KR20010090312A - 바실러스 메센테리쿠스 균주로부터 분리한 플라스미드 ｐＭＭＨ１및 그를 이용한 식용벡터의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인체에 안정적으로 적용할 수 있는 바실러스 메센테리쿠스(KCTC 0750BP) 플라스미드 pMMH1에 관한 것으로, 상기 pMMH1은 일본의 낫또와 한국의 청국장에서 주요한 물성을 구성하고 있는 생중합체 감마-폴리글루탐산 생합성 기능을 지니며, 인체에 무해한 형질전환용 식용벡터로 이용가능한 효과가 있다.

Description

바실러스 메센테리쿠스 균주로부터 분리한 플라스미드 ｐＭＭＨ１{Plasmid pMMH1 isolated from Bacillus mesentericus KCTC 0750BP}
본 발명은 바실러스 메센테리쿠스(KCTC 0750BP) 유래의 형질전환 식용벡터 pMMH1에 관한 것으로, 보다 상세하게는 일본의 낫또와 한국의 청국장에서 주요한 물성을 구성하고 있는 생중합체인 감마-폴리글루탐산를 생합성 기능을 가지며, 인체에 무해하고, 형질전환시 안정적으로 유지될 수 있는 형질전환용 식용벡터 pMMH1에 관한 것이다.
우리나라와 일본을 비롯한 동양지역에서는 오래전부터 바실러스 균주를 식품 생산에 이용해 왔다. 대표적인 청국장이나 낫토(natto)와 같은 여러종의 대두 발효식품으로서 각지역에 따라 고유의 특성은 있지만, 일반적인 방법은 증자한 콩에 바실러스 서브틸리스 계열의 균주를 접종후 2-3일간 배양시키는 것으로서, 배양시 균주에 따라 다량의 점질물(high viscous biopolymer)이 생산되는 것을 관찰할 수 있다.
이러한 방식으로 기존에 이용되어온 균주 및 제품화 경향은 다음과 같다.
청국장은 우리나라 전래의 대두발효식품이지만, 우리나라의 경우 식용방법이 찌개로 제한되어 있고, 균주가 확립되어 있지 않은채로 볏짚등을 사용하여 자연 발효시키고 있기 때문에, 품질 특성이나, 균주 구성등이 일정하지 않은 상태이고, 특유의 불쾌취가 강하게 나고 있기 때문에 근래에는 소비가 점점 줄어들고 있다. 또한 국내에서 구입한 청국장의 경우, 일반 바실러스 서브틸리스를 접종, 발효하여도 일정 정도 생성되는 고유의 점성이 거의 관찰되지 않고 있다. 또한 소금과 고추장으로 간을 한 상태로서 찌개를 하는 용도로 한정하고 있다. 그러나 청국장 고유의 불쾌취는 주로 고유의 바실러스 서브틸리스 이외에 잡균이 같이 발효됨으로서 생성되는 것으로 균주를 선별하고 잡균의 오염을 방지하는 환경에서 제조할 경우 냄새를 최소화 할 수 있다.
낫또는 일본에서 식용되는 대두발효 식품으로, 사용균주는 우리나라 청국장과 거의 동일한 것으로 보인다. 일본의 경우 전국적으로 3개소의 종균보유소가 있어서, 각지의 낫또 제조시설에 균주를 보급하고 있으며, 잡균이 번식하지 않고, 낫또 특유의 점질물이 다량 생성되는 제품이 나오고 있다. 낫또의 경우, 점질물 생성량이 건조중량비 5%이상이며, 순수 발효제품이므로 청국장에서 나타나는 고유의 불쾌취가 매우 적고, 또 아무런 양념을 하지 않은 무미의 상태로 나오기 때문에, 식용시에 여러 가지 용도로 쓸 수 있으며, 영양학적으로도 우수하다고 할 수 있다.
그러나, 이러한 전통적인 식품에 이용되는 이외에 과학적인 배양방법과 분리정제 과정을 거쳐서 산업적으로 이용되는 사례는 아직 찾아보기 힘든데, 이는 최근에야 이에 관련된 미생물소재가 주목받기 시작한 것도 한가지 이유가 될 것이다.
콩 발효식품으로서 제품화 하는 경우에 대하여 구체적으로 살펴보면 최근 유전자조작을 통한 식품의 개발이 이어지면서 인체에 유해한 혹은 그 여부가 검증되지 않은 유전자의 도입에 대한 불안감이 소비자 층에서 증폭되고 있음을 유의하여야 한다.
이러한 상황을 감안하면, 오랫동안 섭취하던 식품미생물에서 분리한 식용벡터(food grade vector) 시스템을 통해 유용 건강물질을 다량 생산해 낼 수 있는 우수한 식용 가능 바실러스 계열의 산업 균주를 개발하여 된장이나 낫또 발효균주로 사용할 경우 인체에 무해하면서도 기능성을 강화한 높은 고부가가치의 된장관련 식품을 제조할 수 있게 될 것이다.
본 발명자들은 식용으로 이용할 수 있는 벡터의 개발을 최종 목표로 하고 한국, 일본을 비롯한 동아시아지역에서 예전부터 이용되어 왔던 바실러스 균주를 분리하고 탐색한 결과, 높은 생산성을 가진 우수균주 및 우수한 발현력을 가진 식용가능한 야생형 플라스미드를 분리할 수 있었고, 상기 분리된 플라스미드의 염기서열 결정 및 제한지도를 작성하고 이를 바탕으로 식품생산 및 건강에 유용한 형질을 새로이 도입하여 안전하게 식품에 적용할 수 있는 식용가능한 벡터를 개발할 수 있어 본 발명을 완성하게 되었다.
이와 같이 본 발명자들은 인체에 적용 가능한 안전하고 안정적인 바실러스 유래의 유래의 천연 벡터를 분리 및 분석하여, 고유의 유전자원으로 구축하였으며 또한 이를 바탕으로 인체에 유용한 기능을 가진 유전형질을 도입하여, 유전적으로 안전한 기능성 식용 벡터(food grade vector)를 구축할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 인체에 안정적으로 적용할 수 있는 바실러스 메센테리쿠스 (KCTC 0750BP) 유래의 플라스미드 pMMH1을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명 플라스미드 pMMH1의 전기영동 사진을 나타내고,
도 2는 본 발명 플라스미드 pMMH1의 유전자지도를 나타내고,
도 3은 본 발명 플라스미드 pMMH1의 염기서열을 나타내고,
도 4는 본 발명 플라스미드 pMMH1으로부터 개발된 발현벡터의 유전자 및 제한효소 절단부위를 나타내는 그림이다.
본 발명자들은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 일차적으로 국내의 토양에서 유용형질을 가진 바실러스 균주를 분리, 스크리닝한 결과 본 발명의 필요에 부응하는 야생형 플라스미드 pMMH1을 분리하고 이의 분석을 실시하였다. 본 발명자들이 확보한 플라스미드 pMMH1은 바실러스 메센테리쿠스 KCTC 0750BP균주내 함유된 것으로, 일본의 낫또와 한국의 청국장에서 주요한 물성을 구성하고 있는 생중합체인 감마-폴리글루타민산 생합성 기능을 가지며, 또한 인체에 무해한 플라스미드로야생형 바실러스에서 안정적으로 다량의 복제수를 유지하고 있으며 발현 효율도 매우 우수하다. 본 발명 pMMH1의 크기는 대략 5.8kb였다.
이차적으로는 상기와 같은 장점을 바탕으로 역시 인간이 섭취해온 식용식물 유래의 유용 유전자를 pMMH1 플라스미드에 재조합하고 활발히 발현이 이루어지도록 벡터를 설계할 수 있으며 인체에 무해하여 그 산물을 안심하고 섭취할 수 있다.
따라서, 본 발명의 플라스미드에 의해 새로운 바실러스 균주에 최적화되고 안정하게 유지될 수 있는 식용가능 벡터의 개발 및 발현시스템을 구축이 가능하게 되었다.
본 발명은 플라스미드를 분리하기 위한 바실러스 균주의 선별 단계; 플라스미드의 분리 및 동정 단계; 상기 분리된 플라스미드의 유전자지도 작성 단계; 및 전체 염기서열 및 암호화 영역 결정 단계로 구성되어진다.
이하, 본 발명의 구성을 보다 하기 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐, 본 발명의 권리범위는 이에 한정된 것은 아니다.
실시예 1 : 바실러스 균주의 선별
유용 플라스미드 탐색을 위한 기초작업으로서 전국 각지의 토양과 대두발효물에서 바실러스 균주를 수집하고, 이를 바탕으로 유용한 균주를 선별하였다. 각각의 균주는 통상의 방법에 의하여 순수 분리한후 고유의 미생물 자원으로 이용할 수 있도록 글리세롤 스탁(glycerol stock) 하였으며, 그 목록은 하기 표1과 같다.
균주 분리원 및 분리 일자
균주 분리원 분리 일자
Bacillus mesentericus(KCTC 0750BP) 보리발효물에서 추출 97.10
Bacillussp. MJ-N1 서울(seoul) 納頭 97.10.20
Bacillussp. MJ-N5 水戶がうあなた 98.3.19
Bacillussp. MJ-N7 평창납두(국산백태) 日本正和공업기술제휴 97.11
Bacillussp. MJ-N8 Osato 유기재배대두사용 98.3.23
Bacillussp. MJ-N9 Osato 水戶の納頭 98.3.20
Bacillussp. MJ-N10 Osato 納頭(큰콩) 98.3.20
Bacillussp. MJ-N11 あかめ 納頭(작은콩) 98.3.12
Bacillussp. MJ-C2 풀무원 청국장 97.12
Bacillussp. MJ-C3 아리랑 식품 청국장 97.12
Bacillussp. MJ-C5 삼대식품 가마솥 청국장 98.4.28
Bacillussp. MJ-C6 완전식품 뚝배기표 청국장 98.3.28
Bacillussp. MJ-C7 광산식품 양념청국장 98.3.25
Bacillussp. MJ-C9 충북지역 일반 가정에서 채취 98.6
Bacillussp. MJ-N10 충북지역 시장에서 구입 98.7
Bacillussp. MJ-MB1 인공 토양에서 분리 99.12
Bacillussp. MJ-MB2 " 99.12
Bacillussp. MJ-MB3 " 99.12
Bacillussp. MJ-BS-T1 " 99.12
Bacillussp. MJ-BS-T2 " 99.12
▶ M~은 보리발효물에서 추출한 균주
▶ N~은 納頭에서 추출한 균주
▶ C~는 청국장에서 추출한 균주
실시예 2 : 플라스미드의 분리 및 동정
실시예 1에서 분리, 선별한 바실러스 균주를 최적화된 배지를 통해 24시간 진탕배양한 후 점질물을 생산하는 균체를 배지에서 추출하고, 통상의 방법에 따라 플라스미드를 정제하여 그 특성을 조사하였다. 특히, 2000년 3월 6일 생명공학연구소 균주센터에 수탁번호 0750BP로 기탁되어 있는 바실러스 메센테리쿠스(KCTC0750BP)에서 분리한 플라스미드는 그 크기가 선형 상태에서 약 5.8kb였으며(도 1), 폴리-글루탐산을 함유하는 점질물 생산을 담당하는 감마-글루타밀트랜스퍼라제 (gamma-GTP) 암호화 유전자를 포함하고 있었으며, 다중 복제수로 존재하고 안정적으로 유지됨을 확인하였으며, 이를 pMMH1이라 명명하였다.
실시예 3 : pMMH1의 유전자 지도
유전정보 데이터베이스에 대한 상동성 검색을 통하여 작성한 플라스미드 pMMH1(5812 base)의 유전자지도는 도 2와 같다. 도 2에 나타낸 바와 같이 pMMH1은 복제기점, 분비 단백질, DNA-결합 단백질 및 시그널 펩티다제 I 및 감마-글루타밀트랜스펩티다아제(gamma-GTP) 암호화 영역을 포함하고 있으며, BamHI, HindIII, EcoRI, PstI 제한효소 절단부위를 지니고 있음을 알 수 있다.
실시예 4 : 전체 염기서열과 암호화 영역 결정
pMMH1의 전체 염기서열 및 암호화 영역(복제기점, 분비단백질, 시그널 펩티다제 I, 감마-글루타밀트랜스퍼라제 및 DNA-결합 단백질)을 도 3(A, B)에 나타내었다.
실시예 5 : 바실러스 형질전환을 위한 고효율의 발현시스템을 가진 식용벡터의 개발
야생형 플라스미드로서 안정성과 높은 발현효율을 갖고 있는 pMMH1 시스템을바실러스에서 유용유전자의 발현에 이용하기위해 벡터내에 발현카세트와 분비시스템을 구축하였다.
우선, pMMH1의 EcoRI 절단부위에 클로람페니콜을 표지인자로 하는 바실러스-이.콜라이 셔틀벡터 및 발현카세트로서의 기능을 담당할 수 있는 플라스미드 pMK4을 삽입하여 유전자 재조합을 위한 일반적인 서브클로닝 및 발현을 수행하고, 벡터가 정상적으로 형질전환되었는지를 확인하기 위한 표지인자로는 인체에 대한 안전성을 확보하기 위하여 바실러스 및 유산균 등에 이용되는 비항생제 선별표지 시스템을 이용하였다. 본 발명에서 엔도글루카나제(endoglucanase)를 도입(도 4)하여 색소환의 형성을 설별표지로 이용하였다.
플라스미드의 복제와 균주내 유지를 위한 시스템은 pMMH1가 가진 기본적인 것을 사용하였고, 순차적 결실(serial deletion) 및 제한효소 절단(restriction cutting)을 통해 플라스미드의 안정성 유지와 높은 발현효율을 보장하는 핵심적인 단편의 위치를 선정하고, 필요없는 부위 및 발현시 모균주의 생육에 장애를 줄 수 있는 부위를 제거하였다. 재조합에 필요한 서브클로닝 작업이 끝난 후, 삽입한 pMK4 단편에서 앰피실린 및 클로람페니콜의 표지인자 부분을 제거하고 발현카세트 부분은 남겨두었다.
최종적으로 바실러스에 다시 형질전환시킴으로써 신규 벡터 시스템 구축을 완료하였다. 또한, 상기 기술한 방법으로 벡터시스템을 구축한 후 도입하였을 때 안정성 및 카피수의 감소가 보일 경우, 셔틀벡터 대신 파아지 유래의 통합벡터 시스템(integration vector system)을 도입한 후 염색체상에 삽입되는 형태로 구성하여 발현시스템을 안정화시킬 수 있었다.
이상 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 바실러스 메센테리쿠스 KCTC 0750BP 유래의 플라스미드 pMMH1은 다중 복제수 상태로 존재하고 안정적으로 유지됨을 확인하여, 본 발명 플라스미드 pMMH1를 통해 유용형질을 도입하여 새로운 고기능성 식용 벡터를 개발할 수 있는 기술을 확보할 수 있어 본 발명은 생명공학 및 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. 바실러스 메센테리쿠스/pMMH1(KCTC 0750BP) 균주로부터 분리한 5.8 kb의 크기, 감마-글루타밀트랜스펩티다아제(gamma-GTP) 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pMMH1.
  2. 제1항의 플라스미드 pMMH1을 안정적으로 유지하고 다중 복제수 유지하게 하는 서열 1과 같은 pMMH1의 복제기점 염기서열.
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