KR20010098066A - 펩타이드 신경독소의 화학적 제조 방법 - Google Patents

펩타이드 신경독소의 화학적 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20010098066A
KR20010098066A KR1020000022695A KR20000022695A KR20010098066A KR 20010098066 A KR20010098066 A KR 20010098066A KR 1020000022695 A KR1020000022695 A KR 1020000022695A KR 20000022695 A KR20000022695 A KR 20000022695A KR 20010098066 A KR20010098066 A KR 20010098066A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fmoc
peptide
neurotoxin
amino acid
synthesis
Prior art date
Application number
KR1020000022695A
Other languages
English (en)
Inventor
김재일
민혜정
Original Assignee
김재일
김효근
광주과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 김재일, 김효근, 광주과학기술원 filed Critical 김재일
Priority to KR1020000022695A priority Critical patent/KR20010098066A/ko
Publication of KR20010098066A publication Critical patent/KR20010098066A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 35개의 아미노산 서열(서열 번호 1)을 지닌는 펩타이드 신경독소를 펩타이드 합성에 필요한 아미노산 유도체를 이용 합성하고, 합성된 펩타이드를 시스틴 결합시켜, 3차구조를 갖는 펩타이드 신경독소를 제조한 후, 칼럼을 통해 정제시킴을 특징으로 하는 펩타이드 신경독소의 제조 방법을 제공하는 것이다.

Description

펩타이드 신경독소의 화학적 제조 방법{Method for chemical synthesis of peptide neurotoxin}
본 발명은 펩타이드 신경독소인 하나독소를 펩타이드 합성기를 이용하여 아미노산을 펩타이드 결합시켜 화학적으로 합성하고, 이를 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
펩타이드를 합성하는 방법으로는 현재 유전공학적 방법과 화학적인 합성방법이 널리 사용되고 있다. 유전공학적 방법은 대상 펩타이드를 세포내에서 발현시키기 위해 재조합된 펩타이드 발현 유전자를 필요로 하며, 펩타이드 마다 적합한 발현 시스템을 찾아야 하므로 상당한 시간과 기술을 요구한다.
또한 신경독소 펩타이드의 경우 독성을 가지는 생물학적 활성에 기인하여 매우 낮은 세포 발현율을 나타내는 바, 일반적으로 펩타이드 신경독소의 제조에는 화학적 합성 방법이 널리 이용되고 있다. 그러나 펩타이드 화학 합성의 경우 선형 펩타이드의 합성은 기술적으로 비교적 용이하나 하나독소와 같이 일차배열 속에 복수의 시스테인 아미노산을 가지는 경우는 화학 합성 후의 시스틴 결합형성 및 분리, 정제가 용이하지 않아 고도의 합성 기술을 요구한다.
따라서 시스테인 아미노산을 경유한 생물학적으로 활성인 삼차 구조의 펩타이드를 형성시키는 방법의 개발은 생리활성 펩타이드의 화학 합성에 있어 가장 기술적으로 어려운 단계이다.
본 발명에서는 펩타이드 합성화학을 이용하여 하나독소의 선형 펩타이드를 효율적으로 합성할 수 있는 화학 합성 방법을 개발함은 물론, 생물학적으로 활성을 지닌 시스틴 결합을 형성시키기 위한 외부조건의 설정 및 복수의 불활성 이성체들로부터 생물학적 활성체를 분리 정제하는 제반 기술을 개발하였다.
본 발명의 이루고자 하는 기술적 과제는 천연 존재량이 극소인 하나신경독소를 대량으로 화학 합성 및 분리 정제하는 방법을 제공하는 것이며, 이 방법의 개발을 통해 하나독소와 관련된 신경계의 칼륨 이온 통로의 작용 기작을 밝히는 것은 물론, 신경계 질환치료를 위한 의약적 활용을 용이하게 하고자 하는 것이다.
또한 본 발명을 통해 개발된 시스틴 결합기술은 유전공학적 방법으로 발현하기 어려운 펩타이드 신경독소의 일반적인 화학합성에 널리 이용 가능한 것이다.
도 1은 본 발명의 하나독소의 합성 및 정제 방법의 공정도이다.
도 2는 하나독소의 화학합성 및 분리, 정제 과정동안 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)분석 데이터이다.
a는 고상 펩타이드 합성기에서 합성후 보호기가 제거된 선형펩타이드의 HPLC 분석데이터이며; b는 정제과정을 거친 선형 하나독소의 HPLC 분석 데이터이고; c는 선형 하나독소의 시스틴 결합형성후 HPLC 분석 데이터이며; d는 이온교환 크로마토그래피 후의 HPLC 분석 데이터이고; e는 분취 HPLC 후의 HPLC 분석 데이터이다.
도 3는 CM52 양이온 교환수지를 이용한 양이온교환 크로마토그래피의 데이터이다.
도 4는 고상 펩타이드 합성기에서 화학 합성 후, 보호기를 제거한 선형의 하나독소의 질량분석 결과이다.
도 5는 화학적으로 합성된 하나독소의 정제 후 질량분석 결과이다.
도 6은 천연의 하나독소와 화학적으로 합성, 정제된 하나독소의 HPLC 비교분석 데이터이다.
a는 천연의 하나 독소의 HPLC 데이터이고; b는 화학적으로 합성된 하나독소의 HPLC 데이터이고; c는 천연의 하나독소와 화학적으로 합성된 하나독소의 혼합물을 HPLC에서 분석한 데이터이다.
도 7은 천연의 하나독소와 화학적으로 합성, 정제된 하나독소의 전기생리학적 활성실험 결과이다.
따라서 본 발명의 목적은 35개의 아미노산 서열(서열 번호 1)을 지닌는 펩타이드 신경독소를 펩타이드 합성에 필요한 아미노산 유도체를 이용 합성하고, 합성된 펩타이드를 시스틴 결합시켜, 3차구조를 갖는 펩타이드 신경독소를 제조한 후, 칼럼을 통해 정제시킴을 특징으로 하는 펩타이드 신경독소의 제조 방법을 제공하는 것으로, 상기 합성에 필요한 아미노산 유도체는 Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH에서 선택된 것임을 특징으로 한다.
또한 이때 펩타이드 신경독소의 칼럼분리는 겔여과크로마토그래프법, 이온 교환 크로마토그래프법 및 분취 고성능 액체 크로마토그래피법(HPLC)을 사용하여 분리 정제시킴을 특징으로 한다.
한편, 본 발명에 의해 제조된 펩타이드 신경독소와 그 신경독소를 신경계 질환치료를 위한 의약학적 용도로 사용하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 자연계에 극소량으로 존재하는 독거미(Chilean tarantula) 유래의 펩타이드 신경독소인 '하나독소'를 화학적으로 대량 합성하고, 이를 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
하나독소는 분자내에 6개의 시스테인을 포함하는 35개의 아미노산(서열 번호 1)으로 구성되며, 3개의 시스틴(cystine) 형성으로 인해 구조적으로 안정한 삼차구조를 형성한다. 분자 내에 형성될 수 있는 시스틴의 결합 양식은 15종류가 가능하나 이들 중 생물학적으로 활성을 가지는 결합 양식은 1종류만으로, 나머지는 생물학적으로 불활성인 시스틴 이성체들이다.
본 발명에서는 펩타이드 화학 합성을 이용하여 하나독소의 선형 펩타이드를 효율적으로 합성할 수 있는 화학 합성 방법을 개발함은 물론, 생물학적으로 활성을 가지는 시스틴 결합을 형성시키기 위한 외부조건의 설정, 그리고 복수의 불활성 이성체들로 부터 생물학적 활성체를 분리 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
하나독소는 DRK1이라는 칼륨 이온 통로를 저해하는 현재까지 알려진 유일한 펩타이드 독소로서 전기생리학적 약리학적 이용도에 있어 그 중요성이 크다. 본 발명을 통해 제조된 '하나독소'는 이 독소가 작용하는 생체내의 칼륨 이온 통로와 관련되는 각종 뇌신경계 질병의 치료제 개발을 위한 모델 화합물로서 활용될 수 있다.
이하 본 발명을 첨부된 도면에 의거 더욱 상세히 설명한다.
도 1은 하나독소를 고상 펩타이드 합성기에서 합성한 후 여러 단계의 분리 및 정제과정을 나타내는 개략도이다.
고상 펩타이드 합성법을 사용하여 35개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드(서열 번호 1)를 두 단계에 걸쳐 합성한다. 고상 펩타이드 합성에는 HMP 수지를 사용하여, 먼저 35번째 아미노산부터 14번째 아미노산까지를 합성한 후, 이것을 이분하여 아미노산의 당량을 높여 1번 아미노산까지 합성한다.
상기와 같이 합성된 펩타이드의 각 아미노산의 기능기에 결합된 보호기를 제거하고 겔 여과 크로마토그래프법과 분취 HPLC를 통하여 바르게 합성된 선형 펩티드를 분리한다. 그 후 시스틴 결합을 위한 조건에서 천연의 하나독소와 같은 구조를 갖도록 한다.
또한 이때 펩타이드 합성에 사용된 하나독소 전구체를 살펴보면 다음과 같은 아미노산 유도체을 사용한다.
즉, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH와 같은 보호기로 보호된 아미노산 전구체를 펩타이드 합성에 필요한 아미노산으로 사용하고, 합성 후 보호기를 이탈시켜 원하는 선형 펩타이드를 얻는다.
도 2의 c에서 보는 것 같이 천연의 하나독소와 같은 물질 이외에 많은 이성질체들이 생성되므로 정제가 어려워진다. 그러나 도 3의 CM 52 양이온 교환 크로마토그래프법에서 천연의 물질과 같은 구조와 활성을 가지고 있는 하나 신경독소를 분리하고 분취 HPLC를 통해 정제를 한다.
이하 본 발명의 실시예에서 실험한 반응 조건 및 시험기기 등을 살펴보면 다음과 같다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
반응 조건은 각 아미노산의 기능기에 결합 된 보호기제거를 위한 최상의 반응 조건을 이용하고, 이는 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid): 물 : 페놀 : 티오아니솔(Thioanisole)을 82.5 : 5 : 2.5 : 7.5 : 5의 중량비로 혼합된 용액에서 3시간 반응시키고, 또한 이황화물 결합(시스틴 결합)을 위한 반응 조건은 25mM 암모니움아세테이트(NH4OAc : pH 8.0, 최종 pH 7.8)를 4°C에서 2일간 반응 시킨다.
또한 이때 펩타이드 농도 : GSH: GSSG는 1∼10 : 10∼100 : 1∼10이고, 펩타이드 농도는 1.25 X 10-6∼10-4M이며, 1∼10M GdnHCl와 1∼10mM EDTA를 이용한다.
ⅰ) 겔여과크로마토그래프법 : Sephadex G50, 30% acetic acid
ⅱ) 이온 교환 크로마토그래프법 : CM52 양이온 교환 수지, NH4OAc(0.01M, pH4.5)에서 NH4OAc(0.25M, pH6.5)까지 농도구배로 분취
ⅲ) 분취 HPLC : 역상 고성능 액체 크로마토그래피(C18),
이동상: A : 0.01∼1% TFA/H2O
B : 0.01∼1% TFA/CH3CN
(실시예 1)
도 6은 아프리칸 거미에서 정제한 천연의 하나신경독소와 본 발명에 의하여 화학적으로 합성된 하나 신경독소를 역상 고성능 액체 크로마토그래피법에서 분석한 데이터이다. 천연의 하나 신경독소의 크로마토그래픽적인 특징이 두개의 피크로 나타나며, 합성된 하나 신경독소도 같은 특징을 가지고 있음을 알 수 있으며, 천연의 하나 독소와 합성된 하나독소를 동시에 분석시 같은 물질임을 확신할 수 있다.
(실시예 2)
도 7은 개구리 알을 이용한 이온통로를 저해하는 하나독소의 전기생리학적인 실험 데이터이다. 천연의 하나독소와 합성된 하나독소가 작용하는 이온 통로에 거의 같은 활성을 가지며 저해하는 것을 보여준다.
상기 실시예를 통해 본 발명에서 합성된 하나 신경독소를 천연의 독소와 구조 및 활성이 동등함을 입증하였다.
본 발명의 효과는 하나 신경독소의 합성방법을 제공한 것으로, 이는 천연으로부터 얻을 수 있는 양이 극소량이고 유전학적으로 합성하기 어려운 분자량이 작고 시스틴 결합 등을 요구하는 펩타이드 신경독소의 합성 방법을 제공하는 것이다. 이때, 시스틴 결합시 천연의 물질과 같은 배열을 가지는 것 이외의 많은 이성질체물을 생성하는 경우 분리 정제 방법이 필요하고, 본 발명을 통해 이룩된 합성 방법은 화학적인 합성 과정 중 단지 천연물과 같은 구조를 우세하게 가지는 물질만을 분리 정제하던 기존의 합성 방법에서 오는 한계를 극복하여 보다 효율적으로 펩타이드를 합성할 수 있게 한 것이다.

Claims (5)

  1. 35개의 아미노산 서열(서열 번호 1)을 지닌는 펩타이드 신경독소를 펩타이드 합성에 필요한 아미노산 유도체를 이용 합성하고, 합성된 펩타이드를 시스틴 결합시켜, 3차구조를 갖는 펩타이드 신경독소를 제조한 후, 칼럼을 통해 정제시킴을 특징으로 하는 펩타이드 신경독소의 제조 방법
  2. 제 1항에 있어서, 상기 합성에 필요한 아미노산 유도체는 Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH에서 선택된 것임을 특징으로 하는 펩타이드 신경독소의 제조 방법
  3. 제 1항에 있어서, 펩타이드 신경독소의 칼럼분리는 겔여과크로마토그래프법, 이온 교환 크로마토그래프법 및 분취 고성능 액체 크로마토그래피법(HPLC)을 사용하여 분리 정제시킴을 특징으로 하는 펩타이드 신경독소의 제조 방법
  4. 제 1항에 방법에 의해 제조된 펩타이드 신경독소
  5. 제 4항의 펩타이드 신경독소를 신경계 질환치료를 위한 의약학적 용도로 사용하는 방법
KR1020000022695A 2000-04-28 2000-04-28 펩타이드 신경독소의 화학적 제조 방법 KR20010098066A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020000022695A KR20010098066A (ko) 2000-04-28 2000-04-28 펩타이드 신경독소의 화학적 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020000022695A KR20010098066A (ko) 2000-04-28 2000-04-28 펩타이드 신경독소의 화학적 제조 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20010098066A true KR20010098066A (ko) 2001-11-08

Family

ID=19667424

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020000022695A KR20010098066A (ko) 2000-04-28 2000-04-28 펩타이드 신경독소의 화학적 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20010098066A (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5695959A (en) * 1993-07-07 1997-12-09 Fmc Corporation Recombinant expression of insecticidally effective spider toxin

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5695959A (en) * 1993-07-07 1997-12-09 Fmc Corporation Recombinant expression of insecticidally effective spider toxin

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Eur J Biochem. 1996 Dec 15;242(3):491-8 *
Int J Pept Protein Res. 1990 Oct;36(4):335-43 *
J Pept Res. 1999 Nov;54(5):369-76 *
J Pept Sci. 2000 Feb;6(2):84-93 *
neuron. 1995 oct ;15(4);941-9 *
Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Aug 15;88(16):6981-5 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Haga et al. Functional reconstitution of purified muscarinic receptors and inhibitory guanine nucleotide regulatory protein
Atherton et al. Peptide synthesis. Part 2. Procedures for solid-phase synthesis using N α-fluorenylmethoxycarbonylamino-acids on polyamide supports. Synthesis of substance P and of acyl carrier protein 65–74 decapeptide
McMurray Solid phase synthesis of a cyclic peptide using Fmoc chemistry
Kato et al. Purification and characterization of thrombopoietin
EP0399806A1 (en) Fibronectin derivative
Atherton et al. Peptide synthesis. Part 7. Solid-phase synthesis of conotoxin G1
AU8076398A (en) Improved process for obtaining insulin precursors having correctly bonded cystine bridges
ABEL et al. Synthesis and characterization of indolicidin, a tryptophan‐rich antimicrobial peptide from bovine neutrophils
Joubert The amino acid sequences of three toxins (CM-10, CM-12 and CM-14) from Naja haje annulifera (Egyptian cobra) venom
CA2115246A1 (en) Lanthionine bridged peptides
NZ231997A (en) Motilin-like polypeptides, their use as pharmaceuticals and production by cyanogen bromide cleavage of fusion proteins
Hidaka et al. Disulfide pairings in geographutoxin I, a peptide neurotoxin from Conus geographus
CN106632655B (zh) 一种艾塞那肽的制备方法及其产品
NITZ et al. Synthesis and receptor binding affinity of both E‐and Z‐dehydro‐phenylaline4 enkephalins
KR20210102362A (ko) 플레카나타이드의 개선된 제조 방법
Hidaka et al. Disulfide linkages in a heat-stable enterotoxin (STP) produced by a porcine strain of enterotoxigenic Escherichia coli.
EP0138616A2 (en) Nona- and dodecapeptides for augmenting natural killer cell activity, processes for making them and pharmaceutical compositions comprising them
CN111057129B (zh) 一种用于合成含有两对二硫键的多肽的制备方法及其试剂盒，以及普利卡那肽的制备方法
Noda et al. Synthesis of 5-(((R, S)-5-((9-Fluorenylmethoxycarbonyl) amino)-10, 11-dihydrodibenzo [a, d] cyclohepten-2-yl) oxy) valeric Acid (CHA) and 5-(((R, S)-5-((9-Fluorenylmethoxycarbonyl) amino) dibenzo [a, d]-cyclohepten-2-yl) oxy) valeric Acid (CHE) Handles for the Solid-Phase Synthesis of C-Terminal Peptide Amides under Mild Conditions
JP2506322B2 (ja) Ｇｒｆ前駆体をコ―ドするｄｎａ
KR20010098066A (ko) 펩타이드 신경독소의 화학적 제조 방법
JP6289937B2 (ja) リラキシンの製造方法
US4058512A (en) Synthetic peptides having growth promoting activity
Andrew Peptide synthesis: synthesis of the cysteine-containing peptides of biological and pharmaceutical interest, α-h-ANF and h-big endothelin
Barany et al. Optimized methods for chemical synthesis of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) analogues

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application