ES2287010T3 - Indicadores biologicos para validar un procedimiento de esterilizacion contra priones. - Google Patents
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Abstract
Un método para evaluar la eficacia de un procedimiento de esterilización, que comprende las etapas de: a) someter una cantidad suficiente de al menos un indicador de degradación de proteína priónica en un recipiente a dicho procedimiento de esterilización, en el que dicho indicador se selecciona entre el grupo constituido por SUP35, URE2, proteína HET-s y combinaciones de las mismas; y b) determinar el nivel de degradación de dicho indicador.
Description
Indicadores biológicos para validar un
procedimiento de esterilización contra priones.
La invención se refiere a un método de control
de procedimiento de esterilización, que comprende las etapas de
medir el nivel de degradación de un indicador de degradación de una
proteína priónica cuando se expone a diferentes procedimientos de
esterilización.
Los indicadores biológicos se consideran
esenciales para evaluar la eficacia de cualquier procedimiento de
esterilización ya que los monitores químicos y físicos no son
completamente fiables. Estos últimos son útiles para detectar
esterilización básica, aunque se requiere que se realicen pruebas
completas de esporas para garantizar cualquier método de
esterilización ya que éstas son más resistentes al calor que los
virus y las bacterias vegetativas. Los indicadores biológicos se
componen habitualmente de esporas de bacterias de Bacillus
stearothermophilus (para autoclaves y esterilizadores químicos
de vapor) o Bacillus subtilis (para esterilizadores de calor
seco y de óxido de etileno) que se retiran después del tratamiento
de esterilización y se incuban a la temperatura apropiada para
observar cualquier crecimiento microbiano (Dental Products Report,
Octubre 1995, págs. 96-104). Sin embargo, hoy en
día, las esporas de bacterias ya no son las formas de vida más
resistentes desde el descubrimiento de los priones.
La proteína Sup35 (que se denomina en este
documento como Sup35p) que lleva [PSI+] es una proteína tipo prión
debido a sus asombrosas similitudes con los priones. De hecho, el
extremo N-terminal de Sup35p es insoluble en
detergentes no iónicos y parcialmente resistente a la acción de las
proteasas. Además, forma principalmente filamentos amiloides
anormales compuestos principalmente de
láminas-\beta, en contraposición a la isoforma
normal de la proteína en su mayor parte formada por
hélices-\alpha (Glover, J.R., Kowal, A.S., y col..
Cell (1997) 89:811-819; King, C.,
Tittmann,P. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1997)
94:6618-6622).
La acumulación intracelular de estos filamentos
de priones anormales es responsable de inducir encefalopatías
esponjiformes transmisibles tanto en animales como en seres humanos,
de ahí la importancia de degradar los filamentos a fin de prevenir
cualquier transmisión iatrogénica de la enfermedad. Se han reseñado
varios casos de contaminación iatrogénica debida a la utilización
de equipo médico contaminado, tales como electrodos EEG, que habían
estado previamente en contacto con pacientes con la enfermedad de
Creutzfeld-Jakob y habían sido inadecuadamente
esterilizados (Jarvis, W.R. Hospital Infection Control (1985)
12 (12):145-148). Dado que también sigue
existiendo la posibilidad de contaminación sanguínea, que no ha sido
todavía desestimada, la mayor parte de los instrumentos médicos
entran en la categoría presentar riesgo de contaminación, pero a
diferentes niveles dependiendo del historial del paciente.
La no disponibilidad de indicadores de
esterilización para confirmar la degradación de priones hace que los
dispositivos sean inadecuados e incluso peligrosos para uso
múltiple. Hoy en día, la mayoría de los países han adoptado
requisitos similares para esterilización de instrumentos
contaminados. Los procedimientos recomendados para esterilización
de instrumentos médicos usados en pacientes de alto riesgo es la
incineración de cualquier equipo desechable que haya estado en
contacto con un paciente o, en última instancia, el baño en
hidróxido sódico 1N, que es muy corrosivo para instrumentos
metálicos, o tratamiento en autoclave a 132ºC/1 atm de presión
durante 1 hora (Rosenberg, R.N. y col., Annals of Neurology
(1986) 19(1):75-77; Galtier, F., J. Pharm.
Clin. (1994)13:317-9) que puede deformar
materiales termosensibles tales como polímeros.
En la patente de EE.UU. Nº 5.633.349 se describe
un método para la inactivación de priones, virus y otros agentes
infecciosos, que pudieran estar presentes en una materia prima
biológica (por ejemplo plasma para la preparación de albúmina), que
deja intacto el producto biológico deseado (por ejemplo, BSA, HSA).
Sin embargo, sería altamente deseable proporcionar un método para
evaluar la eficacia de un procedimiento de esterilización.
Sería altamente deseable proporcionar un nuevo
indicador de degradación de priones y por lo tanto, de
esterilización completa de dispositivos médicos.
La solución por lo tanto reside en el desarrollo
de este nuevo indicador de esterilización, basado en proteína
Sup35, que aseguraría que todos los dispositivos médicos están
esterilizados a fondo y listos para su utilización demostrando la
degradación de los priones. Este indicador se podría usar para
cualquier procedimiento de esterilización usado habitualmente, así
como en nuevas técnicas tales como gas de plasma a baja temperatura
o esterilizadores basados en ozono por ejemplo.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un nuevo indicador de degradación de priones y por lo
tanto, de esterilización completa de dispositivos médicos.
Según la presente invención se proporciona un
método para evaluar la eficacia de un procedimiento de
esterilización, que comprende las etapas de:
- a)
- someter una cantidad suficiente de al menos un indicador de degradación de proteína priónica en un recipiente al procedimiento de esterilización; y
- b)
- determinar el nivel de degradación del indicador.
El indicador se puede seleccionar entre el grupo
constituido por Sup35p, Ure2p, proteína Het-s, y
combinaciones de las mismas.
El indicador puede ser una forma natural
purificada de hongos, una forma recombinante, un análogo, un
mutante, o un fragmento del indicador.
El indicador puede ser un indicador biológico,
indicador bioquímico, o indicador químico.
En aspectos particulares de la invención, la
medición de degradación del indicador se puede realizar determinando
el peso de la masa, cuantificando radicales, variaciones
colorimétricas, radiometría, nefelometría, método
inmuno-enzimático, inmunotransferencia de Western,
inmunotransferencia de punto, radioinmunoensayo, dicroísmo
circular, microscopía electrónica, microscopía fluorescente, FTIR,
unión de rojo Congo, o digestión de proteinasa.
El procedimiento de esterilización se puede
realizar por tratamiento en autoclave, exposición química,
calentamiento en seco, gas de plasma a baja temperatura, exposición
basada en ozono, o técnicas de esterilización que usan agentes
esterilizantes alquilantes y/u oxidantes.
La exposición química puede ser a un vapor o a
una solución que se seleccionan entre el grupo constituido por
detergente, óxido de etileno, proteasa, hidróxido sódico, y
enzima.
La cantidad de indicador expuesta a los
procedimientos de esterilización puede estar entre 0,1 ng y 100
g.
El recipiente puede ser de un material que se
selecciona entre el grupo constituido por papel, vidrio,
borosilicato, metal, polímero, aleación y material compuesto.
El recipiente también puede ser poroso,
permeable o semi-permeable.
La Fig. 1 ilustra la producción de segmento
N-terminal de SUP35 recombinante expresado en
bacterias;
La Fig. 2 ilustra la microscopía electrónica de
transmisión de segmento N-terminal de Sup35
recombinante en diferentes soluciones;
La Fig. 3 ilustra el análisis de dicroísmo
circular de proteína Sup35 N-terminal;
La Fig. 4 ilustra el efecto de tratamientos en
autoclave y con óxido de etileno sobre la integridad del segmento N
de la proteína Sup35;
La Fig. 5 ilustra el efecto de tratamiento
Sterrad® 100 sobre la integridad del segmento N de Sup35.
Según una realización de la presente invención,
se proporciona un nuevo indicador de degradación de priones y por
lo tanto, de la completa esterilización de dispositivos médicos.
Un aspecto particular de la presente invención
es el uso de [PSI+], un factor genético no mendeliano codificado
por el gen de SUP35 de la levadura gemante Saccharomyces
cerevisiae, y Het-s codificado por Podospora
anserina, como indicador de degradación de proteína de priones
en esterilización de dispositivos médicos y todos los demás
aparatos, superficies o cosas usadas en procedimientos quirúrgicos y
de asistencia sanitaria.
Otra realización de la invención es el uso de
indicadores de fertilización formados de Sup35, Ure2p,
Het-s, o Psi que es bastante simple de usar. El
indicador puede estar en solución dentro de un vial de vidrio, de
modo que el recipiente podría ser resistente a cualquier técnica de
esterilización, ya sean tratamiento en autoclave usando calor y
presión elevados o técnicas de baja temperatura tales como plasma.
Se usarían tampones no desnaturalizantes tales como Tris/EDTA,
TFA/acetonitrilo, o incluso urea 2M a fin de mantener la integridad
de los filamentos de Sup35p.
Se sabe que una unidad infecciosa única de prión
corresponde a 10^{4}-10^{5} moléculas PrP, ó
0,5-5 fg, que está por debajo del límite de
detección de geles SDS-PAGE (Hill, A.F., Antoniou,
M. y Collinge, J., Journal of General Virology (1999)
80:11-14).
Por tanto, en otra realización de la invención,
hay una prueba de degradación de una cantidad mayor de proteína,
tal como 10 \mug, que asegura que se ha producido la
esterilización completa y por lo tanto, el instrumento médico es
seguro para volver a usarse. Esto se basa en la consideración de que
si hay una modificación estructural de la proteína, es decir, la
proteína experimenta un cambio conformacional o una degradación
después de la exposición a diversas técnicas de esterilización, se
vuelve inactiva y por lo tanto, no infecciosa.
Además, usando 10 \mug como indicador, la
invención permite que se pueda detectar fácilmente cualquier
degradación de la proteína por geles SDS-PAGE
teñidos con Azul Brillante de Coomassie por ejemplo, una técnica
común de laboratorio, ya que se puede detectar tan poco como 0,1
\mug de proteína mediante este método (Sambrook, J., Fritsch,
E.F., y Maniatis, T. Molecular Cloning, a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition,
1989).
1989).
En otra realización de la invención, la
degradación o alteración se puede estimar por técnica de
inmunotransferencia de Western o inmunotransferencia de punto
usando un anticuerpo contra la proteína marcada para estimar la
falta de señal o detección modificada que se genera por cualquier
alteración de la proteína Sup35 diana. Además, la degradación del
indicador también podría ser detectada por cambio de color de la
solución, que confirmaría la esterilización. Si es necesario,
técnicas tales como dicroísmo circular, microscopía electrónica,
microscopía fluorescente, FTIR, aglomeración de rojo Congo, o
digestión de proteinasa K también se podrían usar para detectar el
cambio en la conformación de la proteína esterilizada de
láminas-\beta a hélices-\alpha,
exponiendo así la degradación de la proteína y por lo tanto, su
inactivación.
Ya que los materiales usados para el indicador
(viales de vidrio, soluciones, etc.) son bastante comunes y
económicos, el coste de producción de un indicador de este tipo es
razonablemente bajo. Resulta por tanto muy asequible para cualquier
institución, hospital o industria que lo comprara, garantizar la
seguridad de sus instrumentos
médicos.
médicos.
En una realización de la invención, el indicador
de esterilización también es eficaz en cuanto al coste, ya que
todos los instrumentos se pueden probar y se puede garantizar que
son seguros para volver a usarse, si y sólo si el indicador de
esterilización demuestra la inactivación completa después de un
ciclo entero de esterilización. Las pruebas de esporas comunes no
desestiman completamente la posibilidad de que queden proteínas
residuales activas en la superficie de los dispositivos. Además,
estas técnicas pueden alterar la calidad de los instrumentos, y por
tanto la calidad de la asistencia médica proporcionada. Reemplazar
todos los instrumentos hipotéticamente contaminados sería
efectivamente muy costoso para los servicios médicos y los
instrumentos reutilizables se podrían descartar en el procedimiento
por miedo a la contaminación.
Para experimentos de clonación, se usó
rutinariamente la cepa SURE de Escherichia coli
(InVitrogen®). Para expresión y purificación de proteína, el
plásmido de expresión se transformó en la cepa de E. coli
BL21(pRep4) (Novagen).
Anteriormente se han descrito técnicas de ADN
convencionales (Sambrook y col., 1989). El secuenciado de ADN se
realizó en las instalaciones de secuenciado de ADN del Institut
Armand Frappier (Montreal, Canadá). Los procedimientos de
expresión/purificación de proteína se realizaron como describe el
fabricante (Clontech).
La primera región 759bp de Sup35 que codifica la
región peptídica suficiente para agregación se amplificó por PCR a
partir de un clon genómico en pEMBLyex4 amablemente proporcionado
por el Dr. Ter-Avanesyan (Moscú, Rusia); (Glover,
J.R., Kowal, A.S., y col., Cell (1997)
89:811-819. Se usaron los siguientes
iniciadores: (a)
5'-AGTGGATCCTCGGATTCAAACCAAGGCAA-3'
(introduciendo un sitio BamHI de restricción de enzima, subrayado)
y (b)
5'-CGCGTCGACATCGTTAACACCTCCGTC-3'
(introduciendo un sitio Sall de restricción de enzima, subrayado).
El fragmento se clonó a continuación en pT7Blue3 (Perfectly Blunt
Cloning Kit-Novagen) en la cepa SURE de E.
coli (InVitrogen). Los clones positivos se secuenciaron para
evaluar cualquier mutación o delección en el gen. El segmento N del
gen Sup35 se escindió a continuación con BamHI y Sall y se insertó
en el vector de expresión pQE30 (Qiagen) usando los mismos sitios
de restricción. Los clones positivos en pQE30 se transfirieron a
continuación en BL21[pREP4] para la expresión y purificación
de proteína.
Los protocolos se realizaron mayoritariamente
según los fabricantes. Se hizo inducción de 1l de cultivo bacteriano
(DO_{600} de 0,8) usando IPTG (concentración final de 1 mM)
durante una hora a temperatura ambiente. Se recogieron las células,
se resuspendieron en 50 ml de Tampón B (urea 8M,
fosfato-Na 0,1M, Tris HCl 0,01M pH 8,0), se
sometieron a ultrasonidos y se centrifugaron a 10.000xg durante 15
min a 4ºC. Se recogió el sobrenadante y se cargó a una columna
Ni^{2+}-NTA (resina de afinidad de metal TALON;
Clontech) para cromatografía de afinidad usando un gradiente de pH
con el protocolo de purificación de urea 8M desnaturalizante de
Qiagen. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE
(técnica de electroforesis de gel usada para estimar el tamaño y
cantidad de la proteína) y por técnica de inmunotransferencia de
Western usando un anticuerpo anti-histidina de ratón
(Qiagen) contra la cola 6-histidina presente en el
vector pQE30, a fin de detectar específicamente la proteína. Después
de la separación de las proteínas en SDS-PAGE y
electroinmunotransferencia en nitrocelulosa, se incubó la membrana
con el anticuerpo primario (anti-HIS RGS, de Qiagen,
1:2000) en Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 100 mM (TBS) con leche desnatada
al 5%, Tween® 20 al 0,1% durante una hora. A continuación hubo tres
lavados (10 minutos cada uno) con TBS 0,1% Tween® 20. La detección
se realizó con el Kit de Quimioluminiscencia BM usando un anticuerpo
anti-ratón acoplado a peroxidasa de rábano picante
(1:4000) (Roche Diagnistics). Las membranas se expusieron
finalmente sobre películas radiográficas y se revelaron.
Para inducir la formación de los filamentos, se
realizó una diálisis de 6h a 12h a temperatura ambiente de la
proteína (9 \muM, en solución de urea 8M) contra una u otra de
solución de urea 2M, Tris-HCl 30 mM pH 8,0, NaCl
300 mM (mencionada como "urea 2M") o solución de ácido
trifluoroacético al 0,1%, solución de de acetonitrilo al 40%
(mencionada como "TA") o una solución de Tris/EDTA (Tris 10 mM
pH 8,0 EDTA 1 mM, "TE").
Se sedimentaron por ultracentrifugación (178000
g, 20 min, Beckman Airfuge) muestras (50 \mul) de suspensión de
filamentos sobre rejillas de cobre revestidas con
carbono-formvar (3 mm diámetro, malla 200). Estas
rejillas se tiñeron a continuación negativamente por PTA (ácido
fosfotúngstico) al 3% (peso/volumen) y acetato de uranilo al 2%
(peso/volumen) durante 1 minuto cada una. Las muestras se observaron
a continuación usando un Microscopío Electrónico de Transmisión
Hitachi H-7100 a 75 KV.
Se registraron espectros CD de una suspensión de
filamento 9 \muM (urea 2M) en un espectropolarímetro Jasco J710 a
temperatura ambiente usando una celdilla de 0,05 cm de longitud de
recorrido. Las muestras se escanearon con los siguientes ajustes:
velocidad de escaneado: 100 nm/min; tiempo de respuesta 0,25 seg.;
acumulaciones: 3 (celdilla vacía), 5 (tampón solo) y 10 (muestras
de proteína); sensibilidad: 50 mgrad; longitud de onda de partida:
260 nm; longitud de onda de terminación: 200 nm.
Se usó tratamiento en autoclave a 121ºC durante
una hora y Sterivac® (óxido de etileno) como controles negativos;
como procedimientos experimentales se usaron los de Sterrad® 100,
que usan una combinación de peróxido de hidrógeno y plasma de gas
como agentes esterilizantes. Las muestras se sometieron
indistintamente a un ciclo entero de cada procedimiento o a sólo un
cuarto de ciclo, como fue el caso con ozono. Después de esto, se
evaluó la degradación de Sup35. Se expusieron 10 \mug de proteína
a los procedimientos de esterilización que se describen en la Tabla
1. La degradación de la proteína se analizó por
SDS-PAGE usando nitrato de plata y coloración Azul
de Coomassie así como micrografías TEM (formación de filamento).
También se usó detección inmunológica usando quimioluminiscencia
(anteriormente descrita), después de los procedimientos de
esterilización.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El gen de SUP35 codifica una proteína asociada a
ribosoma de 76,5 kDa. Sin embargo, se ha mostrado que sólo los
primeros 114 aminoácidos son suficientes para formación de filamento
(King, C., Tittmann, P. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
(1997) 94:6618-6622). Se usaron iniciadores
de ADN similares a los ya descritos (Glover, J.R., Kowal, A.S., y
col. Cell (1997) 89:811-819 para
amplificar los primeros 639 nucleótidos, incluyendo y desde el
codón de iniciación, usando un clon genómico proporcionado por el
Dr. Ter-Avanesyan. Glover y col. (1997) han
mostrado que el péptido de 213 aminoácidos de largo resultante
podría exhibir muchas características bioquímicas similares a
priones. La proteína expresada, purificada en condiciones
desnaturalizantes, tiene un peso molecular aparente de 30 KDa,
según se estima por análisis SDS-PAGE (Fig. 1, panel
a mano izquierda). Proteína expresada en bacterias de la purificada
a través de cromatografía de níquel (Materiales y Métodos) y
muestras de proteínas se analizaron por SDS-PAGE y
tinción con Azul de Coomassie (panel a mano izquierda) y técnica de
inmunotransferencia de Western con un anticuerpo contra la etiqueta
6XHIS (panel a mano derecha). Se confirmó la identidad de la
proteína observada por tinción de Coomassie del gel, usando un
anticuerpo levantado contra la etiqueta 6XHIS, que está presente en
la proteína expresada en bacterias debido a su incorporación en el
armazón en extremo N-terminal del péptido (Fig. 1,
panel a mano derecha).
Para asegurar que la N-proteína
SUP35 purificada se estaba comportando de modo similar a los
priones, se investigó la capacidad para experimentar agregación
ordenada, formando filamentos de tipo amiloide. Éstos se pueden
observar por microscopía electrónica de transmisión (TEM). En la
Fig. 2 se muestran imágenes TEM de suspensión de proteína en urea
8M o lentamente dializada contra urea 2M o solución de ácido
trifluoroacético/acetonitrilo 0,1%/ 40% (TE) y que se mantiene a
4ºC durante 1 semana. La proteína producida en bacterias en urea 8M
se dializó indistintamente contra urea 2M, ácido
trifluoroacético/acetonitrilo 0,1%/40% (TA) o
Tris-EDTA (TE), se mantuvo a 4ºC durante una semana
y se procesó por TEM. (M se refiere al marcador). Efectivamente, la
proteína Sup35, excepto en solución de urea 8M (incluso durante
semanas a 4ºC) tiende a formar agregados que se observan fácilmente
por análisis TEM.
Además, el envejecimiento prolongado de las
soluciones que contienen Sup35p debería exhibir características de
tipo de lámina \beta, con un único mínimo de absorción diferencial
cerca de 220 nm cuando se analiza por dicroísmo circular. Como se
puede ver en la Fig. 3, es posible distinguir una extensión del pico
de proteína en urea 2M (agregados ordenados) del enrollamiento
aleatorio de Sup35p en la solución de urea 8M.
A partir de estos resultados, se concluye que la
porción N expresada en bacterias de la proteína Sup35 se comporta
como se esperaba y exhibe muchas características bioquímicas que se
parecen a priones.
La eficacia de tratamientos de esterilización se
evaluó sobre la base de su impacto en la integridad de Sup35p. Se
procesaron muestras de proteína Sup35, mantenidas en diferentes
formas, y se analizaron a continuación por SDS-PAGE
y/o inmunotransferencia de Western.
Los solicitantes son los primeros en confirmar
que un ciclo clásico de esterilización en autoclave fue incapaz de
destruir proteína Sup35 como es el caso para priones. No se pudo
recuperar proteína intacta de Sup35p mantenida en urea 8M (sin
agregados) después de tratamiento en autoclave mientras que
filamentos de proteína Sup35 en TFA fueron resistentes a la
degradación, según se vio a partir de tinción con Coomassie de
SDS-PAGE (Fig. 4, panel superior, proteína Sup35 en
urea 8M o en TA se procesó para esterilización y a continuación se
analizó respecto a su integridad por SDS-PAGE. (U
se refiere a muestras sin tratar, y T a tratadas)). Resultados
similares se obtuvieron cuando se expusieron las mismas muestras a
óxido de etileno (Fig 4, panel inferior). A partir de estos
resultados, se concluye que los tratamientos con autoclave y óxido
de etileno son incapaces de degradar la proteína Sup35 agregada
ordenadamente.
Por otra parte, las proteínas de urea 8M y urea
2M se degradaron tras el tratamiento por tratamiento de Sterrad®
100 (procedimiento oxidativo, que combina peróxido de hidrógeno y
plasma de gas). Agregados de la proteína de urea 2M se pudieron
destruir por este tratamiento. Sin embargo, agregados de la proteína
TA pudieron resistir al procedimiento de esterilización, según se
evaluó por la proteína intacta que se vio en el gel teñido de Azul
de Coomassie (Fig. 5, panel superior, se procesaron muestras de
proteína Sup35 en urea 8M, urea 2M o ácido
trifluoroacético/acetonitrilo 0,1%/40% (TA), y la proteína que quedó
intacta se analizó por SDS-PAGE se reveló por
tinción con Azul de Coomassie (panel superior) o análisis de
inmunotransferencia de Western, con un anticuerpo contra la
etiqueta 6XHIS (panel inferior)). (U se refiere a muestras sin
tratar, T a tratadas y * en panel de inmunotransferencia Western a
Sup35p intacta). Para aumentar la sensibilidad de la técnica de
detección y para asegurar que este tratamiento podía degradar
efectivamente los filamentos de proteína Sup35 de urea 2M, se
realizó análisis de inmunotransferencia de Western usando un
anticuerpo que detecta la etiqueta 6XHIS presente en el extremo
N-terminal de la proteína expresada en bacterias
(Fig. 5 panel inferior). Estos experimentos muestran que el
procedimiento de Sterrad® 100 puede degradar los agregados de la
proteína Sup35 mantenida en urea 2M. La única resistencia observada
fue en las muestras de Sup35 colocadas en TA. Hay dos posibles
explicaciones para estos resultados inesperados. Primera, podría
haber habido una interacción entre ácido
trifluoroacético/acetonitrilo y el peróxido de hidrógeno que se usa
como agente esterilizante en sistemas Sterrad, que podría haber
inhibido el potencial oxidativo de este procedimiento. Esta
resistencia aumentada también podría haber sido provocada por la
protonación de la proteína por la solución de TA, que haría a la
proteína menos susceptible al efecto oxidante del peróxido de
hidrógeno. Los análisis TEM de muestras en diferentes soluciones
para procedimientos de esterilización usados en este estudio
indicaron la desintegración de la conformación de filamento de
Sup35. Estas observaciones confirmaron los resultados obtenidos por
otros procedimientos, tales como Azul de Coomassie y técnica de
inmunotransferencia de Western según se describen anteriormente en
este documento.
A partir de estos resultados, se espera que
otras técnicas de esterilización que usan agentes esterilizantes
oxidantes, tales como ozono, esterilizantes basados en ácido
peracético, etc., también serán eficaces para alterar la proteína
Sup35.
Claims (7)
1. Un método para evaluar la eficacia de un
procedimiento de esterilización, que comprende las etapas de:
- a)
- someter una cantidad suficiente de al menos un indicador de degradación de proteína priónica en un recipiente a dicho procedimiento de esterilización, en el que dicho indicador se selecciona entre el grupo constituido por SUP35, URE2, proteína HET-s y combinaciones de las mismas; y
- b)
- determinar el nivel de degradación de dicho indicador.
2. El método según la reivindicación 1, en el
que la etapa b) se realiza determinando el peso de la masa,
cuantificando radicales, variaciones colorimétricas, radiometría,
inmunotransferencia de punto, radioinmunoensayo, dicroísmo
circular, microscopía electrónica, microscopía fluorescente, FTIR,
aglomeración de rojo Congo, o digestión de proteinasa.
3. El método según la reivindicación 1, en el
que dicho procedimiento de esterilización se realiza por tratamiento
en autoclave, exposición química, calentamiento en seco, gas de
plasma a baja temperatura, exposición basada en ozono, o técnicas
de esterilización que usan agentes esterilizantes alquilantes y/u
oxidantes.
4. El método según la reivindicación 3, en el
que dicha exposición química es a vapor o solución que se selecciona
entre el grupo constituido por detergente, óxido de etileno,
proteasa, hidróxido sódico, y enzima.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
dicha cantidad de indicador de la etapa a) está entre 0,1 ng y 100
g.
6. El método según la reivindicación 1, en el
que dicho recipiente es de un material que se selecciona entre el
grupo constituido por papel, vidrio, borosilicato, metal, polímero,
aleación y material compuesto.
7. El método según la reivindicación 5, en el
que dicho recipiente es poroso, permeable o
semi-permeable.
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