 (Invitrogen)으로 복제된다. 양성 복제는 유전자 내에서 변종 또는 삭제되도록 서열화된다. Sup35 유전자 N-구획은 BamHI와 SalI로 절단된 후, 동일한 제한 사이트를 이용하여 pQE30 (Qiagen) 발현 벡터내로 삽입된다. pQE30내 양성 복제는 단백질 발현 및 정제 목적으로 BL21[pREP4]로 이동된다.
단백질 발현 및 정제
대부분 제조업자에 따른 규약대로 실행되었다. 1 L의 박테리아 (D600의 0.8)는 1 mM의 최종 농도로 IPTG를 이용하여 실온에서 한시간 동안 배양되었다. 셀은 거둬들여 완충 용액 B (8 M의 우레아, 0.1 M의 나트륨-포스페이트, 0.01 M의 트리스 염산 pH 8.0)의 50 ml에 담구어 초음파 분쇄하였고 4℃에서 15 분간 10,000 xg로 원심분리하였다. 상층액을 모아 Qiagen으로부터 정제된 변성의 8 M의 우레아로 pH 기울기를 이용한 친화성 크로마토그래피를 위해 Ni2+-NTA 컬럼 (TALON 금속 친화 수지; Clontech)에 상층액을 올렸다. 시료는 단백질의 크기와 양을 예상하기 위하여 사용되는 겔 전기영동법인 SDS-PAGE 방법 및 선택적으로 단백질을 감지하기 위하여 pQE30 벡터내 존재하는 6-히스티딘 말단에 대한 쥐의 항-히스타민 항체(Quiagen)가 사용되는 웨스턴 블랏법으로 분석된다. SDS-PAGE 방법의 단백질 분리 및 나이트로셀룰로오즈의 전기적 블랏 처리 후, 막은 초기 항체 (Qiagen에 대한 항 히스티딘 비율, 1:12000)를 10 mM 트리스 pH 7.5, 저지방 우유 5%를 포함한 100 mM NaCl (TBS), 0.1%의 트윈TM20내에서 한 시간동안 배양되었고, TBS 및 0.1%의 트윈TM20으로 10분씩 3회 세척된다. 쥐에 대한 항체와 고추냉이 과산화수소 효소(1:4000)를 이용한 BM 화학적 발광 키트로 감지되었다 (로체 진단법). 최종적으로 막은 방사선 촬영 필름에 노출되어 전개되었다.
필라멘트 유도 및 분석
필라멘트의 형성을 유도하기 위하여, 8 M 우레아 용액 내 9 μM의 단백질을 실온에서 6 시간에서 12 시간동안 투석하였다. 이때, 2 M 우레아, 30 mM 트리스-염산 pH 8.0, 300 mM의 NaCl 혼합용액("2 M 우레아"로 칭함) 또는 0.1% 삼플로로아세트산, 40%의 아세토나이트릴 용액 ("TA"로 칭함) 또는 10 mM 트리스 pH 8.0와 EDTA 1 mM의 혼합용액인 Tris/EDTA용액 ("TE"로 칭함)에 대해 실시되었다.
투과 전자현미경(TEM)
필라멘트 상층액의 50 ㎕의 시료는 초원심분리기 (Beckman Airfuge)를 이용하여 178,000 g, 20 분동안 실시하여 3 mm 지름과 200 메쉬의 구리입자로 코팅된 탄소-formvia상에 침전되었다. 그 후, 상기의 구리입자는 3% (wt/vol)의 PTA (Phoshpotingstic acid)와 2% (wt/vol)의 우라닐 아세테이트로 각각 1 분동안 희미하게 염색된 후, 시료는 75 kV에서 히타시 H-7100의 투과 전자현미경으로 관찰되었다.
원편광 이색성(CD) 분광기
2 M의 우레아에서 9 μM의 필라멘트 상층액의 CD 스펙트라는 실온에서 0.05 ㎝ 길이의 셀을 이용하여 제스코 J710 분광편도계로 측정되었다. 시료는 다음의 조작으로 측정되었다. 조사속도: 100 nm/min; 측정시간: 0.25 초; 누계: 3 (빈 셀), 5 (완충용액만), 및 10 (단백질 샘플); 감도: 50 mdeg; 시작파장: 260 nm; 종료 파장: 200nm.
검정 멸균
한시간 동안 121℃에서 멸균하고, Sterivacⓡ(에틸렌 옥사이드)는 음성 대조군으로 사용되는데, Sterivacⓡ100은 멸균제로서 과산화수소와 가스 플라즈마를 혼합하여 사용하는 것을 실험 방법에 이용하였다. 시료는 각 과정의 전체 공정 중 하나에 넣거나 오존의 경우처럼, 한 공정의 1/4에만 넣었다. 이로써, Sup35의 분해가 조절되었다. 10 ㎍의 단백질은 하기 표 1에 기재한 멸균과정에 노출되었다. 단백질의 분해는 질산 은과 코마시 블루의 착색뿐만 아니라 TEM 현미경 (필라멘트 형성)을 이용한 SDS-PAGE에 의해 검정되었다. 상기에서 서술한 화학 발광을 이용한 면역성 검출에도 다음의 멸균공정이 이용되었다.
Sup35의 분해를 측정하기 위한 멸균 공정
멸균방법 멸균제 공정 필요시간
멸균 열 온도: 121℃압력: 1 기압 1 시간
Sterivacⓡ, 3M 에틸렌 옥사이드(EO) (a) 온도: 134oF(b) 예열시간: 30 분(c) 멸균시간: 2시간 10분(d) 환기 시간: 12시간 약 16 시간
Sterivacⓡ100,존슨 앤 존슨 H2O2와 가스 (a) 진공(0.3torr):5-20 분(b) 58%의 H2O2+H2O주입:6분(c) 확산(0.5 torr):44분(d) 플라즈마: 15분 약 75 ∼ 95 분
결과
정제 및 SUP35 N-단백질의 특성
Sup35 유전자는 76.5 kDa 리보좀-결합된 단백질을 암호화한다. 그러나, 초기 114 아미노산만이 필라멘트를 충분히 형성한다 (King, C., Tittmann, P. et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1997) 94: 6618-6622). 이미 공지되어 있는(Glover. J. r., Kowal, A. S., et al.Cell(1997) 89: 811-819) 이들과 유사한 DNA 프라이머는 초기 암호를 포함하는 첫번째 639 뉴클레오티드를 증폭하는데 사용되기도 한다. 1997년에 Ter-Avanesyan과 Glover등에 의해 제공된 유전적인 복제를 이용한 상기 초기 암호는 최종적으로 213 아미노산의 긴 펩티드가 프라이언과 유사한 여러가지의 생화학적 특성을 나타낼 수 있다는 것을 보이고 있다. 변성 조건하에서 정제된 발현 단백질은 SDS-PAGE 분석에 의한 예상대로 명확한 30 kDa의 분자량을 가진다 (도 1의 왼쪽). 니켈 크로마토그래피 (물질과 방법)를 통해 정제된 박테리아로 발현된 단백질 및 단백질 시료는 SDS-PAGE 및 코마시 블루 염색(도 1의 왼쪽) 및 6XHIS 표지에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블랏(도 1의 오른쪽)으로 분석되었다. 펩티드 N-말단 구조에 삽입되어 박테리아에서 발현된 단백질 속에 존재하는 6XHIS 표지에 대한 항체가 증가하는 것을 이용하여, 겔의 코마시 염색에 의해 관찰된 단백질은 동일하였다.
정제된 SUP35 N-단백질이 프라이언과 유사하게 행동하고 아밀로이드 같은 필라멘트를 형성하는 것을 확신하기 위하여, 규칙적인 집합력을 투과전자현미경 (TEM)에 의해 관찰하였다. 8 M의 우레아의 상층액 또는 2 M 우레아 또는 아세트산/아세토나이트릴 0.1%/40% (TE)용액이 서서히 투석되고 일주일 동안 4℃에서 유지된 단백질의 TEM의 영상을 도 2에 나타내었다. 8 M의 우레아내에서 박테리아로부터 유래된 단백질은 2 M 우레아, 삼플로로아세트산/아세토나이트릴 0.1%/40% (TA) 또는 트리스-EDTA (TE)에서 투석하고 일주일 동안 4℃에서 유지시킨 다음 TEM을 측정하였다 (M은 마커를 의미한다). 실제로 Sup35단백질이 8 M의 우레아 용액에서 4℃에서 수주일동안까지 결합을 형성하려는 경향이 있는 한, 용이하게 TEM 분석은 관찰된다.
더욱이, 원편광 이색성법으로 분석할 경우, Sup35p를 포함하는 용액의 연장된 방치는 220 nm 근처에 상이한 단일 최저 흡수도를 이용하여 β-시트 형의 특성을 보여야 한다. 도 3에서와 같이, 8 M 우레아 용액에서 Sup35p의 무질서한 코일형태로부터 2 M의 우레아에서 규칙적인 집합체에 대한 단백질 피크의 분산을 구별할 수 있다.
상기의 결과로부터, Sup35 단백질의 박테리아로부터 발현된 N-말단은 예상대로 프라이온과 유사하게 행동하고, 유사한 여러 생화학적인 특성을 보였다.
다양한 멸균 과정에 Sup35p의 안정성
Sup35p의 고유성에 대한 미치는 영향에 따라 멸균처리의 효율을 얻는다. 다른 형태하에 보관된 Sup35 단백질의 시료는 공정에 따라 진행되고, SDS-PAGE 및/또는 웨스텐 블랏으로 분석되었다.
발명자들은 프라이언에 대한 경우처럼, 전통적인 멸균 멸균 공정으로 Sup35 단백질을 파괴할 수 없었다는 것을 최초로 확인하였다. SDS-PAGE의 코마시 염색에서 보는바와 같이, TFA 내 Sup35 단백질의 필라멘트가 분해를 억제하는 한, 멸균 후 집합체가 생성되지 않은 8 M 우레아 내에서 Sup35로부터 손상되지 않은 단백질의 회수는 관찰되지 않았다. 도 4의 위쪽 그림은 8 M의 우레아 또는 TA내에서의 Sup35 단백질이 멸균된 다음 SDS-PAGE에 의해 분석된 결과이다 (U는 처리되지 않은 것이고, T는 처리된 시료를 나타낸다). 같은 시료가 에틸렌 옥사이드에 노출되었을때 유사한 결과를 얻었다 (도 4 아래쪽). 이러한 결과로부터 멸균 및 에틸렌 옥사이드 처리는 정렬로 모인 Sup35 단백질을 분해할 수 없다는 결론을 얻었다.
반면에, 8 M 우레아 및 2 M 우레아 단백질은 과산화 수소와 가스 플라즈마의 결합의 산화과정인 Sterradⓡ100 처리로 분해된다. 2 M 우레아 단백질의 집합체는 이러한 처리로 깨질 수 있다. 그러나, 도 5의 위쪽 그림은 코마시 블루에 염색된 겔에서 손상되지 않은 단백질이 보임으로써, TA 단백질의 집합체는 멸균과정을 억제할 수 있었다. 도 5는 8 M 우레아, 2 M 우레아 또는 삼플로로아세트산/아세토나이트릴 0.1%/40% (TA)내에서 Sup35 단백질 시료가 진행되고, 남아있는 손상되지 않은 단백질이 코마시 블루 염색법에 의한 SDS-PAGE (도 5의 위쪽) 또는 6XHIS 표지의 항체에 대한 웨스턴 블랏(도 5의 아래쪽)으로 분석된다 (U는 처리되지 않은 것이고, T는 처리된 시료, *는 손상되지 않은 Sup35p의 웨스턴 블랏을 나타낸다). 검출 기술에 감응성을 증가시키고 이러한 처리가 실제로 2 M의 우레아 Sup35 단백질의 필라멘트를 분해할 수 있는지를 확신하기 위하여, 웨스턴 블랏 분석은 박테리아에서 발현된 단백질의 N-말단에 존재하는 6XHIS 표지를 감지할 수 있는 항체를 이용하여 실시하였다 (도 5의 아래쪽). 이러한 실험은 Sterradⓡ100 공정이 2 M 우레아에 보존된 Sup35 단백질의 집합체를 분해할 수 있음을 보이고 있다. 단지 분해 억제가 관찰된 것은 TA에 놓인 Sup35의 시료의 경우였다. 상기의 예상치 못한 결과는 두 가지 설명으로 가능하다. 첫째, 삼플로로아세트산/아세토나이트릴 및 Sterrad 시스템에서 멸균제로 사용한 과산화수소 간에 상호작용이 있을 수 있고, 이러한 과정은 산화전위를 억제할 수 있다. 상기의 증가된 분해 억제는 TA 용액내에 단백질의 수소화 반응을 유발함으로써 단백질이 과산화 수소의 산화 효과에 대한 민감성을 떨어뜨릴 것이다. 본 연구의 멸균 공정에서 사용된 다른 용액 내의 시료에 대한 TEM 분석 결과는 Sup35 필라멘트의 구조의 변형을 나타내고 있다. 이러한 결과는 이미 서술한 다른 방법인 코마시 블루와 웨스텐 블랏에서 얻은 결과를 뒷받침한다.
이러한 결과로부터, 오존, 과아세트산에 기초한 멸균제 등과 같은 산화 멸균제가 사용되는 다른 멸균 기법 또한 Sup35 단백질을 변형시키는 데 효과적이다.
본 발명의 범위가 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자라면 청구범위에 기재된 본 발명의 보호 범위 내에서 다양한 보완 및 변형이 가능할 것이다.

Claims (13)

  1. a) 반응기 내에 최소 하나의 프라이언 단백질 분해 지시제의 충분한 양을 멸균 공정과정에 넣고,
    b) 상기 지시제의 분해 정도를 결정하는 것으로 이루어지는 멸균 공정의 효율 조절 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 a) 단계의 지시제가 진균(fungus)에서 자연 발생되는 유전자로부터 전사되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 진균(fungus)은 사카로미세스 세라비시애 (Sacchromyces cerevisiae) 및 포도스포라 앤서리나 (Podospora anserina)로 구성되는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 지시제는 SUP35, URE2 및 HET-s로 구성되는 군에서 선택된 유전자로부터 전사된 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 지시제는 Sup35p, Ure2p, Het-s 및 이들의 조합으로 구성하는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 5 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 지시제는 사카로미세스 세라비시애 (Sacchromyces cerevisiae), 포도스포라 앤서리나 (Podospora anserina) 또는 진균, 재조합 형태, 유사종, 변종, 또는 상기 지시제의 단편으로부터 자연 발생되는 정제된 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 지시제는 생물학적 지시제, 생화학적 지시제, 또는 화학적 지시제인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 b) 단계는 무게 또는 질량의 결정, 라디칼, 색조계의 변화, 방사분석, 탁도계, 면역 효소방법, 웨스턴 블랏, 도트 블랏, 방사선 표지 면역 검정법, 원편광 이색성법, 전자 현미경, 형광 현미경, FTIR, 콩고 레드 결합도, 또는 단백질효소 분해의 정량화에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 멸균 공정은 고압 멸균, 화학적 노출, 건식 가열, 저온 플라즈마 가스, 오존에 기초한 노출, 또는 알킬란트 및/또는 산화 멸균제를 이용한 멸균 기법으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 화학적 노출은 증기 또는 세제, 에틸렌 옥사이드, 단백질 분해효소, 수산화 나트륨 및 효소로 구성된 군에서 선택된 용액에서 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 a)단계에서 지시제의 양은 0.1 ng 에서 100 g인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 반응기는 종이, 유리, 보로실리케이트, 금속, 폴리머, 합금, 및 그들의 복합물로 구성된 군에서 선택된 물질로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 반응기는 다공성, 투과성, 또는 반투과성인 것을 특징으로 하는 방법.
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