KR20010108231A - 화합물 - Google Patents

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KR20010108231A
KR20010108231A KR1020017010487A KR20017010487A KR20010108231A KR 20010108231 A KR20010108231 A KR 20010108231A KR 1020017010487 A KR1020017010487 A KR 1020017010487A KR 20017010487 A KR20017010487 A KR 20017010487A KR 20010108231 A KR20010108231 A KR 20010108231A
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비다르 모엔
롤프 올라프 라르젠
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게이르 사그볼덴
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Abstract

본 발명은 항암제, 항바이러스제, 항박테리아제, 면역강화제 및/또는 증가된 세포 증식에 기인한 질병 및/또는 자가면역 질환과 싸우기 위해 사용되는 약제로서 유용한 벤즈알데히드 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 화합물의 일부는 그 자체로서 신규하다.

Description

화합물{CHEMICAL COMPOUNDS}
현재 사용되는 대부분의 항암제는 이들의 작용에 세포독성이 있다. 이들 항암제가 림프종, 백혈병 및 고환종양과 같은 몇몇 암의 치료에 우수한 결과를 보였지만, 효과적 치료 가능성을 제한하는 심각하고 허용될 수 없는 부작용을 수반한다. 더우기, 고형 종양(암종)과 같은 몇몇 암의 유형에서, 화학요법은 지금까지 기존의 세포증식억제성 약물이 좀처럼 환자에 대한 예후를 개선시키지 못하였기 때문에 가치가 제약되는 것으로 입증되었다. 세포독성 생성물에 대한 내성을 전개시키는 암 세포의 능력은 또한 고형 종양의 치료에 사용할 수 없게 하는 주요 이유이다. 따라서, 부작용을 덜 가지며 악성 세포에 대해 보다 선택적인 작용을 가지는 새로운 항암제가 크게 요구되는 실정이다.
EP-0215395, JP-63264411, JP-8800940, JP-55069510 및 EP-0283139로부터 벤즈알데히드 및 이의 유도체가 선택적인 항암 효과를 나타내는 것이 공지되어 있다.
알데히드는 히드록시기, 술프히드릴기 및 아미노기와 같은 O, S 또는 N 친핵성 실체와 반응하여 아세탈, 메르캅탈, 아미날 등과 같은 카르보닐 축합물을 형성한다. 그러나, 1차 아민의 경우, 상기 반응은 쉬프 염기(Schiff's base)(이민) 형태의 부가물 형성을 수반한다. 생체내 쉬프 염기 형성은 트랜스아민화, 데카르복실화 및 피리독살 포스페이트에 의해 매개된 다른 아미노산 개질 반응과 같은 주요 생화학 공정, 해당작용에서 프룩토스 디-포스페이트에 대한 알돌라스의 작용 및 시각 공정에서 레티날의 로돕신과의 축합화에 관여하는 것으로 널리 공지되어 있다. 또한, 카르보닐 축합 반응은 예를 들어 면역 반응을 일으키는데 있어서 경막 신호화에 관여하는 것으로 공지되어 있다.
이민의 형성은 2 단계 메카니즘을 통해 진행한다: 아미노 친핵기를 카르보닐 기에 첨가하여 카르비놀아민(아미노히드린) 중간체를 형성한 다음 탈수 단계에 의해 C=N 이중 결합을 생성시킨다. 두 단계는 가역적이나 상이한 pH 값에서 촉진된다. 이에 따라 반응은 최고 전반적 반응율이 중간 산성도에서 발견되면서 특징적인 종형 pH/반응율 프로파일에 따라 일어난다:
그러나, 쉬프 염기의 형성은 또한 생리적 조건 하서도 용이하게 일어나는 것으로 알려져 있으며, 생체내 많은 카르보닐 축합 반응이 공지되어 있다[참조: E.Schauenstein et. al., Aldehydes in biological systems. London, Pion Ltd. 1977].
쉬프 염기는 그 자체로 반응성 종이 되는 경향이 있으며 이중 결합에 친핵성 제의 첨가를 초래하는 추가 반응을 일으키기 쉽다. 특정 황 함유 아민, 특히 아미노산 시스테인 및 메티오닌의 경우 및 글루타티온의 경우, 초기 형성된 쉬프 염기는 가역적 내부 고리화를 진행하여 술프히드릴기가 아민에 첨가되어 티아졸리딘 카르복실레이트를 형성할 수 있다[참조: M. Friedaman, The chemistry and biochemistry of the sulfhydryl group in amino acids, peptides and proteins, Oxford, Pergamon Press, 1973].
카르보닐 화합물과 단백질의 유리 아미노기 간의 반응으로 가역적 쉬프 염기 결합을 형성한다는 증거는 지.이. 민스(G.E. Means)와 알. 이. 피네이(R.E. Feeney)에 의해 보고되었다[참조: Chemical Modification of Proteins, pp. 125-138, San Francisco, Holden-Day, 1971]. 방향족 알데히드는 일반적으로 포화된 지방족 알데히드보다 반응성이 크며, 쉬프 염기는 반응 동안에 형성된 물을 제거하지 않아 형성될 수 있다[참조: R.W. Layer Chem. Rev. 63(1963), 489-510]. 이러한 사실은 생리적 조건하에서 쉬프 염기의 형성이 고려되는 경우에 중요하다. 아미노산 공급원으로 헤모글로빈을 사용하는 것(Zaugg et. al., J. Biol. Chem. 252(1977))은 방향족 알데히드가 쉬프 염기 형성에 있어서 지방족 알데히드보다 2- 내지 3배의 증가된 방향을 가짐을 보여주었다. 알카날의 제한된 반응성에 대한 설명은, 중성 pH의 수용액에서 쉬프 염기 형성에 유리하게 평형을 이동시키는데는 매우 과량의 유리 알데히드가 요구된다는 사실이 보여준다[참조: E. Schauenstein et. al., Aldehydes in biological systems. London, Pion Ltd. 1977].
벤즈알데히드 및 살리실알데히드는 즉시 막 아미노기를 가진 쉬프(Schiff) 염기 이민을 형성하고, 고 평형 상수가 아민과 반응하는 벤즈알데히드에 대하여 측정되었다[참고문헌: J. J. Pesek and J. H. Frost, Org. Magnet. Res. 8 (1976), 173-176; J. N. Williams Jr. and R. M. Jacobs Biochim Biophys Acta. 154, (1968) 323-331]. 살리실알데히드의 경우, 이민은 이민 질소의 긴 전자쌍과 오르토 위치의 히드록실기 사이의 수소 결합 때문에 여분의 안정화를 이룰 수 있다[참고문헌: G. E. Means and R. E. Feeney, Chemical Modification of Poteins, pp. 125-138, San Francisco, Holden-Day, 1971; J. M. Dornish and E. O. Pettersen Biochem. Pharmac. 39 (1990), 309-318].
본 발명자들은 이미 벤즈알데히드가 세포에 유입되지 않으나 세포막에 부착한다는 사실을 방사선 표지화 이미지에 의해 나타냈다[참조: Dornish, J.M. and Pettersen, E.O.: Cancer Letters 29(1985) 235-243]. 이는 벤즈알데히드가 대장균의 막 단백질과 상호작용함을 보여주는 이전의 연구에 일치한다[참조: K.Sakaguchi et. al. Agric. Biol. Chem., (1979), 43, 1775-1777]. 또한, 피리독살 및 피리독살-5-포스페이트 둘 모두는 세포독성 항암제 시스-DDP에 대해 세포를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 시스-DDP는 세포내 핵에서 그의 작용을 발휘한다. 피리독살이 원칙적으로는 친유성 세포막을 침투할 수 있지만, 이러한 가능성은 피리독살-5-포스페이트 상의 이온 포스페이트 기로 인해 피리독살-5-포스페이트에 대해 차단된다. 이에 따라, 피리독살-5-포스페이트는 세포막 밖으로부터 작용하므로써 그의 보호 효과를 발휘해야 한다. 동시에 관찰된 보다 낮은 파장에 대한 피리독살-5-포스페이티의 흡광도에서의 스펙트럼 이동은 알데히드와 세포막 아미노기 간의 쉬프 염기 부가물 형성과 일치한다[참조: M. Dornish and E.O. Petterssen, Cancer Lett. 29 (1985), 235-243].
이러한 발견은 알데히드가 세포 막에서 아민 및 그 밖의 친핵성 실체와 결합하여 쉬프 염기 및 그 밖의 축합물을 형성함을 시사한다. 세포 성장의 자극은 세포 막 밖으로부터 작용하는 이벤트(event)의 캐스케이트(cascade)에 의해 매개되는 것으로 공지되어 있다. 동일한 방식으로, 본 출원의 유도체는 단백질 합성 및 유사분열과 같은 세포 성장 매개변수 및 종양 억제 유전자 및 면역 반응의 발현에 중요한 세포 내부의 임펄스(impulses)를 일으키는, 세포막 상에서 리간드를 사용하여 부가물을 형성시키므로써 작용할 수 있다. 축합 반응은 가역적이기 때문에, 세포 효과는 종을 연결시키는 것과 관련된 평형에서의 이동 결과로서 변형될 수 있다. 화학적 수준에서 동적 평형의 존재는 벤즈알데히드 유도체로 관찰된 작용의 가역적 및 비독성 방식과 일치한다.
벤즈알데히드 유도체에 의해 발휘되는 단백질 합성의 억제는 본 발명자들의연구진에 의해 시험관내에서 매우 잘 연구되었다. 고형 종양에서, 감소된 단백질 합성은 세포 치사를 일으키는 생체 단백질의 결핍을 초래할 수 있다. 정상 세포에서는, 고형 종양의 대부분의 암 세포에서보다 높은 단백질 합성을 위한 잠재력이 존재한다. 이는 종종 10시간 미만인 정상 간 세포에서 세포 주기 기간의 비교에 의해 입증되는데, 이에 따라 일반적으로 30-150시간인 고형 종양의 대부분의 암세포의 세포 주기 시간보다 짧다[참조: Gustavo and Pileri in:The Cell Cycle and Cancer.Ed.: Baserga, Marcel Dekker Inc., N. Y. 1971, p99]. 평균적으로, 세포는 세포 주기 동안에 그의 단백질을 2배되게 하는데, 이는 단백질 축적이 암세포의 대부분의 유형에서보다 성장 자극된 정상 세포에서 보다 크다는 것을 의미한다.
정상 세포와 암세포 간의 이러한 차이를 염두에 두면, 또 다른 차이가 나는 유사한 중요성이 있다. 즉, 정상 세포는 성장 조절 자극에 반응하는 반면, 암 세포는 이러한 반응이 감소되거나, 이러한 반응을 전혀 가지지 않는다. 따라서, 보통 성장 조건 하에서 정상 세포가 예비 성장 잠재력을 가질 수 있는 반면, 암 세포는 이러한 예비 성장 잠재력이 거의 없거나 전혀 가질 수 없다. 단백질 합성 억제가 암 세포 뿐만 아니라 정상 세포에 대해 오랜 기간 동안 지속적으로 부과되는 경우, 두가지 상이한 유형의 세포가 다르게 반응할 수 있다. 정상 조직은 예비 성장 잠재력의 일부를 사용할 수 있고, 이로써 정상 세포 생성을 유지한다. 그러나, 암 조직은 이러한 예비 성장 잠재력을 거의 가지지 않거나 전혀 가지지 않는다. 동시에 이러한 대부분 암 세포에서의 단백질 축적율은 다소 낮다(즉, 단백질 합성율이 단백질 분해율보다 단지 약간 크다). 그러므로, 단백질 합성 억제는 종양 조직에단백질 축적에 대해 불균형이 이루어지기에 충분할 수 있어서, 이 결과 특정 단백질에 음가(negative balance)를 제공한다. 수일 동안의 지속적인 치료 동안, 이는 정상 조직은 해를 입지 않으면서 종양 조직에는 세포 불활성 및 괴사를 초래할 것이다.
지금까지, 가역적 단백질 합성 억제를 유도하며 항암 활성을 나타내는 가장 많이 시험된 화합물을 5,6-벤질리덴-d1-아스코르브산[질라스코르브(zilascorb)(2H)]이다. 이러한 종래 기술 화합물의 단백질 합성 억제 활성은 페터슨(Pettersen) 등에 의해 상세히 기술되어 있다[참조: Anticancer Res., vol. 11, pp. 1077-1082, 1991 and EP-0283139]. 질라스코르브(2H)는 누드 생쥐에서 사람 종양 이종이식편에서 생체내 종양 괴사를 유도한다[참조: Pettersen et. al., Br. J. Cancer, vol. 67, pp. 650-656, 1993]. 질라스코르브(2H) 이외에, 암 치료와 관련된 가장 최근 종래 화합물은 4,6-O-벤질리덴-D-글루코피라노스(화합물 1)이다. 이들 두가지 화합물은 일반적인 항암 활성을 지니는 것으로 공지되어 있으며, 수 많은 암 질병에 대해 임상 시험되어 왔다. 그러나, 이들 화합물의 치료에 보다 적합한 것으로 특정한 암에 걸린 기관 또는 조직은 전혀 제시되어 있지 않으며, 상업적 개발이 정당화되지 않았다.
본 발명자들은 놀랍게도 헥소스(hexose) 타입 당의 벤즈알데히드 유도체가(4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-글루코피라노스, 화합물 2를 포함하는) 특정 기관또는 조직에서 암에 대해 예상치 못한 강력한 효과를 미침을 밝혀냈다. 본 발명자들은 아직은 이러한 선택성에 대한 메카니즘을 설명할 수 없지만, 이는 특정 세포 또는 조직에 대한 상기 유도체의 당 부분의 친화성과 관련된 것으로 여겨진다.
우리의 신규한 생성물의 일부 예를 들어, 화합물 8 (2-아세트아미도-4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-데옥시-D-글루코피라노제)가 누드 생쥐 모델에서 뜻밖의 양호한 효과를 나타낸다(실시예 3, 표 1 참조)는 것을 발견하였다. 8마리 생쥐 중 3마리는 종양이 없었고, 이것은 면역억제 종에 대한 유사 실험에서 특이한 결과이다. 이러한 효과의 이유는 아세트아미도 부분이 히알루론산 수용체에 매우 친화력이 높기 때문일 수 있다. 악성 종양은 히알루론산 상에서 풍부하고, 그리하여 대응 수용체 상에서 풍부하다.
또한, 본 발명자들은 이들 화합물의 중수소 처리된 유사체가 상응하는 양성자 유사체보다 실질적으로 보다 효과적임을 실험에서 발견하였다. 효과에서의 이러한 차이는 세포 점착에 대한 본 발명자들의 실험에서 매우 두드러진다(실시예 3 및 실시예 7 참조). 수소 원자가 중수소 동위체로서 두번 치환되는 경우, 분자의 반응속도론적 특성은, C-H 결합을 끊는 것과 비교하여 C-D 결합을 끊는데 있어서 속도가 낮기 때문에 변경된다. 엠. 아이. 블레이크(M.I. Blake) 등의 문헌(J. Pharm. Sci. 64(1975), 367-391)으로부터 약물의 중수소 처리가 이들의 약물학적 기능을 변경시킬 수 있음이 공지되어 있다.
또한, 당해 기술(EP 0 283 139 및 Anticancer Res. 15: 1921-1928(1995))에는 4,6-O-벤질리덴-D-글루코피라노스에서 아세탈 양성자가 중수소로 치환되는 경우(화합물 1 대 화합물 2), 이는 시험관내 측정된 세포 생존률 및 단백질 합성 둘 모두에 영향을 미칠 수 있다. 화학적 수준에서 D-동위체 효과에 대한 한 가지 가능한 설명은 중수소 처리된 벤즈알데히드의 불활성 벤조산으로의 보다 느린 산화와 관련되며, 이로써 세포 수준에서 중수소 처리된 활성 성분의 반감기가 보다 길게 된다고 여겨진다. 그러나, 화합물 1 대 화합물에 대해 노출된 NHIK 3025 세포의 생존률에서의 큰 차이를 입증하기 위해, 6mM 초과의 약물 농도가 적용되어야 한다. 단백질 합성 억제의 차이는, 이들 세포가 1-10mM 농도로 노출되는 경우에는 매우 작다.
이제 본 발명자들은 완전히 상이한 유형의 실험을 수행하였다: NHIK 3025 세포와 기층 사이의 점착력을 화합물 1 및 2의 용액 중에서 세포를 예비 인큐베이션시킨 후에 측정하였다(실시예 5 참조). 1mM 농도에서도, 놀라운 D-동위체 효과가 나타났다. 놀랍게도, 화합물 2는 대조군에 비해 1/3로 점착력이 상당히 감소한 반면, 화합물 1은 상당히 감소하지 않았다. 본 발명자들은 화합물 2가 인테그린(integrins)의 생합성을 방해하여 세포가 기층에 부착하는 능력을 감소시키는 것으로 여긴다. 인테그린은 세포를 세포외 매트릭에 결합시키는데와 세포-세포 상호작용에 중요한 구조적 경막(trans-membrane) 단백질이다. 따라서, 인테그린의 기능 억제는 암 세포의 전이능에 직접 영향을 미칠 수 있다. 이 실험은 인테그린이 단백질 합성 억제에 특별히 민감할 수 있음을 시사한다. 따라서, 화합물 2는 암 발병에서 전이 과정을 억제하는데 사용될 수 있다.
화학적으로 유도된 발암작용은 B형 및 C형 간염, 특정 유두종 바이러스, 특정 포진 바이러스 등과 같은 특정 바이러스 타입에 의해 유도된 발암 작용과 같은 유사한 메카니즘을 갖는다. 특히, 이는 B형 및 C형 간염 감염된 환자의 간암 발병의 경우일 것이다. 그러므로, 본 발명의 생성물로 이들 환자를 예방적으로 치료하는 것이 간암의 발병을 예방하거나 지연시킬 수 있음을 가정할 수 있다. 또한, 이들 생성물이 낮은 독성 프로파일을 나타낸다는 사실이 이러한 치료에 적합하게 한다.
영국특허출원 제9026080.3호로부터 일찌기 항암제로서 알려진 벤즈알데히드 화합물이 비정상적으로 증가된 세포 증식에 기인한 질환과 대항하기 위하여 사용됨이 공지되었다. 또한, 그러한 화합물은 비정상적으로 증가된 세포 증식 속도를 가진 세포에 효과가 있으며, 따라서 화합물은 건선, 염증성 질환, 류마티스성 질환 및 궤양성 대장염 및 크론병(Morbus Crohn)과 같은 기타 자가 면역 이상과 같은 질환 및 알레르기 피부 반응의 치료에 사용될 수 있다.
건선과 같은 피부 이상은 종종 급속한 피부 교체에 특성이 있다. 정상 피부가 약 27,000개의 세포로 구성된 피부에서 약 1250 새로운 세포/일/cm2을 생산하는 반면, 건선 피부는 52,000개의 세포 중 35,000 새로운 세포/일/cm2을 생산한다. 그러나, 이러한 질환에 관련된 세포는 세포 분할에 의해 빠르고 반복적으로 재생된 "정상" 세포이다. 정상 피부 세포의 소생은 약 311시간이 걸리는 반면, 이러한 과정은 건선 피부에 대해 약 10 내지 36시간이 걸리게 가속된다.
오늘날, 건선, 염증성 질환, 류마티스성 질환 및 기타 자가 면역 이상은 코르티코스테로이드, NSAIDs로 치료되며, 심한 경우에는 세포증식억제제 및 사이클로스포린과 같은 면역억제제로 치료된다. 따라서, 부작용을 적게 나타내는 생성물에 대한 요구가 크다.
방향족 알데히드 및 그들의 특정 아세탈 유도체는 본래 가역적인 인체 세포에 대해 성장 억제 효과를 갖는 것으로 공지되어 있다. 이러한 화합물에 의해 유도된 성장 억제는 주로 세포에 의한 단백질 합성의 감소에 기인한다[참고문헌: Pettersen et al., Eur. J. Clin., Oncol., vol. 19, pp. 935-940, 1983 and Cancer Res., vol. 45, pp. 2085-2091, 1985]. 단백질 합성의 억제는 이러한 약제가 세포의 미세환경내에 존재하는 경우에만 효과적이다. 세포 단백질의 합성은 예를 들어, 약제를 세포로부터 제거함에 따라 신속하게(즉, 대게 1시간 내에) 정상 수준으로 복원된다.
이것은 정상 세포가 상기 화합물로 처리된 후에도 손상없이 존재하게 한다.
몇 년 동안 세포-접촉(점착) 의존 메카니즘을 통해 신호를 전달하는 세포의 능력이 연구되었다. 이러한 메카니즘은 림프구, 대식세포 등과 같은 유동 세포의 재활성에 특히 중요하고, 또한 새로운 종양을 생성하기 위하여 조직에 정착하는 전이성 세포에 대하여 특히 중요하다. 면역 또는 염증성 반응을 주시하는 세포의 점착 특성을 변경시키는 능력은 류마티즘성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 홍반성 루프스, 좌창, 베흐테루 관절염, 진행성 전신성 경화증(PSS), 지루 및 궤양성 대장염 및 크론병과 같은 기타 자가 면역 이상과 같은 많은 질환의 치료에 중요한 가치가있다.
면역 체계는 박테리아-, 바이러스-, 원생동물성 감염, 또는 암과 같은 비정상 세포에 기원하는 비-자체성으로 인식되는 임의의 물질을 확인하여 제거하도록 주의 깊게 설계되어 있다. 침입자로 표현되는 광범위한 생물성 변형체에 특이 반응을 제공하고자, 면역 체계는 고도로 분화되어야 한다. 그러나, 이러한 미세하게 조절된 시스템의 과도한 자극은 다양한 알레르기성 및 염증성을 일으키고, 자가-면역 질환을 초래한다. 또한, 유익한 이식에 대한 거부는 극복하기 어렵다. 그러므로, 특이 반응을 상향-조정 또는 하향-조정함으로써 면역 체계를 조절하는 것은 커다란 치료학적 도전이다.
면역학적 인식 과정에서, 외래 단백질의 단편은 항원 발현 세포(APC)의 표면상에서 Ⅱ류 MHC 단백질의 홈에 포획된다. 또한, T 보조 세포의 수용체가 상기 MHC-항체 복합체에 부착된다. T 보조 세포를 활성화 하기 위하여, 2개 이상의 신호가 제공되어야 한다: 제 1신호는 Ⅱ류 MHC 복합체를 통하여 항원 자체에 의해 중계되고, CD4 공수용체에 의해 증폭된다. 제 2신호는 APC 표면상의 특이 플라즈마막 결합 신호 분자에 의해 제공될 수 있다. 공수용체 단백질의 매칭(maching)은 T 보조 세포의 표면상에 위치된다. 모든 신호는 T 세포가 활성되는 데 필요하다. 활성되면, 그들은 인터루킨 성장 인자를 분비하고 매칭 세포-표면 수용체를 합성하여 자신의 증식을 자극할 것이다. 그 후, 인터루킨의 이러한 수용체로의 결합은 직접적으로 T 세포가 증식하도록 자극한다.
1980년대, 시클로덱스트린 벤즈 알데히드 함유 복합체가 생쥐 모델내의 림포킨 활성 살해세포의 증가로 면역 체계를 자극한하는 것이 인식되었다[참고문헌: Y. Kuroki et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117, (1991), 109-114]. 연구에 의해 제 2 공-자극 신호를 담당하는 APC-공여체/T-세포 수용체 상호작용 위치에서 화학 반응의 성질이 규명되었고, 이것은 카르보닐-아미노 축합의 형태를 취하였다(쉬프 염기 형성). 더욱이, 이러한 상호작용은 합성 화학 존재물에 의해 모방될 수 있다. 이러한 발견은 면역 체계를 인공적으로 유효하게 하는 새로운 치료학적 기회를 위해 공개되었다. WO 94/07479에서, T-세포 표면 아미노기를 가진 쉬프 염기 및 히드라존을 형성하는 특정 알데히드 및 케톤의 사용이 청구되었다. EP 0609606 A1에서, 바람직한 면역 자극 물질은 4-(2-포르밀-3-히드록시페녹시메틸)벤조산 (투카레솔)이고, 화합물은 원래 겸상적혈구성 빈혈을 치료하기 위해 고안된 것이다. 이 화합물은 구강 투여되고, 전신성 생물이용성이다. 박테리아, 바이러스, 및 원생동물성 감염을 포함하는 많은 질환, 자가-면역 관련 질병 및 암의 치료에 있어서 투카레솔의 가능성은 현재 조사 중이고[참고문헌: H. Chen and J. Rhodes, J. Mol. Med (1996) 74:497-504], 투카레솔이 만성 B형 간염, HIV 및 악성 흑색종을 치료하기 위한 백신과 함께 투여되는 조합 전략이 현재 개발 중이다.
생체 밖에서 면역 매개변수를 측정하고 생체 내의 효과를 평가함으로써, 종상 투여량/반응 프로파일이 규명되었다[참고문헌: H. Chen and J. Rhodes, J. Mol. Med (1996) 74:497-504]. 그렇지 않다면, 알데히드 약물의 고 농도에서 APC를 T-세포에 효과적으로 결합시키기 위한 공-자극 리간드를 포화시킬 것이고 그리하여 억제 작용을 할 것이라고 가정함으로써 다소 특이한 투여량/반응 관계가 정당화 될수 있을 것이다. 세포간 결찰을 방해하지 않으면서 공-자극을 제공하는 기능성 평형을 획득하기에 충분한 투여량이 최적일 것 같다.
일반적으로, 알데히드는 본래 산화에 대해 불안정하다. EP-0609606에 개시된 4-(2-포르밀-3-히드록시페녹시메틸)벤조산 (투카레솔)은 생체 밖에서 보다 생체 내에서 보다 효험이 있다. 이것은 생체 밖의 수용액내에서의 약물의 산화에 대한 민감성에 기인한다[참고문헌: H. Chen and J. Rhodes, J. Mol. Med (1996) 74:497-504]. 많은 알데히드는 그와 같이 투여되기에는 지나치게 반응성이고, 심지어 활성 항암 약물로 증명된 벤즈알데히드도 생체 내에서 직접 이용하기에 매우 자극적이고 불안정하다. 생물 시스템에서, 알데히드 카르보닐기는 전체 신체 유체내에 주로 존재하는 친핵성 존재와 급속하게 반응할 것이다. 이러한 원하지 않는 부반응은 빠른 약물 대사로 이르고 활성 약물의 혈청 수준을 제어하기 어렵게 된다. 세포 수준에서 협소한 농도대 내에서 약물을 제어하는 것은 효과적인 면역 효능을 얻기 위해 중요하다. 투카레솔은 비보호 알데히드로서 경구 투여되고, 혹자는 약물 저하 및 약물생체반응학의 제어의 어려움을 추정할 수 있다.
벤즈알데히드 유도체 4,6-벤질리덴-D-글루코스 및 중수소 처리된 유사체(화합물 1 및 2)는 정맥내 투여되거나 per oz. 투여되는 높은 생체이용율을 지니는 것으로 밝혀졌다. 화합물 2의 BALB 생쥐로의 경구 투여 후에, 혈청 수준으로서 측정된 생체이용율은 93-99%였다[참조: C.B. Dunsaed, J.M. Dornish and E.O. Petterson, Cancer Chemother. Pharmacol. (1995) 35: 464-470]. 또한, 글루코스 부분은 세포 표면에 존재하는 리셉터에 대해 친화성을 지닐 수 있으므로써, 세포수준에서 약물 이용성을 향상시킨다. 유리 알데히드는 아세탈의 가수분해에 의해 쉽게 방출될 수 있어 표적 리간드에서 쉬프 염기 형성에 이용할 수 있는 카르보닐기를 형성한다.
본 발명에서, 알데히드는 글루코스, 갈락토스 및 기타와 같은 생물학적으로 허용되는 탄수화물로 유도체화되어 아세탈을 형성한다. 이에 따라, 당 부분은 표적 세포에 대한 알데히드 작용기의 안정성을 개선시키 생체이용율을 증진시키는데 기여할 것이다. 이는 놀랍게도 이전에 공지된 화합물과 비교하여 본 발명의 화합물을 사용하므로써 보다 효과적인 카르보닐 축합 반응을 유도하고, 보다 쉽게 조절가능한 약물동력학을 유도한다.
화합물 2를 투카레졸과 비교하기 위해, 세포 불활성 및 단백질 합성 억제를 동일한 농도의 두 약물의 존재하에서 측정하였다. 도 4 및 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 화합물 2가 측정된 매개변수 둘 모두에 대해 투카레졸보다 효과적인 것으로 나타났다.
상기 화합물들의 면역 자극 효과는 또한 항바이러스제 또는 백신과 같은 다른 항바이러스 치료제와 조합하여 특정 바이러스 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 많은 바이러스 유형이 일차 감염 후에 세포 핵과 결합하여 오랜 시간 동안 불활성이 된다. B형 및 C형 간염, 특정 레트로 바이러스 및 특정 유두종 바이러스와 같은 종양성 바이러스는 암의 발병을 유발할 수 있다. 이러한 잠복기에, 바이러스 감염을 치료하는 것은 매우 어렵다. 이러한 바이러스들은 면역 반응에 의해 야기되어 바이러스혈증을 유발시킬 수 있으며, 이러한 단계에서는 바이러스 감염을 없을 수 있다. 면역 반응을 일으키는 벤즈알데히드 유도체의 능력은 항바이러스제 또는 백신과 함께 사용되어 이러한 질병의 치료법을 개발할 수 있다.
본 발명은 항암제, 항바이러스제, 항박테리아제, 면역강화제 및/또는 증가된 세포 증식에 기인한 질병 및/또는 자가면역 질환과 싸우기 위해 사용되는 약제로서 유용한 벤즈알데히드 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 화합물의 일부는 그 자체로서 신규하다.
도 1: 데이타는 NHIK 3025-세포가 플라스틱 페트리 접시에 부착되어서 37℃에서 20시간 동안 화합물 8 (○) 또는 화합물 9 (●)로 처리된 실험을 나타낸다. 생존 분율은 치료 후에 거시적 군락을 형성할 수 있는 세포의 분율이다. 표준 오차는 기호의 크기보다 작다.
도 2: 데이타는 NHIK 3025-세포가 플라스틱 페트리 접시에 부착되어서 37℃에서 20시간 동안 화합물 5 (○) 또는 화합물 7 (＊)로 처리된 실험을 나타낸다. 생존 분율은 치료 후에 거시적 군락을 형성할 수 있는 세포의 분율이다. 각 점은 5개의 평행 접시로부터의 군락 수의 평균값을 나타낸다. 수직 기둥은 표준 오차를 나타내고 기호의 크기를 초과하는 경우에 나타내었다.
도 3: 데이타는 NHIK 3025-세포가 플라스틱 페트리 접시에 부착되어서 37℃에서 20시간 동안 화합물 12 (■)로 처리된 실험을 나타낸다. 생존 분율은 치료 후에 거시적 군락을 형성할 수 있는 세포의 분율이다. 각 점은 5개의 평행 접시로부터의 군락 수의 평균값을 나타낸다. 수직 기둥은 표준 오차를 나타내고 기호의 크기를 초과하는 경우에 나타내었다.
도 4: 데이타는 NHIK 3025-세포가 플라스틱 페트리 접시에 부착되어서 37℃에서 20시간 동안 화합물 2 (△) 또는 투카레솔(●)로 처리된 실험을 나타낸다. 생존 분율은 치료 후에 거시적 군락을 형성할 수 있는 세포의 분율이다. 각 점은 5개의 평행 접시로부터의 군락 수의 평균값을 나타낸다. 표준 오차가 기호의 크기를 초과하는 경우에 나타내었다.
도 5: 처리되지 않은 대조군에 대한 37℃에서 1시간 동안 화합물 2 (■) 또는 투카레솔(▲)로 처리된 NHIK 3025-세포의 단백질 합성 속도. 단백질 합성 속도는 약물 치료 시작 후 최초 1시간 동안 혼입된 [3H]-발린의 양에 의해 측정되었다. 단백질 합성 속도는 세포내 단백질 총량에 대하여 측정되었다. 데이타는 4중으로 시행된 하나의 실험에 대한 대표값이다. 표준 오차는 기호의 크기를 초과하는 경우에 나타내었다.
도 6: 누드 생쥐에 이식된 종양계 SK-OV-3 난소 암종 이종이식편의 평균 종양 성장 곡선이 도시되었다. 생쥐는 매일 정맥주사를 통해 1mg/kg의 화합물 8(▼) 및 7.5 mg/kg의 화합물 8(▲)로 처리하였다. 대조군(■)은 0.9% NaCl을 투여하였다. 각 데이타 점은 제 1일의 종양 부피와 관련한 4 내지 5마리 생쥐의 평균 종양 부피를 나타낸다. 수직 기둥은 표준 오차를 나타낸다.
도 7-12는 하기 3개 집단의 각 개체로부터 SK-OV-3 종양의 형태학적 외관을 나타낸다: 동물 중 위약 치료된 집단(도 7 및 도 8), 1 mg/kg/일로 화합물 8로 치료된 집단(도 9 및 도 10) 및 7.5 mg/kg/일로 치료된 집단(도 11 및 도 12). 종양은 포르말린내에서 고정하고, 파라핀내에 파묻고, 6mm 슬라이스로 베어내어 헤마톡실린 및 에오신으로 착색하였다. 배율은 40배이다.
도 13: 세포계 T-47D 흉부 암종의 평균 원형체 부피 성장 곡선이 도시되었다. 원형체는 매질 내에 용해된 0.1 mM의 화합물 8(▲) 및 1.0 mM의 화합물 8(▼)로 처리되었다. 대조군(■)은 배양액으로만 처리된다. 각 데이타 점은 6 내지 11개의 원형체의 평균 원형체 부피를 나타낸다. 수직 기둥은 표준 오차를 나타낸다.
도 14는 3가지 상이하게 처리된 NHIK 3025 세포 원형체의 단면에 대한 현미경 사진으로서, 한 가지는 대조군(A)이고, 한 가지는 0.1 mM의 화합물 8로 4일간 처리되며(B) 다른 한 가지는 1.0 mM의 화합물 8로 4일간 처리된다(C).
도 15-18: 데이타는 화합물 8로 처리된 후 핵내에 결합된 RB-단백질을 가진 경계 단계, G1, S 및 G2 각각의 경우에 핵의 분율을 나타낸다.
도 19-20: 대조군 세포에 대한 NHIK 3025 세포(도 19) 및 T-47D-세포(도 20)의 단백질 합성 속도. 각 점은 4개 병행 표본으로부터 측정된 평균값을 나타낸다. 표준 오차는 기호를 초과하는 경우 수직 기둥에 의해 나타내었다.
도 21: 상이한 벤즈알데히드 유도체에 노출된 세포에 대한 중간 점착력. 세포는 1 mM 농도의 화합물 1 및 화합물 2에 노출되었다.
도 22: Ex Vivo 10 배양액내의 주변 혈액 단일핵 세포 및 수퍼항원이 벤즈알데히드, 중수소화 벤즈알데히드, 화합물 2 또는 지라스코르브(2H)에 노출되었다. 주변 혈액 단일핵 세포의 증식이 상이한 약물 농도에서 삼중수소화 티미딘의 혼입으로 측정되었다.
도 23: NMRI 생쥐는 복강내로 비장 침입 프렌드 적백혈병 바이러스가 감염되었다. 감염된 그리고 비-감염된 생쥐가 복강내로 매일 5 mg/kg의 화합물 2 및 화합물 5로 처리되었다. 19일 동안의 치료 후, 비장을 절단하여 무게를 측정하였다.
도 24: 인체 결장직장 종양, C170HM2의 간 침입에 대한 화합물 1, 2 및 5의 효과를 나타내었다.
도 25: 화합물 1(○) 또는 화합물 13(●)으로 20시간 동안 치료된 후, 인체경부 암종 세포, NHIK 3025에 대한 군락 형성 능력으로 측정된 세포 생존율이 도시되었다.
도 26: 화합물 1(○) 또는 화합물 14(●)으로 20시간 동안 치료된 후, 인체 경부 암종 세포, NHIK 3025에 대한 군락 형성 능력으로 측정된 세포 생존율이 도시되었다.
도 27: 시험 화합물(단힌 기호)의 첨가 직후 시작하여 1시간 동안 또는 개시 2시간 후(열린 기호)에 시작하여 1시간 동안 혼입된 [3H]-발린의 양으로 측정된 화합물 1 또는 화합물 21로 처리된 인체 경부 암종 세포, NHIK 3025의 단백질 합성 속도.
도 28: 시험 화합물(단힌 기호)의 첨가 직후 시작하여 1시간 동안 또는 개시 2시간 후(열린 기호)에 시작하여 1시간 동안 혼입된 [3H]-발린의 양으로 측정된 화합물 2 또는 화합물 22로 처리된 인체 경부 암종 세포, NHIK 3025의 단백질 합성 속도.
도 29: 화합물 1(●) 또는 화합물 21(○)로 20시간 동안 치료된 후, 인체 경부 암종 세포, NHIK 3025에 대한 군락 형성 능력으로 측정된 세포 생존율이 도시되었다.
도 30: 화합물 2(○) 또는 화합물 22(▲)로 20시간 동안 치료된 후, 인체 경부 암종 세포, NHIK 3025에 대한 군락 형성 능력으로 측정된 세포 생존율이 도시되었다.
도 31: L-글루코오스(●) 또는 화합물 21(○)로 20시간 동안 치료된 후, 인체 흉부 암종 세포, T47-D에 대한 군락 형성 능력으로 측정된 세포 생존율이 도시되었다.
도 32: 식염수(열린 기둥 및 수평 줄무늬 기둥) 또는 오발부민(속이 찬 기둥 및 수직 줄무늬 기둥)으로 면역성이 검사되고, 용매 용액 또는 화합물 2로 처리된 오발부민 민감성 생쥐내에서 연무화된 메타콜린에 노출된 후 24시간 후의 임의의 반응성.
도 33: 용매 용액 또는 화합물 2로 처리된 오발부민 민감성 생쥐에 대한 기관지-폐포 유체내의 최종 식염수(열린 기둥) 또는 오발부민(속이 찬 기둥) 면역 시험 후 24시간 후 복원된 친핵성 세포의 수. 결과는 산술 평균 ±SEM (집단 별 n=9)으로 나타난다.
본 발명의 주 목적은 면역 체계에 관련된 암 및 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 신규한 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 바이러스, 박테리아, 균류 및 기타 미세 유기체에 의해 초래된 감염성 질환에 대항하는 가능성을 제공하는 면역 반응을 유효하게 할 수 있는 신규한 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 3의 목적은 독성있는 부작용을 제공하지 않으면서 면역 이상에 관련있는 암 및 질환의 예방 및 치료를 위한 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 4의 목적은 B형 또는 C형 간염이 감염된 사람에게서 간암의 진행을 방지하기 위한 예방적 치료를 위한 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 5의 목적은 대응 당 부분에 대하여 친화력을 가진 수용체를 가진 조직 및 세포내의 암의 효과적이고 우호적인 예방 및/또는 치료를 위한 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 6의 목적은 건선, 장염, 관절염, SLE, PSS 등과 같은 면역 체계과 관련된 질환의 치료를 위한 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 및 기타 목적은 청구항에 의해 달성된다.
본 발명의 화합물은 하기 화학식 (Ⅰ), 또는 그들의 약제학적으로 허용되는염을 갖는다:
여기에서, L은 H 또는 D이다;
Ar은 페닐 또는 1-3개 치환체를 가진 치환된 페닐이고, 여기에서 치환체는 동일하거나 상이하며, 1-20개 탄소원자를 가진 알킬, 3-6개 탄소원자를 가진 시클로알킬, 1-6개 탄소원자를 가진 플루오로알킬, 2-6개 탄소원자를 가진 알케닐, 2-6개 탄소원자를 가진 알키닐, 페닐, 할로겐, 니트로, 시아노, NH2, NHR1, N(R1)2, NHC(O)R1또는 N[C(O)R1]2(여기에서 R1는 동일하거나 상이하고, 1-20개 탄소원자를 가진 알킬, 1-6개 탄소원자를 가진 플루오로알킬이고), OR2또는 OC(O)R2(여기에서 R2는 H, D, 1-20개 탄소원자를 가진 알킬, 1-6개 탄소원자를 가진 플루오로알킬이며), SR2, CA(OR1)2또는 CA[OC(O)R1]2(여기에서 A는 H 또는 D이고), C(O)R2, COOR3(여기에서 R3는 H 또는 1-20개 탄소원자를 가진 알킬 또는 1-6개 탄소원자를 가진플루오로알킬이고), 또는 CON(R3)2(여기에서 R3는 동일하거나 상이하고)를 포함하는 기로부터 선택된다;
Y는 H, D, 1-20개 탄소원자를 가진 알킬, 3-6개 탄소원자를 가진 시클로알킬, 1-6개 탄소원자를 가진 플루오로알킬, 2-6개 탄소원자를 가진 알케닐, 2-6개 탄소원자를 가진 알키닐, 플루오로, 클로로, 니트로, OR2, OC(O)R2, SR2, NH2, NHR1, N(R1)2(여기에서 R1은 동일하거나 상이하며), NHC(O)R1또는 N[C(O)R1]2를 포함하는 원자 또는 기로부터 선택된다;
R은 H, D, 1-20개 탄소원자를 가진 알킬, 3-6개 탄소원자를 가진 시클로알킬, 1-6개 탄소원자를 가진 플루오로알킬, 2-6개 탄소원자를 가진 알케닐, 2-6개 탄소원자를 가진 알키닐이다.
화학식 (Ⅰ)에 따른 임의의 입체 이성질체가 본 발명에 포함된다는 것이 이해된다.
화합물 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 및 24(24-27쪽 표 참조)는 그 자체로 신규하다.
본 발명은 실시예 및 첨부된 도면 및 표에 의해 추가로 하기에 설명될 것이다.
제법
널리 공지되어 있는 바와 같이, 알데히드는 알코올과 산 촉진 축합반응을 진행하여 아세탈을 생성시킨다. 동시에 물이 보조 생성물로서 형성된다. 반응은 가역적이며, 용액으로 알데히드/알코올과 아세탈/물의 평형 혼합물이 형성된다. 평형 위치는 주로 반응성 및 각 종의 농도에 의해 측정될 것이다. 반응을 완료시키기 위해, 생성물 중 하나(아세탈 또는 물)가 일반적으로 반응 혼합물로부터 제거된다.
본원에서, 다양한 당, 디옥시당 및 아미노당을 알데히드 또는 알데히드 등가물과 축합하어 당-아세탈 유도체를 형성하였다. 재-아세탈화 방안이 특히 바람직하며, 여기에서 디메틸 아세탈로 되어 보호된 알데히드를 알데히드 자체 대신에 사용하였다. 그 다음, 메탄올이 공동 생성물로서 형성되었다. 반응 혼합물을 감압하에 적당히 가열하여 형성된 메탄올을 제거하였다. 대부분, 이러한 반응 조건은 아세탈에 유리한 평형에 부드럽게 이르게 된다.
당의 아세탈화는 일반적으로 레지오(regio)- 및 입체 이성질체의 혼합물로 귀결된다. 고리 수축 변형이 일어나서 피라노오스 및 푸라노오스의 혼합물이 되고, 몇몇 경우에는 2차 아세탈화 첨가생성물이 형성된다. 결과적으로, 보호 방안이 이용되지 않는다면, 매우 복잡한 반응 혼합물이 형성되게 된다. 그러나, 놀랍게도 하기 작업예를 따라, 특히 액체 크로마토그래피를 사용하여 순수한 생성물 분율이 준비될 수 있다. 생성물의 확인은 GC-MS-분광기의 사용 및 다양한 NMR 기술을 이용하여 수행되었다.
특이적 반응 조건, 용매 및 촉매는 실험자가 우선하는 사항에 따라서 변형될 수 있다. 촉매는 광산, 예컨대 황산, 유기산, 예컨대 파라-톨루엔 수폰산, 산성 이온 교환 수지, 예컨대, 암버얼리스트(Amberlyst) 15, 루이스산 점토 광물, 예컨대 몬트모릴로나이트(Montmorillonite) K-10 또는 수지 지지된 초강산, 예컨대 나피온(Nafion) NR 50일 수 있다. 이 반응은 디메틸 포름아미드, 디메틸 아세트아미드, 디메틸 술폭사이드, N-메틸 피롤리돈, 디메톡시에탄 등과 같은 쌍극성, 비양성자성 용매 중에서 수행될 수 있다. 디메틸 포름아미드중의 파라-톨루엔 술폰산이 바람직하며, 대부분의 반응 조건에 적용된다.
화학식 (Ⅰ)의 화합물(여기에서 L은 중수소임)이 상기와 같이 준비하였으나, 포르밀 위치에서 중수소화된 알데히드의 디메틸 아세탈에서 출발하였다. 중수소화벤즈알데히드의 준비는 EP 0 283 139 B1에 개시된 바와 같이 중수소화된 용매내에서 D2 기체를 사용하여 변형된 로젠먼드(Rosenmund) 환원반응에 의해 수행된다. 페닐 고리내에 치환체를 갖는 중수소화된 벤즈알데히드 유도체는 EP 0 493 883 A1 및 EP 0 552 880 A1에 주어진 실시예에 따라 준비된다.
하기 실시예는 본 발명의 화합물의 제조법을 예시한다.
화합물 1: 4,6-O-벤질리덴-D-글루코피라노스
상기 종래 기술의 화합물을 중수소 처리되지 않은 벤즈아렐히드 디메틸아세탈을 출발 물질로 하여 화합물 2에 대해 기술된 바와 같이 제조하였다. 실체를 DMSO-d6중에서1H NMR 분광법에 의해 확인하였다.
화합물 2: 4,6-O-(벤질리덴-d 1 )-D-글루코피라노스
벤즈알데히드-d1을 제조하고, EP 0 283 139 B1에 기술된 바와 같이 벤즈알데히드 디메틸아세탈-d1으로 전환시켰다. 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-글루코피라노스의 제법은 또한 EP 0 283 138 B1에 기술되어 있으나, 이 화합물을 이번에는 높은 순도를 달성하는데 우선하는 대안 절차에 따라 제조하였다.
D(+)-글루코스(706g, 3.92mol), 벤즈알데히드 디메틸아세탈-d1(571g, 3.73mol), 무수 DMF(1.68kg) 및 파라-톨루엔 술폰산(4.5g, 24mmol)을 냉각 환류 응축기를 통해 진공 펌프에 연결된 건조 증류 장치에서 혼합하였다. 기계적으로 교반된 혼합물을 30 토르에서 최대 69℃로 가온시켜 메탄올을 증류시키고, 2시간 후에 235g을 수집하였다. 이후, 환류 응축기를 중단시키고, DMF를 증발시키기 위해 온도를 최대 73℃로 증대시켰다. 2시간 후에, 1385g의 추가량을 수집하고, 증류를 중단하였다.
잔류물을 약 40℃로 냉각시키고, 얼음/물(2.9ℓ)를 5분내에 첨가하였다. 온도가 0℃ 미만으로 떨어져, 부분적으로 큰 덩어리로서 침전물이 형성되었다. 혼합물을 비이커에 옮기고, 덩어리가 분리되도록 추가의 8-9ℓ의 얼음/물을 첨가하여 현탁액을 형성하였다. 현탁액을 두개의 노치(notch)상에서 여과하고, 두개의 필터 케익을 연결된 물 분사 진공을 갖는 필터 상에서 밤새 방치시켰으며, 각각의 필터 케익은 역 깔대기(inverted funnel)를 통해 N2로 플러싱되었다. 필터 케익을 두개의 보드 상에 펼쳐놓고, 진공 오븐에서 20시간 동안 32℃에서 건조시켰다. 진공은 처음에는 13mbar에서 맞춰졌으며, 이후 1mbar로 내려 조정하였다.
미정제 생성물을 재결정화시키고(디-벤질리덴 아세탈을 제거하기 위해), 오염 물질이 제거될 때까지 물세척하였다(DMF 및 글루코스를 제거하기 위해). 따라서, 미정제 생성물(500g)을 고온 디옥산(800ml)에 용해시키고, 이 용액을 접힌 필터를 통해 비등하는 클로로포름(9ℓ)에 첨가하였다. 이 용액을 먼저 주위 온도로냉각시킨 후, 밤새 빙욕에서 냉각시켰다. 침전물을 여과시키고, 필터 상에 2시간 동안 건조시키고(전술된 바와 같이 N2로 플러싱), 추가로 회전 증발기에서 진공하에 31℃에서 밤새 건조시켰다. 생성물(142g)을 얼음/물(1ℓ)에 현탁시키고, 노치 상에서 여과시키고(200ml 얼음/물로 세척), 전술된 바와 같이 필터에서 밤새 건조시켰다. 이후, 분쇄하고 시이빙(0.5mm 격자 크기)하고, 회전 증발기에서 31℃에서 5시간 동안 진공하에 건조시켰다. 생성물(96g)을 다시 한번 얼음/물(500ml)에 현탁시키고, 여과시키고(150ml 얼음/물로 세척), 건조시켰다(N2플러시 하에 7시간). 끝으로, 막자사발에서 분쇄하고, 시이빙(0.5mm)하고, 진공 오븐에서 건조시켰다.
생성물은 HPLC로 분석한 결과, 고순도의 백색의 미세하게 분할된 분말이었다. 수율은 95g이고 이론치의 10%였다. DMSO-d6중의 NMR에서는 α대 β아노머비가 약 7:3인 것으로 나타났다.
화합물 3: 4,6-O-벤질리덴-D-글루코피라노오스
D(+) 갈락토오스(15g, 0.083 mol) 및 건조 DMF를 50℃에서 교반과 함께 증발 장치내에서 혼합하였다. 그렇게 형성된 현탁액에, 벤즈알데히드 디메틸아세탈 (12.2g, 0.083 mol) 및 파라-톨루엔 술폰산(0.14g)을 첨가하고, 워터 젯(water jet)으로 메탄올/DMF를 천천히 증발 제거하였다. 3시간 후에, 대부분의 갈락토오스가 소비되고, 잔류 DMF는 진공 펌프에 열결된 회전증발기 상에서 제거하였다. 잔류물은 매운 점성인 시럽을 형성하는 데, 메탄올/물 1:1로 용리된 로바(Lobar) C RP-8 칼럼상에서 정화하였다. 생성물 분획을 냉동 건조하였다.
TMS 유도체의 GC는 주로 2개의 이성질체로 구성된 생성물을 나타낸다.1H-,13C-, COSY-, DEPT- 및 C-H 연관 NMR 스펙트럼에 기초하여, 생성물은 표제 화합물의 α 및 β 아노머로서 확인되었다.
1H 및13C NMR(D2O), TMS에 대한 δ: 7.49-7.27(5H, m, Ar-H), 5.57(1H, s, 아세탈-H), 5.22(0.5H, d,H-1-α), 4.56(0.5H, d,H-1-β), 4.23+4.18(0.5H+0.5H, d+d,H-4-α+β), 4.14-3.98(2H, m,H-6-α+β), 3.94-3.79(1.5H, m,H-2-α,H-3-α 및H-5-α), 3.69-3.49(1.5H, m,H-2-β,H-3-β 및H-5-β); 137.422, 129.981, 128.902, 126.639 및 126.590(Ar-C), 101.325(아세탈-C), 96.540(C-1-β), 93.161(C-1-α), 76.581(C-4-α), 76.093(C-4-β), 71.889+71.802(C-2-β+C-3-β), 69.404(C-6-α), 69.182(C-6-β), 68.566+68.057(C-2-α+C-3-β), 66.759(C-5-β) 및 62.866(C-5-α).
화합물 4: 메틸 4,6-O-벤질리덴-α-D-만노피라노사이드
메틸-α-만노피라노사이드 (18.1g, 0.093 mol), 벤즈알데히드 디메틸아세탈 (21.0g, 0.138 mol) 및 건조 DMF(90 ml)를 50-55℃에서 교반과 함께 증류 장치내에서 혼합하였다. 파라-톨루엔 술폰산(약 0.1g)을 첨가하고, 10분 후에 워터 젯을 연결하여 메탄올을 증류 제거하였다. 4시간 후에, 반응 혼합물을 증발시켜 백색 고체를 형성하였다. 잔류물을 디부틸 에테르로 세척하고, 여과하고, 여과 편을 아세토니트릴에 용해시켰다. 침전이 시작되고, 혼합물을 5일 동안 냉장고에 보관하였다. 그 후, 침전물을 여과하고, 여과액을 증발시켰다. 잔류물을 물 중 30% 아세토니트릴로 용리된 로바(Lobar) C RP-8 칼럼상에서 정화하였다. 4개의 개별적 시행으로부터의 생성물 분획을 냉동 건조하고 혼합하였다.
TMS 유도체의 GC는 생성물이 95표면적%의 모노아세탈로 구성됨을 나타내었다. 그 다음, 모노아세탈은 0.4, 3.2, 94.1 및 2.4 표면적% 각각에 대하여 기록된 4개 피크로 구성되었다. GC/MS 분광기와 함께1H-,13C-, COSY-, DEPT- 및 C-H 연관 NMR 스펙트럼에 기초하여, 우월한 종이 표제 화합물임을 확인하였다.
1H 및13C NMR(아세톤-d6), TMS에 대한 δ: 7.54-7.30(5H, m, Ar-H), 5.60(1H, s, 아세탈-H), 4.71(1H, s,H-1), 4.34(1H, 넓은 s, OH), 4.22+4.02(2H, m+넓은 s,H-6'-OH), 3.94-3.82(3H, m,H-2,H-3 및H-4), 3.80-3.60(2H, m,H-5+H-6" 및 3.39(3H, s, CH3); 139.264, 129.396, 128.662 및 127.211(Ar-C), 102.825(C-1), 102.468(아세탈-C), 79.888(C-4), 72.090(C-3), 69.308(C-6), 69.127(C-2), 64.363(C-5) 및 54.921(CH3).
화합물 5: 4,6-O-(벤질리덴-d 1 )-2-디옥시-D-글루코피라노오스
벤즈알데히드-d1을 준비하고, EP 0 283 139 B1에 개시된 바와 같이 벤즈알데히드 디메틸아세탈-d1으로 전환하였다.
2-디옥시-D-글루코오스(10g, 60.9 mol), 벤즈알데히드 디메틸아세탈-d1(11.7g, 76.4 mol), 건조 DMF(35 ml) 및 파라-톨루엔 술폰산(70mg, 0.37 mol)을 N2하에 혼합하여 백색 슬러리를 생성하였다. 45-50℃로 데워서, 1/2시간내에 무색 용액을 형성하였다. 진공 펌프를 연결하여 냉각된 칼럼을 통하여 메탄올을 제거하였다(벤즈알데히드 디메틸아세탈-d1의 손실을 방지하고자 함). 압력을 70 mbar에서20-30 mbar까지 4.5시간 동안 단계적으로 조절하여 낮추고, 온도를 40-45℃로 유지하였다. 그 후, 증류를 중지하고, 장치를 칼럼없이 다시 설치한 후, 50-55℃에서 최대 진공하에 단경로 증류에 의해 DMF를 제거하였다. 잔류물은 약간 노란색의 시럽이었다
1/4의 시럽을 60/40의 약간 알칼리(NaHCO3) 메탄올/물에 용해시키고, 60/40의 메탄올/물로 용리된 머크 리크로프렙(Merck LiChroprep) RP-8 역상 칼럼상에서 정화하였다. 생성물 분획을 농축하여 메탄올을 제거하고 냉동 건조하여 백색, 솜털형 고체를 수득하였다. 4개 개별적 시행으로부터의 생성물을 혼합하여 3.5g(이론 수율의 23%)을 획득하였다.
TMS 유도체 및 NMR 분광기의 GC 분석은 1:1의 α 및 β 아노머로 구성됨을 증명하였다
1H 및13C NMR(DMSO-d6), TMS에 대한 δ(ppm): 7.52-7.28(5H, m, Ar-HⅠ+Ⅱ), 6.9-6.65(1/2H, 넓은 s, OH-1Ⅱ), 6.55-6.32(1/2H, 넓은 s, OH-1Ⅰ), 5.25-5.12(1H, m, OH-3Ⅱ 및H-1Ⅰ), 5.12-5.0(1/2H, d, OH-3Ⅱ), 4.84-4.73(1/2H, dd,H-1Ⅱ), 4.20-4.02(1H, m,H-6Ⅰ+Ⅱ), 3.98-3.73(1H, m,H-3Ⅰ 및H-5Ⅰ), 3.73-3.58(1.5H, m,H-6'Ⅰ+Ⅱ 및H-3Ⅱ), 3.42-3.18(2.5H,H-4Ⅰ+Ⅱ 및H-5Ⅱ 및H 2O), 2.10-1.86(1H, m,H-2Ⅰ+Ⅱ) 및 1.62-1.34(1H, m,H-2'Ⅰ+Ⅱ); 137.979, 137.926, 128.841, 128.036 및 126.432(Ar-CⅠ+Ⅱ), 101.5-100.0(아세탈-CⅠ+Ⅱ), 94.057 및 91.424(C-1Ⅰ+Ⅱ), 83.916 및 83.093(C-4Ⅰ+Ⅱ), 68.374 및 68.119(C-6Ⅰ+Ⅱ), 66.889, 66.092, 64.174 및 62.604(C-3Ⅰ+Ⅱ 및C-5Ⅰ+Ⅱ) 및 41.932 및 40.051(C-2Ⅰ+Ⅱ).
화합물 6: 4,6-O-(4-카르보메톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스
메틸 4-포르밀벤조에이트(101g, 0.609 mol), 메탄올(91.5g, 2.86 mol), 트리메틸 오르토포름에이트(71g, 0.67 mol) 및 진한 염산(165㎕)을 500ml 3목 플라스크에서 혼합하였다. 슬러리를 수 분내에 약간 노란색의 용액으로 변형시키고, 온도를 15℃로부터 30℃까지 점진적으로 증가시켰다. 15분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 58℃에서 다시 25분간 환류시키고 나서, 10℃로 냉각하였다(얼음/물). KOH(8.3g)을 메탄올(53ml)에 녹여 알칼리 용액을 만들고, 7 ml의 용액을 반응 혼합물에 혼합하였다. 10℃에서 25분 동안 교반한 후, 반응기를 단경로 증류를 위해 재구성하고, 진공상태(워터 젯)에서 모든 휘발물질을 제거하였다. 그 후, 진공 펌프와 함께 증류를 계속하여 112-114℃/0.5 mbar에서 무색 오일을 수득하였다. 오일을 무색 고체(m.p. 32-33℃)로 전환시키고, NMR에 의해 메틸 4-포르밀벤조에이트 디메틸아세탈임을 확인하였다. 수율은 108.75g, 이론적 수율의 85%이었다.
D(+)-글루코오스(8.0g, 44.4 mol), 건조 DMF(25ml), 메틸-4-포르밀벤조에이트 디메틸아세탈(10.4g, 49.5 mmol) 및 파라-톨루엔 술폰산을 50℃에서 N2하에 혼합하여 백색 현택액을 수득하였다. 장치를 수직 응축기를 통하여 진공 펌프에 연결하고, 55℃에서 80-100 mbar로 메탄올을 증발시켰다. 진공도를 40 mbar까지 점차 낮추고, 온도를 55-60℃로 유지하였다. 반응 혼합물이 점차 깨끗해져서 결국 투명하게 되었다. 8시간 후에, 증류를 중지하고, 장치를 DMF의 단경로 증류를 위해 재구성하였다. 잔류물은 약간 노란색의 시럽이었다.
시럽을 20 ml 메탄올 및 8 ml 물 중의 100 mg NaHCO3의 따뜻한 용액에 용해시키고, 100 ml의 에틸아세테이트를 첨가하여 침전시켰다. 침전물을 여과에 의해 모용액으로부터 단리시키고, 차가운 물(4×15-20 ml)로 세수하고, 회전증발 플라스크로 운반하였다. 에틸아세테이트를 첨가하여 습기를 제거하고 2회 증발시켰다. 마지막으로 생성물을 고 감압하에 증발시켰다. 더 많은 침전물이 모용액으로부터 여과 분리되었고, 이것을 세수하고 건조하여 제 2 수득물을 생성하였다. 2개의 수득물을 혼합하여 1.94g의 순수 생성물(이론 수율의 13%)을 수득하였다.
TMS 유도체의 GC 분석은 2:1 비율의 2개의 이성질체를 나타내었다.
1H 및13C NMR(DMSO-d6), TMS에 대한 δ(ppm): 7.99 및 7.61(2+2H, dd, 푸르푸릴-H), 6.87(0.67H, d, OH-1Ⅱ), 6.59(0.28H, d, OH-1Ⅰ), 5.68(1H, s+s, 아세탈-HⅠ+Ⅱ), 5.29(0.68H, d, OH-3Ⅱ), 5.21(0.67H, d, OH-2Ⅱ), 5.16(0.31H, d, OH-3Ⅰ), 5.00(0.30H, t,H-1Ⅰ), 4.85(0.28H, d, OH-2Ⅰ), 4.48(0.73H, t,H-1Ⅱ), 4.25-4.08(1.14H, m,H-6), 3.95-3.77(3.43H, m, OCH 3및H-5Ⅰ), 3.78-3.59(1.40H, m,H-3Ⅰ 및H-6'), 3.49-3.23(3.59H, m,H-4Ⅰ 및 Ⅱ,H-5Ⅱ,H-2Ⅰ 및H-3Ⅱ), 3.10-2.98(0.72H, m,H-2Ⅱ); 165.978, 142.553, 142.553, 129.959, 129.067, 126.763, 99.982, 99.812, 97.661, 93.238, 81.794, 81.794, 80.963, 75.808, 72.902, 69.658, 68.487, 68.110, 65.714, 61.952 및 52.253.
화합물 7: 4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-D-글루코피라노오스
12-디옥시-D-글루코오스(10.0g, 60.9 mmol), 건조 DMF(34ml), 벤즈알데히드 디메틸아세탈(11.6g, 76.2 mmmol) 및 파라-톨루엔 술폰산(70mg, 0.37 mmol)을 N2하에 혼합하여 백색 슬러리를 수득하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 45-50℃로 데워서 고체를 점차 녹였다. 진공 펌프를 연결하여 냉각된 칼럼을 통해 메탄올을 제거하였고(벤즈알데히드 디메틸아세탈의 손실을 방지하기 위함), 반응을 4.5시간 동안 진행시켰다. 그 후, 증류를 중단하고, 칼럼을 제거하였으며, 50-55℃에서 최대 진공하에 단경로를 통하여 DMF를 증류로 제거하였다. 잔류물은 약간 노란색의 시럽이었다.
시럽을 60/40의 약간 알칼리(NaHCO3) 메탄올/물에 용해시키고, 60/40의 메탄올/물로 용리된 머크 리크로프렙 RP-8 역상 칼럼상에서 정화하였다. 생성물 분획을 농축하여 메탄올을 제거하고 냉동 건조하여 백색, 솜털형 고체를 수득하였다. 4개 개별적 시행으로부터의 생성물을 혼합하여 3.18g(이론적 수율의 21%)을 획득하였다.
TMS 유도체 및 NMR 분광기의 GC 분석은 1:1의 α 및 β 아노머로 구성됨을 증명하였다
1H 및13C NMR(DMSO-d6), TMS에 대한 δ(ppm): 7.52-7.30(5H, m, Ar-HⅠ+Ⅱ), 6.85-6.68(1/2H, 넓은 s, OH-1Ⅱ), 6.50-6.35(1/2H, 넓은 s, OH-1Ⅰ), 5.61(1H, s+s, 아세탈-HⅠ+Ⅱ), 5.23-5.12(1H, m, OH-3Ⅱ 및H-1Ⅰ), 5.12-5.02(1/2H, d, OH-3Ⅱ), 4.84-4.74(1/2H, dd,H-1Ⅱ), 4.20-4.04(1H, m,H-6Ⅰ+Ⅱ), 3.98-3.74(1H, m,H-3Ⅰ 및H-5Ⅰ), 3.74-3.57(1.5H, m,H-6'Ⅰ+Ⅱ 및H-3Ⅱ), 3.42-3.18(2.5H,H-4Ⅰ+Ⅱ 및H-5Ⅱ 및H 2O), 2.08-1.88(1H, m,H-2Ⅰ+Ⅱ) 및 1.62-1.32(1H, m,H-2'Ⅰ+Ⅱ).
화합물 8: 2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-d 1 -2-디옥시-D-글루코피라노오스
벤즈알데히드-d1을 준비하고, EP 0 283 139 B1에 개시된 바와 같이 벤즈알데히드 디메틸아세탈-d1으로 전환하였다.
N-아세틸-D-글루코사민(10g, 45.2 mmol), 벤즈알데히드 디메틸아세탈-d1(8.7g, 56.8 mmol), 건조 DMF(30 ml) 및 파라-톨루엔 술폰산(88mg, 0.46 mmol)을 N2하에 혼합하여 백색 현탁액을 생성하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 45분 동안 교반하고 나서, 수직 응축기를 통해 진공 펌프를 연결하고, 반응을 55℃/60-70 mbar에서 2시간 동안 진행시켰다. 장치를 재구성하여 단경로를 통해 DMF를 제거하고, 증류를 55-60℃에서 최대 진공하에 추가로 1시간 진행시켰다. 잔류물은 노란-흰색의 무른 고체이었다
NaHCO3(150 ml)를 30 ml 메탄올/물(3:2)에 혼합하여 용액을 만들고, 그 용액을 첨가하여 잔류물을 중화시켰다. 그렇게 형성된 크림형 슬러리를 여과하고, 1% NaHCO3용액으로 2-3회 세수하고, 에테르로 수 차례 세수하였다. 생성물이 충분히 순수하게(GC) 되도록 분석하고 진공하에 건조시켰다. 수율은 8.8g(이론 수율의63%)이었다.
TMS 유도체의 GC 분석은 1:1의 이성질체 혼합물을 나타내었다.
1H 및13C NMR(DMSO-d6), TMS에 대한 δ(ppm): 7.83(1H, s+s, NH), 7.51-7.28(6H, m, Ar-H), 7.0-6.2(1H, 넓은 s, OH-1), 5.65-5.05(1H, 넓은 s, OH-3), 4.99(1H, d,H-1Ⅰ), 4.61(0.3H, d,H-1Ⅱ), 4.21-4.03, 3.92-3.67 및 3.51-3.22(6 H, m,H-2,H-3,H-4,H-5 및H-6) 및 1.85(3H, s+s, CH 3); 169.452(C=O), 137.818, 128.869, 128.035 및 126.438(Ar-C), 100.505(아세탈-C), 96.056, 91.500, 82.471, 81.505, 70.549, 68.300, 67.961, 67.218, 65.906, 62.123, 58.038, 54.790(당-C) 및 23.123 및 22.674(CH3).
화합물 9: 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스
3-니트로벤즈알데히드(100g, 0.66 mol), 메탄올(99g, 3.1 mol), 트리메틸 오르토포름에이트(77.3g, 0.73 mol) 및 진한 염산(165㎕)을 500ml 3목 플라스크에서 혼합하여 노란색 슬러리를 형성하였고, 그것은 5분 이내에 용액으로 변하였다. 반응 혼합물을 ~50℃에서 15분 동안 환류시키고 나서, 얼음/물로 10℃로 냉각하였다. KOH(2.5g)을 메탄올(16ml)에 용해시키고, 반응 혼합물을 이 용액 6.6ml로 켄칭하였다. 15분 동안 교반하고, 반응기를 재구성하여 단경로 진공 증발을 시켰다. 워터 젯내에서 휘발성 물질(CH3OH + HCOOCH3)을 증류로 제거하고 나서, 증류를 중지하고 진공 펌프를 연결하였다. 그 후, 증류를 계속하여 노란색 오일이 93-97.5℃/20mbar에서 증류로 분리되었다. 오일을 NMR에 의해 고순도의 3-니트로벤즈알데히드 디메틸아세탈임을 확인하였다. 수율은 127g(이론적 수율의 97.6%)이었다.
3-니트로벤즈알데히드 디메틸아세탈(5.5g, 0.028 mol), N-아세틸-D-글루코사민(5.0g, 0.023 mol), 건조 DMF(15ml) 및 파라-톨루엔 술폰산(50mg, 0.263 mmol)을 50℃에서 혼합하여 백색 현택액을 수득하였다. 1/2시간 후에, 진공 펌프를 연결하고, 반응을 56℃/50 mbar에서 11시간 동안 진행시켰다. 반응 혼합물을 증발시켰고, 잔류물은 작은 부피의 약간 알칼리(NaHCO3) 물 및 클로로포름 사이에서 분할되었다. 수성 상(치즈형 현탁액)을 클로로포름으로 2회 재추출하고 여과하였으며, 물 및 에테르로 수 차례 세수하였다. 생성물을 진공에서 건조하여 약간 갈색의 분말을 형성하였다. 수율은 570mg(이론 수율의 7%)이었다.
TMS 유도체의 GC 분석은 2:1 비율의 2개의 이성질체로 구성되는 생성물을 나타내었다. NMR 분광기에 의해 α 및 β 아노머 혼합물로서 생성물을 확인하였다.
1H 및13C NMR(DMSO-d6), TMS에 대한 δ: 8.4-8.1(2H, m, Ar-H), 8.05-7.79(2H, m, Ar-H), 7.79-7.60(1H, t, NH), 6.80(1H, d, OH-1), 5.81(1H, s+s, 아세탈H), 5.30 및 5.18(1/2H + 1/2H, s+s,H-1), 4.30-4.10, 3.93-3.3(6H, m,H-2 -H-6) 및 1.85(3H, d, CH 3); 169.331(C=O), 147.490, 139.544, 133.018, 129.862, 123.732, 120.884(Ar-C), 99.000, 98.806(아세탈-C), 95.924, 91.406, 82.433, 81.454, 70.320, 68.240, 67.907, 67.020, 65.574, 61.833, 57.875, 54.609(당-C) 및 23.014 및 22.557(CH3).
화합물 10: 4,6-O-(벤질리덴-d 1 )-D-갈락토피라노오스
벤즈알데히드-d1을 준비하고, EP 0 283 139 B1에 개시된 바와 같이 벤즈알데히드 디메틸아세탈-d1으로 전환하였다.
D-갈락토오스(15g, 0.0833 mol) 및 건조 DMF(80 ml)를 45℃의 증류 장치내에서 교반하였다. 벤즈알데히드 디메틸아세탈-d1(12.8g, 0.0836 mol) 및 파라-톨루엔 술폰산(0.14g)을 첨가하고, 메탄올 및 DMF를 진공하에(워터 젯) 천천히 증류하여 제거하였다. 3시간 후에, 진공 펌프를 연결하고, 잔류 DMF를 증류로 제거하였다. 잔류물 부분을 NaHCO3(11 mg/ml) 함유하는 메탄올/물 (1:1)에 용해시키고, 메탄올/물(1:1)로 용리된 로바 C RP-8 칼럼상에서 정화하였다. 7개의 개별적 시행으로부터의 생성물 분획을 냉동 건조하고 혼합하여 백색, 솜털형 생성물을 수득하였다. 수율은 6.62g(이론 수율의 30%)이었다.
GC 및 NMR 분석은 1:1 비율의 아노머로 구성된 생성물을 나타내었다.1H 및13C NMR(DMSO-d6), TMS에 대한 δ: 7.52-7.30(5H, m, Ar-H), 6.62(0.5H, d, OH-1-β), 6.32(0.5H, d, OH-1-α), 5.05(0.5H, t,H-1-α), 4.85+4.69+4.49(1H+0.5H+0.5H, m+d+d, OH-2+OH-3), 4.35(0.5H, t,H-1-β), 4.12-3.92+3.81-3.71+3.69-3.59+3.49-3.39+3.39-3.28(3H+1H+0.5H+1H+2H, m+m+m+m+m,H-2-H-6+H2O); 138.753, 138.690, 128.607, 128.319, 127.913 및 126.3(Ar-C),99.345(아세탈-C), 97.307 및 93.178(C-1), 76.738 및 76.158(C-4), 72.101, 71.605, 68.947, 68.862, 68.486 및 67.730(C-2, C-3 및 C-6) 및 62.068(C-5).
화합물 11: 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-만노피라노오스
벤즈알데히드-d1을 준비하고 EP 0 283 139 B1에 개시된 바와 같이 벤즈알데히드 디메틸아세탈-d1으로 전환하였다.
D(+)-만노오스(15g, 0.0833 mol) 및 건조 DMF(70ml)를 40℃의 증류장치에서 교반하였다. 벤질리덴 디메틸아세탈-d1 및 파라-톨루엔 술폰산(0.14g)을 첨가하여 깨끗한 용액을 형성하였다. 진공 펌프를 연결하고 메탄올 및 DMF를 45-50℃에서 70-20 mbar하에 천천히 증류 제거하였다. 3시간 후에, 잔류 DMF를 최대 진공하에 증류시켜 제거하고, 약간 노란색의 시럽을 수득하였다.
잔류물을 에테르로 반복하여 세수하여 친지질성 종을 제거하였다. 조제 생성물 부분을 약간 알칼리(NaHCO3) 메탄올/물(3:2)에 용해시키고, 로바 C RP-8 칼럼상에서 메탄올/물(3:2)로 용리시켰다. TMS 유도체의 GC 분석은 생성물이 4개의 이성질체로 10:3:1:4의 비율로 구성되었음을 나타내었다. 메탄올/물(1:4)로 재용리시켜서 흰색, 솜털형 생성물을 수득하였고, 그것은 GC 분석에 의해 2개의 이성질체가 70/30의 비율로 구성되었음을 알 수 있었다. 수율은 1.42g(이론수율의 6.4%임)이었다.
1H-,13C-, COSY-, DEPT- 및 C-H 연관 NMR에 기초하여, 화학 구조를 확인하였고, α 및 β 아노머가 1:8의 비율로 평형을 이루고 있었다.
우월한 이성질체의 1H- 및 13C NMR(DMSO-d6), TMS에 대한 δ: 7.5-7.28(m, 5H, Ar-H), 6.56(d, 1H, OH-1), 5.0-4.85(m, 3H, H-1, OH-2 및 OH-3), 4.10-4.02(m, 1H, H-6), 3.63-3.40(m, 5H, H-2, H-3, H-4, H-5 및 H-6'); 138.045, 128.825, 128.029, 126.438(Ar-C), 100.802(아세탈-C), 95.233(C-1), 78.987(C-4), 72.032(C-3), 68.317(C-6), 67.252(C-2), 63.495(C-5).
화합물 12: 2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-α-D-갈락토피라노오스
벤즈알데히드 디메틸아세탈(2.0 ml, 14 mmol)에 이어서 파라-톨루엔 술폰산 모노히드레이트(15 mg)을 아세토니트릴(37 ml) 중의 N-아세틸-D-갈락토사민(1.50 g, 6.77 mmol)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 그 후, 반응 혼합물을 따뜻한(60℃) 오일욕에 침지하고, 질소 분위기하에 3시간 동안 교반하였으며, 그 동안 매우 흰색의 침전물이 형성되었다. 그 다음, 반응 혼합물을 여과하고, 차가운 디클로로메탄(약 2 ml)으로 세수하고 이어서 질소 흐름하에 흡입 여과하였다. 그 후, 흰색 분말을 미리 계량된 유리병에 넣고, 72시간 동안 진공(0.06 mbar)하에 두어서 순수하게 원하는 생성물인 α-이성질체(1.74g, 83%)를 수득하였다.
1H NMR δH(300 MHz; d6-DMSO) 1.83(3H, s, CH3), 3.80-4.17(m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5 및 H-6), 4.65(d, 1H, OH-3), 5.06(t, 1H, H-1), 5.59(1H, s, ArCH), 6.52(d, 1H, OH-1), 7.33-7.55(m, 5H, ArH) 및 7.69(1H, d, NH);13C NMR δC{1H}(75 MHz; D6-DMSO) 23 (CH3), 50, 62, 65, 69 및 76(C-2, C-3, C-4, C-5, C-6), 91(C-1), 100(ArCH), 126, 128, 128 및 138(방향족 C) 및 170(C=O).
화합물 13: 4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스
3-니트로벤즈알데히드 디메틸아세탈을 화합물 9에서와 같이 준비하였다.
3-니트로벤즈알데히드 디메틸아세탈(21.9 g, 0.11 mol), D(+)-글루코오스(16 g, 0.09 mol), 파라-톨루엔 술폰산(100 mg, 0.5 mmol) 및 건조 DMF(50 ml)를 질소 분위기하에 혼합하고 58℃에서 25분 동안 교반하였다. 진공 펌프를 연결하고, 55-60℃에서 30-40 mbar 하에 차가운 칼럼을 통해 4시간 15분 동안 천천히 증발하여 제거하였다. 장치를 재구성하여 대부분의 DMF를 단경로를 통해 1.5시간 동안 계속 증류하여 제거하였다. 잔류물은 약간 노란색의 시럽이었다.
시럽을 약간 알칼리(NaHCO3) 메탄올/물 60:40에 용해시키고, 로바 C RP-8 칼럼상에서 메탄올/물 60:40로 용리시켜 정화하였다. 생성물 분획을 (메탄올을 제거하기 위해) 증발시키고, 냉동 건조하고 혼합하여 5 g의 흰색, 솜털형 고체를 수득하였다. 생성물을 메탄올/물 60:40로 용리시켜 재정화하여 충분히 정화된 표제 화합물을 수득하였다. 수율은 3.3 g(이론 수율의 12%)이었다. GC 분석은 생성물이 2개의 이성질체가 70:30의 비율로 구성되어 있음을 나타내었다.
1H NMR (DMSO-d6), TMS에 대한 δ: 8.33-7.63(5H, m, Ar-H), 6.89+6.60(d+d, 1H, OH-1-Ⅰ+Ⅱ), 5.78(1H, s+s, 아세탈-H-Ⅰ+Ⅱ), 5.34(0.65H, d, OH-3-Ⅱ), 5.75+5.71(d+d, 1.12H, OH-2-Ⅱ+OH-3-Ⅰ), 4.99(m, 0.56H,H-1-Ⅰ), 4.88(0.32H, OH-2-Ⅰ), 4.49(m, 0.74H,H-1-Ⅱ), 4.28-4.12(m, 1H,H-6'-Ⅰ+Ⅱ), 3.85-3.53(2.27H, m,H-3-Ⅰ,H-5-Ⅰ 및H-6"-Ⅰ+Ⅱ), 3.49-3.32(2.58H, m,H-2-Ⅰ,H-3-Ⅱ,H-4-Ⅰ+Ⅱ 및H-5-Ⅱ) 및 3.12-2-98(0.85H, m,H-2-Ⅱ).
화합물 14: 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스
2-히드록시벤즈알데히드(16.0 g, 0.13 mol), D-글루코오스(23.6 g, 0.13 mole) 및 파라-톨루엔 술폰산(촉매양)을 DMF(100 ml)내에서 혼합하였다. 혼합물을 약 60℃까지 0.5시간 동안 가열하여 용액을 수득하였다. 반응을 TLC 분석(실리카 겔, 에틸 아세테이트)으로 관측하였다. 20℃에서 20시간 후에, 혼합물을 60℃까지 1시간 동안에 2회 가열하고 나서, 60℃에서 감압하에 증발시켜 대부분의 DMF를 제거하였다. 에틸 아세테이트(약 100 ml)를 첨가하여 침전물을 수득하였다. 용액을 기울여 따라서 TLC로 분석하고, 감압하에 증발시켜 오일을 수득하였다. 오일을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 실리카 겔(120 g, 200-500 ㎛)을 첨가하고 용매를 증발시켰다. 생성물의 약 절반을 용리제로서 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔(550 ml, 30-60 ㎛)상에서 크로마토그래피를 하였다. 100 ml 분획을 취하고, 15 내지 25 분획을 감압하에 증발시켜 오일(3.4g)을 수득하였는 데, 그것은 상당량의 DMF로 인해 순수하지 않다. 클로로포름에 약간 용해하는 생성물은 동 용매를 약 20 ml 첨가하여 침전시켰다. 클로로포름으로 세수하고 건조시켜 고체(1.86g)을 수득하였다. 생성물의 나머지를 크로마토그래피하여 침전시켜서 2.43g을 수득하였고, 모용액으로부터 침전에 의해 1.6g을 추가로 회수하였다. 총 수득량은 5.85g(이론 수율의 16%)이었다.
NMR 및 TLC 분석에 따라, 생성물은 약간 비율의 2-히드록시벤즈알데히드 및글루코오스를 불순물로 포함하였다. 상기와 같이 크로마토그래피로 불순물이 전혀 없는 생성물을 수득하였다. NMR 분광기는 생성물이 α 및 β 아노머로 구성되었음을 나타내었다. DMSO-d6에서 아노머의 비율은 초기 α/β = 2:1이었으나, 시간이 흐름에 따라 변하였다. 또한, 실릴화된 유도체의 GC 분광은 2:1 비율의 2개의 피크를 나타내었다.
1H 및13C NMR (DMSO-d6), TMS에 대한 δ: 9.50(1H, s, Ar-OH), 7.30(m, 1H, Ar-H-6), 7.09(m, 1H, Ar-H-4), 6.80+6.68(m, 2.34H, Ar-H-3 + Ar-H-5 + OH-1-β), 6.48(d, 0.67H, OH-1-α), 5.71(s, 아세탈-H-α+β), 5.10(t, 0.65H, OH-2-β + OH-3-β), 4.97(d, 0.63H, OH-3-α), 4.90(t, 0.66H,H-1-α), 4.71(d, 0.65H, OH-2-α), 4.39(t, 0.39H,H-1-β), 4.10-3.93(m, 1.13H,H-6'-α+β), 3.80-3.67(m, 0.71H,H-5-α), 3.60-3.45(m, 1.73H,H-3-α 및H-6"-α+β), 3.35-3.14(m, 3.31H,H-4-α+β,H-2-α,H-3-β,H-5-β 및H2O), 3.00-2.95(m, 0.42,H-2-β); 154.72, 154.69, 130.11, 127.85, 127.77, 124.44, 124.38, 118.97 및 115.69(Ar-C), 97.95(C-1-β), 96.95 및 96.87(아세탈-C), 93.50(C-1-α), 82.35(C-4-α), 81.52(C-4-β), 76.04(C-2-β), 73.32(C-3-β), 73.19(C-2-α), 70.04(C-3-α), 68.98(C-6-α), 68.61(C-6-β), 66.24(C-5-β) 및 62.46(C-5-α).
화합물 15: 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코리피라노오스
파라-톨루엔 술폰산의 촉매양을 2-히드록시벤즈알데히드(10.7 ml, 0.100 mol) 및 트리메틸 오르토포름에이트(11.0 ml, 0.100 mol)에 첨가하였다. 60분 후에, 2-디옥시-D-글루코오스(16.4 g, 0.100 mol) 및 DMF(300 ml)를 첨가하고, 혼합물을 빠르게 약 60℃로 가열하였다. TLC 분석은 10분에 생성물의 존재를 나타내었고, 소량의 피리딘을 25시간 후에 첨가하였다. 표본을 추출하고 크로마토그래피(에틸 아세테이트/메탄올 9:1)하여 불순물 포함 분획을 수득하였다. 매우 순수한 생성물을 가진 분획을 헵탄/에틸 아세테이트(1:4)의 소량으로 크로마토그래피를 한 후 채취하였다. 반응 혼합물의 나머지를 진공하에 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 실리카 겔(200-500 ㎛)을 첨가하고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트 1:4)로 약 2 g의 생성물을 적당한 순도로 수득하였다.
적당한 수득량은 불필요한 긴 반응시간에 기인하는 것으로 추정하여 준비를 2.5시간 후에 피리딘을 첨가하는 것과 함께 반복하였다. 상기와 같은 시행 및 크로마토그래피로 2.4 g의 불순한 생성물을 수득하였다. 수집된 생성물을 혼합하고 다시 크로마토그래피(헵탄/에틸 아세테이트 1:4)하여 흰색 고체를 수득하였다. 수득량은 4.1 g(이론수율의 7%)이었다. NMR 분석은 기대된 생성물의 깨끗한 스펙트럼을 나타내었고, 약간 비율의 불순물의 신호(1 ppm 주변의 신호: 가능한 불순물은 용매를 통해 유입됨)만이 있었다. 반복된 크로마토그래피에 의해 생성물을 정화함으로써 물질을 상당량 손실하였고, 결국 1.2 g만을 단리시켰다. NMR 분광은 α:β의 비율이 약 1:1임을 나타내었다.
1H 및13C NMR (DMSO-d6), TMS에 대한 δ: 9.56(1H, s, Ar-OH), 7.41-7.29(m,1H, Ar-H), 7.18-7.06(m, 1H, Ar-H), 6.86-6.70(m, 2.54H, Ar-H+ OH-1-β), 6.40(d, 0.50H, OH-1-α), 5.83 및 5.80(s+s, 1H, 아세탈-H), 5.17(t, 0.51H,H-1-α), 5.11(d, 0.46H, OH-3-β), 5.03(d, 0.50H, OH-3-α), 4.79(t, 0.46H,H-1-β), 4.14-3.59(m, 1.25H,H-6-α+β) +EtAc), 3.91-3.72(m, 1.11H,H-3-α+H-5-α), 3.72-3.57(m, 1.48H,H-3-β +H-6'-α+β), 3.36-3.16(m, 1.39H,H-4-α+β,H-5-β + H2O), 2.05-1.86(m, 0.93H,H-2-α+β + EtAc), 1.63-1.47(m, 0.51H,H-2'-α) 및 1.47-1.32(m, 0.48H,H-2'-β); 154.71 및 154.66(Ar-C-OH), 13.09, 127.88, 127.78, 124.54, 124.48, 118.96, 118.93, 115.67(Ar-C), 97.06 및 97.00(아세탈-C), 94.36(C-1-β), 91.71(C-1-α), 84.52 및 83.70(C-4), 68.92 및 68.68(C-6), 67.24(C-3-β), 66.52(C-5-β), 64.50(C-3-α), 63.03(C-5-α) 및 42.29(C-2).
화합물 16: 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글로코피라노오스
2-히드록시벤즈알데히드(10.7 ml, 0.100 mol) 및 트리메틸 오르토포름에이트(11.0 ml, 0.100 mol)에 파라-톨루엔 술폰산을 촉매양으로 첨가하였다. 온도를 자발적으로 약 60℃까지 증가시키고, 혼합물을 약 2시간 동안 방치한 후, N-아세틸 글루코사민(20.3 g, 0.092 mol) 및 DMF(150 ml)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 30분 동안 교반하고 나서, 빨리 50℃로 가열하였다. 대부분의 N-아세틸 글루코사민이 용해되고, TLC 분석은 기대 생성물로 상당한 전환이 있음을 나타내었다. 반응 혼합물을 다시 빠르게 약 50℃로 가열하고, 휘발성 성분을 20℃/15 mmHg에서 증발시켰다. 약간 흐린 반응 혼합물을 20℃에서 4일간 유지하였다. 소량의 피리딘을 첨가하고, 대부분의 용매를 60℃/15 mmHg에서 증발시켜 오일을 수득하였다. 오일을 에틸 아세테이트(350 ml)에 첨가하여 소량의 침전물을 수득하고, 따라 옮긴 용액을 실리카 겔(200 g, 200-500 ㎛)과 함께 증발시켰다.
소량의 생성물을 실리카(550 ml, 30-60 ㎛)상에서 크로마토그래피하여 에틸 아세테이트로 용리시켜 100 ml 분획을 수집하였다. 분획 58을 취한 후, 용리제는 에틸 아세테이트/메탄올 9:1로 변화하였고, 생성물이 다음 분획 20 내에서 수집되었다. 생성물 분획을 증발시켜 고체 3.3 g을 수득하였다. 나머지 생성물을 에틸 아세테이트/메탄올 9:1을 용리제로 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 고체 생성물 21 g을 추가로 수득하였다. 에틸 아세테이트(200 ml)로 미세하게 분리된 생성물을 2시간 동안 교반하여 DMF를 제거하였다. 여과, 에틸 아세테이트로 세수 및 건조하여 순수한 생성물을 16.7 g(이론 수율의 56%)을 수득하였다. 실릴화된 유도체의 GC 분석은 이성질체 중 하나가 5:1로 우세함을 나타내었다. DMSO-d6에서의 NMR 분석은 β 이성질체가 α 이성질체에 비하여 4-5배 과량으로 존재함을 나타내었다.
1H 및13C NMR (DMSO-d6), TMS에 대한 δ: 9.59(1H, s, Ar-OH), 7.80(d, 1H, NH), 7.38(t, 1H, Ar-H), 7.17(t, 1H, Ar-H), 6.86-6.72(m, 3H, Ar-H및 OH-1-α+β), 5.82(s+s, 1H, 아세탈-H), 5.17(d, 0.22H, OH-3-β), 5.10-4.98(m, 1.54H, OH-3-α 및H-1-α), 4.61(t, 0.21H,H-1-β), 4.17-4.10(m, 0.24H,H-6'-β),4.10-4.03(m, 0.78H,H-6'-α), 3.90-3.80(m, 0.80H,H-5-α), 3.79-3.61(m, 2.53H,H-6"-α+β,H-3-α 및H-2-α), 3.31-3.53(m, 0.26H,H-3-β) 및 3.46-3.28(m, 3.58H,H-2-β,H-4-α+β,H-5-β 및H 2O); 169.81, 169.77(C=H), 154.70, 130.15, 127.86, 127.75, 124.41, 124.36, 118.97 및 115.70(Ar-C), 97.00 및 96.86(아세탈-C), 96.34(C-1-β), 91.81(C-1-α), 83.08 및 82.12(C-4), 70.92 및 67.58(C-3), 68.86 및 68.52(C-6), 66.34 및 62.58(C-5), 58.33 및 55.08(C-2), 23.46 및 23.00(CH3).
화합물 17: 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스
파라-톨루엔 술폰산 촉매량을 2-히드록시벤즈알데히드(10.7 ml, 0.100 mol) 및 트리메틸 오르토포름에이트(11.0 ml, 0.100 mol)에 첨가하였다. 60분 동안 교반시킨 후, D-갈락토오스(18.0 g, 0.100 mol) 및 DMF(300 ml)를 첨가하고, 반응 혼합물을 빠르게 약 60℃로 가열하였다. 반응 혼합물은 몇 분 동안은 균질이었고, 생성물의 존재는 TLC 분석으로 검증되었다. 소량의 피리딘을 20시간 후에 첨가하고, 대부분의 용매를 제거하고, 잔류물을 상기와 같이 실리카 겔 상에 적용하였다. 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트/메탄올 9:1)로 원하는 생성물의 높은 수득량(약 17g)을 수득하였고, 그것은 단지 DMF의 불순물만을 포함하였다. 크로마토그래피를 반복하여 약간 비율의 DMF 불순물만을 포함하는 약 10g과 함께 4.9g의 순수한 생성물을 수득하였다. NMR 분광은 α 대 β의 비율이 77:23임을 나타내었다. 또한, 실릴화된 유도체의 GC 분석은 비슷한 비율의 2개의 피크를 나타내었다.
1H 및13C NMR (DMSO-d6), TMS에 대한 δ: 9.28(1H, s, Ar-OH), 7.43-7.34(m, 1H, Ar-H), 7.19-7.13(m, 1H, Ar-H), 6.85-6.76(m, 2H, Ar-H), 6.63(d, 0.23H, OH-1-β), 6.30(d, 0.76H, OH-1-α), 5.75(s, 1H, 아세탈-H), 5.06(t, 0.76H,H-1-α), 4.84(d, 0.23H, OH-2-β), 4.79(d, 0.22H, OH-3-β), 4.60(d, 0.76H, OH-3-α), 4.54(d, 0.78H, OH-2-α), 4.34(t, 0.23H,H-1-β), 4.13-3.87(m, 3H,H-4-α+β 및H-6-α+β), 3.79-3.70(m, 1.55H,H-3-α 및H-5-α), 3.66-3.59(m, 0.78H,H-2-α), 3.45-3.36(m, 0.49H,H-3-β 및H-5-β) 및 3.36-3.27(m, 0.95H,H-2-β및H 2O); 154.76, 154.70, 129.96, 128.08, 128.03, 125.18, 125.06, 118.95, 118.88 및 115.69(Ar-C), 95.57(C-1-β), 96.68 및 96.49(아세탈-C), 93.49(C-1-α), 77.19 및 76.62(C-4), 72.36 및 71.88(C-2-β 및C-3-β), 69.30 및 69.16.52(C-6), 68.79 및 67.99(C-2-α 및C-3-α), 66.10 및 62.33(C-5).
화합물 18: 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스
파라-톨루엔 촉매량을 2-히드록시벤즈알데히드(0.65 ml, 6.1 mol) 및 트리메틸 오르토포름에이트(0.63 ml, 6.1 mol)에 첨가하였다. 1시간 후에, 2-디옥시-D-갈락토오스(1g, 0.61 mol) 및 DMF(25ml)를 첨가하고, 혼합물을 빠르게 약 60℃로 가열하여 균일 용액을 수득하였다. TLC 분석은 10분 이내에 생성물이 형성됨을 나타내었다. 피리딘을 2.5시간 후에 첨가하고, 상기와 같이 시행하였다. 에틸 아세테이트에 의한 크로마토그래피로 대충 분리하고, 용리제를 에틸 아세테이트/메탄올 95:5로 변경하여 매우 순수한 생성물 98 mg(6%)을 수득하였다. NMR 분광은 2개의이성질체가 3:2의 비율로 존재함을 나타내었다.
1H NMR (DMSO-d6), TMS에 대한 δ: 9.26(1H, s, Ar-OH), 7.48-7.37(m, 1H, Ar-H), 7.23-7.10(m, 1H, Ar-H), 6.86-6.73(m, 2H, Ar-H), 6.62(d, 0.31H, OH-1-β), 6.21(d, 0.48H, OH-1-α), 5.80(s, 1H, 아세탈-H), 5.31(s, 0.49H,H-1-α), 4.78(d, 0.31H, OH-3-β), 4.67(d, 0.49H, OH-3-α +H-1-β), 4.07-3.79(m, 3.49H,H-4-α+β,H-6-α+β +H-3-α), 3.70(m, 0.95H,H-5-α +H-3-β), 3.33(m,H-5-β + H2O), 1.89-1.77(m, 0.53H,H-2-α), 1.77-1.62(m, 0.90H,H-2-β +H-2'-β), 및 1.72-1.51(m, 0.53H,H-2'-α); 154.79 및 154.76(Ar-C-OH), 129.96, 128.12, 125.24, 125.15, 118.94, 118.88 및 115.69(Ar-C), 96.62 및 96.45(아세탈-C), 94.21(C-1-β), 91.66(C-1-α), 75.80 및 74.71(C-4), 69.86 및 69.61(C-6), 67.47(C-3-β), 66.35(C-5-β), 63.43(C-3-α), 62.38(C-5-α) 및 37.09 및 34.23(C-2).
화합물 19: 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스
소량의 파라-톨루엔을 2-히드록시벤즈알데히드(0.48 ml, 4.5 mmol) 및 트리메틸 오르토포름에이트(0.47 ml, 4.5 mmol)에 첨가하였다. 60분 후에, N-아세틸 갈락토사민(1g, 4.5 mmol) 및 DMF(25ml)를 첨가하고, 반응 혼합물을 빠르게 50℃로 가열하여 균일 용액을 수득하였다. 생성물의 존재는 15분 후에 TLC 분석에 의해 나타났다. 소량의 피리딘을 2.5시간 후에 첨가하고, 대부분의 DMF를 감압하에 증발시켰다. 생성물을 상기와 같이 크로마토그래피에 적용하고, 에틸 아세테이트/메탄올 9:1에 의해 크로마토그래피하여 표제 화합물 444 mg(30%)을 수득하였다. NMR 분광은 화합물이 하나의 이성질체 아마도 α 이성질체가 우월하게 존재함을 나타내었다.
1H 및13C NMR (DMSO-d6), TMS에 대한 δ(우월한 이성질체): 9.34(1H, s, Ar-OH), 7.63(d, 1H, NH), 7.47-7.39(m, 1H, Ar-H), 7.21-7.14(m, 1H, Ar-H), 6.87-6.79(m, 2H, Ar-H), 6.52(d, 0.96H, OH-1), 5.80(s, 1H, 아세탈-H), 5.08(t, 0.97H,H-1), 4.58(d, 1H, OH-3), 4.12(d, 1H,H-4), 4.08-3.98(m, 2H,H-2 +H-6), 3.98-3.89(m, 1H,H-6'), 3.89-3.79(m, 1H,H-3), 3.78(s, 1H,H-5) 및 1.83(s, 3H, CH 3); 169.92(C=O), 154.69(Ar-C-OH), 130.00, 128.05, 125.15, 118.98 및 115.68(Ar-C), 96.40(아세탈-C), 91.72(C-1), 76.45(C-4), 69.37(C-6), 65.75(C-3), 62.27(C-5), 50.57(C-2) 및 23.09(CH3).
화합물 20: 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-만노피라노오스
촉매량의 파라-톨루엔을 2-히드록시벤즈알데히드(10.7 ml, 0.100 mol) 및 트리메틸 오르토포름에이트(11.0 ml, 0.100 mol)에 첨가하였다. 60분 후에, D-만노오스(18g, 0.100 mol) 및 DMF(300ml)를 첨가하고, 반응 혼합물을 빠르게 약 60℃로 가열하였다. 반응 혼합물은 20분 후에 거의 균질이었고, TLC 분석은 생성물의 존재를 나타내었다. 소량의 피리딘을 2.5시간 후에 첨가하고, 대부분의 DMF를 감압하에 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(소량의 메탄올이 첨가되어 균일 시스템을 획득함)에 용해시키고, 실리카 겔(200-500 ㎛)을 첨가하고, 용매를 진공하에 증발시켰다. 소량의 조제 생성물을 크로마토그래피(에틸 아세테이트/메탄올 9:1)하고, NMR 분석으로 생성물을 확인하였다. 나머지 조제 혼합물을 크로마토그래피하여 7.7g의 생성물을 수득하였고, 그것은 다량의 DMF 불순물을 포함하였다. 생성물을 클로로포름내에서 교반하여 DMF를 제거하고 여과하여 약 20 몰%의 DMF를 함유하는 고체 생성물 7.1g을 수득하였다. 생성물을 약 300 ml의 에틸 아세테이트와 함께 20시간 동안 교반하고 여과하여 DMF가 전혀 없이 약간 붉은 빛의 결정을 1.7g 수득하였다. 크로마토그래피로 DMF가 없지만 약간 변색된 생성물을 수득하였다. 여과액을 증발시키고, 잔류물을 크로마토그래피로 정화하여 추가로 3.5g의 생성물을 수득하였다. 총 단리된 수득량은 4.7g(이론수율의 16%)이었다. NMR 분광은 화합물이 α 이성질체가 우월하게(α:β = 85:15) 존재함을 나타내었다.
1H 및13C NMR (DMSO-d6), TMS에 대한 δ(우월한 이성질체): 9.51(1H, s, Ar-OH), 7.42-7.29(m, 1H, Ar-H), 7.22-7.11(m, 1H, Ar-H), 6.83-6.72(m, 2H, Ar-H), 6.52(d, 0.73H, OH-1), 5.79(s, 0.72H, 아세탈-H), 4.96-4.79(m, 2.88H,H-1, OH-2 + OH-3), 4.04-3.98(m, 0.58H,H-6), 3.83-3.68(m, 2.52H,H-3,H-4 +H-5) 및 3.68-3.54(m, 2.84H,H-2 +H-6'); 154.65(Ar-C-OH), 130.07, 127.84, 124.56, 118.92 및 115.69(Ar-C), 97.29(아세탈-C), 95.51(C-1), 79.55(C-4), 72.38(C-2), 68.88(C-6), 67.53(C-3) 및 63.87(C-5).
화합물 21: 4,6-O-벤질리덴-L-글루코피라노스
L(-)-글루코스(5.0g, 27.8mmol), 벤즈알데히드 디메틸아세탈(4.66g, 30.6mmol) 및 파라-톨루엔 술폰산(32mg, 0.17mmol)을 증류 장치내 무수 DMF(20ml) 중에서 혼합하였다. 수펌프를 짧은 경로를 통해 연결하여 진공하에 메탄올 및 DMF를 제거하였다. 무색 현탁액이 1/2 시간내에 55℃에서 용해되었고, 형성된 용액을 1/2 시간 동안 120mbar에서 교반하면서 온도를 서서히 65℃로 증가시켰다. 진공을 최대로 증가시키고, 반응 혼합물을 추가 45분 동안 증발시켰다. 증류 종료시에 온도를 75℃로 증가시켰다. 잔류물은 약한 황색 시럽이었고, NaHCO3(29mg)를 첨가시켜 중화시키고 냉각시켰다.
미정제 생성물을 메탄올(10ml) 중에 용해시키고, 메탄올/물 1:1로 용리되는 역상 RP-8 칼럼에서 정제하였다. 생성물 분획을 결합시키고, 증발시켜 메탄올을 제거하였다. 잔류 용액을 추가로 물로 희석하고 냉동 건조시켰다. 세가지 개별적 수행으로부터 백색의 보풀의 고형물을 수집하여 전체 2.42g을 수득하였다(이론치의 32.5%).
실릴화된 샘플의 GC 크로마토그래피는 두 이성질체(α및 β아노머)가 35/65비로 구성된 생성물을 나타내었다. DMSO-d6에서1H NMR 이동은 4,6-O-벤질리덴-D-글루코피라노스의 것과 유사하였다:
화합물 22: 4,6-O-(벤질리덴-d 1 )-L-글루코피라노스
L-글루코스(5.14g, 12.8mmol)을 맑은 용액이 형성될 때까지 95℃로 DMF(20ml) 중에서 가온시켰다. 이후, 반응 플라스크를 65℃의 수욕으로 옮기고, 파라-톨루엔 술폰산(33mg, 0.17mmol)을 첨가하였다. 이후, 벤질리덴 디메틸 아세탈-d1(4.7ml, 31mmol)을 80mbar의 조절된 수펌프 진공하에서 교반된 글루코스 용액에 20분에 걸쳐 주사기에 의해 적가하였다. 이후, DMF를 65℃에서 진공(2mbar) 하에서 증발시켜 매우 엷은 황색 오일을 수득하고, 이것에 NaHCO3(345mg)을 첨가한 후 5분동안 교반하였다. 가온된 물(67℃, 15ml)을 상기 오일에 65℃에서 교반(자기 비드)하면서 첨가한 후, 플라스크를 가온된 수욕 중에서 오일이 분해되는 것으로 나타날 때까지 흔들어주었다. 이후, 반응 플라스크를 약 5분 동안 냉각수의 스트림 하에 두었다. 단지 1 또는 2분 후에, 무정형 덩어리가 형성되었다. 수성 혼합물을 빙수욕에 넣고, 40분 동안 방치하였다. 이 시간 동안에 형성된 백색 침전물을 진공 여과에 의해 단리시키고(무정형 물질로부터 따라내어), 냉각 용수(25ml)로세척한 후 냉각된 이소-프로판올(5℃, 2x5ml)로 세척하고, 질소 스트림하에서 건조시켜 1.85g의 건식 백색 분말을 수득하였다. 이 생성물을 실릴화시키고, 기체 크로마토그래피에 의해 분석한 결과, 99% 순수한 목적 생성물인 것으로 나타났다.
화합물 23: 4,6-O-(2-아세톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스
2-아세토벤즈알데히드를 2-히드록시벤즈알데히드를 아세틸화하여 또는 2-아세톡시벤조일 클로라이드를 환원하여 준비하였다.
촉매량의 파라-톨루엔 술폰산을 2-아세톡시벤즈알데히드 및 트리메틸 오르토포름에이트의 동일몰 혼합물에 첨가하였다. 1시간 교반 후, 동일몰 양의 D-글루코오스 및 DMF를 첨가하고, 혼합물을 약 60℃까지 가열하였다. 전환 후에 TLC 크로마토그래피를 하고, 평형에 도달할 때, 반응을 소량의 피리딘을 첨가하여 켄칭하였다. 대부분의 DMF를 감압하에 증발시키고, 잔류물을 상기와 같이 실리카 상에 적용하였다. 이것을 크로마토그래피로 정화하고, 생성물 분획을 단리시켜 증발시키고, 화합물을 NMR 분광으로 분석하였다.
화합물 24: 4,6-O-(2,3-디히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스
표제 화합물을 2,3-디히드록시벤즈알데히드로부터 출발하여 준비하고 상기와같이 정화하였다. NMR 분광으로 동일성을 확인하였다.
생물학적 실험
실시예 1
효과를 입증하기 위해 사용된 생물 재료 및 방법
세포 배양 기술
제자리 경부 암종으로부터 기원한 사람 세포, NHIK 3025(Nordbye, K., and Oftebro, R.Exp. Cell Res., 58:458,1969, Oftebro R., and Nordbye K., Exp. Cell Res., 58: 459-460, 1969)를 15% 송아지 태아 혈청(Gibco BRL Ltd)로 보충된 이글스 미니멀 에센셜 미디엄(Eagel's Minimal Essential Medium(MEM))중에서 배양하였다. 사람 흉부 암종 세포 T-47D(Keydar, I. et al., Eur. J. Cancer, vol 15, pp. 659-670)를 10% 송아지 태아 혈청, 0.2u/ml 인슐린, 292mg/ml L-글루타민, 50u/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 배지 RPMI-1640 중에서 배양하였다. 세포는 통상적으로 조직 배양 플라스크에서 37℃에서 단층으로 성장하였다. 지속적인 지수 성장으로세포를 유지시키기 위해, 세포를 트립신처리하고, 일주일에 3회 다시 배양하였다.
세포 생존율
세포 생존율을 콜로니 형성능으로서 측정하였다. 시딩(seeding) 전에, 지수 성장 세포를 트립신 처리하고, 단일 세포로서 현탁시키고, 5cm 플라스틱 접시에 직접 시딩하였다. 시딩된 세포를 수를 조정하여 생존 세포의 수가 접시당 약 150이 되도록 하였다. 37℃에서 약 2시간 인큐베이션한 후, 세포를 접시의 바닥에 부착시켰다. 이후, 목적하는 약물 농도를 갖는 배지로 배지를 대체시키므로써 약물 처리를 개시하였다. 약물 처리 후, 세포를 가온된(37℃) 행크(Hank) 평형 염 용액으로 1회 헹구고, 새로운 배지를 추가하였다. CO2-인큐베이터에서 37℃에서 10 내지 12일 경과한 후, 세포를 에탄올 중에 고정시키고, 메틸렌 블루로 염색시킨 후, 콜로니를 계수하였다.
도 1-3은 화합물 8 및 9(도 1), 화합물 5 및 7(도 2) 또는 화합물 12(도 3)으로 20시간 동안 치료된 NHIK 3025-세포에 대한 세포 생존 분율을 도시하였다. 데이타는 모든 화합물이 매 약물 투여량에서 지라스코르브(2H)에 비하여 유사하거나 더 많이 세포를 비활성화시킨다는 것을 나타내었다[참고문헌: Pettersen et al., Anticancer Res. vol. 11, (1991), pp. 1077-1082].
도 4에서, 화합물 2가 투카레솔보다 세포를 더욱 비활성화시킴을 알 수 있다.
실시예 2
단백질 합성
단백질 합성 속도가 상기와 같이 계산되었다[참고문헌: Ronning, O. W. et al., J. Cell Physiol., 107: 47-57, 1981]. 간략하게는, 세포 단백질을 최소 2일의 사전 배양 동안에 일정한 특이 방사능(0.5 Ci/mol)을 갖는 [14C]발린으로 표지하여 포화시켰다. 특이 방사능을 일정 수준으로 유지하기 위하여, 고농도의 발린(1.0 mM)을 배양액에 사용하였다. 발린의 이러한 농도에서, 세포간 발린 및단백질 가수분해적으로 발생된 발린에 의한 [14C]발린의 희석은 무시할만 하다[Ronning, O. W., et al., Exp. Cell Res. 123: 63-72, 1979]. 단백질 합성 속도는 각 측정 기간의 초기에 단백질내의 총 [14C]방사능에 대한 [3H]발린의 혼입으로부터 계산되며 시간 당 비율로 표현된다[참고문헌: Ronning, O. W. et al., J. Cell Physiol., 107: 47-57, 1981].
도 5에서, 화합물 2는 투카레솔보다 더 단백질 합성 억제를 유도한다는 것을 알 수 있다.
실시예 3
누드 생쥐내의 인체 이종이식편에 대한 실험
약물은 암컷이며 흉선이 없는 생쥐내로 이식된 3개 인체 암 이종이식편의 치료로 시험되었다. 사용된 세포계는 SK-OV-3 난소 암종, A-549 폐 암종 및 Caco-2 직장결장 암종이다. 그들은 ATCC(American Type Culture Collection)으로부터 구매하여 누드 생쥐에 이식되기 전에 생체 밖에서 단기간 배양되었다. 종양계는 누드 생쥐의 피하 이식편으로 전달되었다. 실험에 사용되는 생쥐는 종양 이식 당시에 생후 8-9주된 것이다. 작은 종양 조각을 동물의 좌측 옆구리의 피하에 이식하였다. 성장하는 종양(종양 부피 25-110 mm3)을 가진 동물을 무작위로 약물 치료군 및 대조군으로 할당하고, 집단내의 평균 종양 크기는 대략 동일하게 하였다. 항종양 활성은 종양 부피 성장 곡선 및 몇몇 종양의 해부학적 평가에 의해 측정되었다. 치료 동안에, 종양은 캘리퍼스를 사용하여 2개의 수직 직경을 측정함으로써 주 당2회 측정되었다. 종양 부피는 다음 공식에 의해 추정되었다: 부피 = (길이 ×폭2)/2. 종양 부피 성장 곡선은 상이한 집단내의 종양 크기를 식 RV = Vx/V1에 의해 계산하여 상대 종양 부피를 획득함으로써 표준화하여 생성하였고, 여기에서 Vx는 제 x일에서의 종양 부피이고 V1은 치료를 시작할 때(제 1일)의 초기 부피를 의미하며, 평균 부피를 표준 오차와 함께 각 치료 집단에 대하여 시간의 함수로서 도시하였다. 지수 곡선은 상대 종양 부피 성장 데이타에 맞추어졌고, 각 집단내의 종양 부피가 2배로 증가하는 기간 즉, 종양 부피 배가 시간(TD)은 적합화된 곡선으로부터 결정된다(loge2/k, 여기에서 k는 과정에 대한 추정 속도 상수이다). 해부학적 평가는 종양에 대한 거시적 관찰 및 파라핀에 묻혀 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 작은 종양 단편(6-8 mm 두께)에 대한 현미경적 관찰에 기초하였다.
표 1에, 매일 지시된 약물 및 투여량으로 정맥주사된 누드 생쥐내에서 성장된 인체 종양 이종이식편에서의 종양 부피 배가 시간(TD)이 나타났다.
표 1:
*치료군과 대조군 사이의 중요한 차이, p<0.05.
도 6에, 매일 1 mg/kg 및 7.5 mg/kg의 화합물 8로 치료된 누드 생쥐에 이식된 종양계 SK-OV-3 난소 암종 이종이식편의 평균 종양 성장 곡선이 도시되었다. 곡선은 양쪽 투여량에 대해 상당한 성장 억제 효과를 나타낸다.
도 7-12는 각 집단으로부터의 종양의 현미경 사진을 나타낸다. 이러한 사진은 이러한 화합물의 일반적 관찰 결과, 즉 대조군 종양 및 화합물 8로 처리된 종양 사이에 종양 세포 괴사에 대한 측면에서 차이가 있음을 나타낸다. 처리된 종양이 치료에 의해 괴사되므로, 약물 효과는 성장 곡선에 의해 나타난 것보다 현실적으로 매우 강력하다.
실시예 4
다중세포 원형체 및 망막아세포종 단백질(pRB)의 활성
부유된 단일 세포를 12 ml의 배양액을 함유하는 25 cm2조직 배양 플라스크에 운반하여 원형체가 발생하기 시작하였다. 그 후, 플라스크를 37℃의 대형 배양기 실내의 상하동 보드(MIXER 440, Swelab Instrument)상에 위치시켰다. 상하운동 속도는 18초 당 10틸트로 조정하였다. 상하운동 동안에, 부유된 세포는 플라스크의 바닥에 점착되는 것이 방지된다. 그 대신에, 많은 세포는 서로 점착하여 약 24시간 상하운동 후에 통상 50-100개 세포를 함유하는 작은 세포 응집체를 형성할 수 있다. 그 후, 작은 응집체는 또다른 25 cm2조직 배양 플라스크로 운반하였다. 이 경우에, 플라스크의 바닥은 미리 1.3% 멸균 한천(Bacto-Agar, Difco Laboratories,USA)의 박층으로 도포(즉, 코팅)되었다. 세포 응집체는 한천 층의 상부에 침전되고, 이것에 점착될 수 없다. 그러나, 응집체 내의 세포는 서로 점착하여 세포 분할을 시작하였다. 1주일 후, 응집체는 몇 번에 걸쳐 그 부피가 2배가 되었고, 원형체와 같이 둥글게 되었다. 이 기간 동안에, 배양액은 일주일에 3회 교환되고, 원형체는 새로운 한천 코팅 플라스크로 일주일에 1회 운반되었다.
원형체가 직경이 약 400㎛의 크기에 도달하는 경우(2 내지 3주 배양 후), 그들을 작은 미소 웰(well)로 운반하는 데, 각 웰 당 1개 원형체를 1 ml 배양액과 함께 운반한다. 모든 선택된 원형체는 대략 동일한 크기를 갖게 하였다. 또한, 웰은 한천으로 코팅되어 원형체가 웰의 바닥에 점착하는 것을 방지하였다. 다양한 웰에 선택된 농도의 시험 물질을 함유하는 새로운 배양액을 공급하고 나서, 각 개개의 원형체의 직경을 매일 1회 측정하였다. 이것은 접안렌즈 중 하나로 상 대조 광학기 및 알려진 선 분리의 회절격자를 사용하여 현미경 검사에 의해 수행하였다. 각 집단에는, 8-12개의 병행 원형체가 존재하였다. 상대 원형체 부피(제 n일의 부피를 제 1일의 부피로 나눔)는 각 개개의 원형체에 대해 매일 계산하였고, 성장 곡선은 치료 개시 후에 집단내의 모든 원형체에 대해 평균 상대 부피를 시간의 함수로 도시하였다.
표 2에서, 지시된 투여량의 화합물 8로 259시간 동안 치료된 T-47D 원형체 부피 배가 시간(TD)을 나타내었다. 표 2는 배양액내에 0.1 또는 1.0 mM의 화합물 8로 계속 치료되거나 또는 치료되지 않은(투여량=0 mM) T-47D-세포의 원형체의 부피 배가 시간을 나타내었다. 효과가 약물이 0.1 mM인 경우보다 1.0 mM인 경우에더 강력하기 때문에, 화합물 8은 투여량에 독립된 방식으로 원형체 배가 시간(즉, 원형체 성장을 억제하는)을 증가시키는 것으로 보인다.
표 2:
*치료군 및 대조군 사이의 상당한 차이, p<0.05.
도 13에서, 세포계 T-47D 흉부 암종의 평균 원형체 부피 성장 곡선이 도시되었는 데, 여기에서 원형체는 배양액에 용해된 0.1 mM 및 1.0 mM의 화합물 8로 치료되었다.
NHIK 3025-세포 원형체에 있어서, 원형체 부피의 시간에 따른 증가는 T-47D 세포 원형체에서 발견된 것과 동일하게 감소하지 않는다. 그 대신에, 화합물 8로 처리된 원형체는 비교적 짧은 치료 시간(7 내지 10일) 후에 분해되었다. 이러한 강력한 효과에 대한 이유를 해명하기 위하여, NHIK 3025-세포의 원형체를 단지 4일 동안 치료하고 나서, 원형체의 해부학적 단편을 준비하였다. 이 시험의 결과는 도 14에 도시되어 있다.
도 14는 3개의 상이하게 처리된 NHIK 3025 세포 원형체의 현미경 사진으로서, 하나는 처리되지 않은 대조군(A)이고, 하나는 0.1 mM의 화합물 8로 4일간 처리된 집단(B)이며, 하나는 1.0 mM의 화합물 8로 4일간 처리된 집단(C)이다. 원형체는 4% 포름알데히드내에 고정되었고, 6 mm의 두꺼운 단편을 취하여 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하기 전에 파라핀에 묻었다.
화합물 8로 처리된 원형체 양자는 세포가 그것들이 세포소멸 중에 있다는 것을 나타내는 모습을 갖는 상당한 중심 영역을 나타낸다. 세포소멸적 모습은 대조군 원형체의 어디에서도 발견되지 않지만, 화합물 8로 처리된 원형체에 있어서는 일반적이다.
화합물 8로 처리된 세포의 2개 형태에 있어서, 제 1 세포형이 다른 것과는 상이하더라도 분명히 약물 효과가 존재한다. T-47D 세포의 원형체에 있어서, 약물 처리된 원형체에 약물 투여량에 무관하게 감소된 부피 성장이 있었다. NHIK 3025 세포의 원형체에 있어서는, 약물에 기인한 원형체 부피 성장의 감소가 없고, 오히려 처리된 원형체에서 제 9일을 지나면서 대조군 원형체보다 빠른 부피 증가가 있었다. 그러나, 이러한 원형체 중에서, 약물 처리된 원형체에 세포소멸을 겪는 상당한 분획의 세포가 있었으므로, 이러한 경우의 사망한 세포로부터의 잔해는 원형체 부피의 많은 부분을 구성한다. 이러한 원형체에서의 빠른 부피 증가는 아마도 세포 단편의 용해에 따른 삼투압의 변화에 기인할 것이다. 팽창 때문에, 원형체는 불안정해지고, 약 제 9일 이후에 분해가 된다.
2가지 세포형 사이의 반응 차이의 이유는 확실히 설명될 수 없다. 그러나, 세포 성장 및 증식의 조율에 대하여 2가지 세포형 사이에 중요한 유전적 차이가 존재하고, 이것은 그 차이의 이유 중 일부가 될 수 있을 것이다. T-47D 세포는 정상 세포내에서 세포 사이클의 진행을 조율하는 데 중요한 통상 종양 억제제인 기능성 pRB, 망막아세포종 단백질을 발현한다. 이 유전자는 종종 암 세포내에서 검출되고, NHIK 3025 세포는 결함된 pRB-기능을 갖는 것에 속한다. pRB는 세포가 세포사이클의 S-단계에 들어가 경우라도 세포를 스트레스 상태하에 묶어두도록 활성될 수 있으며, 이것은 이 유전자가 DNA-합성과 관련된 스트레스 효과의 불활성에 대해 세포를 보호한다는 것을 암시한다[참고문헌: Amellem, Sandvik, Stokke and Pettersen, British Journal of Cancer 77 (1998) 862-872]. 본 연구에서, 벤즈알데히드 유도체는 성장억제 스트레스 영향물로서 작용한다. 그리하여, T-47D-세포가 그들의 기능적 pRB에 의해 보호되어 세포소멸을 유도하지 않지만, 결함된 pRB 기능을 가진 NHIK 3025-세포는 세포소멸을 회피할 수 없게 된다.
pRB의 활성을 시험하기 위하여, 모두가 pRB의 정상 발현을 갖는 상이한 2개의 세포형, T-47D 및 MCF-7-세포를 사용하였다. 핵 결합 pRB 단백질은 유식세포측정기에 의해 측정하였다. DNA의 동시 측정을 수행하였고, 데이타를 pRB-도수분포도에 대한 2개 매개변수적 DNA로 나타내었다. 고정 및 염색 방법은 상기[참고문헌: Amellem, Sandvik, Stokke and Pettersen, British Jounal of Cancer 77 (1998) 862-872]와 같이 수행하였다. 간략하면, 세포를 1.5 ml의 저염 세제 완충액에 다시 부유시킴으로써 세제 추출 세포를 준비하였다. 추출된 핵을 4% 파라포름알데히드에서 1시간 동안 고정하고 나서, pRB가 단백질의 저- 및 고-인화 형태를 모두 인식하는 PMG3-245 단일클론 항체(Pharmingen)와 결합하였다. pRB 항체는 스트렙타비딘(streptavidin)-FITC로 염색되고, DNA는 호에스트(Hoechst) 33258로 염색되었다. 핵은 488 nm 및 UV로 각각 조율된 2개의 아르곤 레이저(Spectra Physics)를 구비한 FACStartplus유식세포측정기(Becton-Dickinson)로 측정되었다.
도 15-18의 데이타는 중간 단계 G1, S 및 G2 각각내의 핵의 분획이 화합물 8의 치료에 따라 핵내에 결합된 RB-단백질을 가짐을 나타낸다. 이러한 방식으로 결합되는 경우에, pRB는 세포 사이클을 벗어난 세포를 조절하는 즉, 세포 사이클 조절을 인계하는 것으로 간주된다[참고문헌: Amellen, Ø., Stokke, T., Sandvik, J. A. & Pettersen, E. O.: The retinoblastoma gene product is reversibly dephosphorylated and bound in the nucleus in S and G2 Phase during hypoxic stress. Exp. Cell Res.227(1996) 106-115]. 데이타는 2가지 형태의 인체 흉부 암 세포, MCF-7(도 15 및 16) 및 T-47D(도 17 및 18)에 대하여, 및 24시간(도 15 및 17) 및 48시간(도 16 및 18)의 약물 치료 시간에 대하여 도시되었다. 2가지 세포형에 대하여, 0.5 mM 초과 농도의 화합물 8은 모든 중간 단계에서 pRB와 결합된 핵의 증가된 분획을 유도한다. 치료 시간이 증가함에 따라 효과가 증가하고, 따라서 24시간의 치료후 보다는 48시간 후에 더욱 두드러지게 된다. 이것은 물질이 pRB에 의한 세포 사이클 조절 작용을 활성시킴으로써 세포 사이클 진행을 감소시키는 것을 의미한다. 그러나, 약물 투여 의존성은 복잡하여, 화합물 8 투여량에 대한 최대 효과는 1 mM 정도에 있고, 약물 투여량의 증가는 효과를 감소시킨다. 따라서, 누드 생쥐내 SK-OV-3 이종이식편에 대한 동물 실험에서 화합무 10에 대해 나타난 바와 똑같이 종상 투여량 반응 곡선을 볼 수 있다(표 1 참조). 1 내지 1.5 mM 초과된 화합물 8의 투여량에 대해 pRB-활성이 감소되는 이유는 지금까지 알려지지 않았지만, 이러한 투여량의 약물에 의해 비교적 강한 단백질 합성 억제가 있음을 주목하는 것이 흥미롭다. NHIK 3025-세포를 1.5 mM의 화합물 8로 24시간 치료한 후에, 단백질 합성 속도는 대조군 세포의 속도의 70%이다(도 19 참조).
도 20에서, 1.5 또는 2.5 mM의 화합물 8로 24시간 치료한 후의 단백질 합성은 각각 75 또는 50%이었지만, 약물을 제거한 후 약 6시간 이내에 정상으로 복귀하게 증가하였다. 아마도 세포 사이클 억제는 감소된 단백질 합성 억제의 결과로서 반드시 수반되는 데[참고문헌: Ronning, O. W., Lindmo, T.,Pettersen, E. O.& Seglen, P. O.: Effect of serum step-down on protein metabolism and proliferation kinetics of NHIK 3025 cells. J. Cell Physiol.107(1981) 47-57], 본질적으로 1.5 내지 2.5 mM 범위의 농도에서 pRB의 조절 효과를 지배하는 것일 것이다.
실시예 5
세포 점착력 측정
세포 점착력을 매니플레이션 포스 마이크로스코프(manipulation force microscope)를 사용하여 측정하였다[참조: G. Sagvolden. Manipulation force microscope. Ph.D. thesis, University of Oslo, 1998, and G.Sagvolden, I. Giaever and J. Feder. Characteristic protein adhesion forces on glass and polystyrene substrates by atomic force microscopy. Langmuir 14(21), 5984-5987, 1998]. 간단히, NHIK 3025 암종 세포를 15% 송아지 태아 혈청을 함유하는 C02-비의존성 배지에서 배양하였다. 세포를 1mM 농도의 화합물 1 또는 화합물 2에 20시간 동안 노출시킨 후, 트립신을 사용하여 세포 배양 플라스크로부터 방출시켰다. 세포를 현탁액 중에 유지시키고, 트립신 반응이 중단된 후 90분에 폴리스티렌 조직 배양 기질에 대해 화합물 1 또는 화합물 2로 배지에 시딩하였다. 세포-기질 점착력을 포스 트랜스듀서(force transducer)로서 작용하는 경사 원자력 마이크로스코프 캔틸레버(cantilever)를 사용하여 세포를 배치시키므로써 측정하였다. 하나의 세포를 특정 시간에 배치시키고, 각 세포를 오직 1회 배치시켰다.
세포가 기질에서 시딩되었기 때문에, 각 세포에 대해 발휘된 최대 포스를 시간의 함수로서 기록하였다. 19개 측정값 군의 중간 포스가 화합물 1 및 2에 노출되지 않은 세포의 점착력과 함께 도 4에 화합물 1 또는 화합물 2에 노출된 세포에 대한 평균 시간의 함수로서 도시되어 있다. 화합물 2는 상기 농도에서 점착력을 감소시키는데 큰 효과를 보여주는 반면, 화합물 1은 두드러진 반응을 나타내지 않는다. 이 화합물의 효과는 주로 세포의 점착력을 감소시키는 것이지 점착력의 시간 경과는 아니다.
기질에 부착하는 능력 감소는 세포의 인테그린 매개된 고착의 블록킹과 관련될 수 있다. 이러한 블록킹은 간암 및 멜라노마 암 둘 모두에 계획된 세포 치사를 유도할 수 있다[참조: Paulsen JE, Hall KS, Rugstad HE, Reichelt KL and Elgjo K, The synthetic hepatic peptides pyroglutamylglutamylglycylserylasparagine and pyroglytamylglutamylglycylserylaspartic acid inhibit growth of MH1C1 rat hepatoma cells transplanted into buffalo rats and athymic mice. Cancer Res.52(1992) 1218-1221. and Mason MD, Allman R, and Quibell M, "Adhesion molecules in melanoma - more than just superglue?" J. Royal Soc. Med.89(1992) 393-395].
NHIK 3025 세포와 기층 간의 점착력은 화합물 1 및 2의 용액 중에 세포를 예비인큐베이팅한 후에 측정하였다. 1mM 농도에서도, 놀라운 D-동위체 효과가 나타났다. 놀랍게도, 화합물 2는 점착력을 대조군에 대해 1/3로 현저히 감소시킨 반면, 화합물 1은 현저한 감소를 유도하지 못하였다. 본 발명자들은 화합물 2가 인테그린의 생합성을 방해하여 기층의 부착하는 세포의 능력을 감소시킬 수 있는 것으로 여겼다. 인테그린은 세포외 매트릭스에 세포를 결합시키는데, 그리고 세포-세포 상호작용에 중요한 구조적 경막 단백질이다. 따라서, 인테그린의 기능 억제는 암 세포의 전이 능력에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다. 이 실험은 인테그린이 단백질 합성 억제에 특히 민감할 수 있음을 시사한다. 따라서, 화합물 2는 암 발병에서 전이 과정을 억제하는데 사용될 수 있다.
실시예 6
프렌드 적백혈병 바이러스(FLV)로 감염된 NMRI 생쥐의 화합물 2 및 화합물 5를 사용한 실험.
바이러스: 에벨린(Eveline) 세포를 게르하르트 헌스만(Gerhard Hunsman, Munich)교수에 의해 공급받았다. 본 발명자들은 원래 프렌드 헬퍼 바이러스의 공급원으로서 사용된 이 바이러스가 4-8주의 지연 후에 NMRI 생쥐에 적백혈병을 유도하는 SFFV(Spleen Focus Forming Virus)와 동일한 크기의 결함 바이러스를 포함함을 나타냈다.
생쥐:NMRI 생쥐를 덴마크의 올드 봄홀드 팜(old Bombholt Farm, Denmark로부터)에서 입수하고, SIFF를 통해 구입하였다. 이들 생쥐를 5월 6일에 접수하여 5월 11일자로 실험에 착수하였다. 이후, 생쥐를 에벨린 배양물로부터의 50㎕ 상청액으로 복강내 투여로 감염시켰다. 24ㅇ시간 후에, 치료를 개시하였다. 화합물 2및 화합물 5를 50㎕를 복강내 투여하는 경우에 kg 당 5mg에 상응하는 농도로 살균된 등장성 글리세롤 용액에 용해시켰다.
이 실험은 하기와 같이 설정하였다:
감염되지 않은 대조군 10마리 생쥐
감염된 대조군 10마리 생쥐
화합물 2로 처리된 감염되지 않은 5마리 생쥐
화합물 2로 처리된 감염된 10마리 생쥐
화합물 5로 처리된 감염되지 않은 5마리 생쥐
화합물 5로 처리된 감염된 10마리 생쥐
생쥐를 19일 동안 일일 1회 복강내 주사액을 주입하였다. 6월 1일부터 6월 16일까지, 생쥐가 희생되지 않는 경우에는 치료를 하지 않았다. 6월 16일에, 생쥐가 희생되었다. 차후 분석을 위해 채혈하였다. 비장을 제거하고, 정량하였다(하기 표 1 참조). 비장의 일부를 얇은 슬라이스를 컷팅(cutting)할 목적으로 질소 하에서 동결시키고, 일부는 포르말린 고정화시켰다.
표 3:
결과는 또한 도 23으로부터 알 수 있다.
알 수 있드시, 감염되지 않은 대조군과 비교하여 감염된 동물에서의 비장 중량의 차이가 컸다. 화합물 2 및 화합물 5로 처리된 감염되지 않은 동물의 중량은 현저하지는 않지만, 감염되지 않은 대조군의 중량보다 높다. 화합물 2로 처리된 감염된 동물이 사실상 유사하게 처리된 감염되지 않은 동물과 비교하여 평균 비장 중량이 더 낮음을 알 수 있다(여기에서, 이 결과가 비교적 큰 비장을 갖는 대조군의 어느 한 동물에 기인한 것으로 가정된다).
조직학적 조사는, 감염되지 않은 대조군이 정상 비장 해부를 가짐을 밝혀냈다. 감염된 비처리된 집단의 모든 동물은 레드 펄파(red pulpa)에 병인적 백혈구 세포의 침입을 갖는다. 감염되지 않은 화합물 2 - 및 화합물 5-로 처리된 동물로부터의 비장은 면역 자극의 발현으로서 해석되는 비대성 배 중심(hypertrophic germinal centra)을 갖는다. 화합물 2로 처리된 감염된 집단으로부터 비장에서의 백혈병 변화는 발견하지 못한다. 화합물 5로 처리된 집단에서, 최대 비장(308g)을가진 동물이 백혈병 변화를 갖는 반면에, 감염된 대조군 집단의 모든 개체가 백혈병 변화를 갖는다.
이 결과는 생쥐의 FLV의 공격성 및 아지도티미딘 및 그 밖의 안티 바이러스 치료로 보여진 것과 상기 결과를 비교하는 경우를 고려하도록 한다.
실시예 7
말초혈 단백 세포의 증식
본 발명자들은 말초혈 단책 세포를 벤즈알데히드, 중수소 처리된 벤즈알데히드, 화합물 2 또는 질라스코르브(2H)와 함께 슈퍼 항원에 노출시키는 실험을 수행하였다. 슈퍼항원은 T-세포의 증식에 매우 활성인 표준 물질로서 사용되며, 항원 제공 세포를 거쳐 T-세포에 제공된다.
상기 실험은 벤즈알데히드, 중수소 처리된 벤즈알데히드 또는 화합물 2를 부가하므로써, 말초혈 단핵 세포의 증식이 종형 투여 의존성 방식으로 현저히 증가되는 반면, 질라스코르브(2H)의 경우에는 영향이 거의 관찰되지 않았다. 슈퍼항원으로부터 증식 신호를 증가시킬 수 있다는 사실은 상기 화합물이 T-세포에 대한 추가의 공동 자극 효과에 의해 작용함을 시사한다.
실시예 8
누드 생쥐에서의 간 침입성 결장직장 암에 대한 효과
물질 및 절차
평가되는 세포주 C170HM2는 공지의 사람 결장직장 세포주(S.A. Watson etal., Eur. J. Cancer 29A(1993), 1740-1745)이며, 환자의 일차 종양으로부터 기원한다. C170HM2 세포를 5% CO2하에 37℃에서 10%(v/v) 열 불활성 송아지 태아 혈청(Sigma, Poole, UK)을 함유하는 RPMI 1640 배지(Gibco, Paisley, UK)에서 시험관내 유지시켰다. 반융합성 단층으로부터의 세포를 0.025% EDTA로 수집하고, 상기 기술된 배지로 2회 세척하였다.
반유합성 세포 단층으로부터 수집된 C170HM2를 1x106/ml의 살균된 포스페이트 완충 염수(pH 7.4[PBS])에서 재현탁시키고, 20MFI 수컷 누드 생쥐(노팅엄 대학교내 암 연구소에서 사육됨)의 보강에 1ml 용량으로 주입하였다. 생쥐를 전자식 표식 시스템(RS Biotech DL2000 Datalogger)에 의해 동정하였다. 세포 주입후 10일째날, 생쥐를 플라세보 대조군(n=생쥐 2마리) 또는 실험군(n=6/집단)으로 변경하기 위해 무작위로 할당하였다;
집단 1: 화합물 1, 5mg/kg
30mg/kg
90mg/kg
집단 2: 화합물 2, 5mg/kg
30mg/kg
90mg/kg
집단 3: 화합물 3, 20mg/kg
40mg/kg
90mg/kg
약물을 제 10일째로부터 정맥내 투여하고 치료가 완료될 때까지 계속 투여하였다. 이 실험은 세포 이식후 40일째에 종료되었다. 생쥐를 파일럿(pilot) 연구 동안 내내 규칙적인 간격으로 정량하였다.
종료시, 간을 노출시키고, 눈에 보이는 간 종양을 계수하고, 이의 총 단면적을 측정하였다. 또한, 종양을 사진촬영하였다. 종양의 액화가 전혀 일어나지 않아서, 정상 간 조직 없이 절개하고, 포르말 염수에서 고정화시켰다. 복막 단괴를 자유 절개하고, 단면적 및 중량을 측정하였다. 종양에 대한 상세한 병리학적 평가를 수행하였다.
화합물 1, 2 및 5의 사람 결장직장 종양, C170HM2의 간 침입에 대한 효과가 도 24에 도시되어 있다.
실시예 9
화합물 1과 비교된 화합물 13의 생물학적 효과
세포 생존율
도 25는 화합물 1(○) 또는 화합물 13(●)으로 20시간 치료된 후, 인체 경부 암종 세포, NHIK 3025에 대한 군락 형성 능력에 의해 측정된 세포 생존을 나타낸다. 세포는 37℃의 CO2-배양기 내에서 배양되는 개방형 플라스틱 페트리 접시내에서 처리되었다. 도시된 생존 곡선은 5개의 동시에 유사하게 처리된 접시의 평균 값을 나타낸다. 표준 오차는 그것이 기호의 크기를 초과하는 모든 경우에 수직 기둥으로 표현하였다. 데이타는 화합물 13이 투여량에 기초하여 화합물 1보다 약 10배 강한 불활성 효과를 유도하는 것으로 나타났다.
실시예 10
화합물 1과 비교된 화합물 14의 생물학적 효과
세포 생존
도 26은 화합물 1(○) 또는 화합물 14(●)로 20시간 치료된 후, 인체 경부 암종 세포, NHIK 3025에 대한 군락 형성 능력에 의해 측정된 세포 생존을 나타낸다. 세포는 37℃의 CO2-배양기 내에서 배양되는 개방형 플라스틱 페트리 접시내에서 처리되었다. 도시된 생존 곡선은 5개의 동시에 유사하게 처리된 접시의 평균 값을 나타낸다. 표준 오차는 그것이 기호의 크기를 초과하는 모든 경우에 수직 기둥으로 표현하였다. 데이타는 두 화합물이 12 mM까지 전체 농도 범위에 걸쳐 유사한 불활성 효과를 유도하는 것으로 나타났다.
실시예 11
화합물 1, 2 및 L-글루코스와 비교되는 화합물 21 및 22의 생물학적 효과
단백질 합성
도 27은 시험 화합물의 첨가 직후(진한 부호) 1시간 동안 또는 2시간 후(빈 부호)에 1시간 동안 혼입된 [3H]-발린의 양을 측정하므로써, 사람 경부 암종 세포 NHIK 3025의 단백질 합성율을 도시한 것이다. 시험 화합물인 화합물 1 및 21은 0시간째부터 펄스의 종료시까지 존재하였다. 모든 세포 단백질이 표지 포화되도록적어도 4일 동안 [14C]-발린으로 사전 표지시켰다. [3H]의 혼입량을 [14C]의 혼입량과 관련시켜 단백질 합성율을 세포의 단백질 전체량의 백분율로서 계산하였다. 단백질 합성율은 처리되지 않은 대조군의 합성율의 백분율로 제시된다. 단백질 합성을 위한 플로팅된 값은 4개의 동시에, 그리고유사하게 처리된 웰의 평균값을 나타낸다. 표준 오차는 부호를 초과하는 모든 경우에 수직 막대로 표시된다. 데이타는 화합물 1이 약물의 증가 농도에 따라 선형 증가하는 단백질 합성 억제를 유도하는 반면, 화합물 21에 의한 효과는 거의 없거나 전혀 없음을 나타내고 있다.
도 28은 시험 화합물의 첨가 직후(진한 부호) 1시간 동안 또는 개시 2시간 후(빈 부호)에 1시간 동안 혼입된 [3H]-발린의 양을 측정하므로써, 사람 경부 암종 세포 NHIK 3025의 단백질 합성율을 도시한 것이다. 시험 화합물인 화합물 2 및 21는 0시간째부터 펄스의 종료시까지 존재하였다. 모든 세포 단백질이 표지 포화되도록 적어도 4일 동안 [14C]-발린으로 사전 표지시켰다. [3H]의 혼입량을 [14C]의 혼입량과 관련시켜 단백질 합성율을 세포의 단백질 전체량의 백분율로서 계산하였다. 단백질 합성율은 처리되지 않은 대조군의 합성율의 백분율로 제시된다. 단백질 합성을 위한 플로팅된 값은 4개의 동시에, 그리고 유사하게 처리된 웰의 평균값을 나타낸다. 표준 오차는 부호를 초과하는 모든 경우에 수직 막대로 표시된다. 데이타는 화합물 2 및 화합물 22 둘 모두가 두 화합물에 대해 대략 동일 수준으로 효과적인 단백질 합성 억제를 유도함을 나타내고 있다. 이들 두 중수소 처리된 화합물 모두는 도 27에 도시된 상응하는 중수소 처리되지 않은 화합물보다 효과적이다.
세포 생존률
도 29는 화합물 1(●) 또는 화합물 21(○)으로 20시간 처리한 후 사람 경부 암종 세포 NHIK 3025에 대한 콜로니 형성 능력으로 측정된 세포 생존력을 도시한 것이다. 세포를 37℃에서 CO2-인큐베이터에서 인큐베이팅되는 개방된 플라스틱 페트리 접시에서 처리하였다. 플롯팅된 생존률 값은 동시에 그리고 유사하게 처리된 5개의 접시로부터의 평균값을 나타낸다. 표준 오차는 부호의 크기를 초과는 모든 경우에서 수직 막대로 표시된다. 이 데이타로부터, 투여 반응 곡선은 두 화합물에 대해 다른 형태를 나타냈으며, 이는 낮은 화합물 농도에서 세포를 불활성화시키는데 있어서 화합물 21이 화합물 1보다 효과적임을 나타내는 것이다. 곡선 형태의 차이는 이들 두가지 약물에 대한 세포 불화성의 메카니즘이 다름을 나타낸다.
도 30은 화합물 2(○) 또는 화합물 22(▲)로 20시간 처리한 후 사람 경부 암종 세포 NHIK 3025에 대한 콜로니 형성 능력으로 측정된 세포 생존률을 도시한 것이다. 세포를 37℃에서 CO2-인큐베이터에서 인큐베이팅되는 개방된 플라스틱 페트리 접시에서 처리하였다. 플롯팅된 생존률 값은 동시에 그리고 유사하게 처리된 5개의 접시로부터의 평균값을 나타낸다. 표준 오차는 부호의 크기를 초과는 모든 경우에서 수직 막대로 표시된다. 화합물 22는 특히 낮은 투여 영역에서 세포를 불활성화시킴에 있어서 화합물 2보다 효과적이다. 예를 들어, 0.5mM의 화합물 22와 4mM의 화합물 2로 처리한 후 세포 생존률이 각각 50%로 감소하였다. 이는 이러한특별한 효과 수준에서 화합물 2와 비교하여 화합물 22의 불활성화 효능이 8배 높음을 나타낸다. 10%의 생존 수준에서, 그 차이는 훨씬 작다.
도 31은 L-글루코스(●) 또는 화합물 21(○)으로 20시간 처리한 후 사람 흉부 암종 세포 T47-D에 대한 콜로니 형성 능력으로 측정된 세포 생존력을 도시한 것이다. 세포를 37℃에서 CO2-인큐베이터에서 인큐베이팅되는 개방된 플라스틱 페트리 접시에서 처리하였다. 플롯팅된 생존률 값은 동시에 그리고 유사하게 처리된 5개의 접시로부터의 평균값을 나타낸다. 표준 오차는 부호의 크기를 초과는 모든 경우에서 수직 막대로 표시된다. 데이타는, L-글루코스가 시험된 최고 투여량인 적어도 10mM까지의 농도에 대해 세포 생존율에 거의 또는 전혀 효과를 가지지 않음을 나타낸다. 화합물 21은 또한 2mM 가지의 농도에 대해서도 이들 세포에 대해 효과가 거의 없으나, 보다 높은 농도에 대해서는 상당한 불활성화 효과를 유도하고 이 화합물 8mM 존재하에서는 단지 1000개의 세포중 하나만 20시간 생존하였다.
결론
시험된 두개의 L-글루코피라노스 유도체(화합물 21 및 22)는 모두 상응하는 D-글루코스피라노스 유도체(화합물 1 및 2)보다 효과적으로 세포를 불활성화시킨다. 그러나, L-글루코스 단독으로는 본원에서 시험된 농도에 대해 현저한 세포 불활성화 효과를 유도하지 못한다. 따라서, 벤질리덴 유도체의 범위에서 D 글루코스와 비교하여 L 글루코스의 이러한 증가된 효과가 발견된 것이다.
실시예 12
오발부민 민감성 및 투여 동물에서 화합물 2의 효과 시험
생후 6주된 수컷 Balb/C 생쥐에 격일로 0.5 ml 식염수 중의 10 ㎍ 오발부민을 7회 복강내 주입하여 민감성으로 만들었다. 최후 주입 후 3주 후에, 생쥐를 매일 8회 오발부민(2 mg/ml) 또는 8회 식염수 연무에 노출시켰는 데, 하루 당 1회 연무를 5분 동안 노출시켰다. 최초 오발부민 투여 전 2일 전에 화합물 2를 가진 식염수 주입 치료를 시작하고, 10일 동안 매일 복강내로 5 mg/kg을 주입하고, 9마리에는 오발부민을 9마리에는 식염수를 주입하였고, 대조군에는 식염수를 주입하였다. 최후 노출 후 24시간 후, 메타콜린에 대한 반응 측면의 통풍로 고반응성이 BUXCO 장비를 이용하여 생체 내에서 측정되었다. BUXCO내에서의 측정 후에, 생쥐를 내려 놓고, 폐를 세척하고, 분리된 세포를 세척하고, 계수하고 분류하였다. 혈액을 취하여 전체 및 오발부민-특이 IgE-수준을 결정하기 위하여 혈청을 분리하였다. 흉부 림프절을 IFN-감마, IL-4, IL-5 및 IL-12를 결정하기 위하여 기관주위 영역 및 기관지주위 영역에서 분리하였다. 시험을 집단 당 9마리에 대해 수행하였다.
식염수 처리된 또는 오발부민 민감성 생쥐내의 세포의 수(도 32)는 화합물 2의 처리에 의해 영향을 받지 않고, 두 집단 사이에 대식세포, 림프구 또는 호산구의 수에 차이가 없었다.
놀랍게도, 호중구의 유입은 화합물 2의 처리에 의해 억제되었다(도 33). 폐세척에서 호중구의 수는 대조군 및 화합물 2로 처리된 오발부민 민감성 동물에 대해 동일하였고, 동시에 호중구의 수는 식염수로 처리된 오발부민 민감성 동물에서증가하였다.
본 발명자의 식견으로는, 이러한 종류의 효과를 주는 약물이 없다. 호중구 유입의 억제는 의약에 있어서 중요한 가치가 있는 데, 왜냐하면 호중구 방출 리소좀 효소에 의해 초래되는 조직의 손상이 폐기종(또한, 흡연에 의해 유도된), 직업성 천식, 염증성 장 질환(크론 병 및 궤양성 대장염과 같은), 류마티즘성 관절염 및 유사 면역 질환에서 매우 중요한 것으로 생각되기 때문이다. 이것은 매우 놀라운 관찰 결과이다.
결론
본 발명의 벤즈알데히드 유도체는 세포 표면의 특정 기 예를 들어, 유리 아미노기와 반응하여 쉬프 염을 형성한다. 단백질 합성, 세포 사이클, 면역 반응 등의 많은 세포 과정이 세포 표면으로부터의 신호에 의해 조절되기 때문에, 이러한 결합은 세포의 거동을 변화시킬 것이다. 세포 표면의 벤즈알데히드 복합물은 세포의 점착 특성을 변화시키는 것을 보였다. 본 발명의 화합물이 암, 자가 면역 이상, 바이러스 감염 및 가능한 기타 원생동물의 감염에 대항하는 새로운 치료법에 유용할 수 있음을 보였다.
벤즈알데히드의 당류 유도체가 간, 신장 및 폐와 같은 특정 기관에서 암을 치료하는 데 다른 탄수화물 유도체보다 놀랍게도 더 효과적이라는 것을 발견하였다. 이러한 현상은 유도체의 당 부분에 대한 이러한 기관의 수용체 친화력과 연관이 있는 것으로 믿어진다.
투여
본 발명에 따른 약제 조성물은 항암 치료, 항바이러스 치료 또는 비정상적으로 증가된 세포 증식에 기인한 질환의 치료 및/또는 자가 면역 이상의 치료에 투여될 수 있다. 또한, 이러한 약제학적 조성물은 면역강화제로서 투여될 수 있다.
이를 위해, 화학식 (Ⅰ)의 화합물은 단독으로 또는 적합한 약제학적 담체 또는 애쥬번트와 혼합하여 환자에게 투여에 적합한 방식으로 제형될 수 있다.
전신 치료를 위해 경구 제제 또는 비경구 제형으로서 제형을 제조하는 것이 특히 바람직하다.
적합한 소장 제제는 정제, 캡슐, 예를 들어, 연질 또는 경질 캡슐, 과립, 그미립자 또는 분말, 시럽, 현탁액, 용액 또는 좌제일 것이다. 이러한 것들은 본 발명의 하나 이상의 화합물을 비독성 불활성 고체 또는 액체 담체와 혼합하므로써 당해 공지된 바와 같이 제조될 것이다.
본 발명에 다르는 적합한 비경구 제제는 주입 또는 주사액이다.
국부적으로 투여되는 경우, 화합물은 국부 제제에 통상적인 비독성 불활성 고체 또는 액체 담체와 함께 화합물을 함유하는 로션, 고약, 크림, 젤, 팅크제, 스프레이 등으로서 제형될 수 있다. 공기, 물 등에 대해 활성 성분을 보호하는 제형을 사용하는 것이 특히 적합하다.
제제는 불활성 또는 약동학적 활성 첨가제를 함유할 수 있다. 예컨대, 정제 또는 과립은 일련의 결합제, 충전제, 담체 물질 및/또는 희석제를 함유할 수 있다. 액체 제제는 예를 들어 살균 용액의 형태로 존재할 수 있다. 캡슐은 활성 성분 이외에 충전제 또는 농후제를 함유할 수 있다. 또한, 맛 개선용 첨가제 뿐만 아니라보존, 안정화, 수분 억제 및 유화제, 삼투압을 변화시키기 위한 염, 완충제 및 그 밖의 첨가제로서 통상적으로 사용되는 물질 또한 존재할 수 있다.
제제가 투여되는 투여량은 지시, 사용 형태 및 투여 경로 뿐만 아니라 환자의 요구 사항에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 평균 성인 환자에 대한 전신 치료를 위한 일일 투여량은 일일 1회 또는 2회 체중당 약 0.01 내지 500mg/kg, 바람직하게는 일일 1회 또는 2회 체중당 0.5 내지 100mg/kg이고, 매우 바람직하게는 일일 1회 또는 2회 1-20mg/kg이다.
경우에 따라, 본 발명의 화합물의 약제학적 제제는 산화방지제, 예를 들어, 토코페롤, N-메틸-토코페라민, 부틸화 히드록시아니졸, 아스코르브산 또는 부틸화 히드록시톨루엔을 함유할 수 있다.

Claims (18)

  1. 암의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제의 제조를 위한 하기 화학식 Ⅰ의 벤즈알데히드 유도체, 또는 그것의 입체 이성질체, 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염의 용도:
    여기에서, L은 H 또는 D이다;
    Ar은 페닐 또는 1-3개 치환체를 가진 치환된 페닐이고, 여기에서 치환체는 동일하거나 상이하며, 1-20개 탄소원자를 가진 알킬, 3-6개 탄소원자를 가진 시클로알킬, 1-6개 탄소원자를 가진 플루오로알킬, 2-6개 탄소원자를 가진 알케닐, 2-6개 탄소원자를 가진 알키닐, 페닐, 할로겐, 니트로, 시아노, NH2, NHR1, N(R1)2, NHC(O)R1또는 N[C(O)R1]2(여기에서 R1는 동일하거나 상이하고, 1-20개 탄소원자를 가진 알킬, 1-6개 탄소원자를 가진 플루오로알킬이고), OR2또는 OC(O)R2(여기에서 R2는 H, D, 1-20개 탄소원자를 가진 알킬, 1-6개 탄소원자를 가진 플루오로알킬이며), SR2, CA(OR1)2또는 CA[OC(O)R1]2(여기에서 A는 H 또는 D이고), C(O)R2, COOR3(여기에서 R3는 H 또는 1-20개 탄소원자를 가진 알킬 또는 1-6개 탄소원자를 가진 플루오로알킬이고), 또는 CON(R3)2(여기에서 R3는 동일하거나 상이하고)를 포함하는 기로부터 선택되고;
    Y는 H, D, 1-20개 탄소원자를 가진 알킬, 3-6개 탄소원자를 가진 시클로알킬, 1-6개 탄소원자를 가진 플루오로알킬, 2-6개 탄소원자를 가진 알케닐, 2-6개 탄소원자를 가진 알키닐, 플루오로, 클로로, 니트로, OR2, OC(O)R2, SR2, NH2, NHR1, N(R1)2(여기에서 R1은 동일하거나 상이하며), NHC(O)R1또는 N[C(O)R1]2를(여기에서 R1은 동일하거나 상이하며) 포함하는 원자 또는 기로부터 선택되며;
    R은 H, D, 1-20개 탄소원자를 가진 알킬, 3-6개 탄소원자를 가진 시클로알킬, 1-6개 탄소원자를 가진 플루오로알킬, 2-6개 탄소원자를 가진 알케닐, 2-6개 탄소원자를 가진 알키닐이며;
    4,6-O-벤질리덴-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-글루코피라노오스, 4,6-벤질리덴-D-알로오스 및 4,6-벤질리덴-D-알로오스의 유도체는 배제된다.
  2. 제 1항에 있어서, 4,6-O-벤질리덴-D-갈락토피라노오스, 메틸4,6-O-벤질리덴-α-D-만노피라노시드, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(4-카르보메톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-만노피라노오스, 2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-α-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 4,6-(2-히드록시벤질리덴)-D-만노피라노오스, 4,6-O-(2-아세톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스 및/또는 4,6-O-(2,3-디히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 또는 대응하는 L-당 이성질체, 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염을 암의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제의 제조를 위해 사용함을 특징으로 하는 용도.
  3. 제 1항에 있어서, 4,6-O-벤질리덴-L-글루코피라노오스 및/또는 4,6-O-(벤질리덴-d1)-L-글루코피라노오스 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염을 암의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제의 제조를 위해 사용함을 특징으로 하는 용도.
  4. 제 1항에 있어서, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-벤질리덴-L-글루코피라노오스 및 4,6-O-(벤질리덴-d1)-L-글루코피라노오스를 제외한 화학식 Ⅰ의 벤즈알데히드 유도체, 또는 그들의 입체이성질체, 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염을 간염 B형 및 C형, 종양원 유두종 바이러스 및 기타 종양원 바이러스와 같은 바이러스에 의해 유도된 암의 예방적 치료를 위한 치료제를 제조하기 위해 사용함을 특징으로 하는 용도.
  5. 제 4항에 있어서, 4,6-O-벤질리덴-D-글루코피라노오스, 4,6-O-벤질리덴-D-갈락토피라노오스, 메틸 4,6-O-벤질리덴-α-D-만노피라노시드, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(4-카르보메톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-만노피라노오스, 2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-α-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-만노피라노오스, 4,6-O-(2-아세톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스 및/또는 4,6-O-(2,3-디히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 또는 대응하는 L-당 이성질체, 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염을 간염 B형 및 C형, 종양원 유두종 바이러스 및 기타 종양원 바이러스와 같은 바이러스에 의해 유도된 암의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제의 제조를 위해 사용함을 특징으로 하는 용도.
  6. 면역 체계의 변경을 통해 바이러스, 원생동물, 균류 및 기타 미생물에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 치료제의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 그들의 입체이성질체, 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염의 용도.
  7. 제 6항에 있어서, 4,6-O-벤질리덴-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-벤질리덴-D-갈락토피라노오스, 메틸 4,6-O-벤질리덴-α-D-만노피라노시드, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(4-카르보메톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-만노피라노오스, 2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-α-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-만노피라노오스, 4,6-O-(2-아세톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스 및/또는 4,6-O-(2,3-디히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 또는 대응하는 L-당 이성질체, 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염을 면역 체계의 변경을 통해 바이러스, 원생동물, 균류 및 기타 미생물에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 치료제의 제조를 위해 사용함을 특징으로 하는 용도.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 4,6-O-벤질리덴-L-글루코피라노오스 및/또는 4,6-O-(벤질리덴-d1)-L-글루코피라노오스 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염을 면역 체계의 변경을 통해 바이러스, 원생동물, 균류 및 기타 미생물에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 치료제의 제조를 위해 사용함을 특징으로 하는 용도.
  9. 4,6-O-벤질리덴-D-글루코피라노오스 및 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-글루코피라노오스를 제외한 화학식 Ⅰ의 벤즈알데히드 유도체, 또는 그들의 입체이성질체, 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염을 비정상적으로 증가된 세포 증식으로부터 유래된 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제를 제조하기 위한 용도.
  10. 제 9항에 있어서, 4,6-O-벤질리덴-D-갈락토피라노오스, 메틸 4,6-O-벤질리덴-α-D-만노피라노시드, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(4-카르보메톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-만노피라노오스, 2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-α-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-만노피라노오스, 4,6-O-(2-아세톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스 및/또는 4,6-O-(2,3-디히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 또는 대응하는 L-당 이성질체, 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염을 비정상적으로 증가된 세포 증식으로부터 유래된 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제를 제조하기 위해 사용함을 특징으로 하는 용도.
  11. 제 9항에 있어서, 4,6-O-벤질리덴-L-글루코피라노오스 및/또는 4,6-O-(벤질리덴-d1)-L-글루코피라노오스 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염을 비정상적으로 증가된 세포 증식으로부터 유래된 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제를 제조하기 위해 사용함을 특징으로 하는 용도.
  12. 류마티즘성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 홍반성 루프스, 좌창, 베흐테루(Bechterew's) 관절염, 진행성 전신성 경화증(PPS), 지루, 및 궤양성 대장염 및 크론 병과 같은 기타 자가 면역 이상과 같은 자가 면역 이상의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제의 제조를 위한 화학식 Ⅰ의 화합물, 또는 그들의 입체이성질체, 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염의 용도.
  13. 제 12항에 있어서, 4,6-O-벤질리덴-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-벤질리덴-D-갈락토피라노오스, 메틸 4,6-O-벤질리덴-α-D-만노피라노시드, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(4-카르보메톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-만노피라노오스, 2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-α-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-만노피라노오스, 4,6-O-(2-아세톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스 및/또는 4,6-O-(2,3-디히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 또는 대응하는 L-당 이성질체, 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염을 류마티즘성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 홍반성 루프스, 좌창, 베흐테루(Bechterew's) 관절염, 진행성 전신성 경화증(PPS), 지루, 및 궤양성 대장염 및 크론 병과 같은 기타 자가 면역 이상과 같은 자가 면역 이상의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제의 제조를 위해 사용함을 특징으로 하는 용도.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 4,6-O-벤질리덴-L-글루코피라노오스 및/또는 4,6-O-(벤질리덴-d1)-L-글루코피라노오스 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염을 류마티즘성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 홍반성 루프스, 좌창,베흐테루(Bechterew's) 관절염, 진행성 전신성 경화증(PPS), 지루, 및 궤양성 대장염 및 크론 병과 같은 기타 자가 면역 이상과 같은 자가 면역 이상의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제의 제조를 위해 사용함을 특징으로 하는 용도.
  15. 벤즈알데히드 유도체가 4,6-O-벤질리덴-D-갈락토피라노오스, 메틸 4,6-O-벤질리덴-α-D-만노피라노시드, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(4-카르보메톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-만노피라노오스, 2-아세트아미도-4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-α-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-만노피라노오스, 4,6-O-(2-아세톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스 및/또는 4,6-O-(2,3-디히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 또는 대응하는 L-당 이성질체, 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염인 치료제로 유용한 벤즈알데히드 유도체.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 따른 벤즈알데히드 유도체, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 벤즈알데히드 유도체를 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 혼입시키는 단계를 포함하여, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  18. 4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(4-카르보메톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-벤질리덴-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-4,6-O-(벤질리덴-d1)-2-디옥시-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(벤질리덴-d1)-D-만노피라노오스, 4,6-O-(3-니트로벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 2-아세트아미도-2-디옥시-4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-갈락토피라노오스, 4,6-O-(2-히드록시벤질리덴)-D-만노피라노오스, 4,6-O-(2-아세톡시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 4,6-O-(2,3-디히드록시벤질리덴)-D-글루코피라노오스, 또는 대응하는 L-당 이성질체, 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염으로 정의된 벤즈알데히드 유도체.
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