KR20010112918A - 탄소원의 존재 하에서의 국균에서의 단백질 분해 효소의발현 - Google Patents

탄소원의 존재 하에서의 국균에서의 단백질 분해 효소의발현 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탄소원의 존재 하에 단백질 분해 효소를 탄소원이 존재하지 않는 경우와 동일한 양 이상으로 발현할 수 있는 국균에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 탄소원의 존재 하에 광범위한 스펙트럼의 단백질 분해 효소의 양을 증가시키기 위한 도구로서의 creA 유전자의 돌연변이에 관한 것이다.

Description

탄소원의 존재 하에서의 국균에서의 단백질 분해 효소의 발현{EXPRESSION OF PROTEOLYTIC ENZYMES IN KOJI MOLD IN THE PRESENCE OF CARBON SOURCES}
식품 산업에서 광범위하게 사용되는 가수분해된 단백질은 산, 알칼리 또는 효소를 이용한 단백질 원료의 가수분해적 분해에 의해 제조될 수 있다. 산 또는 알칼리를 이용한 단백질 원료의 처리에 있어서, 상기 방법은 가수분해 동안 생성되는 필수 아미노산도 파괴하여 최종 제품의 영양가를 감소시키는 것으로 나타났다. 반면, 효소의 첨가에 의한 가수분해는 완전한 분해로는 거의 진행하지 않아 가수분해된 단백질 원료는 여전히 상당한 양의 펩티드를 포함한다. 그러나, 단백질 분해에 이용되는 단백질 및 효소적 성분의 성질에 따라, 형성된 펩티드가 매우 쓴 맛을 낼 수 있어 관능적으로 바람직하지 못하다.
따라서, 몇몇 방법에 있어서 화학적 또는 단리된 생물학적 원료 대신 미생물이 상기 목적에 이용된다. 이러한 경우, 이용가능한 단백질성 원료는 미생물에 의해 분비되는 다수의 다양한 효소, 예를 들어 아밀라제, 프로티나제, 펩티다제 등의 작용에 의해 가수분해된다.
이러한 미생물 중 한 부류가 코지 배양물 제조에 전통적으로 사용된 국균이다 (예를 들어 US 4,308,284 참조). 상기 국균은 예를 들어 아스페르길루스 (Aspergillus), 리조푸스 (Rhizopus) 및/또는 무코르 (Mucor) 속의 미생물, 특히 아스페르길루스 소야에 (Aspergillus soyae), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 포에니시스 (Aspergillus phoenicis), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 아와모리 (Aspergillus awamori), 리조푸스 오리자에 (Rhizopus oryzae), 리조푸스 올리고스포루스 (Rhizopus oligosporus), 리조푸스 자포니쿠스 (Rhizopus japonicus), 리조푸스 포르모사엔시스 (Rhizopus formosaensis), 무코르 시르시넬로이데스 (Mucor circinelloides), 무코르 자파니쿠스 (Mucor japanicus), 페니실륨 글라우쿰 (Penicillium glaucum) 및 페니실륨 푸스쿰 (Penicillium fuscum)을 포함한다.
국제 식물 명명법 (International Code of Botanical Nomenclature, ICBN)의 규칙에 따르면, 아스페르길루스는 기형적 속이다. 이는 실제 아스페르길루스가 단지 콘이디오포어 (conidiophore)를 통하여 무성 생식함을 의미한다. 그러나, 전형적인 아스페르길루스 콘이디오포어 형태는 아스코스포어 (ascospore)를 통하여 유성 생식할 수 있는 진균류에서도 발견될 수 있다. 몇몇 아스페르길루스 분류학자들은 혼란을 야기하였는데, 이는 상기 학자들이 ICBN 용어에 집착하지 않았기 때문이다. 대신, 그들은 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans)의 정확한분류학적 명칭이 에메리셀라 니둘란스 (Emericella nidulans)임에도 불구하고, 상기 속에 속하는 아스페르길루스 니둘란스를 포함시키기 위하여 분류학적 체계를 다양하게 개정하려고 하였다 (Samson, In: Aspergillus. Biology and Industrial Applications, pp 355-390, Bennett 및 Klich 편집, 미국 보스턴). 사실상, 아스페르길루스 니둘란스로 명명된 미생물은 아스페르길루스 속 그 자체에는 속하지 않는 것으로 생각될 수 있다.
EP 0 417 481에는 발효 간장의 제조 방법이 기술되어 있는데, 여기에서 코지는 가열 간장 및 볶은 밀의 혼합물과 코지 배양물을 혼합함으로써 제조된다. 이어서 이와 같이 얻어진 코지는 코지 배양물의 발효 동안 생성되는 효소를 사용하여 45 내지 60℃에서 3 내지 8 시간 동안 수성 현탁물 중에서 가수분해되며, 가수분해된 코지 현탁물에 염화나트륨을 첨가함으로써 모로미 (moromi)가 추가로 제조되며, 모로미는 발효되도록 두며, 이어서 수득된 용액으로 가압되며, 저온살균 및 정화된다.
EP 0 429 760에는 단백질이 풍부한 원료의 수성 현탁물을 제조하고, pH 6.0 내지 11.0에서 프로테아제를 사용하여 현탁물을 가수분해시킴으로써 단백질을 용해시키고, 현탁물을 pH 4.6 내지 6에서 가열 처리하고, 그 후, 코지 배양물의 효소로 숙성시키는 풍미제의 제조 방법이 기술되어 있다.
마찬가지로, 유럽 특허 출원 96 201 923.8에는 식물성 단백질원 및 식물성 탄수화물 포함원을 포함하며, 처음에 45% 이상의 건조 물질을 보유하는 혼합물을 제조하고, 코지 배양물 및 전통적인 고기 발효에 연루된 하나 이상의 다른 미생물종을 혼합물에 접종하고, 혼합물을 인큐베이션하여 고기 풍미가 형성되게 하는 고기 풍미의 제조 방법이 기재되어 있다.
그러나, 상이한 미생물의 사용을 포함하는 모든 방법들은, 단백질 원료가 완전히 가수분해되지 않는 불리한 점을 또한 나타낼 수 있는데, 한편, 실질적 가수분해를 성취하기 위해 원료를 미생물과 함께 더 오래 인큐베이션하면, 원하지 않는 대사 부산물이 형성될 수 있다.
따라서, 당 업계에서는 상기 가수분해 공정을 최적화할 필요가 존재한다. 그러나, 상기 코지 공정의 최적화 및 추가의 개발은 관련된 가수분해 효소의 성질, 그의 조절, 및 그의 발현 및 활성에 대한 공정 파라미터, 예를 들어 온도, pH, 수분 활성도, 및 염 농도의 영향에 대한 지식의 결여에 의해 심각하게 제한받았다.
Katz 등의 문헌 [Gene 150 (1994), 287-292]으로부터, 진균류 에메리셀라 니둘란스에 있어서, 그의 증식에 필요한 질소원, 황원 및 탄소원을 제공하기 위하여 미생물에 의해 본질적으로 사용되는 단백질 분해 효소의 발현 및 분비는, 탄소 이화 생성물 억제, 질소- 및 황-대사산물 억제를 포함하여 일반적인 3가지 이상의 회로에 의해 제어받음이 알려졌다.
상기 3가지의 조절 회로는 기질에 있어서의 이용가능한 질소원, 탄소원 및 황원이 그의 질소-, 에너지- 및 황-생성에 따라 순차적으로 이용되는 것을 보증한다. 특히 질소 대사산물 억제는 에메리셀라 니둘란스에 있어서 areA 유전자 산물에 의해 발휘되는 것으로 밝혀진 반면 (Arst 등, Mol. Gen. Genet. 26 (1973), 111-141), 기타 진균류에 있어서는, 아마도 다른 유전자가 상기 기능에 책임이 있다고 추정된다. 사실, 연구된 대부분의 진균류는 상기 기능을 수행하는 areA 호몰로그를 가지는 것으로 보인다.
아스페르길루스 오리자에를 이용하여 수행되는 밀겨 발효에 있어서, 단백질 분해 활성은 단지 특정 한계 이하로 글루코스 농도가 강하되는 경우에만 검출될 수 있다. 이러한 관찰 결과는 에이. 오리자에에 있어서 단백질 분해 효소의 발현이 단백질의 존재에 의해 유도되는 것이 아니라 단순히 탄소에 의해 활성화됨을 암시한다. 대두 코지를 이용한 발효 공정 동안 상당한 양의 글루코스가 아밀라제 활성의 결과로서 유리되며 이는 결국 프로테아제 코딩 유전자의 탄소 이화생성물 억제로 이어지는 것으로 밝혀졌다.
그러므로, 고도로 단백질을 가수분해시켜 가수분해물이 탁월한 관능성을 가지게 하는 개선된 단백질 가수분해 방법에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 개요
본 발명의 목적은, 단백질 분해 활성은 탄소에 의해 억제되지 않는 아스페르길루스, 리조푸스, 무코르 또는 페니실륨 속에 속하는 국균을 제공함으로써 해결되었다.
본 발명에 따르면, 상기 미생물에 있어서, creA 유전자의 발현은, 그의 유전자 산물이 프로테아제 전사를 차단하도록 하는 DNA 서열에 대하여 감소된 결합 친화성을 나타내거나 결합 친화성을 전혀 나타내지 않는 폴리펩티드가 수득되게 하도록 변경하였다.
다른 바람직한 실시 형태에 있어서, creA 유전자의 합성은, 상응하는 유전자산물이 실질적으로 전사되지 않거나 전혀 전사되지 않거나 기능성 생성물로 번역되지 않게 하는 방식으로 변경된다. 이는 예를 들어 creA 안티-센스 mRNA 를 생성시켜 creA 유전자가 기능성 폴리펩티드로 번역되지 않게 하는 작제물을 미생물의 게놈 내로 도입함으로써 성취될 수 있다. 반면, 전사가 일어나지 않도록 creA 유전자 내로 돌연변이를 도입할 수도 있다. 결국, creA 유전자는 탄소원의 존재 하에 억제가 전혀 일어나지 않도록 완전히 결실시킬 수도 있다.
목적 특색을 가지는 미생물이 되게 하는 돌연변이는 고전적인 기술, 예를 들어 돌연변이 및 선발을 통하여, 또는 유전 공학 기술을 사용하여 얻어질 수 있는데, 이를 이용하여 creA 유전자에서의 선택적 돌연변이가 성취될 수 있다.
또한, creA 돌연변이는 프로테아제 생성의 긍정적인 촉진체인 areA 유전자 생성을 증가시키는 특성과 조합될 수도 있다.
본 발명은 탄소원의 존재 하에 단백질 분해 효소를, 탄소원이 존재하지 않는 경우와 동일한 양 이상으로 발현할 수 있는 국균 (koji mold)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 탄소원의 존재 하에 광범위한 스펙트럼의 단백질 분해 효소의 양을 증가시키기 위한 도구로서 creA 유전자 산물의 발현을 변경하는 것에 관한 것이다.
도면에 있어서:
도 1은 λGem12 클론의 제한효소 지도이다. 코딩 영역은 pUC19에 서브클로닝된 4.3 kB의 PstI-SpHI 단편 상에 위치하였다.
이론적으로, creA 유전자 산물이 상응하는 DNA 서열에 결합하는 것을 감소시키거나 심지어 차단하는 creA 유전자에서의 돌연변이의 생성은 밀겨 코지에 있어서 프로테아제 생성을 좀 더 초기에 개시되게 하여 프로테아제 생성량이 더 많아지게 하고 그에 따라 프로테아제 분비도 증가시켜야 한다. 또한, 대두 코지에 있어서, creA 돌연변이는 이론적으로 프로테아제 생성의 탄소 이화생성물 억제를 경감시켜프로테아제가 더 많이 생성되도록 해야 한다.
그러나, M. Drysdale 등은 문헌 [Gene 130 (1993), 241-245]에서, 에이. 니둘란스에 있어서, creA 유전자를 측면 서열과 함께 결실시키면 치사 표현형이 된다는 것을 보고하고 있다. 따라서, creA는 리프레서 단백질로서의 그의 역할 외에도 미생물이 그 없이는 증식 및 생장할 수 없는 다른 생육가능한 조절 역할을 가지는 것으로 생각되었다.
이러한 일반적인 생각과는 반대로, 본 발명자들은 심지어 탄소원의 존재 하에서도 매우 다양한 상이한 단백질 분해 효소를 발현할 수 있는, 생육가능한 creA 돌연변이체를 실제 창조할 수 있음을 놀랍게도 알아내었다.
이러한 목적을 성취하기 위하여, 하기의 과정을 채용하였다.
creA 돌연변이체가 areA 서프레서 돌연변이로 단리될 수 있다고 생각되었다. areA 유전자는 매우 다양한 단백질 분해 폴리펩티드의 전사의 활성화에 연루된 여러 유전자 중 하나이다. areA 유전자는 세포내 글루타민의 존재 또는 부재에 의해 제어되는데, 사실상 이는 질소 의존성 제어를 나타낸다.
본원에 참고로 채택된 문헌인 EP 97111378.2에 상세하게 기술되어 있는 areA 눌 (null)-돌연변이체 에이. 오리자에 NF2 (CNCM 1882)는 0.2% 대두 단백질 및 50 mM 글루코스를 포함하는 최소 배지 (하기 참조) 상에서 생장할 수 없는 것으로 나타났다. 동일 돌연변이체는 또한 밀 글루텐 코지에서도 생장할 수 없었다.
areA 눌-돌연변이체에 있어서, areA 유전자 산물은 더 이상 프로테아제 코딩 유전자의 전사를 촉진하지 못하여, 미생물이 감소된 프로테아제 분비를 나타내게된다.
또한, 탄소원, 예를 들어 글루코스, 프룩토스 또는 사카로스의 존재 하에, creA 유전자 산물은 프로테아제 코딩 유전자의 전사를 억제하여, 결국 areA 눌 돌연변이체가 질소원으로서 단백질을 사용할 수 없도록 한다. 결과적으로, 작동성 creA 유전자를 갖는 areA 눌 돌연변이체는 상기와 같은 환경에서 증식 및 생장할 수 없다.
creA 돌연변이체를 단리하기 위하여, 상기 배지 (0.2% 대두 단백질, 50 mM 글루코스) 중에서 에이. 오리자에의 areA 눌 돌연변이체에 돌연변이유발제, 예를 들어 UV 조사, EMS (에틸 메탄 술포네이트), 메틸 메탄 술포네이트 또는 DMSO, 니트로소구아니딘 등의 처리를 행할 수 있다.
이론적으로는, 배지 상에서 생장할 수 있는 적어도 몇몇 콜로니에 있어서, creA 유전자 산물이 그의 정상적인 작용을 나타낼 수 없어 상기와 같은 배지 중에서 생장이 가능해지도록 creA 유전자를 돌연변이시켰다 (상기 참조).
이어서, 콜로니에 있어서, 예를 들어 creA의 제어 하의 효소, 예를 들어 알콜 데히드로게나제, 아밀라제, 아세트아미다제 등의 활성을 측정함으로써 성취될 수 있는 단백질 분해 활성 증가의 존재를 분석할 수 있다.
예를 들어 상기 배지에서 생장하는 콜로니에 있어서, 플루오르-아세테이트에 대한 과민증을 조사할 수 있다. 야생형 균주에 있어서, 활성 creA 단백질은 글루코스의 존재 하에서 아세테이트 이용 효소의 유도를 방해한다. 이러한 상태 하에서, 플루오르-아세테이트는 대사되지 않는다. 그러나, creA 유전자 산물이 그의고유의 기능을 인계받지 못한 creA 돌연변이체에 있어서, 상기 아세테이트 이용 효소는 본질적으로 콘스티튜티브(constitutive)한 방식으로 전사된다. 그 결과, 플루오르-아세테이트는 미생물에 유독한 화합물로 전환된다. creA 유전자 산물이 본질적으로 무효화되게 하는 creA 유전자 돌연변이를 갖는 균주는 플루오르-아세테이트 및 탄소원을 함유하는 배지에서 생장하지 않는다는 것에 가시적인 결과가 존재한다.
CreA 돌연변이체는 탄소원의 존재 하에서의 알릴-알콜에 대한 그의 과민성에 따라 동정될 수도 있다. 야생형 균주에 있어서, 활성 creA 단백질은 일반적으로 알콜 데히드로게나제의 유도를 방해하는데, 알콜 데히드로게나제는 상기 기질을 미생물에 유독한 화합물인 케톤 아크레올린으로 산화시킨다. 억제 조건 하에서, 즉, 탄소원의 존재 하에서, 일반적으로 알릴 알콜은 알콜 데히드로게나제의 전사를 억제하는 고유 기능을 나타내는 creA로 인하여 유독 화합물로 산화되지 않는다. 그러나, creA 유전자가 더이상 기능적이지 않은 돌연변이체에 있어서, 알콜 데히드로게나제는 본질적으로 콘스티튜티브하게 발현되어 심지어 탄소원의 존재 하에서도 아크레올린으로 국균을 중독시킨다.
creA 유전자는, 상기 돌연변이유도제 및 목적 특색에 대한 선별에 의한 areA 눌 돌연변이체의 랜덤 돌연변이유발 외에도, 유전 공학적 방법에 의해 적당한 방식으로 변경될 수도 있다.
마지막으로, 안티-센스 RNA를 creA로 전사되는 DNA 서열을 포함하는 작제물을 국균의 게놈 내로 혼입시킬 수 있다. 이는 예를 들어 Maniatis의 문헌 [ALaboratory manual, Cold Spring Harbor, 1992]에 기술되어 있는 바와 같은 당 업계에 잘 알려진 기술에 의해 성취될 수 있다. 이러한 선택권은 주어진 시스템에서 전사를 유도하는 것으로 알려진 특정 분자의 존재 또는 부재에 의존적으로 전사가 행해지게 함으로써 적당한 방식으로 안티-센스 RNA 그 자체의 작용이 제어될 수 있다는 잇점을 제공한다. 주어진 DNA 단편을 클로닝하기 위한 벡터, 프로모터 및 그의 유도 방식은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Maniatis의 상기 문헌에서 발견할 수 있다.
또한, creA 유전자는 그의 유전자 산물이 실질적으로 무효하게 되거나 심지어 완전히 무효하게 되는 방식으로 변경될 수 있다. 이는 DNA 서열 내로 돌연변이를 도입하여, 상응하는 폴리펩티드가 그의 조절 작용을 나타내는 능력을, 예를 들어 상응하는 조절 DNA 서열에 결합함으로써, 느슨하게 함으로써 달성될 수 있다.
그러나, 관련된 상이성에도 불구하고, 혼성화 동안 낮은 엄격성 조건을 적용하고, 프로브로서 아스페르길루스 니둘란스의 상응하는 유전자 코딩 영역을 포함하는 DNA 서열을 사용하여, 에이. 오리자에의 creA 유전자를 단리할 수 있음이 지금에 와서야 밝혀졌다.
적용되는 낮은 엄격성 조건으로 인하여, 다수의 상이한 콜로니가 처음에 단리되며, 이는 그 후 엄격성 조건을 증가시킴으로써 배제시킬 수 있다.
강력하게 혼성화하는 콜로니의 DNA를 단리한 후, 완전한 에이. 오리자에 creA 유전자는 4.3 KB의 PstI-SphI 단편에 할당할 수 있었는데, 이는 적합한 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로 클로닝하여 서열결정할 수 있다.그에 의해 얻어진 서열을 하기 서열 번호 1에 나타내었다.
DNA 서열을 분석하는 데 있어서, 잠재적 개봉 판독 프레임을 찾아내어 하기 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 생성할 수 있었다.
이어서, 상기와 같이 확인한 DNA 서열을 사용하여 creA 유전자 내로 특정 돌연변이를 도입할 수 있다. 이는, 예를 들어 적합한 벡터, 예를 들어 고 카피수 벡터 pUC 또는 M13에 단편을 클로닝하고, 판독 프레임에 있어서 코딩 서열 일부를 결실시키거나 종결 코돈을 도입하고, 변경된 creA 유전자를 에이. 오리자에 NF2 (CNCM 1882)와 같은 areA 돌연변이체 내로 도입함으로써 달성될 수 있다. 이어서 CreA-areA 이중 돌연변이체를 단백질 (즉 0.2% 대두) 및 50 mM 글루코스를 포함하는 최소 배지 상에서 그의 생장능에 의해 선발할 수 있는데, areA 돌연변이체는 생장하지 않는다.
야생형 배경 중 적합하게 변경된 작제물의 효과적인 전달을 측정하는 데 있어서, 마커, 예를 들어 내성 유전자가 이용될 수 있는데, 내성 유전자는 목적 특색을 가지는 creA 돌연변이체를 단리한 후 국균의 게놈으로부터 결실시킬 수 있다. 클로닝, 주어진 유전자 내로의 돌연변이 및/또는 결실의 도입, 및 미생물 내로의 DNA 서열의 도입 기술은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Maniatis 등의 상기 문헌에서 찾을 수 있다.
하기 실시예로 본 발명을 더욱 더 예시한다.
균주 및 플라스미드
creA 유전자를 증폭시키는 데 사용하는 에이. 니둘란스 G332(pabaAl,yA2,xprD1)은 Dr. A.J. Clutterbuck을 통하여 Glasgow Genetic Stock Centre로부터 수득하였다. 에이. 오리자에 TK3 (aflR1, omtA1)은 Nestle Research Center Lausanne의 균주 콜렉션으로부터 수득하였다. 에이. 오리자에 NF1 (pyrG1)은 오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 pyrG 유전자를 표적화 파괴로 불활성화시킨 에이. 오리자에 TK3의 우리딘 영양요구주 유도체이다. 에이. 오리자에 NF2 (CNCM 1882)은 EP 97111378.2에 기술되어 있는 에이. 오리자에 NF1으로부터 유래한 areA 파괴 돌연변이체이다.
벡터 LambdaGem-12는 프로메가로부터 수득하였으며, pUC19 (Yanisch-Perron C., Vieira, J. 및 Messing, J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of M13mp18 and pUC19; Gene 33 (1985), 103-119) 는 미국의 New England Biolabs Inc.사로부터 수득하였다.
배지
최소 배지(minimal medium, MM)는 1 리터 당 1.5 KH2PO4(독일 담스타트 소재의 Merck사제), 0.5 g MgSO4.7H20 (독일 담스타트 소재의 Merck사제), 0.5 g KCl (Merck)을 포함한다. 돌연변이체의 선발을 위하여 50 mM 글루코스 (독일 담스타트 소재의 Merck사제), 0.2% 대두 단백질 (Protein Technologies International) 및 2% 아가 노블을 MM에 첨가하였다. 프로테아제 플레이트 분석은 단일 탄소원 및 질소원으로 0.08% 소듐 데속시콜레이트 (스위스 부크스 소재의 Fluka사제) 및 0.2% 대두 단백질을 포함하는 MM, 또는 1% 탈지유 (Difco사제) 및 2% 아가 노블 (Difco사제)를 포함하는 MM 상에서 수행하였다.
실시예 1
creA 돌연변이체의 단리
단백질 분해 활성의 생성과 관련한 creA 돌연변이체를 단리하기 위하여, EP 97111378.2에 기술된 바와 같이 areA 눌 돌연변이체를 제조하였다. 또한, 108개의 에이. 오리자에 NF2 (CNCM 1882) 콘이디오스포어에 UV를 조사하고 (500 mJ/cm2254 nm, 50% 생존률), 이를 0.2% 대두 단백질, 50 mM 글루코스 및 2% 아가 노블 (Difco사제)을 포함하는 최소 배지 상에 도말하였다. NF14 내지 NF17로 명명한 4개의 포자형성 콜로니를 선발하였으며, 이들은 50 mM 글루코스의 존재 하에 15 mM 알릴 알콜에 민감성인 것으로 밝혀졌는데, 이는 상기 4개의 돌연변이체가 creA 돌연변이체임을 암시한다. 또한, NF14 내지 NF17은 글루코스의 존재 하에 프로테아제를 분비하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2
creA 유전자의 단리
에이. 니둘란스 creA 유전자의 코딩 영역을 포함하는 1.3 KB PCR 생성물을 사용하여 낮은 엄격성 조건 (55℃, 5 x SSC, 1% SDS )하에서 GEM 12 중 아스페르길루스 오리자에 TK3 게놈 라이브러리 (상기)를 스크리닝하였다.
전체 100개의 양성 클론을 증식시키고, 온도를 약 60℃로 증가시킴으로써 약간 증가한 엄격성 조건 하에 프로브를 사용하여 다시 혼성화하였다. 하기 3개의가장 강력하게 혼성화하는 클론을 단리하였다.
7.3 KB BamHI 단편으로서 Gem12 클론으로부터의 에이. 오리자에 creA 유전자를 서브클로닝하였다. 서턴 분석에 의하면, 코딩 영역은 pUC19에 서브클로닝되어 pNFF212를 생성하며 완전히 서열결정된 4.3 KB PstI-SphI 단편 상에 위치화되었다. 에이. 오리자에 creA 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 추정 아미노산 서열을 하기에 나타내었다. CREA DNA-결합 부위의 SYGRGG 콘센서스 (Kulmburg 등, 1993)에 맞는 추정 프로모터 영역 중 서열 모티프를 단일 밑줄로 표시하고 볼드체로 나타내었다. CREA 단백질 중 DNA-결합 C2H2Zn-핑거 영역 (Dowzer 등, 1989)을 포함하는 영역을 이중 밑줄 및 볼드체로 나타내었다.
실시예 3
creA 유전자의 유전적 변경
DNA 서열에 있어서, 종결 코돈을 +226-228 및 +229-231에 도입하여 디펩티드 TyrLys를 코딩하는 서열 TACAAG을 TAGTAG (StopStop)로 변화시켰다. 퀵체인지 (Quickchange) 프로토콜 (바젤 소재의 Stratagene사제)에 기재되어 있는 바와 같이 올리고뉴클레오티드 CTTCCCCGTCCATAGTAGTGTCCCCTGTG 및 그의 상보체 CACAGGGGACACTACTATGGACGGGGAAG를 사용하여 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 상기 돌연변이를 pNFF212 내로 도입하였다.
상기 돌연변이로 인해 DNA 결합 징크 핑거 도메인의 creA 유전자 산물 N-말단이 절단되어 상기 유전자 산물은 불활성화된다. 상기 작제물을 에이. 오리자에 NF2 (CNCM 1882, EP97111378.2) 내로 도입함으로써, 0.2% 대두 단백질 및 50 mM 글루코스를 포함하며 2% 아가 노블로 고형화한 MM 플레이트 상에 상기 미생물을 도말함으로써 creA-areA 이중 돌연변이체를 직접 선발할 수 있었다.
실시예 4
creA 유전자의 변경
또한 하기하는 바와 같이 국균 게놈으로부터 creA 유전자를 결실시켰다. pNFF212를 EcoRI으로 부분 절단하고, 선형 분자를 아가로스 겔로부터 회수하였다. 탈인산화 및 pNFF38로부터의 1843 bp의 에이. 니둘란스 pyrG 단편으로의 라이게이션 후 (A. Doumas, P van den Broek, M. Affolter, M. Monod (1998) Chacterisation of the Prolyl dipeptidyl peptidase gene (dppIV) from the Koji mold Aspergillus oryzae, Applied and Environemental Microbiology 64, 4809-4815), pNFF234를 생성하였다. pNFF234에 있어서, creA 코딩 영역은 기능성 에이. 니둘란스 pyrG 유전자에 의해 중단되어 있어 DNA 결합 징크 핑거의 바로 하류에서 유전자 산물이 절단된다.
creA 돌연변이체를 얻기 위하여, pNFF234를 BstXI으로 절단하고, 형질 전환에 의해 에이. 오리자에 NF1 내로 도입하였다. 일차 형질전환체를 우리딘을 포함하지 않는 MM 상에서 선발하고, 50 mM 글루코스의 존재 하에 알릴-알콜 및 플루오르-아세테이트에 대한 과민성에 대하여 스크리닝하였다. 이어서, 서턴 분석 또는 PCR에 의해 민감성 형질전환체에 있어서 목적 유전자 대체를 시험하였다.
실시예 5
발현 시험
creA 유전자에 있어서의 돌연변이를 추가로 입증하기 위하여 여러 시험을 수행하였다.
1) 아밀라제 시험
실시예 1에서 얻은 균주를, 탄소원으로 1% 전분 및 50 mM 글루코스를 포함하는 최소 배지 (상기) 상에서 생장시켰다. 상기 조건 하에서, 아밀라제가 글루코스에 의해 억제되는 야생형 균주는 KI 용액으로 염색할 경우 할로를 생성하지 않는다. 이와는 반대로, creA 돌연변이체는 할로를 생성하는데, 이는 아밀라제 발현이 더이상 글루코스에 의해 억제되지 않기 때문이다. 실시예 1에서 단리한 모든 3개의 콜로니는 할로를 생성하였다.
2) 아세트아미다제 시험
균주에 있어서 탄소원으로 아세트아미드 및 글루코스를 포함하는 최소 배지 (상기) 상에서 생장시킬 경우의 아세트아미다제 활성을 또한 분석하였다. 상기 조건 하에서 야생형 균주는 아세트아미다제 활성을 생성하지 않는 반면, creA 돌연변이체는 아세트아미다제 활성을 생성한다.
3) 할로 생성
1% 탈지유 및 50 mM 글루코스를 포함하는 최소 배지 플레이트 (처음에는 불투명한 외관의 플레이트) 상에서, creA 돌연변이체는 30℃에서의 2일 후에 할로를 나타내는 반면, 야생형 균주는 그러하지 않다.

Claims (10)

  1. 아스페르길루스 (Aspergillus), 리조푸스 (Rhizopus), 무코르 (Mucor) 또는 페니실륨 (Penicillium) 속에 속하며, 단백질 분해 활성이 탄소에 의해 억제되지 않는 것을 특징으로 하는 국균 (koji mold).
  2. 제1항에 있어서, creA 유전자가 그의 고유 기능을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 국균.
  3. 제2항에 있어서, creA 유전자가 기능성 폴리펩티드로 번역될 수 있는 mRNA로 전사되지 않는 것을 특징으로 하는 국균.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, creA 유전자가, 그의 유전자 산물이 본질적으로 비기능성이 되도록 돌연변이된 것을 특징으로 하는 국균.
  5. 제1항에 있어서, creA 유전자가 결실된 것을 특징으로 하는 국균.
  6. 제1항에 있어서, 미생물 수탁번호가 I-2165 (NF14)인 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae)인 것을 특징으로 하는 국균.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, areA 유전자 또는 그의 기능성 유도체가 과다발현되는 것을 특징으로 하는 국균.
  8. 단백질 분해 효소의 제조 방법에 있어서, 탄소원의 존재 하에서, 국균이 단백질 분해 효소를 발현하는 조건 하에, 적합한 생장 배지에서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 국균을 배양하고, 임의로 농축물의 형태로 효소를 단리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 단백질 포함 원료의 가수분해를 위한 제1항 내지 제7항에 따른 국균의 용도.
  10. 프롤리다제 활성을 제공하는 효소 및/또는 미생물과 조합된 제8항에 따른 용도.
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