KR20010087383A - 아폽토시스 유전자의 종간 전달 및 이로부터 발생된형질전환된 식물 - Google Patents

아폽토시스 유전자의 종간 전달 및 이로부터 발생된형질전환된 식물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 세포로의 아폽토시스 유전자의 종간 전달, 이로부터 발생된 형질전환된 식물, 및 이러한 식물을 사용하는 선별 분석법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 형질전환된 식물 세포를 이용하여 약물을 개발하기 위한 선별 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 비식물 단백질 및 핵산을 이용하여 식물의 아폽토시스 경로의 성분을 동정하는 방법에 관한 것이다.

Description

아폽토시스 유전자의 종간 전달 및 이로부터 발생된 형질전환된 식물{Trans-species transfer of apoptotic genes and transgenic plants developed thereby}
동물세포에서 프로그램된 세포 사멸(programmed cell death)을 유도하는 복잡한 신호 경로를 이해하는데 최근에 진보가 이루어지고 있는 한편, 식물과 같이 진화상 구분되는 유기체에서 유사한 경로를 동정하는데 연구가 강화되어져 왔다. 식물에서, 프로그램된 세포 사멸-체계는 발생 동안에 특정 지점에서 일어나는 것으로 알려져 있으며 병원체에 반응하여 자발적으로 진행될 수 있다[참조: Woodson, et al., Plant Physiol. 99:526-532, 1992; O'Neill et al., The Plant Cell 5:419-432. 1993; Chasan, The Plant Cell 6:917-919, 1994; Smart, New Phytol.126:419-448, 1994; Keen. Ann. Rev. Genet. 24:447-463, 1990; Lamb, Cell 76:419-422, 1994; Mittler et al., Cell 7:29-42, 1995]. 세포 사멸이 결정적인 역할을 하는 것으로 제안된 질병-관련된 환경 가운데 하나는 수 가지의 양립할 수 없는 식물-미생물 상호작용의 특징인 과민성 내성-연관된(HR) 세포 사멸이다. DNA 서열 및 아폽토시스 덩어리[Wyllie, Curr. Opin. Gen. Dev. 5:97-104, 1995]를 포함한 아폽토시스의 상태를 증명하는 형태학적 증거가 식물 발생, 질병 연관된 사멸 및 과민성 반응[Wang et al., The Plant Cell 8:375-391, 1996; Ryerson and Heath, The Plant Cell 8:393-402, 1996]에서 보고되어온 한편, 식물 세포의 사멸을 조절하는 유전자 및 상응하는 단백질에 대해서 및 동물 세포에서 아폽토시스를 조절하는 것으로 알려져 있는 동물 유전자(척추동물 및 무척추동물)가 식물에서 상동성을 갖고 있는지의 여부에 대해 거의 알려진 바 없다.
동물 조직내에서는 항상성이 아폽토시스의 과정, 즉 프로그램된 세포 사멸의 정상적인 생리학적 과정에 의해 유지된다. 정상적인 세포의 재편을 억제하거나 지연시키는 아폽토시스 경로의 변화는 세포 주기의 조절에 있어서의 비정상성과 마찬가지로 질환의 발병에 중요할 수 있다. 세포 주기 조절 단백질사이의 복잡한 상호작용을 통해 조절되는 세포 분열과 마찬가지로, 아폽토시스는 세포 사멸을 억제 또는 유도하는 유전자 산물의 상호작용에 의해 정상적인 환경하에서 조절된다.
아폽토시스는 배발생, 면역 세포 조절 및 정상적인 세포 재편과 같은 생리학적 과정에 있어서 조직의 항상성을 유지하는 작용을 하기 때문에, 조절된 아폽토시스의 이상 또는 상실은 여러 병리학적 질병 상태를 초래할 수 있다. 예를 들면,아폽토시스의 상실은 많은 자가면역 질병과 함께 발생하는 자가-반응성 임파구의 병리학적 축적을 일으킬 수 있다. 또한, 아폽토시스의 부적절한 상실 또는 억제는 바이러스 감염된 세포 및 과증식성 세포(예, 신생 또는 종양 세포)의 축적을 야기할 수 있다. 유사하게, 아폽토시스의 부적절한 활성화는 또한 예를 들면, 후천성면역결핍증(AIDS), 신경변성 질환 및 허혈성 상해를 포함한 여러 병리학적 질환 상태의 원인이 될 수 있다. 상기 및 기타 병리 증세에 있어서 아폽토시스 경로를 조절하도록 특정적으로 고안된 치료는 그러한 질병 가운데 많은 것들의 자연적인 진행을 변경시키는 것일 수 있다. 따라서, 동물에 있어서 아폽토시스의 인정된 중요성 및 식물의 발생 및 병원체 내성에 있어서 아폽토시스의 보고된 중요성에 비추어[Mittler, in; When Cells Die, Lockshin et al. (eds), pp. 147-174], 식물과 같은 유기체에서 아폽토시스 경로를 이해하는 것은 가치가 있는 것일 수 있다.
비록 아폽토시스는 세포 유전자 산물의 다양한 신호 및 복잡한 상호작용에 의해 매개될지라도 이들 상호작용의 결과는 궁극적으로 사람과 무척추동물 사이에서 진화적으로 보존되는 세포 사멸 경로로 집결된다. 이 경로 자체는 혈액 응집 과정과 유사한 단백질 분해성 자이모겐 활성화 이벤트의 과정을 포함한다. 흥미롭게도, 식물에서 유사한 경로를 동정하고자 하는 노력은 여전히 실현되지 않고 있으며 식물에서의 프로그램된 세포 사멸 경로의 아폽토시스와 함께 포유류 및 무척추동물의 아폽토시스간의 관계는 밝혀지지 않고 있다. 그러나, 과민성 반응뿐만 아니라 식물의 노화는 프로그램된 세포 사멸의 경로와 일치하는 특징을 입증해 준다[Drake, et al., Plant Mol. Biol. 30:755-767, 1996]. 따라서, 식물의 프로그램된 세포 사멸 경로를 이해함으로써 그 경로를 조절하는 방법을 얻을 수 있으며 이에 따라 다양한 생물학적 및 비생물학적 손상에 대한 내성뿐만 아니라 자른 식물, 과실 및 야채의 증가된 저장 수명과 같은 독특한 표현형 특징을 나타내는 세포 사멸 조절인자를 함유한 형질전환된 식물을 수득할 수 있다.
따라서, 당해 분야에서는 식물에서 세포 사멸 경로 성분을 동정하는 방법뿐만 아니라 식물에서 프로그램된 세포 사멸을 조절하는 방법이 필요하다. 게다가, 당해 분야에서는 생물학적 및 비생물학적 손상 내성 식물을 생성하여 작물의 수율 및 생명력을 향상시킬 필요가 있다. 또한, 당해 분야에 있어서는 노화가 감소된 식물 및 식물 산물을 제조할 필요성이 있다. 본 발명은 아폽토시스 경로 단백질을 암호화한 유전자의 종간 전달을 통해 상기 필요성을 충족시켜 주며, 그에 따라 식물 세포의 병리 및 노화를 예방하기 위해 식물의 프로그램된 세포 사멸 경로를 조절할 뿐만 아니라 아폽토시스 억제 및 증가 능력을 위한 화합물을 검정하는 방법 및 조성물을 제공하는 한편, 기타 연관된 이점들을 추가로 제공한다.
발명의 개요
간략히 설명하면, 본 발명은 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 식물에서 아폽토시스를 조절하는 방법을 제공한다.
한 가지 관점으로서, 본 발명은 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질 또는 이의 기능성 변이체를 암호화할 수 있는 하나 이상의 이종 뉴클레오타이드 서열을 함유한 식물 세포를 포함하는 형질전환된(transgenic) 식물을 제공한다. 특정 양태로서, 형질전환된 식물은 아폽토시스 억제 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 여러 양태로서, 뉴클레오타이드는 Ced-9, Bcl-2, IAP, E1B 19K 및 이의 기능성 변이체를 암호화할 수 있다. 또 다른 양태로서, 아폽토시스 경로 단백질의 발현은 조직 특이성, 유도성 또는 구성성 프로모터에 의해 조절된다. 다른 특정 양태로서, 식물은 병원체 또는 노화 내성을 나타낸다. 이하에 상세히 설명되어 있는 바와 같이, 본 발명의 또 다른 추가의 관점은 여러 생물학적 및 비생물학적 내성 식물을 제공한다.
본 발명은 또한 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질 또는 이의 기능성 변이체를 암호화할 수 있는 하나 이상의 이종 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 식물 세포 및 종자를 제공한다. 다른 여러 양태로서, 형질전환된 식물에 대해 상기 주지된 바와 동일한 특징을 갖는 식물 세포가 제공된다.
상기 주지된 바와 같이, 본 발명은 형질전환된 생물학적 손상 내성 식물을 제공한다. 식물은 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질, 바람직하게는 아폽토시스 억제 단백질을 암호화하는 이종 핵산 서열을 함유한다. 특정 양태로서, 아폽토시스 억제 단백질은 Ced-9, Bcl-2, IAP, E1B 19K 및 이의 상동체로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 여러 양태로서, 생물학적 손상은 병원체의 결과이다.
관련된 관점내에서, 형질전환된 생물학적 손상 내성 식물이 제공된다. 식물은 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질, 바람직하게는 아폽토시스 억제 단백질을 암호화하는 이종 핵산 서열을 함유한다. 특정 양태로서, 아폽토시스 억제 단백질은 Ced-9, Bcl-2, IAP, E1B 19K 및 이의 기능성 변이체로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또한, 본 발명은 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하는 하나 이상의 이종 핵산 서열이 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 생성하며, 생물학적 또는 비생물학적 내성을 갖는 형질전환된 식물을 선별함을 포함하여, 형질전환 생물학적 또는 비생물학적 내성 식물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 관점으로서, 식물 세포에 의해 정상적으로 생성되지 않는 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 유도성 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 식물 세포를 식물의 형성에 적합한 조건하에서 배양하며, 식물을 핵산 서열의 전사를 유도하기에 충분한 조건 및 시간 동안 성장시킴을 포함하여, 식물에서 아폽토시스를 조절하는 방법이 제공된다.
또한, cDNA 라이브러리의 각 구성원이 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는 식물 cDNA 라이브러리로 동물 세포(들)를 형질전환시키고, 형질전환된 세포(들)를 아폽토시스 유도제와 접촉시키며, 세포내에서의 아폽토시스 활성을 검출하고, 이 활성을 대조 세포주와 비교하여 활성의 증감으로 식물 cDNA 라이브러리내에 아폽토시스 경로 단백질의 존재를 표시함을 포함하여, 아폽토시스 경로 활성을 나타내는 식물 유전자를 동정하는 방법이 제공된다.
관련된 관점으로서, 본 발명은 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는 이종핵산 분자 한 개 이상으로 한 개 이상의 동물 세포(들)를 형질전환시키고, 형질전환된 세포(들)를 아폽토시스 유도제와 접촉시키며, 세포내에서의 아폽토시스 활성을 검출하고, 이 활성을 대조 세포주와 비교하여 활성의 증감으로 식물에서 작용하는 아폽토시스 경로 유전자의 존재를 표시함을 포함하여, 식물에서 작용하는 아폽토시스 유전자를 동정하는 방법을 제공한다. 특정 양태로서, 이종 핵산 분자는 cDNA 라이브러리의 각 구성원이 프로모터와 작동적으로 연결되어 있는 이종 cDNA 라이브러리를 포함한다.
상기된 본 발명의 형질전환된 식물, 식물 세포 및 방법은 식물의 프로그램된 세포 사멸에 일반적으로 적용가능하다. 따라서, 식물에서 세포 사멸 경로 성분을 동정하는 방법뿐만 아니라 식물에서 프로그램된 세포 사멸을 조절하는 방법이 제공된다. 주지된 바와 같이 본 발명은 또한 작물 수율 및 생명력이 향상된 생물학적 및 비생물학적 손상 내성을 제공한다. 또한, 자른 과실, 야채, 절화 등의 저장 수명이 연장된 노화 감소된 식물 및 식물 산물이 제공된다. 또한, 본 발명은 아폽토시스 억제 및 증가 능력에 대한 화합물을 검정하기 위한 방법 및 조성물에 적용가능한 한편, 추가로 다른 연관된 이점을 제공한다.
본 발명의 상기 및 기타 관점들은 이하의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고로 자명할 것이다. 또한, 여러 참고문헌들이 하기되어 있는데 이들은 특정 절차 또는 조성물(예, 플라스미드 등)을 보다 상세히 기술하고 있음으로써 이들의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다.
본 발명은 일반적으로 식물에서 아폽토시스를 조절하는 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 아폽토시스(apoptosis) 경로 단백질 암호화 유전자를 비식물 종으로부터 식물로 전달시킴으로써 여러 생물학적 및 비생물학적 손상에 대해 증가된 내성을 갖는 식물을 생성할 뿐만 아니라 다른 관련된 이점을 제공하는 방법에 관한 것이다.
도 1A 및 1B는 IAP 암호화 핵산 분자를 포함한 플라스미드의 구성도이다.
도 2A 및 2B는 Bcl-2 암호화 핵산 분자를 포함한 플라스미드의 구성도이다.
도 3A 및 3B는 Ced-9 암호화 핵산 분자를 포함한 플라스미드의 구성도이다.
도 4A 내지 4C는 E1B-19K 암호화 핵산 분자를 포함한 플라스미드의 구성도이다.
도 5는 형질전환된 담배 식물에서의 형질전환된 유전자(transgene) 발현에 대한 노던 블롯 분석을 보여주는 스캐닝 이미지이다. 레인 1 내지 3은 별도의 담배 식물에서의 IAP의 발현을 나타내고, 레인 4는 대조군 벡터로 형질전환된 담배 식물에서의 발현을 나타내며, 레인 5 및 6은 별도의 담배 식물에서의 Ced-9의 발현을 나타낸다.
도 6은 세 개의 형질전환된 담배주(A, C, D) 및 대조군주(B)에 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)을 접종한 후 촬영한 잎 형태의 사진이다.
도 7은 야생형 대조군(A, B, C) 및 두 개의 독립적인 IAP 발현성 형질전환된 담배주(D 및 E)를 담배 모자이크 바이러스(TMV)로 접종한 후 촬영한 잎 형태의 사진이다.
도 8은 Bcl-2를 함유한 일차 담배 형질전환체(글루크 품종)에 대한 노던 블롯 분석을 나타내는 스캐닝 이미지이다. 레인 2, 3, 5 및 7은 Bcl-2 발현을 증명하는 한편, 대조군 레인은 Bcl-2 삽입체가 없는 벡터(G115)로의 형질전환을 나타낸다.
도 9는 Ced-9를 함유한 일차 담배 형질전환체에 대한 노던 블롯 분석을 나타내는 스캐닝 이미지이다. 레인 4 및 8은 발현을 입증한다.
도 10A 및 10B는 Bcl-2 함유 담배를 TMV로 접종한 후 촬영한 잎 형태의 사진이다. 가운데 잎은 야생형인 한편, 나머지 잎은 별도의 Bcl-2 함유 담배 식물로부터 유도된 것이다.
도 11A 및 11B는 Bcl-2 또는 Ced-9 유전자 및 N 유전자를 함유한 담배주(A) 및 Bcl-2 또는 Ced-9 유전자를 함유하지만 N 유전자가 없는 담배주(B)에 대한 웨스턴 블롯 분석의 스캐닝 이미지이다. B는 Bcl-2, C는 Ced-9, T는 TMV이고, A는 접종 부위에 인접한 부분으로부터 채취된 잎 샘플을 나타낸다.
도 12는 Bcl-2 및 Ced-9 함유 담배 식물을 토마토 반점 입고병 바이러스(TSWV)로 접종한 후 촬영한 잎 형태의 사진이다. 상단 및 하단 우측 잎은 대조군인 한편, 상단 좌측 잎은 Ced-9를 함유한 글루크(Glurk) 품종이고 하단 좌측 잎은 Ced-9를 함유한 터키쉬(Turkish) 품종이다.
도 13은 자가수분된 형질전환된 담배 식물의 Ced-9 발현에 대한 노던 블롯 분석의 스캐닝 이미지이다. 레인 1 내지 4는 개개의 자손 식물이다.
도 14A 내지 14C는 자가수분된 형질전환된 담배 식물의 잎 형태를 촬영한 사진이다. 14A는 TMV에 대한 Bcl-2 함유 식물의 내성을 보여주는 한편, 가운데 잎은 포지티브 대조군이다. 14B는 TMV에 대한 Ced-9 함유 식물의 내성을 보여주고 14C는 TSWV에 대한 Ced-9 함유 식물을 보여준다.
도 15는 스클레로티니아 스클레로티오룸 접종된 잎의 형태를 촬영한 사진이다. 하단 잎은 야생형 대조군이고 상단 잎은 Ced-9를 함유한 것이다.
도 16A 및 16B는 자가수분된 형질전환된 Bcl-2를 함유한 식물(A) 및 자가수분된 형질전환된 Ced-9를 함유한 식물(B)를 스클레로티니아로 접종한 후 촬영한 잎 형태의 사진이다.
도 17A 내지 17C는 Bcl-2를 함유한 담배주(A) 및 Ced-9를 함유한 담배주(B 및 C)를 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)로 접종한 후 촬영한 잎 형태의 사진이다.
도 18은 스클레로티니아 내성 식물(레인 5 내지 7) 및 비내성 식물(레인 1 내지 4)에서의 Ced-9 발현에 대한 노던 블롯 분석의 스캐닝 이미지이다.
도 19는 세로코스포라 니코티아내(Cerocospora nicotianae)로 접종한 후 Bcl-2, IAP, Ced-9, E1B 19K 및 대조군(단지 벡터만)을 촬영한 잎 형태의 사진(각각 좌측에서 우측으로)이다.
도 20A 및 20B는 Bcl-xL 함유 담배 식물을 촬영한 잎 형태의 사진이다. 도 20A에서 상단 잎은 Bcl-xL에서 G138A 돌연변이를 함유하는 한편, 하단 잎은 야생형 Bcl-xL을 함유한다. 도 20B에서, 좌측 잎은 Bcl-xL에서 G138A 돌연변이를 함유하는 한편, 우측 잎은 야생형 Bcl-xL을 함유한다.
본 발명을 설명하기에 앞서 이하에 사용되는 특정 용어를 정의함으로써 본발명을 이해하는데 도움이 될 수 있을 것이다.
본원에 사용된 "괴사영양체(necrotroph)"는 세포를 사멸시켜 세포의 생활사를 종료시키고 사멸된 세포의 물질(예, 많은 진균)을 이용함으로써 영양분을 획득하는 병원체를 가리킨다.
본원에 사용된 "생물학적 손상(biotic insult)"은 생균체 또는 생물학적 병원체에 의해 유발된 식물 감염을 가리킨다. 따라서, 생물학적 손상을 일으키는 생물학적 병원체의 예로는 곤충, 진균, 세균, 바이러스, 선충류, 비로이드, 마이코플라스마 등이 포함된다.
본원에 사용된 "비생물학적 손상(abiotic insult)"은 생명이 없는 또는 살아있지 않은 원인체(비생물체)에 의한 식물의 감염을 가리킨다. 따라서, 비생물학적 손상을 일으키는 비생물체의 예로는 낮은 수분(한발), 높은 수분(홍수), 영양 결핍, 방사능 수준, 공기 오염(오존, 산성비, 이산화황 등), 온도(극고온 및 극저온) 및 토양 독성과 같은 환경 요인뿐만 아니라 제초제 피해, 살충제 피해 또는 기타 농경 피해(예, 과다한 비료 사용, 부적당하게 사용된 화합물질의 살포 등)가 포함된다.
본원에 사용된 "아폽토시스 경로 단백질"은 사람, 마우스, 씨. 엘레강스, 드로소필라 멜라노가스터 및 백큘로바이러스(백큘로바이러스의 p35 유전자 제외)의 단백질을 포함하여, 많은 유기체에서 규명된 프로그램된 세포 사멸 경로에 연관된 단백질중 어느 하나를 가리킨다. 또한, "아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자" 또는 "아폽토시스 경로 유전자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 다양한 아폽토시스 경로 단백질이 알려져 있으며 이들은 본 발명의 범주내에서 유용하다. 대표적인 분자로는 카스파제 분자(이들 가운데 14개가 현재 동정되었다), bcl-2 패밀리 구성원(예, bcl-2, bcl-xL, bcl-xs, bcl-W, McL-1, A1, NR-13, Ced-9, E1B 19K, BHRF1, KSHV ORF 16, LMW5-HL, KS-bcl-2, 등), Bax, Bak, Bok, Bad, Bik, Bid, Blk, Hrk, BNIP3, BimL, EGL-1, 아폽토시스의 억제제(예, 1AP-백큘로바이러스, DIAP 1 및 2-드로소필라, c-IAP 1 및 2-사람, X-IAP-사람, NIAP-사람, 서비빈-사람 등) 등이 포함된다. 상기 및 기타 유전자의 서열은 진뱅크 데이터베이스에서 입수가능하며 문헌[When Cells Die, edited by Lockshin et al., Wiley-Liss, New York, 1998]을 포함하여 많은 문헌에 기술되어 있다.
본원에 사용된 "rev-카스파제"는 단백질을 Asp 잔기 이후에서 특정적으로 절단하는 시스테인 프로테아제를 가리키며 작은 아단위는 큰 아단위의 N-말단인 자이모겐으로서 발현된다[참조: PCT WO 제99/00632호].
본 발명의 범주내에서, 아폽토시스 경로 단백질은 야생형 단백질 서열 뿐만 아니라 천연 단백질 서열의 기타 변이체(대립형질체를 포함)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 요컨대, 그러한 변이체는 천연 다형체로부터 기인하거나 재조합 방법에 의해 합성될 수 있으며 야생형 단백질과는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입, 결실 등에 의해 상이하다. 전형적으로, 공학적으로 조작되었을 때 아미노산 치환은 보존적인 치환, 즉 극성, 비극성, 방향족, 하전된 및 기타 아미노산의 그룹내에서의 아미노산의 치환이다. 천연 서열과의 상동성의 영역에 있어서, 변이체는바람직하게는 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 나타내야 하며 특정 양태내에서는 92%, 95% 또는 97% 이상의 동일성을 나타낸다. 이러한 아미노산 서열 및 핵산 동일성은 www.ncbi.nlm.nih.gov에서 입수할 수 있는 내셔날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 BLAST 조사 방법의 이용을 포함한 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 동일성 방법은 non-gapped BLAST 알고리듬이다. 그러나, 문헌[미국 특허 제5,691,179호] 및 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997]에 기술된 동일성 알고리듬이 또한 유용하며 이들 문헌은 본원에 참고로 원용된다. 따라서, 만일 Gapped BLAST 2.0을 사용하는 경우에는 데폴트 세팅을 적용한다. 게다가, 뉴클레오타이드 변이체는 전형적으로 엄격한 하이브리드화 조건하에서 참조 서열과 하이브리드화하기에 충분할 정도로 서열이 유사하다(약 500 bp 이상의 핵산 분자 경우, 엄격한 조건은 융점 이하 25 내지 30℃에서 약 1 M Na+를 포함한 용액, 예를 들면, 약 65℃의 5 x SSPE, 0.5% SDS를 포함한다)[참조: Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1989)]. 일부 변이체는 특정 숙주에서 코돈의 최적화를 위해 도입된 축퇴성과 같은 코돈 축퇴성으로 인해 참조 서열과 하이브리드화하지 않을 수 있으며 이 경우에 아미노산 동일성을 이용하여 변이체와 참조 단백질과의 유사성을 평가할 수 있다.
"분리된 핵산 분자"는 이의 공급원 세포(정상적으로 그 분자가 내재하고 있는 염색체를 포함)로부터 적어도 한번 실질적으로 순수한 형태로 분리된 독립된 단편의 형태로 존재하거나 좀 더 큰 핵산 작제물의 구성원으로서 존재하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 가리킨다. 핵산 분자는 DNA, RNA, 뉴클레오타이드 유사체 또는 이들의 일부 조합체를 포함한 여러 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다.
용어 "시험관내"는 완전한 세포를 포함하지 않는 시스템을 가리킨다.
용어 "생체외"는 예를 들면, 일차 및 이차 세포 배양물, 완전한 기관 배양물 및 유사한 시스템을 포함한 세포 배양 시스템을 가리킨다.
용어 "생체내"는 완전한 유기체를 가리킨다.
본원에 사용된 "유전자 변형"은 하나 이상의 이종 핵산 서열을 하나 이상의 식물 세포내로 도입하여 완전하고, 생식 능력이 있으며, 살아있는 식물을 생성할 수 있는 것을 의미한다. 용어 "형질전환(transgenic)된"과 "유전적으로 변형된(genetically modified)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 상기 언급된 과정을 통해 생성된 식물을 가리킨다. 본 발명의 형질전환된 식물은 배선(germ line)내에 함유된 외래 유전자가 농예학적으로 유용한 식물 변이체내로 삽입되거나 번식될 수 있도록 동일한 종의 다른 식물과 자화수분하거나 이화수분할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "식물 세포"는 원형질체, 생식세포 생성 세포 및 완전한 식물로 재생할 수 있는 세포를 가리킨다. 따라서, 완전한 식물로 재생할 수 있는 다수의 식물 세포를 포함한 종자는 "식물 세포"의 정의에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "식물 조직"은 이들로 한정되는 것은 아니지만 뿌리, 줄기, 지맥, 잎, 화분, 종자, 종양 조직 및 여러 형태의 세포 및 배양물(예, 단일 세포, 원형질체, 배 및 유합 조직)을 포함하여 식물의 분화 및 미분화 조직을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "식물"은 완전한 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포의 그룹(예, 식물 조직)을 가리킨다. 묘목도 또한 "식물"의 의미에 속한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 식물에는 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함하여 형질전환 기술에 적용되기 쉬운 식물이라면 어떠한 것도 포함된다.
단자엽 식물의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 아스파라거스, 옥수수, 사탕옥수수, 보리, 밀, 쌀, 사탕수수, 양파, 수크령(pearl millet), 호밀, 귀리 및 관상식물이 포함된다. 쌍자엽 식물의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 토마토, 감자, 아라비돕시스, 담배, 목화, 평지씨, 콩, 대두, 후추, 상추, 완두, 자주개자리, 클로버, 서양평지 작물 또는 브라시카 올레라세아(예, 양배추, 브로컬리, 꽃양배추, 싹양배추), 무, 당근, 사탕무, 가지, 시금치, 호박, 스쿼시, 멜론, 칸탈루프 멜론, 해바라기 및 여러 관상식물이 포함된다. 본원에서는 예시적인 식물로서 담배 식물이 사용된다.
본원에 사용된 용어 "이종 핵산 서열"은 일반적으로 프로모터와 같은 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있는 하나 이상의 구조 유전자를 가리킨다. 핵산 서열은 이종에서 또는 이의 원형으로부터 실질적으로 변형될지라도 동종에서 유래된다. 예를 들면, 용어 "이종 핵산 서열"은 동종에서 유래된 핵산을 포함하며 이러한 서열은 천연 또는 야생형 프로모터와는 상이한 프로모터와 작동적으로 연결된다.
"구조 유전자"는 전령 RNA(mRNA)로 전사된 다음 특이적인 폴리펩타이드의 특징인 아미노산 서열로 해독되는 DNA 서열이다. 용어 "발현"은 유전자 산물의 생합성을 가리킨다.
용어 "작동적으로 연결된"은 프로모터 서열과 이 프로모터 핵산 서열에 의해 조절되는 구조 유전자 사이의 기능성 연결을 가리킨다. 작동적으로 연결된 프로모터는 구조 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 조절한다.
본원에 사용된 "프로모터"는 구조 유전자의 전사를 유도하는 DNA 서열을 가리킨다. 전형적으로 프로모터는 구조 유전자의 전사 개시 부위에 근접하여 유전자의 5' 영역에 위치한다.
본원에 사용된 "클로닝 벡터"는 숙주 세포에서 자가 복제능이 있는 플라스미드, 코스미드 또는 박테리오파아지와 같은 DNA 분자를 가리킨다. 클로닝 벡터는 전형적으로 외래 DNA 서열이 벡터의 필수적인 생물학적 기능을 상실시키지 않으면서 결정적인 양상으로 삽입될 수 있는 하나 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위뿐만 아니라 클로닝 벡터로 형질전환된 세포를 동정 및 선별하는데 적합하게 사용되는 마커 유전자를 함유한다.
본원에 사용된 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자를 가리킨다. 전형적으로, 유전자 발현은 프로모터, 조직 특이적 조절 요소 및 인핸서를 포함한 특정 조절 요소의 조절하에 설정된다. 이러한 유전자는 주지된 바와 같이 조절 요소에 "작동적으로 연결된다".
본원에 사용된 "병원체"는 이들로 한정되는 것은 아니지만 바이러스, 진균, 세균, 선충류 및 기타 연관된 미생물을 포함하여, 식물에서 질병 또는 질환 상태를일으키는 병원체 모두를 가리킨다.
본원에 사용된 "조절하다"는 기본 수준을 변경시키거나 그로부터 변화시키는 능력을 가리킨다.
본원에 사용된 "억제하다"는 활성의 강도를 차단, 지연 또는 감소시키거나 통계적으로 유의적인 양상을 낳는 능력을 가리킨다.
A. 아폽토시스 경로 유전자 및 유전자 산물
상기 주지된 바와 같이, 본 발명은 아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자를 함유함으로써 유전자를 발현하는 형질전환된 식물 및 식물 조직을 제공한다. 다양한 아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자가 알려져 있으며 본 발명의 범주내에서 유용하다. 대표적인 분자로서 카스파제 분자(이들 가운데 14개가 현재 동정되어 있다), Apaf-1(진뱅크 NM 001160 및 AF013263), bc1-2 패밀리 구성원(예, bcl-2, bcl-xL, bcl-xs, bcl-W, McL-1, A1, NR-13, Ced-9, E1B 19K, BHRF1, KSHV ORF 16, LMW5-HL, KS-bcl-2, 등), Bax, Bak, Bok, Bad, Bik, Bid(진뱅크 NM 001196), Blk, Hrk, BNIP3, BimL, EGL-1, 아폽토시스의 억제제(예, 백큘로바이러스 OpIAP, DIAP 1 및 2-드로소필라, c-IAP 1 및 2-사람, X-IAP-사람, NIAP-사람, 서비빈-사람 등) 등(참조: 예시 목록 및 진뱅크 승인 번호에 대한 하기 표 1)이 포함된다. 본원에 제공된 기술 내용에 따라, 여러 세포 유형으로부터 목적하는 아폽토시스 경로 유전자를 분리하고 식물에 사용하기에 적합한 발현 벡터내로 삽입시킬 수 있다.
아폽토시스 억제 단백질과 아폽토시스 촉진 단백질 및이들의 진뱅크 승인 번호
아폽토시스 억제 단백질 진뱅크 승인 번호
Bcl-2 계열
사람
Bcl-2Bcl-xLMcl-lBfl-l(A1)Bcl-w M14745Z23115, L20121L08246U2746759747
다른 유기체
NR-13Ced-9 씨. 엘레강스Ced-9 씨. 브리그새 X84418, Q90343L26545L26546
바이러스 Bcl-2 동족체
E1B 19KEBV-BHRF1KSHV ORF 16LMW5-HLLMH-5WEAR_ASFB7A9 L19443, AF099665 등A22899U93872L09548Q07818, Q07819P42485AAC58120
세포 IAP
사람
x-IAPcIAP-1cIAP-2NAIP서비빈 U32974, NM001167U45878U45879, NP001157Q13075U75285, NP001159
다른 유기체
dIAP-1 디. 멜라노가스터dIAP-2 디. 멜라노가스터BRUCE Q24306U45881, Q24306CAA76720
바이러스 IAP
IAP3 NPVOPCfMNPVIAPGVCP IAPBSNPV-IAPNPVOP-IAP1NPVAC-IAP1NPVEP-IAPIAP1AcMNPV orf27IAP1NPVLD-IAP P41437AAD00537P41436AAC34373O10296P41435AAD19698AAC63701AAC70325
아폽토시스 억제 단백질과 아폽토시스 촉진 단백질 및이들의 진뱅크 승인 번호
아폽토시스 억제 단백질 진뱅크 승인 번호
FLIPS
사람
FLICE-형 억제 단백질 긴 형태카스퍼FLAME-1-감마MRIT-알파-1I-FLICE우서핀-알파 U97074AF010127AF009618U85059AF041458AF015450
다른 유기체
FLICE-형 억제(마우스)CASH 알파 단백질(마우스)CASH 베타 단백질(마우스) U97076Y14041Y14042
바이러스 FLIPS
MC160LMC159L추정 단백질 E8 U60315U60315U20824
아폽토시스 억제 단백질과 아폽토시스 촉진 단백질 및이들의 진뱅크 승인 번호
아폽토시스 촉진 단백질 진뱅크 승인 번호
Bcl-xSBaxBakBokBadBikNbkBidHrkBlkBimNip-3Egl-1Nip-3 씨. 엘레강스 동족체Boo/DivaApaf-1 Z23116, L20122L22473X84213, U16811, U23765AF027954, AF051093AF031523U34584U49730AF042083, NP001187U76376AF048838AF032457, AF032458AF002697AF0577309AAD32265AF102501, AF067660AF013263, AF149794
카스파제(Caspase)-1카스파제-2카스파제-3카스파제-4카스파제-5카스파제-6카스파제-7카스파제-8카스파제-9카스파제-10카스파제-11카스파제-12카스파제-13카스파제-14 X65019U13021U13737U25804U28015U20536U37448U60520U56390U60519Y13089, P70343Y13090NM 003723AF097874
본원에 기술된 본 발명은 이종 아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자를 발현하는 식물 세포 및 식물 조직을 제공한다. 아폽토시스 경로 유전자는 게놈 DNA 또는 바람직하게는 cDNA 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자의 분리는 전형적으로 당해 분야에 공지된[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989] 또는 시판중에 있는 것을 구입할 수 있는(예, 캘리포니아 팔로 알토 소재 제조원: Clontech) 라이브러리를 작제하기 위한 기술을 통해 일차로 적절한 DNA 라이브러리를 생성함으로써 진행될 수 있다. 요컨대, cDNA 라이브러리는 선별에 적합한 박테리오파아지 벡터(예, λZAPII), 플라스미드 등에서 작제할 수 있는 한편, 게놈 DNA 라이브러리는 염색체성 벡터(예, YAC(효모 인공 염색체)), 박테리오파아지(예, λEMBL3, λgtl1), 코스미드 또는 플라스미드에서 작제할 수 있다.
한 가지 양태로서, 공지된 아폽토시스 경로 핵산 서열을 사용하여 게놈 또는 cDNA 라이브러리에 적합한 올리고뉴클레오타이드 하이브리드화 탐침을 설계할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 올리고뉴클레오타이드 탐침은 길이가 20 내지 30개 염기이다. 하이브리드화 검출을 용이하게 하기 위해, 올리고뉴클레오타이드를 일반적으로 5' 말단에서 통상적으로 방사성핵종(예,32P), 효소적 표지, 단백질 표지, 형광 표지 또는 바이오틴과 같은 리포터 분자로 표지시킬 수 있다. 그런 다음, 그러한 라이브러리는 일반적으로 사용된 벡터에 따라 파아지 또는 콜로니로서 플레이팅된다. 이어서, 콜로니 또는 파아지가 전달된 니트로셀룰로즈 또는 나일론 막을 탐지하여 아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자를 함유하는 후보 클론을 동정한다. 이러한 후보는 예를 들면, DNA 서열 분석 또는 제2 비중복성 탐침과의 하이브리드화를 포함하여 많은 여러 수단에 의해 아폽토시스 경로 단백질 암호 DNA를 함유하는 것으로서 입증될 수 있다.
일단 라이브러리가 아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자를 함유한 것으로 동정된 경우, 유전자는 증폭에 의해 분리할 수 있다. 요컨대, cDNA 라이브러리를 사용할 때 주형 증폭 프라이머로서의 DNA는 공지된 아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자 서열(참조: 표 1)을 기초로 하여 설계한다. 전체 길이 cDNA를 분리하기 위해 증폭용 프라이머는 바람직하게는 5' 및 3' 비해독 영역내의 서열로부터 유도한다. 프라이머는 바람직하게는 약 50%의 GC 함량을 갖고 클로닝을 촉진하기 위한 제한 부위를 함유하며 자체-상보 서열 또는 3' 말단에서 상보 서열을 함유하지 않는다(프라이머-이량체 형성을 방지하기 위해). 프라이머는 cDNA 또는 게놈 DNA에 어닐링시키고 겔 전기영동 및 염색에 의해 쉽게 가시화되는 생성물을 얻기 위해 충분한 증폭 주기를 실시한다. 증폭된 단편을 정제하고, λgt10 또는 pBS(M13+)과 같은 벡터내로 삽입한 다음 증식시킨다. DNA 서열을 분석하거나 간접적으로 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 분석함으로써 단편의 성질을 확인한다.
또한, 다른 방법을 사용하여 아폽토시스 경로 단백질 암호화 핵산 분자를 수득할 수 있다. 예를 들면, 그러한 핵산 분자는 아폽토시스 경로 단백질에 대해 반응성인 항체로 스크리닝함으로써 발현 라이브러리로부터 수득할 수 있다[참조: Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989; Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, NY, 1995].
표준 방법을 이용하여 여러 종으로부터 아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자를 분리할 수 있다. 밀접하게 연관된 종의 경우, 사람 서열 또는 이의 일부는 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리에 대한 탐침으로서 이용할 수 있다. 예를 들면, 카스파제의 경우에, 촉매 부위를 포함하는 단편을 표지하고 마우스, 영장류, 랫트, 개 또는 기타 척추, 온혈 또는 포유류 종으로부터 작제된 라이브러리에 대한 탐침으로서 사용할 수 있다. 정상적인 엄격성 하에서의 초기 하이브리드화로 후보 클론 또는 단편을 수득할 수 있다. 만일 하이브리드화가 초기에 전혀 관찰되지 않은 경우에는 다양한 엄격성 정도를 이용할 수 있다[참조: 상기 Sambrook et al. 및 엄격한 조건에 대해 기타 숙지된 문헌]. 이러한 탐침은 또한 드로소필라와 같이 진화상 다양한 종으로부터 라이브러리를 탐지하는데 사용할 수 있는 한편, 하이브리드화 조건은 더욱 다양할 수 있다.
사람의 서열로부터 설계된 탐침을 이용한 폭넓은 하이브리드화 조건으로 진화상 다양한 종의 아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자를 동정할 수 있는 한편, 이들 유전자를 사람 서열 자체를 필요로 하지 않는 방법을 사용하여 라이브러리로부터 직접 분리하고자 하는 시도가 더욱 유익할 수 있다. 이들 방법으로는 이로써 한정되는 것은 아니지만 보존된 영역으로부터 유도된 프라이머를 이용한 증폭, 여러 영역으로부터의 축퇴성 프라이머를 이용한 증폭, 발현 라이브러리의 항체 탐침 등이 포함된다. 예를 들면, 랜덤-프라임된 증폭(예, 중합효소 연쇄 반응)을 사용할 수 있다[참조: Methods Enzymol. 254:275, 1995; Trends Genet. 11:242, 1995; Liang and Pardee, Science 257:967, 1992; Welsh et al., Nucl. Acids Res. 20:4965, 1992]. 또한, 랜덤-프라임된 PCR의 여러 변형을 이용할 수 있는데특히 특정 유전자 또는 유전자 계열이 필요할 때 그러하다. 이와 같은 방법에 있어서, 증폭 프라이머 가운데 하나는 "고정된 올리고(dT)(올리고(dT)dN)"이고 다른 프라이머는 관련된 유전자의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열을 기초로 이루어진 축퇴성 프라이머이다. 유전자 서열은 아미노산 유사성, 핵산 유사성 및/또는 기능성 등가성에 의해 아폽토시스 경로 단백질로서 동정된다. 또한, 유전자는 기능성과 이차 구조를 비교하거나 기능을 삼차원 포맷의 도메인 구조와 연관시켜 주는 컴퓨터 알고리듬(이러한 알고리듬은 현재 이용되고 있다)을 기초로 하여 아폽토시스 경로 단백질로서 동정할 수 있다. 후보 유전자를 발현시키고 유전자 산물은 표준 아폽토시스 검정 및 본원에 기술된 검정 또는 기타 유사한 검정을 사용하여 효소 활성 및/또는 기타 작용 활성에 대해 검사한다.
본원에 제공된 아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자의 변이체는 천연 변이체(예, 다형체, 스플라이스 변이체, 돌연변이체)로부터 공학적으로 조작되거나, 합성되거나 작제될 수 있다. 돌연변이체를 생성하기 위해 많은 방법이 개발되어 왔다[참조: 일반적으로 상기 Sambrook et al.; 상기 Ausubel, et al. 및 상기 설명]. 요컨대, 소수의 뉴클레오타이드 치환을 형성하기 위한 바람직한 방법은 돌연변이될 염기를 연결하고 돌연변이된 염기를 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 이용한다. 올리고뉴클레오타이드는 상보적인 일본쇄 핵산에 하이브리드화하며 이 올리고뉴클레오타이드로부터 제2쇄 합성이 개시된다. 이본쇄 핵산을 숙주 세포, 예를 들면, 원핵세포, 효모 또는 진핵세포, 전형적으로 이. 콜라이를 형질전환시키기 위해 제조한다. 표준 스크리닝 및 벡터 성장 프로토콜을 사용하여 돌연변이 서열을 확인하고 고수율로 수득한다.
유사하게, 아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자의 결실 및/또는 삽입은 상기 설명된 바와 같이 여러 공지 방법에 의해 작제할 수 있다. 예를 들면, 유전자를 제한 효소로 분해시키고 서열이 결실되도록 재연결시키거나 삽입 또는 대규모 치환이 이루어지도록 추가의 서열과 재연결시킬 수 있다. 변이 서열을 형성하기 위한 다른 수단을 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 문헌[상기 Sambrook 등 및 Ausubel 등의 문헌]에 기술된 방법과 함께 사용할 수 있다. 변이 서열의 검증은 전형적으로 제한 효소 지도작성, 서열 분석 또는 탐침 하이브리드화에 의해 달성된다.
또한, 식물 아폽토시스 경로 단백질에 관한 안티센스 및 리보자임 분자를 발현하는 형질전환된 식물 및 식물 세포가 본 발명의 범위에 속한다. 안티센스 RNA 분자의 발현은 표적화된 mRNA에 결합하여 단백질 해독을 방지함으로써 mRNA의 해독을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 또한, RNA의 특정 절단을 촉매할 수 있는 효소적 RNA 분자인 리보자임의 발현을 사용하여 단백질 해독을 차단할 수 있다. 리보자임 작용의 기작은 리보자임 분자의 상보적인 표적 RNA에 대한 서열 특이적 하이브리드화 및 이후 엔도핵산분해 절단을 포함한다. RNA 서열의 엔도핵산분해 절단을 특이적으로 및 효율적으로 촉매하는 공학적으로 조작된 해머헤드 모티프 리보자임 분자가 본 발명의 범위에 속한다. RNA 분자는 이 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열의 전사에 의해 생성될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이 사용하기 위한 핵산 및 올리고뉴클레오타이드는 당업자에게 알려진 방법에 의해 합성할 수 있다[참조: WO 제93/01286호, 미국 특허원 제07/723,454호, 미국 특허 제5,218,088호, 제5,175,269호 및 제5,109,124호]. 유전자 요법을 위한 안티센스 물질 및 DNA로서 사용하기 위한 리보자임 및 올리고뉴클레오타이드의 동정은 당해 분야에 잘 알려진 방법을 포함한다. 예를 들면, 그와 같은 올리고뉴클레오타이드의 원하는 특성, 길이 및 기타 특징은 잘 알려져 있다.
안티센스 뉴클레오타이드는 서열 특이적 방식으로 mRNA 또는 DNA와 같은 핵산에 결합하는 올리고뉴클레오타이드이다. 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 결합되었을 때 안티센스는 mRNA의 해독을 억제한다[참조: 알트만 등의 미국 특허 제5,168,053호; 이노우에의 미국 특허 제5,190,931호; 부르크의 미국 특허 제5,135,917호; 스미스의 미국 특허 제5,087,617호; 및 아령 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 기술하고 있는 Clusel et al., Nucl. Acids Res. 21:3405-3411, 1993]. 삼중쇄 분자는 일본쇄 DNA가 이본쇄 DNA와 결합하여 형성된 대응직선 삼중쇄 분자를 가리키며 이로써 전사를 억제한다[참조: 이본쇄 DNA상의 표적 부위에 결합하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 방법이 기술되어 있는 호간 등의 미국 특허 제5,176,996호].
특히 유용한 안티센스 뉴클레오타이드 및 삼중쇄 분자는 아폽토시스 경로를 조절하는데 연관되어 있는 단백질 또는 단백질의 해독의 억제가 바람직하도록 다른 원하지 않는 과정을 매개하는 단백질을 암호화한 DNA 또는 mRNA의 센스 쇄에 상보적이거나 결합하는 분자이다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 설폰, 설페이트, 케틸, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스페이트 에스테르와 같은 연결 및 기타 다른 연결을 사용함으로써 내인성 핵산분해 효소에 의한 분해에 견딜 수 있도록 설계된다[참조: Agrwal et al., Tetrehedron Lett. 28:3539-3542, 1987; Miller et al., J. Am. Chem. Soc. 93:6657-6665, 1971; Stec et al., Tetrehedron Lett. 26:2191-2194, 1985; Moody et al., Nucl. Acids Res. 12:4769-4782, 1989; Uznanski et al., Nucl. Acids Res., 1989; Letsinger et al., Tetrahedron 40:137-143, 1984; Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54:367-402, 1985; Eckstein, Trends Biol. Sci. 14:97-100, 1989; Stein, in; Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, pp. 97-117, 1989; Jager et al., Biochemistry 27:7237-7246, 1988].
식물에서 생성된 아폽토시스 경로 단백질은 친화성 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 금속 이온 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC 및 기타 공지된 단백질 분리 방법과 같은 표준 방법에 의해 분리할 수 있다[참조: 일반적으로 상기 Ausubel 등; 상기 Sambrook 등]. 분리된 정제 단백질은 쿠마씨 블루로 염색했을 때 SDS-PAGE에서 단일 밴드를 제공한다. 본 발명은 내인성 식물 아폽토시스 경로 단백질의 생성뿐만 아니라 비식물 아폽토시스 단백질(예, 포유류 아폽토시스 단백질)의 재조합 생성을 포함함으로써 식물을 재조합 생성 비히클로서 이용함을 인식해야 한다. 또한, 본 발명은 동물 유전자 및 이들의 식물 세포에서의 기능을 연구하는데 사용할 수 있다. 따라서, 이하에 상세히 기술된 바와 같이,아폽토시스를 억제하는 아폽토시스 경로 단백질을 함유하는 형질전환된 식물을 생성함으로써, 비-아폽토시스 연관된 펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하여 많은 펩타이드 및 폴리펩타이드의 재조합 생성은 내인성 또는 이종 폴리펩타이드(예, 항체)의 재조합 생성과 연관된 세포 사멸 이벤트를 줄여 상당히 향상시킬 수 있다.
아폽토시스 경로 단백질은 hexa-his 융합 단백질로서 발현되고 니켈-결합된 비드와 같은 금속-함유 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다. 요컨대, His6를 암호화한 서열은 아폽토시스 경로 단백질을 암호화한 DNA 서열에 연결된다. 비록 His6서열은 분자내의 어느 곳에든 위치할 수 있을 지라도, 바람직하게는 His6서열은 종결 코돈 바로 앞의 3' 말단에 연결된다. 융합은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 편리한 방법은 His6에 대한 코돈을 함유하는 하류 프라이머를 사용하여 아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자를 증폭시키는 것이다.
정제된 아폽토시스 경로 단백질은 억제 화합물을 선별하기 위한 검정에 사용할 수 있다. 이들 검정은 시험관내 또는 생체내에서 실시할 수 있으며 본원에 기술된 방법 또는 당해 분야에 공지된 방법을 이용한다. 또한, 단백질을 결정화하고 X-선 분석하여 이의 삼차원 구조를 결정하거나 항체를 유도하는데 사용할 수 있다. 또한, 하기된 바와 같이, 아폽토시스 경로 단백질을 암호화한 이종 핵산을 식물에서 발현시켜 식물 세포가 아폽토시스의 억제제 및 촉진제에 대한 선별 검정에 사용될 수 있도록 할 수 있다.
B. 벡터 및 형질전환 방법
아폽토시스 경로 단백질은 여러 숙주 유기체에서 발현될 수 있다. 그러나, 본원에 주지된 바와 같이, 이러한 단백질은 특히 유사한 아폽토시스 경로 단백질이 전혀 동정되지 않은 식물 세포내에 설정되었을 때 예상하지 못한 이점을 제공한다. 예를 들면, 식물 세포에서 발현되었을 때 아폽토시스 경로 억제 단백질은 진균 및 바이러스 감염에 대한 내성을 포함한 생물 및 비생물 손상 내성을 증가시키는데 사용할 수 있다. 또한, 식물에서 세포 사멸을 조절하는 능력은 식물내에서 살충 화합물(예, 바실러스 투린지엔시스 암호화된 독소)[참조: PCT 출원 WO 제97/34926호]의 발현을 결부시키는 능력을 제공한다. 따라서, 식물내에서 좀 더 고도의 살충 내성은 특정 유형 또는 수준의 살충 화합물을 발현할 때 프로그램된 세포 사멸 주기를 정상적으로 개시하는 식물에서 달성될 수 있다. 유사하게, 좀 더 고도의 살충 내성은 살충제에 의해 유도된 프로그램된 세포 사멸 이벤트에 대한 식물 세포의 내성을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 유전 물질의 전달은 많은 식물 유형에서 일상적인 것이며 모든 식물 유형에서 다양한 정도로 가능하다. 당업자는 식물 세포에서 발현시키기 위한 벡터로서 적합하고 쉽게 얻을 수 있는 것들이 아주 많이 있음을 인식할 것이다.
1. 벡터
본 발명의 형질전환된 식물은 프로그램된 세포 사멸(즉, 아폽토시스)을 조절하는 단백질을 암호화하는 구조 유전자를 하나 이상 함유하는 이종 핵산 서열을 포함한 벡터로 식물 세포를 접촉시킴으로써 생성된다. 식물 세포내로 한번에 효과적으로 도입하기 위해, 목적하는 구조 유전자는 식물 세포에서 그 유전자의 전사를 효과적으로 유도하는 프로모터와 작동적으로 연결되어야 한다. 또한, 식물 세포에서 인식되는 폴리아데닐화 서열 또는 전사 조절 서열을 사용할 수 있다. 이종 핵산 서열을 함유한 벡터는 또한 형질전환된 세포를 본원에 기술된 바와 같이 배양물에서 비형질전환된 세포와 쉽게 선별할 수 있도록 한 개 이상의 선별가능한 마커 유전자를 함유하는 것이 바람직하다.
당업자는 비교적 완전한 상태로 이종 핵산 서열을 도입하는데 적합한 벡터를 선택할 수 있을 것이다. 따라서, 도입된 DNA 서열을 함유한 식물을 생성하는 어떠한 벡터도 충분하다. 따라서, 단지 낮은 효율의 형질전환이 일어날지라도 나출형(naked) DNA를 사용할 수 있다. 벡터의 선택 또는 벡터의 사용 여부는 전형적으로 선택된 형질전환 방법에 의해 결정된다.
요컨대, 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 숙주 식물 세포에 적합한 발현 벡터내로 도입된다. 특정 양태로서 아폽토시스 경로 단백질은 아폽토시스의 억제제인 한편, 다른 양태로서 아폽토시스 경로 단백질은 아폽토시스의 촉진제 또는 개시제이다. 바람직한 억제제로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 IAP, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-W, McL-1, A1, NR13, CED-9, E1B 19K, BHRF1, Bag-1 등이 포함된다. 다른 양태로서, 아폽토시스 경로 단백질 암호화 핵산은 벡터내로 삽입되고 융합 단백질이 생성되도록 다른 폴리펩타이드 암호화 핵산 분자에 연결된다. 아폽토시스 경로 단백질 서열은 본원에 기술된 바와 같이 유도된다. 상기 논의된 바와같이, 서열은 다수의 코돈을 갖는 각 아미노산에 대해 다른 코돈을 함유할 수 있다. 다른 코돈은 숙주 종에 대해 "최적"으로서 선택될 수 있으며 이러한 최적화 프로토콜은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 게다가, 제한 부위는 전형적으로 프라이머 서열내로 삽입되며 벡터의 클로닝 부위와 관련하여 선택된다. 필요한 경우, 해독 개시 및 종결 코돈이 프라이머 서열내로 공학적으로 삽입될 수 있다.
최소한, 벡터는 프로모터 서열을 함유해야 한다. 상기 주지된 바와 같이, "프로모터"는 연결/결합된 유전자의 전사를 유도하는 요소를 함유한 뉴클레오타이드 서열을 가리킨다. 최소한, 프로모터는 RNA 폴리머라제 결합 부위를 함유한다. 보다 전형적으로, 진핵세포에서 프로모터 서열은 유전자 발현의 속도 및 시간을 조절하는 다른 전사 인자에 대한 결합 부위를 함유한다. 이러한 부위로는 TATA 박스, CAAT 박스, POU 박스, AP1 결합 부위 등이 포함된다. 프로모터 영역은 또한 인핸서 요소를 함유할 수 있다. 프로모터가 유전자의 전사가 가능하도록 유전자에 연결될 때 프로모터는 유전자와 "작동적으로 연결/결합"된다.
다른 조절 서열이 또한 포함될 수 있다. 이러한 서열로는 전사 종결 시그날 서열, 인트론, 분비 시그날 서열, 복제 오리진, 선별 마커 등이 포함된다. 조절 서열은 전사 또는 해독을 가능하게 하는 또 다른 서열과 작동적으로 연결된다.
본원에 사용된 발현 벡터는 식물 숙주 세포에서 단백질의 발현을 위해 설계된 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터가 널리 이용되고 있으며 당해 분야에 잘 알려져 있다. 유도성 또는 구성성 프로모터가 바람직하다.
다른 바람직한 양태로서, 벡터는 또한 전사 터미네이터 서열을 포함한다. "전사 터미네이터 영역"은 선택된 프로모터를 인식하는 폴리머라제에 의해 전사를 종결하는 시그날을 제공하는 서열 및/또는 폴리아데닐화를 위한 시그날 서열을 포함한다.
상기 주지된 바와 같이, 본 발명에 사용된 벡터는 일반적으로 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하는 구조 유전자 한 개 이상이 프로모터와 작동적으로 연결되어 있는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명에 따라 형질전환 과정을 개시하기 위해, 우선은 적합한 벡터를 작제하고 이를 적절하게 식물 세포내로 도입할 필요가 있다. 본원에 사용된 벡터의 작제에 대한 세부 내용은 필수적인 형질전환 방법과 마찬가지로 식물 유전공학 분야의 숙련가에게 알려져 있다. 이들에 관한 내용은 본원에 상세히 논의되고 있다. 전형적으로 발현 벡터는 세균 숙주에서 발현 벡터의 성장 및 선별을 제공하기 위한 세균 복제 오리진(예, 이. 콜라이 ori) 및 리포터 유전자 또는 선별 마커(예, 항생제 내성)를 암호화하는 원핵성 핵산 요소; 식물 및 세균의 성장을 위한 프로모터와 같은 전사의 개시를 조절하는 핵산 요소; 전사 종결/폴리아데닐화 서열과 같은 전사체의 프로세싱을 조절하는 핵산 요소; 및 프로모터와 작동적으로 연결되는 리포터 유전자 또는 마커를 함유한다. 유용한 리포터 유전자로는 β-글루쿠로니다제, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 루시퍼라제 등이 포함된다. 바람직한 리포터 유전자는 β-글루쿠로니다제(GUS) 또는 녹색 형광 단백질(GFP)이다. 바람직한 선별 마커로는 G418, 하이그로마이신, 카나마이신, 바이알로포스(bialophos)(bar 유전자에 의해 제공됨)과 같은 항생제 내성이 포함된다. 특정 양태로서, 세균 발현 시스템을 사용하여 목적하는 유전자를 절단하기 위한 후속되는 제한 엔도뉴클레아제 분해를 위한 작제물의 양을 합성한다. 그런 다음, 목적하는 유전자를 식물 발현 벡터내로 연결하고 이를 사용하여 식물 세포를 형질전환시킨다. 따라서, 당업자는 식물과 상반되는 세균에서 완전히 다른 리포터 유전자 또는 선별 마커를 사용할 수 있음을 인식할 것이다. 바람직한 세균 선별은 암피실린 내성을 사용하여 실시하는 한편, 형질전환(transgenic) 세포는 전형적으로 카나마이신 내성을 기초로 하여 선별된다.
식물 발현 벡터 및 리포터 유전자에 대한 일반적인 설명은 문헌[Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation, in Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology" in Glich et al., Eds. pp. 89-119, CRC Press, 1993]에서 찾아볼 수 있다. 게다가, GUS 발현 벡터 및 GUS 유전자 카세트는 제조원(캘리포니아 팔로 알토 소재 Clontech Laboratories, Inc.)으로부터 입수가 가능한 한편, GFP 발현 벡터 및 GFP 유전자 카세트는 제조원(캘리포니아 샌 디에고 소재 Aurora Biosciences)으로부터 입수가 가능하다.
또한, 아폽토시스 경로 단백질을 암호화한 핵산 서열은 분비 시그날을 포함하며, 이에 따라 생성된 폴리펩타이드는 전구체 단백질로 프로세싱되고 분비된다. 프로세싱된 단백질 생성물은 식물 세포 또는 조직 또는 체관부로부터 회수할 수 있다. 사용에 적합한 분비 시그날은 널리 이용되고 있으며 당해 분야에 잘 알려져 있다[참조: During et al., Plant Mol. Biol. 15:281-293, 1990; Lindsey and Jones in: Plant Cell Line Selection, pp. 317-335, VCH Weinham, Germany, 1990; Gruber and Crosby in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,pp. 89-117, CRC Press, Boca Raton, FL, 1993].
본 발명에 사용된 이종 핵산 서열은 Ti 플라스미드, 뿌리-유도성(Ri) 플라스미드, 입자 충격법(particle bombardment), 전기천공법 및 식물 바이러스 벡터를 사용하여 식물 세포내로 도입할 수 있다(이들 기술 및 벡터는 문헌[Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Secretion VHI, pp. 421-463; 1988; Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9, 1988, and Horsch et al., Science 227:1229, 1985; and Gene Transfer to Plants, eds. Potrykus. Springer Verlaa, 1995]에서 찾아 볼 수 있다). 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다.
게놈성 단편 또는 합성 단편을 함유하는 발현 벡터는 원형질체 또는 완전한 조직 또는 분리된 세포내로 도입될 수 있다. 바람직하게는 발현 벡터는 완전한 조직내로 도입된다. 식물 조직을 배양하는 일반적인 방법은 문헌[Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glich et al. Eds., pp. 67-88 CRC Press, 1993 및 Phillips et al., Corn & Corn Improvement, 3rd Edition, Sprague et al., Eds. American Society of Agronomy Inc. et al. pp. 345-387 1988]에서 찾아 볼 수 있으며 이하에 보다 자세하게 기술되어 있다.
2. 프로모터
일단 숙주 식물이 선택되고 식물내로 유전자의 전달 방법이 결정되었으면, 외래 단백질이 식물의 원하는 부위(예, 모든 세포, 일부 세포 또는 전체 조직)에서발현되도록 숙주 식물을 위한 구성성, 유도성/발생적으로 조절되는 또는 조직 특이적 프로모터를 선택한다. 당업자라면 쉽게 인지할 수 있듯이, 어떠한 식물 양립성 프로모터도 구조 유전자, 특히 아폽토시스 경로 유전자의 발현을 구동하는데 사용할 수 있다. 비록 목적하는 구조 유전자의 내인성 프로모터가 유전자의 전사 조절을 위해 사용될 수 있을 지라도 바람직한 프로모터는 외인성 조절 서열이다. 식물 발현 벡터를 위해 적합한 바이러스 프로모터로는 CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터[Brisson et al., Nature 310:511, 1984; Odell et al., Nature 313:810, 1985]; 현삼 모자이크 바이러스(FMV)로부터의 전체 길이 전사 프로모터[Gowda et al., J. Cell Biochem. 13D: 301, 1989 및 미국 특허 제5,378,619호] 및 TMV에 대한 염소 단백질 프로모터[Takamatsu et al., EMBO J 6:307, 1987]가 포함된다. 또한, 리불로오스 비스-포스페이트 카복실라제의 작은 아단위(ssRUBISCO)로부터의 광-유도성 프로모터[Coruzzi et al., EMBO J 3:1671, 1984; Broglie et al., Science 224:838, 1984]; 만노핀 신타제 프로모터[Velten et al., EMBO J 3:2723, 1984], 노팔린 신타제(NOS) 및 옥토핀 신타제(OCS) 프로모터(아그로박테리움 투메파시엔스의 종양-유도성 플라스미드상에 포함됨) 또는 열 쇼크 프로모터(예, 대두 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B)[Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6:559, 1986; Severin et al., Plant Mol. Biol. 15:827, 1990]과 같은 식물 프로모터가 사용될 수 있다. 본 발명의 범주내에서 사용하기에 적합한 여러 공지된 식물 프로모터는 문헌[PCT 출원 WO 제91/19806호]에서 찾아 볼 수 있다.
a. 구성성 프로모터
본 발명의 범위내에서 유용한 프로모터로는 구성성 및 유도성 천연 프로모터뿐만 아니라 공학적으로 조작된 프로모터가 포함된다. 이러한 프로모터들은 식물, 바이러스 또는 기타 공급원으로부터 얻을 수 있으며 이들 프로모터로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 본원에 사용된 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 프로모터("CaMV 35S" 프로모터는 CaMV 35S 프로모터의 변이체 및 유사체, 예를 들면, 오퍼레이터 영역과의 연결 수단, 랜덤 또는 조절된 돌연변이유발에 의해 유도된 프로모터, 병렬 프로모터 등을 포함한다); 종자 저장 단백질 유전자, 예를 들면, Zma10Kz 또는 Zmag12(각각 옥수수 제인 및 글루텔린 유전자) 또는 모든 세포에서 발현하는 "하우스키핑 유전자"(예, 옥수수 액틴 유전자인 Zmaact)가 포함된다[참조: Benfey et al., Science 244:174-181, 1989; Elliston in Plant Biotechnology, eds. Kung and Arntzen, Butterworth Publishers, Boston, Mass., p. 115-139, 1989]. 따라서, 본 발명은 감자의 파파틴 유전자 프로모터와 같은 식용 식물 부위에서 고도의 발현을 제공하는 것으로 알려진 유전자에 대한 프로모터를 사용할 수 있다[참조: Wenzler et al., Plant Mol. Biol. 12:41-45, 1989]. CaMV 프로모터가 구성성 프로모터의 흔한 예이지만 유비퀴틴 프로모터[참조: 유럽 특허원 제0342926호] 및 클로렐라 바이러스 DNA 메틸트랜스퍼라제 프로모터[참조: 미국 특허 제5,563,328호] 또한 대표적인 예이다.
b. 유도성 프로모터
상기 주지된 바와 같이, 유도성 프로모터가 본 발명의 범위내에서 유용하다. 유도성 프로모터는 유도물질에 반응하여 핵산 서열의 전사를 직간접적으로 활성화시킬 수 있는 프로모터이다. 이 서열은 유도물질의 부재하에는 전사되지 않는다. 한 가지 양태로서, 유도성 프로모터에 특이적으로 결합하여 전사를 활성화시키는 단백질 인자는 불활성 형태로 존재하며 그런 다음 유도물질에 의해 직간접적으로 활성 형태로 전환된다. 유도물질은 생물학적 또는 비생물학적 손상일 수 있으며 예를 들면, 화학물질(예, 단백질, 대사물질(당, 알콜 등), 성장 조절인자, 제초제 또는 페놀성 화합물) 또는 열, 염, 독성 요소 등에 의해 직접적으로 부과되거나 바이러스와 같은 병원체의 작용을 통해 간접적으로 부과된 생리학적 스트레스일 수 있다. 유도성 프로모터를 함유한 식물 세포는 이 세포에 유도물질을 외부에서 적용함으로써, 예를 들면, 분무, 급수, 가열, 광에의 노출, 병원체에의 노출 또는 유사한 방법에 의해 유도물질에 노출시킬 수 있다. 특정 양태로서, 유도성 프로모터는 종자 형성 동안 또는 적어도 재조합 핵산 분자의 핵산 서열의 전사에 상응하는 기간 동안 유도된 상태로 있을 수 있다.
가장 유용하기 위해서는, 유도성 프로모터는 바람직하게는 유도물질의 부재하에 발현이 적거나 일어나지 않으면서 유도물질의 존재하에서는 고도의 발현을 제공하며; 식물의 정상적인 생리를 방해하지 않는 유도 계획을 사용하고; 다른 유전자의 발현에 거의 영향을 미치지 않아야 한다. 본 발명의 범위내에서 유용한 유도성 프로모터의 예로는 화학적 수단에 의해 유도된 것, 예를 들면, 구리 이온에 의해 활성화되는 효모 메탈로티오네인 프로모터[Mett et al., Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 90:4567, 1993]; 치환된 벤젠설폰아미드(예, 제초제 독성완화제)에 의해 활성화되는 In2-1 및 In2-2 조절인자 서열[Hershey et al., Plant Mol. Biol 17:679, 1991]; N,N-디알릴-2,2-디클로로아세트아미드(일반명: 디클로라미드) 또는 벤질-2-클로로-4-(트리플루오로메틸)-5-티아졸카르복실레이트(일반명: 플루라졸)에 의해 유도되고 문헌[PCT 공개번호 WO 제90/08830호]에 기술된 옥수수 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST II) 유전자의 27kD 아단위로부터 분리된 화학적 유도성 유전자 프로모터 서열; 글루코코르티코이드에 의해 유도되는 GRE 조절 서열[Schena et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:10421, 1991]; 디. 멜라노가스터의 70kDa 열 쇼크 프로모터[Freeling and Bennet, Maize ADN 1, Ann. Rev. of Genetics 19:297-323] 및 에탄올에 의해 유도되는 알콜 데하이드로게나제 프로모터[Negao et al. Miflin, Ed, Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, Vol. 3, p. 384-438, Oxford University Press, Oxford, 1986] 또는 화학적 처리로 작동되고 제조원(리간드 파머슈티칼즈)으로부터 입수가능한 Lex A 프로모터가 포함된다. 다른 유도성 프로모터로는 병원체 공격에 의해 유도된 것, 예를 들면, 문헌[PCT 공개번호 WO 제98/22599호]에 기술되어 있는 선충류-유도성 프로모터, 글루코코르티코이드 유도성 프로모터[Aoyama and Chua, The Plant J. 11:605-612, 1997], 칼콘 신타제 및 방어 활성화된 프로모터(prop1-1)[Strittmatter et al., Bio/Technology 13:1085-1089, 1995]가 포함된다. 또한, 유도성 프로모터는 문헌[시바-가이기의 공개 특허원 EP 제89/103888.7호]에 기술되어 있다. 여기에는, PR 단백질 유전자, 특히 담배 PR 단백질 유전자(예, PR-1a, PR-1b, PR-1c, PR-1, PR-A, PR-S), 오이키티나제 유전자 및 산성 및 염기성 담배 베타-1,3-글루카나제 유전자를 포함한 많은 유도성 프로모터가 동정되어 있다. 또한, 상처 유도성(WIN) 프로모터가 본 발명의 범주내에서 유용할 수 있다[참조: Lindsey and Jones, Plant Cell Line Selection, pp. 317-335, VCH Weinham, Germany, 1990]. 다른 구성성 및 유도성 프로모터 및 인핸서가 당업자에게 알려져 있다.
c. 조직 특이적 프로모터
조직 특이적 프로모터가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 조직 특이적 프로모터의 예로는 지맥 분열조직에서 발현되는 프로모터를 들 수 있다[Atanassova et al., Plant J. 2:291, 1992]. cdc2a 프로모터 및 cyc07 프로모터를 포함하여 형질전환된 식물에 유용한 다른 조직 특이적 프로모터가 당업자에게 알려져 있다[참조: Ito et al., Plant Mol. Biol. 24:863, 1994; Martinez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7360, 1992; Medford et al., Plant Cell 3:359, 1991; Terada et al., Plant Journal 3:241, 1993; Wissenbach et al., Plant Journal 4:411, 1993; 괴경-지정된 부류 I 파타틴 프로모터, Beban et al., Nucleic Acids Res. 14:4625-38, 1986; 감자 괴경 ADPGPP 유전자와 연관된 프로모터, Muller et al., Mol. Gen. Genet. 224:136-46, 1990; 종자-지정된 전사를 구동하는 7S 단백질로도 알려진 β-콘글리시닌의 대두 프로모터, Bray, Planta 172:364-370, 1987; 옥수수 배유의 zein 유전자로부터의 종자-지정된 프로모터, Pedersen et al., Cell 29:1015-26, 1982; 옥수수로부터 분리된 화분 특이적 프로모터를 기술한 마스카렌하스의 미국 특허 제5,086,169호에 기술된 것과 같은 화분 특이적 프로모터; 옥수수로부터의 다른 화분 특이적 프로모터를 기술한 알렌 등의 미국 특허 제5,412,085호; 다른 특이적 프로모터를 기술한 투틀 등의 미국 특허 제5,477,002호; 타페툼 특이적 프로모터를 기술한 후프만 등의 미국 특허 제5,470,359호; 브라시카세아로부터 분리된 타페툼 특이적 프로모터를 기술한 드래퍼 등의 WO 제92/11379호; 담배로부터의 화분 특이적 프로모터를 기술한 Plant 8(1):55-63, 1995].
암호 영역에 인트론 서열이 내재되어 있는 경우 발현 및 특이성이 향상될 수 있기 때문에 프로모터 작제물에 인트론 서열을 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 식물의 세포/조직에 특이한 폴리펩타이드의 제1 인트론 및 엑손 서열을 함유하는 프로모터 서열에 발현될 DNA 서열을 연결시키는 것이 유리할 수 있다. 추가로, 키메라 프로모터를 얻기 위해 한 프로모터의 영역을 다른 프로모터의 영역에 연결시킬 수 있다.
3. 마커
본 발명의 벡터는 또한, 바람직하게는 숙주에서 작용하는 선별가능하거나 기록이 가능한 마커/리포터 한 개 이상을 함유한다. 이 목적을 위한 많은 유전자가 동정되어 있다[참조: Fraley, in Plant Biotechnology, eds. Kung and Arntzen, Butterworth Publishers, Boston, Mass., p. 395-407, 1989; Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477, 1988]. 선별가능한 마커 유전자로는 형질전환 세포의 동정 및 선택적 성장을 가능케 하는 표현형 또는 특성을 숙주에 제공하는 어떠한 유전자도 포함된다. 따라서, 선별 마커 유전자는 재조합 핵산 분자로 형질전환된 식물 세포가 선별 물질을 이용하여 쉽게 선별될 수 있도록 식물 세포에 화학물질 또는 생리학적 스트레스에 대한 내성을 제공하거나 세포에 구별가능한 표현형 특징을 제공하는 선별 유전자 산물을 암호화한다. 세균 숙주에 적합한 마커 유전자로는 암피실린 내성 유전자(Ampr), 테트라사이클린 내성 유전자(Tcr) 및 카나마이신 내성 유전자(Kanr)이 포함된다. 암피실린 내성 유전자가 현재 바람직하다. 진핵세포에 적합한 마커는 보통 숙주에서 상보적 결손(예, tk-숙주에서 티미딘 키나제(tk))을 필요로 한다. 그러나, 약물 마커 또한 이용가능하다(예, G418 내성 및 하이그로마이신 내성). 적합한 선별 마커의 예로는 bar 유전자, 아데노신 데아미나제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 하이드로마이신-B-포스포트랜스퍼라제, 티미딘 키나제, 크산틴-구아닌 포스포리보실-트랜스퍼라제 및 아미노-글리코시드 3'-O-포스포트랜스퍼라제 II(카나마이신, 네오마이신 및 G418 내성)이 포함된다. 다른 적합한 마커가 당업자에게 알려져 있다. 또한, 유전자 발현의 동정은 식물에 의해 생성된 해당 mRNA의 노던 블롯과 같은 방법에 의해 실시할 수 있다.
4. 형질전환 방법
본 발명에 따른 식물의 형질전환은 식물 분자생물학의 분야에 속하는 당업자에게 알려진 여러 방법중 어느 것으로도 실시할 수 있다[참조: Methods of Enzymology, Vol. 153, 1987, Wu and Grossman, Eds., Academic Press]. 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다. 본원에 사용된 용어 "형질전환"은 숙주 식물의 표현형이 이종 핵산 서열의 도입에 의해 변형된 것을 의미한다.
발현 벡터를 식물 조직내로 도입하는 방법으로는 전기천공법, 입자 충격법, 바이러스 및 세균 감염/예를 들면, 아그로박테리움 투메파시엔스와의 공동배양이 포함된다. 이들 형질전환 방법은 외래 유전자를 단자엽 및 쌍자엽 식물내로 도입하는데 유용하다[참조: Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol., Plant Mol. Biol. 42:205-225, 1991 and Shimamoto et al., Nature 338:274-276, 1989]. 식물 게놈 DNA내로 외인성 DNA의 안정한 통합을 유도하는 주요 방법은 다음의 방법을 포함한다: 1) 아그로박테리움-매개된 유전자 전달[Horsch et al., Science 227:1229, 1985; 상기 Gruber 등; Klee et al., Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486, 1987; Klee et al., Molecular Biology of Plant Nuclear Genes 6:2-25, 1989; Gatenby, Plant Biotechnology, 93-112, 1989; White, Plant Biotechnology, 3-34 1989], 2) 원형질체내로 DNA를 직접적으로 흡수하는 방법[Toriyama et al., Bio/Technology 6:1072-1074, 1988]; 식물 세포의 간단한 전기 쇼크에 의해 유도된 DNA 흡수[Zhang et al., Plant Cell Rep. 7:379-384, 1988 and Fromm et al., Nature 319:791-792, 1986]; 입자 충격법[Klein et al., Progress in Plant Celluar and Molecular Biology, 56-66, 1988; Klein et al., Bio/Technology 6:559-563, 1988; McCabe et al., Bio/Technology 6:923-926, 1988 and Sanford, Physiol. Plant 79:206-209, 1990], 마이크로피펫 시스템의 사용[Hess, Int. Rev. Cytol 107:367-395, 1987, Neuhaus et al., Theor. Appl Genet. 75:30-36, 1987,Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. 79:213-217, 1990] 또는 발아하는 화분과 DNA의 직접적인 배양[DeWet et al., Experimental Manipulation of Ovule Tissue, 197-209, 1985, Ohta, Y. Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:715-719, 1986] 에 의한 식물 세포 또는 조직내로의 DNA 주입을 포함한 직접 DNA 흡수[Paszkowski et al., Molecular Biology of Plant Nuclear Genes 6:52-68, 1989], 또는 3) 유전자 벡터로서 식물 바이러스의 사용[Klee et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 38:467-486, 1987; Futterer et al., Physiol. Plant 79:154-157, 1990].
벡터로서 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)[Howell et al., Science 208:1265, 1980) 및 제미니 바이러스[Goodman, J. Gen Virol. 54:9, 1981]의 사용이 제시되어왔으나 지금까지 상당히 성공한 예로서 보고된 것은 아그로세균 종을 사용한 것이다[Rorsch et al., Science 227:1229-1231, 1985]. 형질전환 시스템을 기초로 아그로박테리움을 사용하는 방법이 현재 많은 다른 종에서 공개되어 왔다. 일반적으로, 종양의 후속 형성 없이 숙주 식물에 DNA가 전달되도록 천연 Ti 플라스미드의 변형체를 보유하는 세균 균주가 사용된다. 이들 방법은 형질전환 세포의 선별을 촉진하기 위한 선별 마커 유전자에 연결된 식물 게놈내로 삽입될 DNA가 Ti 플라스미드의 영역내로 삽입되는 것을 포함한다. 이와 같은 벡터 시스템은 문헌 [Hajdukiewicz et al., Plant Mol. Bio. 25:989-994]에 기술되어 있다. 이러한 이원 시스템은 식물내로 전달 DNA(T-DNA)의 도입에 필수적인 병독성 영역 (vir)을 갖는 제1 Ti 플라스미드 및 키메라 플라스미드를 포함한다. 후자는 전달될 DNA를 플랭킹하는 야생형 Ti 플라스미드의 T-DNA 영역의 접경 영역을 한 개 이상 함유한다.이원 Ti 플라스미드 시스템은 식물 세포를 형질전환시키는데 효과적인 것으로 제시되어 왔다[De Framond Biotechnology 1:262, 1983; Hoekema et al., Nature 303:179, 1983]. 또 다른 이원 시스템이 문헌[PCT 공개번호 WO 제99/01563호 및 WO 제99/10514호]에 기술되어 있다.
식물 세포내로 외래 DNA가 전달되도록 세균과 식물 조직을 함께 배양한 다음 형질전환된 식물을 선별 배지에서 재생한다. 상이한 기관 및 조직가운데 많은 것이 브라시카세아의 구성원에 대해 특정적으로 기술된 바와 같이 아그로박테리움 매개된 형질전환으로부터 표적물로서 작용할 수 있다. 이들로서는 얇은 세포 층 [Charest et al., Theor. Appl. Genet. 75:438-444, 1988], 어린 줄기[DeBlock et al., Plant Physiol. 91:694-701, 1989], 잎 디스크[Feldman, Plant Sci. 47:63-69, 1986], 줄기[Fry et al., Plant Cell Repts. 6:321-325, 1987], 떡잎[Moloney et al., Plant Cell Repts 8:238-242, 1989] 및 부정배[Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75:30-36, 1987]이 포함된다. 그러나, 당업자는 일부 작물에서 다른 조직 및 형질 방법을 선택하는 것이 바람직할 수 있음을 이해할 것이다.
어떠한 위치 효과로부터도 자유로운 식물을 회수하기 위해 재조합 작제물로 형질전환된 많은 개개 식물을 형성하는 것이 유용할 수 있다. 특정 양태로서, 침묵 효과를 최소화하기 위해 도입된 이종 핵산 분자의 한 개 복제물을 함유하는 식물을 선별하는 것이 바람직할 수 있다.
한 가지 양태로서, 바이러스 또는 세균과 식물 세포의 공동 배양을 이용하여 발현 벡터를 식물 조직내로 도입한다. 예를 들면, 전형적으로 해당 구조 유전자를프로모터의 조절하에 적합한 식물 바이러스의 피막 프로모터 영역내로 삽입시킴으로써 식물 RNA 바이러스 계통 시스템을 사용할 수 있다. 식물 RNA 바이러스 계통 시스템은 예를 들면, 문헌[미국 특허 제5,500,360호, 제5,316,931호 및 제5,589,367호]에 기술되어 있다. 이들 각 특허의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다.
상기 주지된 바와 같이, 본 발명의 특정 양태로서, 아그로박테리움-Ti 플라스미드 시스템이 사용된다[Watson et al., Recombinant DNA, a Short Course, Scientific American Books, 164-175, 1983]. 아그로박테리움 투메파시엔스의 종양-유도성 (Ti) 플라스미드는 형질전환 DNA(T-DNA)로서 알려진 플라스미드 DNA의 단편을 함유하며 이 T-DNA는 식물 세포로 전달되어 여기서 식물 숙주 게놈내로 통합된다. 형질전환 벡터 시스템의 작제는 기본적인 2 단계를 포함한다. 첫째, 이. 콜라이에서 복제하는 플라스미드 벡터를 작제한다. 이 플라스미드는 목적하는 단백질(본 발명에서 항원 단백질)을 암호화하는 DNA를 함유한다. 이 DNA는 이것이 식물 게놈내로 통합하는 지점을 규정짓는 T-DNA 접경 서열에 의해 플랭킹된다. 보통, 선별가능한 마커를 암호화하는 유전자(예, 카나마이신과 같은 항생제에 대한 내성을 암호화하는 유전자)가 또한 좌측 접경(LB)와 우측 접경(RB) 서열 사이에 삽입된다. 형질전환된 식물 세포에서 이 유전자의 발현은 통합된 T-DNA를 가진 식물 또는 식물 세포를 동정하는 포지티브 선별 방법을 제공한다[Watson et al., Recombinant DNA, a Short Course, Scientific American Books, 164-175, 1983; White, Plant Biotechnology, 3-34, 1989]. 두 번째 단계는 이. 콜라이로부터 아그로박테리움으로 플라스미드의 전달을 수반한다. 이는 결합 교배 시스템을 통해 또는 아그로박테리움에 의한 플라스미드 DNA의 직접적인 흡수에 의해 달성될 수 있다. 식물로 T-DNA의 후속 전달을 위해, 사용된 아그로박테리움 균주는 식물 세포로의 T-DNA 전달을 위한 병독성(vir) 유전자를 함유한다[White, Plant Biotechnology, 3-34, 1989; Fraley, Plant Biotechnology, 395-407, 1989; Hajdukiewicz et al., Plant Mol. Bio. 25:989-994, 1994]. 당업자는 식물의 유전적 형질전환을 최적화하기 위해 사용할 수 있는 것으로 선택할 수 있는 많은 아그로박테리움 균주 및 플라스미드 작제물이 있음을 이해할 것이다. 당업자는 또한 아그로박테리움 투메파시엔스가 사용된 유일한 아그로박테리움 균주가 아닐 수 있음을 인식할 것이다. 일부 경우에 있어서는 아그로박테리움 리조게네스와 같은 아그로박테리움 균주가 더욱 적합할 수 있다. 식물 조직의 접종 방법은 식물 종 및 아그로박테리움 전달 시스템에 따라 다양하다. 아주 편리한 방법은 완전한 식물 분화의 개시를 위한 양호한 공급원을 제공하는 조직 외식편으로 실시할 수 있는 잎 디스크 방법(leaf disc procedure)이다. 영양 조직의 첨가가 특정 조건하에서 바람직할 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔스로 재생 원형질체의 시험관내 형질전환과 같은 다른 방법을 또한 실시하여 형질전환된 식물 세포를 수득할 수 있다[Potrykus, Plant Mol. Biol. 42:205-225, 1991; White, Plant Biotechnology, 3-34, 1989].
아그로박테리움의 사용을 포함하는 방법은 이들로 한정되는 것은 아니지만 1) 배양 분리된 원형질체와 아그로박테리움의 공동배양; 2) 아그로박테리움으로 식물 세포 또는 조직의 형질전환; 또는 3) 아그로박테리움으로 종자, 선단(apex) 또는 분열조직의 형질전환을 포함한다. 또한, 유전자 전달은 문헌[Bechtold et al., C. R. Acad. Sci. Paris 316:1194, 1993]에 기술된 바와 같이 아그로박테리움에 의한 원위치 형질전환 및 문헌[미국 특허원 제08/667,118호 및 상응하는 PCT 공개번호 WO 제97/48814호]에 기술되어 있으며 이들 특허원에 예시된 형질전환 방법에 의해 달성될 수 있다. 요컨대, 이 방법은 아그로박테리움 세포의 현탁액의 진공 침윤을 기초로 하고 있다.
식물 세포내로 이종 핵산을 도입하는 바람직한 방법은 상기된 바와 같이 그러한 식물 세포, 외식편, 분열조직 또는 종자를 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스로 감염시키는 것이다. 당해 분야에 알려진 적절한 조건하에서 형질전환된 식물 세포는 성장하여 지맥, 뿌리를 형성하고 식물로 발육한다. 한 가지 양태로서, 본 발명의 벡터는 이종 핵산 서열이 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하고 있는 Ti 플라스미드 이원 시스템을 포함한다. 특정 양태로서, 핵산 서열은 한 개 이상의 아폽토시스 억제 단백질을 암호화한다. 이러한 벡터는 제2 또는 그 이상의 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 임의로 함유할 수 있다. 다른 방도로서, 각 벡터는 이종 핵산 서열을 함유하는 두개 이상의 벡터를 사용할 수 있다. 유사한 방식으로 한 개 이상의 벡터를 작제하기 위해 다른 아폽토시스 경로 유전자를 사용할 수 있다.
특정 양태로서, 이종 핵산 서열은 직접적인 물리적 또는 화학적 수단을 사용하여 식물 세포와 접촉시킴으로써 식물 세포내로 도입할 수 있다. 예를 들면, 마이크로피펫 또는 입자 충격법을 사용하여 핵산을 식물 세포내로 직접 미세주입함으로써 물리적으로 전달시킬 수 있다. 다른 방도로서, 세포에 의해 흡수되는 유전 물질과 침전 복합체를 형성하는 폴리에틸렌 글리콜을 사용함으로써 핵산을 식물 세포내로 전달시킬 수 있다.
핵산을 식물 세포내로 도입시키는 또 다른 방법은 도입될 핵산을 갖는 작은 입자에 의한 고속 탄도 침투인데 그 작은 입자는 작은 비드 또는 입자의 매트릭스내에 함유되거나 그의 표면에 존재한다[Klein et al., Nature 327:70, 1987; 미국 특허 제4,945,050호, 제5,036,006호 및 제5,100,792호]. 전형적으로, DNA는 소 입자 충격법을 사용하는 경우, 황산마그네슘 결정 또는 텅스텐 입자와 같은 미세발사체상에 흡착되며 미세발사체는 물리적으로 세포 또는 식물 조직내로 가속된다. 비록 새로운 핵산 서열의 단지 한번의 도입만이 필요할 지라도 이 방법은 전형적으로 다수의 도입을 제공한다.
이종 핵산은 또한 전기천공법에 의해 식물 세포내로 도입할 수 있다[Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:5824, 1985]. 이 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다. 이 기술에 있어서, 식물 원형질체는 관련 핵산 서열을 함유하는 벡터 또는 핵산의 존재하에서 전기천공된다. 높은 장 세기의 전기 임펄스는 가역적으로 막을 투과성으로 만들며 이에 따라 핵산의 도입이 가능하다. 전기천공된 식물 원형질체는 세포벽을 재편하고 분열하여 식물 유합조직을 형성한다. 형질전환된 유전자를 갖는 형질전환된 식물 세포의 선별은 본원에 기술된 바와 같이 표현형 마커를 사용하여 달성할 수 있다.
또한, 상기된 바와 같이, 식물 세포내로 이종 핵산을 도입하기 위한 벡터로서 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)를 사용할 수 있다[미국 특허 제4,407,956호]. CaMV 바이러스 DNA 게놈을 모 세균 플라스미드내로 삽입시켜 세균에서 증식할 수 있는 재조합 DNA 분자를 형성한다. 클로닝 후 다시 재조합 플라스미드를 클로닝하고 추가로 목적하는 핵산 서열의 도입에 의해 변형시킬 수 있다. 그런 다음, 재조합 플라스미드의 변형된 바이러스 부분을 모 세균 플라스미드로부터 절단하고 이를 식물 세포 또는 식물에 접종하는데 사용한다.
여러 양태로서, 본 발명은 조절된 아폽토시스, 비생물학적 손상 및/또는 생물학적 손상 내성을 갖는 형질전환된 식물을 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하는 구조 유전자 한 개 이상이 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는 이종 핵산 서열을 포함하는 벡터와 식물 세포를 접촉시키고, 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 생성하며, 비생물학적 또는 생물학적 손상 내성 및/또는 조절된 아폽토시스를 나타내는 식물을 선별하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "접촉시키고"는 상기된 화학적, 물리적 또는 기계적 수단을 포함하여, 벡터를 식물 세포내로 도입하는 모든 수단을 가리킨다. 바람직하게는, 접촉은 상기된 바와 같이 이종 핵산으로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스를 통한 식물 세포(외식편, 분열조직 또는 종자를 포함)내로의 핵산 또는 벡터의 도입을 가리킨다.
정상적으로, 식물 세포는 재생되어 형질전환 과정으로부터 완전한 식물을 획득한다. 형질전환의 즉각적인 산물은 "트랜스게노트(transgenote)"라고 한다. 본원에 사용된 용어 "성장", "생성" 또는 "재생"은 식물 세포, 식물 세포의 그룹, 식물 일부분(종자를 포함) 또는 식물 조직(예, 원형질체, 유합 조직 또는 조직 일부분)으로부터 완전한 식물로 성장하는 것을 가리킨다.
원형질체의 재생은 식물의 종마다 다양하지만 일반적으로 원형질체의 현탁액을 우선 제조한다. 특정 종의 경우, 원형질체 현탁액으로부터 배 형성이, 즉 천연 배로서 성숙 및 발아의 단계로 유도될 수 있다. 배양 배지는 일반적으로 성장 및 재생에 필요한 여러 아미노산 및 호르몬을 함유한다. 사용된 호르몬의 예로는 옥신 및 사이토키닌이 포함된다. 때때로 배지에 글루탐산 및 프롤린을 첨가하는 것이 유리한데, 특히 옥수수 및 자주개자리와 같은 종의 경우에 그러하다. 효율적인 재생은 배지, 유전형 및 배양 경력에 따라 좌우된다. 이들 변수를 조절한다면 재생은 재현가능하다.
재생은 또한, 식물 유합조직, 외식편, 기관 또는 일부분으로부터 발생한다. 형질전환은 기관 또는 식물의 일부분의 재생 범주안에서 실시할 수 있다[참조: Methods in Enzymology, Vol. 118 and Klee et al., Ann. Rev. Plant Phys. 38:467, 1987]. 문헌[Horsch et al., Science 227:1229, 1985]의 잎 디스크-형질전환-재생 방법을 사용하여 디스크를 선별 배지에서 배양한 후 약 2 내지 4주 내에 지맥이 형성된다. 발육하는 지맥을 유합조직에서 절단하고 적절한 뿌리-유도성 선별 배지에 이식한다. 적절한 선별 배지는 당해 분야에 알려져 있으며 문헌[Curry and Cassells, Plant Cell Culture Protocols, pp. 31-43, Humana Press, Totowa, NJ, 1999; Blackwell et al., IBID 19-30, 1999; Franklin and Dixon, Plant CellCulture, pp. 1-25, IRL Press, Oxford, 1994]에 기술되어 있다. 뿌리가 출현한 후 묘목은 가능한 곧 토양에 이식한다. 묘목은 성숙하게 될 때까지 필요에 따라 다른 화분에 옮길 수 있다.
무성적으로 번식하는 농작물에 있어서는 자른 가지를 심거나 조직 배양 기술을 이용하여 성숙한 형질전환된 식물을 번식시켜 다수의 동일한 식물을 생산한다. 상업적으로 이용하기 위해서는 목적하는 트랜스제노트의 선별을 실시하고 새로운 변종을 얻은 다음 무성적으로 번식시킨다. 파종하여 번식되는 농작물에 있어서는 성숙한 형질전환된 식물을 자가교배시켜 동종접합 근교 식물을 생산할 수 있다. 근교 식물은 새로이 도입된 이종 핵산 서열을 함유하는 종자를 생산한다. 이들 종자를 성장시켜 선별된 표현형(예, 병원체 내성)을 생성하는 식물을 생산할 수 있다.
꽃, 종자, 잎, 가지, 과실 등과 같은 재생된 식물로부터 수득된 일부분은 이들의 일부분이 기술된 바와 같이 형질전환된 세포를 포함하는 한 본 발명에 포함되며 단 재생된 식물의 후손, 변이체 및 돌연변이체도 또한 이들의 일부분이 도입된 이종 핵산 서열을 포함하는 한 본 발명의 범위에 속한다.
특정 양태로서, 식물 세포는 두 개 이상의 DNA 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자로 형질전환되거나 한 개 이상의 재조합 DNA 분자로 형질전환될 수 있다. 이러한 양태에서 DNA 서열 또는 재조합 DNA 분자는 동일한 벡터내에 있음으로써 또는 상이한 벡터상에서 물리적으로 분리되어 있음으로써 물리적으로 연결될 수 있다. 세포는 각 벡터가 특정적인 선별 마커 유전자를 갖고 있는 한 개 이상의 벡터로 형질전환될 수 있다. 다른 방도로서, 세포는 한 개 이상의 벡터로 순차적으로 형질전환될 수 있는데 이로써 제1 벡터로 형질전환된 후 중간의 재생 단계가 가능하다. 게다가, 상이한 DNA 서열 또는 재조합 DNA 분자, 바람직하게는 동일한 염색체에서 연결 또는 위치하고 있는 DNA 서열 또는 재조합 분자를 함유하는 개개 식물 또는 식물주 사이에 생식 교배를 실시할 수 있으며 그런 다음 두 DNA 서열 또는 재조합 DNA 분자를 함유하는 교배 식물의 후손을 선별한다.
본원에 기술된 DNA 서열과 프로모터를 함유한 재조합 DNA 분자의 형질전환된 식물 세포에서의 발현은 노던 블롯 기술, 서던 블롯 기술 및/또는 마커 발현을 사용하여 모니터링할 수 있다. 발현은 그 외에도 당업자에게 알려져 있는 다른 기술을 통해 모니터링할 수 있다.
C. 바람직한 특성을 가진 식물 및 식물의 일부의 생성
본 발명은 이종의 아폽토시스 경로 단백질들이 식물내에서 작용한다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 이와 같은 발견은 노화 억제뿐만 아니라 식물의 내성 증가를 비롯한 생물 및 비생물학적 손상에 대한 식물 및 식물의 일부(예, 절단된 꽃과 채소 등)의 내성 증가를 비롯한 각종 잇점을 제공한다. 또한, 본 발명은 기능적인 식물 아폽토시스 단백질 동족체를 동정하는 방법 및 식물 세포의 측면에서 아폽토시스 경로 단백질의 억제제 및 증강제를 동정하는 방법을 제공한다.
1. 생물학적 손상/인자 내성
생물학적 손상이란 생물 인자의 공격에 대한 직접 또는 간접적인 결과로서 식물에 입는 상해이다. 생물 인자에는, 예를 들면, 곤충, 진균, 박테리아, 바이러스, 선충류, 비로이드, 마이코플라스마 등이 있다. 생물 인자는 일반적으로 감염된 식물 세포내에서 프로그램된 세포 사멸을 유도한다. 이와 같은 프로그램된 세포 사멸은 침입된 병원균의 분산을 억제하기 위해서 일어나는 것으로 생각되고 있다. 따라서, 본 발명의 한 가지 양태에서 다른 개체 중에서 아폽토시스를 억제 조절하는데 관여하는 단백질을 암호할 수 있는 핵산 서열을 식물 세포로 전달하면 이로부터 성장된 식물은 각종 생물 인자에 대한 입증된 내성을 갖는다.
특정 구체 예에 있어서, 생물학적 손상 내성 식물은 작물의 수확량 및 지속적으로 건강한 관상용 식물과 관련하여 상당한 잇점을 제공한다. 주요 생물 인자로는 진균 및 바이러스와 같은 다양한 병원균이 있다. 병원균의 한 가지 예로는 공지된 가장 비특이적이고 잡식성 식물 병원균 중 하나인 진균 병원균 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)이다[예를 들면, Purdy, Phytopathology 69:875:880, 1979 참조]. 또한, 진균 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 마그나포르티헤 그리세아(Magnaportyhe grisea), 파이토프토라(Phytophthora) 종, 코클리오볼루스(Cochliobolus) 종, 푸사리엄 그라미네아럼 (Fusarium graminearum) 및 푸사리엄 종; 선충류 멜로이도기네(Meloidogyne) 종(뿌리혹 선충류); 담배 모자이크 바이러스(TMV), 토마토 반점 입고병 바이러스(TSWV), 담배 식각 바이러스(TEV), 담배 괴사 바이러스(TNV), 밀 선조 모자이크 바이러스 (WSMV), 토양 유래의 밀 모자이크 바이러스(SBWMV), 보리 황색 주유(侏儒) 바이러스와 같은 바이러스; 박테리아 슈도모나스(Pseudomonas) 종 및 크산토모나스 (Xanthomonas) 종 등을 비롯한 기타 경제적으로 중요한 각종 병원균이 알려져 있다. 예를 들면, 문헌[Plant Pathology, 4th ed., Agrios, ed., Academic Presss, San Diego, 1997]에는 다양한 예가 예시되어 있고 당업자라면 쉽게 알 수 있다.
한 가지 구체 예로서, 본 발명은 생물학적 손상 내성의 형질전환된 식물을 제공한다. 이러한 구체 예에서, 암호화된 아폽토시스 경로의 단백질은 아폽토시스 억제성 단백질로서, 이 단백질은 프로그램된 세포 사멸 주기로의 세포의 개시 또는 진행을 직접 또는 간접적으로 억제 조절한다. 바람직한 억제제로는, 활성부위 시스테인 변이된 카스파제 분자, CARD 도메인, Apaf-1의 말단 절단된 형태 등과 같은 주요 억제 조절인자 뿐만 아니라 IAP, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-W, MeL-1, A1, NR13, Ced-9, E1B 19K, BHRF1 등과 같은 기타 억제 조절인자 등이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 따라서, 본 명세서에서는 Bcl-2 및 Ced-9 억제제를 예시하고 있다. 이와 같은 아폽토시스 억제제는 식물에 전달되었을 때 생물학적 손상 내성을 부여한다. 생물학적 손상 내성의 예로는, 담배 모자이크 바이러스(TMV), 담배 괴사 바이러스(TNV), 담배 식각 바이러스(TEV), 토마토 반점 입고병 바이러스(TSWV), 스클레로티니아 스클레로티오룸 1980[Dickman and Mitra, Physiol. Mol. Plant Pathol. 41:255-263, 1992], 보트리티스 시네레아(ATCC), 세르코스포라 니코티아네 (Cercospora nicotianae) 및 글로메렐라 신귤라타(Glomerella cingulata)와 같은 각종 바이러스 및 진균에 대한 내성을 비롯한 병원균 내성이 있다. 하지만, 본 발명은 이와 같이 예시한 병원균에 대한 내성에만 제한되는 것은 아니라는 점은 자명한 것이다. 따라서, 특정 관점에서, 살충제의 적용 및 발현과 제초제로의 처리는 아폽토시스 단계에 있는 식물에 대하여 질병 상태를 유도할 수 있고, 따라서 아폽토시스 억제 폴리펩타이드의 발현은 특정 식물의 살충 화합물의 발현력을 증가시키고/거나 각종 제초제로의 처리에 대한 특정 식물의 내성을 증가시켜 비생물학적 손상을 견딜 수 있다.
2. 비생물학적 손상/인자 내성
전술하였듯이, 본 발명은 또한 비생물학적 손상에 대한 내성 증가를 제공한다. 비생물학적 손상을 유발하는 무생물 인자로는 예를 들면, 저수분(가뭄), 고수분(홍수), 영양분 결핍, 방사선 농도, 공기 오염(오존, 산성비, 이산화황 등), 온도(극고온 및 극저온), 토양 독성과 같은 환경적 요인 뿐만 아니라 제초제 손상, 구충제 손상 또는 기타 농업적 처리(예, 비료 과잉 투여, 화학약품 분무제의 부적당한 사용 등) 등이 있다. 따라서, 이와 같은 무생물 인자들이 식용 작물 및 관상용 식물 등과 같은 각종 식물의 생존력에 계속적으로 중요 역할을 하기만 한다면 본 발명은 이러한 상해에 대한 내성이 증가된 식물을 생산하는데 사용할 수 있다.
한 가지 구체 예로서, 생물학적 손상과 관련하여 전술한 바와 같이 본 발명은 비생물학적 손상 내성의 형질전환된 식물을 제공한다. 이러한 구체 예에서, 아폽토시스 경로의 단백질을 암호화하는 이종의 핵산 서열은 본 명세서에 상세히 설명된 방법으로 식물내로 전달된다. 생물학적 손상 내성과 마찬가지로 무생물 억제제는 식물내로 전달되었을 때 식물에 대하여 비생물학적 손상 내성을 부여한다.
당업자라면 본 명세서에 개시된 내용을 토대로, 특정 인자의 작용 방식에 적당하다면 전체 식물이나 잎 단편을 사용하여 특정 생물 또는 비생물학적 손상/인자에 대한 내성을 용이하게 시험할 수 있다는 것을 잘 인식하고 있을 것이다.
3. 노화
식물의 노화는 최종적으로 세포 사멸을 일으키는 조절된 과정으로 알려져 있다[일반적으로, 문헌 Guiamet et al., Plant Cell Phys. 31:1123-1130, 1990에 상세히 설명되어 있음]. 또한, 노화는 프로그램된 세포 사멸과 마찬가지로 시스테인 프로테아제, RNase 등의 유도와 같은 다양한 생화학적 변화 및 구조적 변화를 수반한다. 따라서, 본 발명은 이종 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 전달을 이용하여 식물의 노화를 조절하는 방법을 제공한다. 일반적으로 식물의 수명을 연장시키는 용도 뿐만 아니라 다른 잇점도 달성할 수 있다. 예를 들면, 노화 억제는 채소 및 과일의 저장 수명을 연장시킬 수 있을 뿐만 아니라 절단된 꽃과 기타 관상용 식물의 수명과 심미적 매력을 증가시킬 수 있다. 또한, 살아있는 식물의 경우 개화 기간 및 과실 생산을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 식료품 시장 뿐만 아니라 관상용 식물 시장에 대해서도 다양한 유용성을 갖고 있다.
또한, 본 발명의 방법은 적당한 식물 세포내에서 선택적으로 과발현되어 노화를 억제시킬 수 있는 식물의 프로그램된 세포 사멸의 내인성 조절인자를 동정하는데 사용할 수 있다.
D. 아폽토시스 경로 유전자의 이종간 전달을 이용하는 방법
1. 아폽토시스 활성의 억제제 및 증강제
식물 아폽토시스의 억제제와 증강제에 관한 연구는 제초제 및 구충제 뿐만 아니라 형질전환된 식물을 고안할 때에도 유용한 자료를 제공할 수 있다. 또한, 매우 상이한 종 유래의 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하는 유전자가 식물내에서 유사하게 작용한다는 예상치못한 놀라운 발견에 따라, 전달된 아폽토시스 경로 단백질 암호화 유전자의 기능을 탐색하는 분석에 식물 세포를 사용할 수 있다. 예를 들면, 카스파제와 Bcl-2 패밀리 구성원과 같은 포유동물의 아폽토시스 경로 유전자를 식물 세포로 전달하여 아폽토시스의 억제 또는 증가를 다양한 방법, 예를 들면, DNA 래더(ladder)와 같은 아폽토시스 표지인자를 동정하기 위한 핵산 추출물의 분석, TUNEL 염색 분석 및/또는 아폽토시스성 핵 응집을 확인하기 위한 세포의 현미경분석으로 조사할 수 있다.
시험 억제제와 증강제는 사람, 설치류, 파리(D. melanogaster), 해충(C. elegans), 바이러스(예, 바큘로바이러스, 헤르페스 바이러스), 박테리아, 진균, 식물, 기생충, 화학약품의 라이브러리, 펩타이드 또는 펩타이드 유도체 등과 같은 다양한 공급원으로부터 분리 또는 입수할 수 있다. 또한, 억제제와 증강제는 X선 결정학으로부터 측정된 단백질 구조에 기초하여 적당하게 고안할 수도 있다[Mittl et al., J. Biol. Chem., 272:6539-6547, 1997]. 바람직한 특정 구체 예에서 억제제는 특정 아폽토시스 경로 단백질에 대해서만 작용한다(예, Bcl-2 또는 이의 동족체).
억제제는 특정 기작에 의해서만이 아니라 아폽토시스 경로의 자이모겐(예, 카스파제)의 진행을 방해하거나, 효소 활성을 방해하거나, 경로 중의 성분들의 상호작용을 방해하거나(직접 또는 간접적으로) 또는 다른 기작으로 작용할 수 있다. 억제제 자체는 직접 또는 간접적으로 작용할 수 있다. 바람직한 구체 예에 있어서, 아폽토시스 억제제는 DNA 래더링, 말단 데옥시트란스퍼라제 매개의 dUTP 닉 말단 라벨링(TUNEL)(시판용 키트), Ca2+의존적 뉴클레아제의 농도[Mitteler et al., Plant Cell 7:1951-1962, 1995], 트립판 블루와 같은 생물 염색제의 사용 또는 기타 유사한 방법에 의해 측정되는 바와 같이 식물내에서 프로그램된 세포 사멸을 억제시킨다. 기타 바람직한 구체 예에 있어서 억제제는 소분자이다. 가장 바람직한 구체 예에 있어서, 억제제는 아폽토시스를 방해한다. 세포에 침투할 수 있는 억제제가 바람직하다.
또한, 아폽토시스 활성 또는 아폽토시스 경로 단백질 발현의 증강제는 특정 경우에만 필요하다. 때로, 아폽토시스의 증가는 특히 작용하는데 생세포를 필요로 하는 병원균(예를 들면, 바이러스 또는 진균 병원균)과 관련된 병원균의 손상을 경감시킬 것이다. 따라서, 이와 같은 증강제는 병원균에 의해 유도 발현되는 것이 유리할 수 있다. 증강제는 DNA 래더링의 농도 증가, TUNEL 포지티브 세포, Ca2+의존적 뉴클레아제의 상승 조절[Mittler et al., Plant Cell 7:1951-1962, 1995], 자이모겐(카스파제 또는 이의 동족체)의 프로세싱을 통해 입증되는 바와 같이 아폽토시스 진행의 속도 또는 효율을 증가시키거나, 전사 또는 해독을 증가시키거나, 또는 다른 기작을 통해 작용할 수 있다. 당업자에게는 자명한 것처럼 전술한 대부분의 지침들은 증강제의 고안에도 역시 적용된다.
억제제 및 증강제에 대한 선별 분석은 억제제 또는 증강제의 종류 및 영향을 받는 활성의 성질에 따라 달라질 수 있다. 이러한 선별 분석은 시험관내 또는 생체내에서 실시할 수 있다. 일반적으로, 시험관내 분석은 아폽토시스의 표현형 유무, DNA 래더링, TUNEL 염색, Ca2+의존적 뉴클레아제 농도[Mittler et al., Plant Cell 7:1951-1962, 1995], 단백질 프로세싱 또는 효소 활성을 평가하는데 사용하며, 생체내 분석은 생물 및 무생물 공격에 대한 반응성과 같은 특성을 평가하는데 사용한다. 이러한 모든 분석법에 있어서, 적당한 대조군과 비교하였을 때 통계적으로 유의적인 증가 또는 감소는 내성, 증가 또는 억제를 나타낸다.
2. 식물 아폽토시스 단백질 및 관련 유전자의 동정
식물내에 존재하는 아폽토시스 경로 단백질을 조사하기 위한 한 가지 시험관내 분석으로서, 포유동물 단백질(또는 기타 공지된 아폽토시스 경로 단백질)에 대하여 식물 세포 단백질이 결합하는지를 조사하여 실시할 수 있다. 간략하게 설명하면, 식물 cDNA의 발현 라이브러리는 각종 포유동물 아폽토시스 경로 성분들에 대한 발현 생성물의 결합력을 조사하여 선별할 수 있다. 이와 유사하게, 식물 추출물도 선별할 수 있다. 예를 들면, Apaf-1 단백질은 컬럼과 같은 고상 표면 상에 고정시키고 식물 cDNA 라이브러리의 발현 생성물과 접촉시킨다. 포유동물 Apaf-1에 결합하고 이어서 pH 구배, 염구배 등에 의해 용출되는 단백질은 식물의 카스파제-9 동족체임을 나타낼 수 있다. 따라서, 모든 아폽토시스 경로의 단백질은 유사한 방식으로 고정화되어 식물의 cDNA 발현 라이브러리를 탐침하는데 사용할 수 있다. 당업자라면 다양한 종 유래의 아폽토시스 단백질이 식물내에서 기능적 활성을 유지할 수 있다는 놀라운 발견을 통해 단백질-단백질 상호작용을 탐침하는 모든 공지된 방법들을 다른 공지된 아폽토시스 단백질에 대한 식물 단백질 동족체를 동정하는데 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 당업자라면 각종 라벨링 및 검출 방법을 사용할 수 있음을 잘 알 것이다. 이와 같은 방법으로는 효소 결합된 면역흡착 분석, 분석용 초원심분리 및 BiaCore 3000™(제조원: BiaCore, Uppsula, Sweden)의 사용을 포함한다.
따라서, 식물의 아폽토시스 경로 단백질을 동정하는 한 가지 방법은 공지된 이종의 아폽토시스 경로 단백질이나 이의 단편 및 항체 또는 다른 분자(예, 글루타티온)에 의해 결합되는 태그 펩타이드 서열(예, 글루타티온-S-트란스퍼라제)을 함유하는 융합 단백질을 작제한다. 이 융합 단백질을 암호화하는 벡터로 박테리아를 형질전환시킨다. 그 다음, 융합 단백질을 정제한다. 간략히 설명하면, pGEX-4T-3(제조원: Pharmacia, Uppsala, Sweden)내에 존재하는 GST(글루타티온-S-트란스퍼라제) Bcl-2 융합 단백질은 IPTG로 유도하고 글루타티온 비드를 사용하여 정제하면 된다[Kaelin et al., Cell 64:521, 1991 참조]. 식물 유래의 발현 라이브러리 작제물을 보유하는 세포는 대사적으로 라벨링할 수 있다. 예를 들면, 이 세포의 추출물을 GST-Bcl-2 충전된 글루타티온 세파로오즈 비드와 함께 항온처리하거나, 또는 융합 단백질을 면역침전 등으로 처리한다. 결합되지 않은 단백질은 세척해내고, 결합된 단백질을 용출시킨다. 결합된 단백질은 겔 전기영동 등으로 더 분별한다. 이와 같은 결합된 단백질은 항체 유발, 아미노산 서열 분석 및 기타 시험관내 시험에 사용할 수 있다. 결합된 단백질을 암호화하는 클론은 발현 라이브러리의 면역선별, 부분 아미노산 서열에 기초한 프로브가 사용되는 프로브 하이브리드화 및 기타 공지의 방법을 포함하는 다양한 표준 방법 중 임의의 한 방법으로 동정할 수 있다.
단백질-단백질 상호작용이 식물 발현 라이브러리 또는 식물 추출물과 공지된 아폽토시스 경로 성분 간에 검출되면 식물 발현 라이브러리 유래의 단백질은 서열분석과 동정된 적당한 cDNA에 의해 확인할 수 있다.
한 가지 구체 예에 있어서, 식물의 아폽토시스 경로 단백질을 검출하는 방법은 식물 유래의 발현 cDNA 라이브러리로 세포를 형질감염 또는 형질전환시키는 단계; 및 세포에서 발현된 단백질과 이종의 아폽토시스 경로 단백질 간의 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체 예에 있어서, 추정상의 식물 아폽토시스 경로 단백질을 검출하는 방법은 발현 라이브러리 유래의 식물 추출물 또는 식물 단백질과 공지된 이종의 아폽토시스 경로 단백질을 접촉시키는 단계 및 이와 같은 이종의 아폽토시스 경로 단백질과 식물 유래의 단백질 간의 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다. 다양한 대안적 방법에 있어서 식물 또는 동물 유래의 유전자는 기능적 등가물에 대한 시험을 하거나 또는 동물 세포내에서 식물 유래의 유전자를 발현시키고 식물 세포내에서 동물 유래의 유전자를 발현시켜 아폽토시스 활성에 대해 선별할 수 있다. 예를 들면, 리포터 단백질 또는 펩타이드 태그와 함께 융합 단백질이 생성될 수 있도록 조직 또는 세포원 유래의 cDNA 라이브러리를 벡터내에 작제한다. 리포터 또는 태그는 측정을 편리하고 민감하게 하는 모든 단백질일 수 있다. 예를 들면, β-갈락토시다제 및 FLAG 펩타이드를 사용할 수 있다. 또한, 샌드위치 분석으로 검출하기 위하여 복수의 태그를 사용할 수도 있다. 일반적으로, 벡터에는 cDNA-융합 유전자의 발현을 유도하기 위한 강력한 프로모터와 숙주 세포의 적당한 복제 오리진이 사용된다. 그 다음, 식물 유전자의 라이브러리를 이용하여 동물 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시킨다. 또는, 각종 식물 숙주 세포를 본 명세서에 개시된 임의의 방법이나 또는 기타 공지된 방법을 이용하여 형질전환시켜 동물 유전자를 기능적 아폽토시스 등가물에 대하여 시험할 수 있다[예를 들면, 담배-(BY-2) Nagata et al., Int.Rev.Cytol. 132:1-30, 1992; 옥수수(Hi-II), The Maize Handbook, pp.663-671, Freeling et al., eds., Springer, NY, 1994; Arabidopsis(landsberg erecta) Fuerst et al., Plant Physiol. 112:1023-1028, 1996].
또한, 또 다른 식물 아폽토시스 경로 단백질은 효모 2중 하이브리드 시스템(two-hybrid system)과 같은 다른 방법으로 동정할 수 있다. 간략히 설명하면, 2중 하이브리드 시스템에서 DNA 결합 도메인-아폽토시스 경로 단백질의 융합체(예를 들면, GAL4-Bcl-2 융합체)를 작제하여, 선별용 마커 유전자에 GAL4 결합 부위가 결합되어 있는 세포를 형질전환 또는 형질감염시킨다. 또한, 식물 세포 및 조직 유래의 cDNA 라이브러리를 상기 GLA4 활성화 도메인에 융합시키고 이것으로 공형질전환 또는 공형질감염시킨다. 상기 cDNA-GAL4 활성화 도메인 융합체내의cDNA가 Bcl-2와 상호작용하는 단백질을 암호화하면 선별용 마커가 발현된다. 그러면, 이 cDNA를 함유하는 세포를 증식시키고, 작제물을 분리하여 특성 분석한다.
폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질이 다른 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 공지의 아폽토시스 경로 단백질과 기능적으로 등가물인지를 측정하거나 또는 식물 유전자 또는 cDNA가 아폽토시스 촉진 또는 아폽토시스 억제 활성을 갖고 있는지를 측정하기 위하여 또 다른 분석을 실시할 수 있다. 이와 같은 분석의 한 가지 양태로, 예를 들면, 사람을 비롯한 포유동물 시스템, 조직 배양시의 세포 또는 세포주, 프로그램된 세포 사멸 중에 작용하는 유전자 ced9, ced4 또는 ced3 중에 돌연변이를 갖고 있는 씨. 엘레강스(C. elegans) 선충류 시스템(따라서, 기능의 복원을 기대할 수 있음), 및 과일파리 (D. melanogaster), 특히 과일파리의 눈에서 아폽토시스를 조절하는 유전자의 결실이나 이질적인 과발현으로 인하여 파리 망막의 과도한 아폽토시스로 작은 눈을 갖도록 유전자 조작된 파리 균주내에서 눈-특이적 프로모터의 조절하에 있는 과일파리 등을 포함하는 여러 시스템 중 어느 하나의 시스템에서 당해의 유전자를 이질적으로 발현시켜 분석을 실시한다.
포유동물의 분석 시스템을 사용하는 경우에는, 프로모터(예, CMV)의 조절하에 있는 유전자 또는 cDNA를 형질감염시켜 발현시킨다. 이러한 유전자를 발현하는 세포는 자발적으로 아폽토시스 유도를 나타내는지 관찰하거나 아폽토시스를 유도하는 자극을 가한 뒤 아폽토시스 동력학 또는 정도에 미치는 상기 유전자 발현의 효과를 측정한다. 아폽토시스를 유도하는 자극에 대해서는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 성장 인자 제거, 이온화 방사선, TNF 수용체 패밀리(예, Fas,TNFα, TRAIL)의 사멸 수용체에 결합하는 리간드로의 자극, 및 아폽토시스 촉진 유전자(예를 들면, Bax, Bad)의 이종성 발현 등이 있다. 아폽토시스 자극에 대한 반응으로 나타나는 형질감염된 세포의 아폽토시스는 당해 기술 분야에 모두 공지된 다양한 분석법을 사용하여 측정한다. 그 예로는, 카스파제 효소 활성의 유도(세정제에 의한 세포 추출물이 카스파제 기질 아세틸-Asp-Glu-Val-Asp-아미노메틸쿠마린을 절단하는 성질을 측정하여 얻음), DNA 분해(아가로스 겔 전기영동으로 측정), 핵 응집(Hoechst 또는 DAPI 염색법으로 측정), 미토콘드리아에서 세포질로의 사이토크롬 방출(예를 들면, 세포 분획화 실험이나 사이토크롬 c 모노클로날 항체를 이용한 면역세포조직화학 국재화 실험 중 하나로 측정), 및 미토콘드리아 기능(테트라졸륨 염, MTT 또는 MTS의 환원으로 측정) 등이 있다. 따라서, 아폽토시스에 미치는 효과(아폽토시스 표현형의 동력학 또는 정도의 증가 또는 감소, 또는 자신에 대한 아폽토시스 유도)가 정량적 및/또는 정성적으로 유사하다면 당해의 유전자는 공지 유전자(예를 들면, Bcl-2, Bax)와 기능적으로 동등한 것이며, 식물 유전자의 경우에는 그 유전자의 발현이 아폽토시스 표현형의 동력학 또는 정도에 영향을 미치거나 자신의 아폽토시스를 유도한다면 아폽토시스 촉진 유전자 또는 아폽토시스 억제 유전자인 것으로 간주한다.
씨. 엘레강스 시스템의 경우에는, 대부분의 해충 세포가 프로그램된 세포 사멸을 겪게 되어 있지만 ced9 결실된 기능 돌연변이 해충에서 그 유전자의 발현은, 그 유전자가 아폽토시스 억제 단백질을 암호화하는 경우에만 일부 또는 모든 세포를 회생시킬 것이다(예를 들면, ced 9는 ced9 결실된 기능 돌연변이 해충을 회생시킨다). 또한, 자웅동체의 발생시 아폽토시스를 겪도록 예정된 128개 세포가 방해받는 ced3 또는 ced4 결실된 기능 돌연변이 해충 균주에서의 그 유전자의 발현은, 그 유전자가 아폽토시스 촉진성인 경우에만 결실된 세포 사멸을 복원시킬 것이다.
또한, 디. 멜라노가스터 시스템의 경우에는, 그 유전자의 발현이 파리의 눈을 정상 크기로 복원시키면 아폽토시스 억제 단백질을 암호화하는 것으로 간주하고, 파리 눈의 크기를 더욱 감소시키면 아폽토시스 촉진 단백질을 암호화하는 것으로 간주한다.
생체내 분석은 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같이 아폽토시스 경로의 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 발현 벡터로 일시 또는 영구적으로 형질전환 또는 형질감염된 세포에 대하여 실시한다. 식물 세포인 경우, 생체내 분석은 일반적으로 세포, 식물 또는 식물 일부에 생물 또는 무생물 인자를 투여하는 단계 및 아폽토시스 징후에 대하여 접종 부위의 형태를 관찰하는 단계를 포함한다. 그 다음, 접종 부위는 DNA 단편화 분석 및 TUNEL 포지티브 세포 수의 변화를 대조군 시료와 비교하여 특성 분석할 수 있다. 또한, 동물 세포인 경우에는, 이 세포를 사용하여 카스파제 프로세싱, 기질 전환률 또는 시험 화합물의 존재 유무하에서의 아폽토시스를 측정한다. 아폽토시스를 분석할 때, 사용할 수 있는 각종 세포 분석법으로는, 예를 들면, 핵산 단편화 및 세포의 다공도를 조사하기 위한 염료 염색 및 현미경 분석이 있다. 또한, 형질전환 또는 형질감염된 아폽토시스 경로 단백질 또는 이에 의해 활성화된 단백질이 시험 화합물의 존재하에 세포 배양액에 공형질감염, 공형질전환 또는 첨가된 공지의 기질을 절단하는 성질이 있는지를 측정하는생체내 분석은 기질 전환률을 검출 및 측정하여 실시할 수 있다.
아폽토시스 경로 효소의 검출 방법으로는, 효소 반응을 분석하는데 일반적으로 사용되는 방법이 있으며, 예를 들면, SDS-PAGE, 분광 분석, HPLC 분석, 자동방사능측정, 화학발광 분석, 발색 반응 및 면역화학(예를 들면, 블롯팅, 침전 등)을 포함한다. 또한, 식물내의 프로그램된 세포 사멸(즉, 아폽토시스)을 관찰할 수 있는 검출 방법으로는 다양한 방법이 있다. 예를 들면, 문헌[Mittler et al., Plant Cell 7:29-42, 1995; Mittler et al., Plant Mol.Biol. 34:209-221, 1997]을 참조하고 TUNEL 키트(제조원: Oncor and Boehringer-Mannheim에서 입수)를 사용할 수 있다.
카스파제 활성의 분석이 필요한 경우, 예를 들면, 추정상의 식물 아폽토시스 경로 유전자가 동물 세포에서 발현되는 경우 또는 그외의 다른 경우에는 발색원성 기질이 사용되는 것이 바람직하다. 이와 같은 기질의 전환률은 아폽토시스 경로 및 특히 하나 이상의 카스파제 분자의 효소적 활성을 직접 또는 간접적으로 측정한다. 이와 관련하여 표지된 카스파제 분자, 라민, PARP 및 카스파제 기질 유사체와 같은 다양한 기질들이 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 이러한 기질들은 제조원(온코진 리서치 프로덕츠, 미국 매사츄세츠 캠브리지 소재)와 같은 회사에서 시판하고 있다. 형광 마커로 표지된 기질 유사체의 예로는, ZEVD-amc(카르보벤즈옥시-Glu-Val-Asp-아미노메틸쿠마린), YVAD-amc(아세틸-Tyr-Val-Ala-Asp-아미노메틸쿠마린) 및 DEVD-amc(아세틸-Asp-Glu-Val-Asp-아미노메틸쿠마린) 등이 있다.
또한, 다른 분석 예로서, 유도적으로 발현되거나 구성적으로 발현되는 아폽토시스 촉진 단백질 또는 아폽토시스 억제 단백질을 분석용 세포로 전달하기 위한 작제물에는 진핵세포의 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들면, 아폽토시스 억제 폴리펩타이드 Bcl-2를 과발현하도록 세포를 형질전환 또는 형질감염시키면 막 제조물이 보다 고농도의 Bcl-2를 갖는 세포가 얻어져서 Bcl-2 억제를 극복할 수 있는 아폽토시스 촉진제만이 검출될 수 있다. 따라서, 세포는 식물 발현 라이브러리 유래의 유도성 cDNA를 함유하는 제2 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 이와 관련하여, cDNA 전사를 유도하기 전에 세포가 아폽토시스에 "준비"되도록 아폽토시스 자극으로 세포를 처리할 수 있다.
아폽토시스 억제제와 증강제를 동정하기 위한 전술한 방법은 프로그램된 세포 사멸에 세포가 "준비"되도록 세포를 처리한다는 점에서 아폽토시스 활성을 측정할 수 있는 별법으로도 사용할 수 있다. 이러한 별법에서는, 세포가 프로그램된 세포 사멸에 필요한 모든 필수 성분을 합성 및/또는 활성화시킨다. 필요한 것은 단지 세포가 정지점(holding point)통과하여 아폽토시스로 진행되게 하는 자극이다. 따라서, 아폽토시스 자극의 존재하에(예, 항-fas 항체, 스타우로스포린 등), 증강제는 세포를 프로그램된 세포 사멸로 진행시킬 수 있고, 억제제는 이러한 진행을 지연 또는 억제할 수 있다.
세포가 프로그램된 세포 사멸로 진행되지 못하도록 하는 정지점은 세포 생존(아폽토시스 억제) 폴리펩타이드인 아폽토시스 경로 단백질이 과발현되거나 세포를 공지된 아폽토시스 억제제로 처리한 지점일 수 있다. 아폽토시스 억제 폴리펩타이드는 아폽토시스가 일어나도록 유도된 세포내에서 발현 또는 활성화될 때 아폽토시스를 억제하는 성질을 나타낸다는 점을 특징으로 한다. 예를 들면, 기능성 아폽토시스 억제 폴리펩타이드가 없다면 아폽토시스 증강제(예, 아폽토시스 촉진제)로 처리된 세포는 아폽토시스를 개시하거나 가속화할 것이다. 하지만, 아폽토시스 억제 폴리펩타이드가 있다면, 아폽토시스 촉진제/증강제로 세포를 처리하면 프로그램된 세포 사멸 경로는 개시되지만 그 경로를 따라 나타나는 하나 이상의 단계들이 억제되어 세포는 생존할 것이다. 아폽토시스 억제 폴리펩타이드가 작용하는 지점에 따라 프로그램된 세포 사멸 경로는 궁극적으로 세포 사멸로 유도되는 일련의 진행 단계들의 실행시 초기에 또는 비교적 후기에 억제될 수 있다. 아폽토시스 억제 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 핵산은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, Bcl-2 패밀리의 관련 단백질인 Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, E1B-19K, IAP, Ced-9, Bcl-w 등 뿐만 아니라 카스파제의 우성-네가티브 형태를 포함한다. 이와 같은 형태로는, 예를 들면, 활성 부위 시스테인의 불활성화 돌연변이를 가진 카스파제를 포함한다.
아폽토시스 억제 폴리펩타이드의 과발현은 예를 들면, 당해 기술 분야에 공지된 재조합 방법으로 실현할 수 있다. 이러한 재조합 발현 방법을 실시하는 통상적인 방법에 대해서는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1992), Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York(1995)]에 기술되어 있다. 이와 같은 방법은 아폽토시스 억제 폴리펩타이드를 영구적으로 또는 일시적으로 아폽토시스 유도를 억제하기에 충분한 농도로 발현시키는데 사용할 수 있다. 아폽토시스억제성 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 예를 들면, 동일한 종 또는 세포 종류에서 유래되는 동종 핵산에 의해 암호되거나 또는 상이한 종 또는 세포 종류에서 유래되는 이종 핵산에 의해 암호될 수 있다. 암호화 핵산의 기원은 암호화된 아폽토시스 억제 폴리펩타이드가 아폽토시스 억제 활성을 나타내기만 한다면 중요하지 않다.
아폽토시스 유도를 억제하기에 충분한 아폽토시스 억제 폴리펩타이드의 발현 농도는 당업자라면 잘 알고 있는 것이며, 또한 당업자에 의해 통상적인 방식으로 측정될 수 있다. 재조합 폴리펩타이드를 발현시키는 발현 벡터 및 시스템도 공지되어 있고 상품으로서 입수용이하다. 또한, 특정 숙주 세포내에서 충분한 발현 농도를 제공하는 벡터 또는 시스템을 선택하는 것은 당업자에게는 통상적인 일이다. 별법으로서, 아폽토시스 유도를 억제하기에 충분한 발현 농도는 아폽토시스 억제 폴리펩타이드를 발현시킨 뒤, 아폽토시스 촉진 인자로 처리한 후에도 세포가 생존하는지를 측정하거나, 또는 식물 유래의 cDNA 분자의 유도를 측정하여 통상적으로 결정할 수 있다.
아폽토시스 억제 폴리펩타이드를 과발현하는 재조합 방법 외에도, 아폽토시스 억제 폴리펩타이드를 본래 과발현하는 세포를 사용할 수도 있다. 아폽토시스 억제 폴리펩타이드를 본래 과발현하는 세포의 구체적인 예는 Bcl-2가 최초로 동정된 B세포 림프종이다. 이 백혈병은 염색체 14가 18로 전위되어 있어 Bcl-2를 고농도 발현하게 되고, 따라서 세포가 생존하게 된다. 따라서, 백혈병의 표현형은 세포 생존의 증가에 따른 것이다. 아폽토시스 억제 폴리펩타이드를 본래 과발현하는기타 다른 세포주 역시 본 발명의 방법에 유사하게 사용할 수 있다.
아폽토시스 억제 폴리펩타이드의 과발현 및 아폽토시스 촉진 인자로의 세포 처리에 의한 아폽토시스 방해는 세포에 길항적 영향을 미친다. 이와 같은 방식에서, 세포는 본질적으로 프로그램된 세포 사멸에 준비된다. 아폽토시스 촉진 인자는 분자 자극, 환경적 자극 및 물리적 자극을 비롯하여 세포에 다양한 여러 상해를 줄 수 있다. 전술한 바와 같이, 이와 같은 자극은 당업자라면 잘 알고 있는 것으로 아폽토시스 경로내의 분자를 활성화시켜 나타날 수 있다. 아폽토시스 촉진 인자의 예로는 성장인자의 고갈, Fas 리간드, 항-Fas 항체, 스타우로스포린, 종양 괴사 인자, 자외선 및 감마선 조사 등과 같은 유도제를 포함한다. 따라서, 아폽토시스 억제 폴리펩타이드를 과발현하는 세포를 아폽토시스 촉진 인자로 처리하면 포지티브 및 네가티브 시그널이 균형 효과를 제공하여 세포가 아폽토시스를 개시할 것이다. 이러한 개시의 한 가지 잇점은 아폽토시스 억제 폴리펩타이드의 방해를 극복하는 시그널이 수용되면 모든 세포 사멸 성분이 아폽토시스에 이용될 수 있다는 점이다. 이로써, 아폽토시스를 신속하게 유도하여 Bcl-2 또는 Bcl-XL또는 관련 분자의 존재하에 아폽토시스 유도 활성을 보유한 화합물을 선별하는데 이용될 수 있다. 이러한 세포는 특히, 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드의 식물 유래의 cDNA 발현 라이브러리를 선별하는데에도 매우 유용하다. 이와 마찬가지로, 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드는 유도성 프로모터의 지시하에 발현될 수 있다. 이와 같은 세포는 구성적 발현하에 있는 식물 유래의 cDNA 발현 작제물을 포함할 수 있다. 따라서, 유도가 세포 사멸을 일으키지 못한다면 발현된 cDNA 유래의 세포 사멸 조절인자가존재하는 것으로 추정한다.
식물 유래의 cDNA 발현 라이브러리에서 수득되는 아폽토시스 억제 단백질은 포유동물 세포와 같은 숙주 세포를 식물 cDNA 발현 라이브러리로 형질전환시키는 단계, 이 세포를 스타우로스포린, 감마선 조사, 항Fas 또는 Fas 리간드 등과 같은 아폽토시스 유도제와 접촉시키는 단계 및 아폽토시스를 개시하지 않는 세포를 검출하여 아폽토시스 억제 단백질을 발현하는 세포 및 cDNA 작제물을 동정하는 단계를 포함하는 방법으로 확인할 수 있다. 그 다음, 발현 작제물은 서열분석하여 서열을 밝힐 수 있다.
3. 고처리량
본 명세서에 개시된 방법은 고처리량 방식으로 실시할 수 있다(예를 들면, 다수의 시료가 신속하고 효율적으로 선별될 수 있는 다중웰 방식 분석). 예를 들면, 96웰 방식은 평판이 조작하기에 적당하고 측정 장치가 상품으로 입수용이하기 때문에 실질적인 잇점을 제공한다. 이와 같은 절차는 방법의 속도와 효율을 더욱 증가시키기 위하여 자동화할 수도 있다. 이와 같은 특징과 본 방법의 특이성으로 인하여 아폽토시스 활성의 시험 억제제 또는 증강제를 무세포하에 고처리량 선별법으로 분석할 수 있다.
E. 약제 이용가능성
프로그램된 세포 사멸의 억제제 및 증강제는 본 발명과 관련하여 세포 사멸과정을 조절하는데 사용할 수 있다. 즉, 이러한 억제제와 증강제는 과도하거나 불충분한 아폽토시스 정도를 특징으로 하는 질병 및 생물학적 손상과 비생물학적 손상에 대해 식물을 보호하는데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 식물에 대한 아폽토시스 억제제는 주요 신경변성 질환, 즉 발작, 파킨슨씨병, 알츠하이머병 및 ALS 등을 치료하는 사람 치료제로서 잠재성이 있다. 뿐만 아니라, 억제제는 심근 경색 후의 심장내 아폽토시스, 급성 허혈 후의 신장내 아폽토시스 및 간 질환시의 아폽토시스를 억제하는데도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 약학 조성물도 제공한다. 이러한 조성물은 전술한 모든 억제제, 증강제, DNA 분자, 벡터 또는 숙주 세포를 약학적 또는 생리학적 허용성 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 함유할 수 있다. 일반적으로, 이러한 담체는 사용되는 투여량과 농도에서 수용체에게 무독성이어야 한다. 보통, 이러한 조성물의 제법은 치료제와 완충제, 아스코르브산과 같은 산화방지제, 저분자량(잔기 약 10개 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산; 글루코오스, 슈크로오스 또는 덱스트린을 비롯한 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제, 글루타티온 및 기타 안정화제 및 부형제를 혼합하는 단계를 수반한다. 적당한 희석제로는 예를 들면, 중성 완충화된 식염수 또는 비특이적 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 동맥내, 두개내, 피내, 간내, 근육내, 안내, 복강내, 협막내, 정맥내, 경피적 또는 종양내로 직접 투여하는 등의 다양한 투여 경로용으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 이러한 조성물의 사용에 관한 지침을 제공하는 포장 물질과 함께 용기에 넣어 제조할 수도 있다. 일반적으로, 상기 지침은 약제 농도를 나타내는 분명한 표현과 특정 양태에서 약학 조성물을 복원시키는데 필요할 수 있는 부형제 성분 또는 희석제(예, 물, 식염수 또는 PBS)의 상대적 양을 설명하고 있다. 약학 조성물은 진단용 또는 치료용으로서 모두 유용하다.
본 발명의 약학 조성물은 치료(또는 예방)하고자 하는 질병에 적당한 방식으로 투여할 수 있다. 투여 양과 횟수는 환자의 상태, 환자 질환의 종류 및 정도와 같은 요인에 따라 결정한다. 투여량은 임상 시험 동안 가장 정확하게 결정한다. 임상적 악화 증후, 영상화 등을 비롯한 적당한 기술로 환자의 치료 효과를 모니터한다.
한 가지 구체 예에서, 식물 유래의 아폽토시스 경로 단백질은 유전자 전달 비히클의 일부분으로서 세포에 전달할 수 있다. 많은 질병과 증상에서, 지나치게 적은 아폽토시스는 그 질병과 증상의 진행에 있어서 중요한 특징이다. 많은 자가면역 질병 및 종양의 치료는 아폽토시스의 증가가 유리할 것이다. 아폽토시스를 증가시키는 한 가지 방법은 발현성 형태로 카스파제 유전자를 보유하는 표적 세포를 제공하는 것이다. 이 방법은 아폽토시스 촉진 폴리펩타이드를 생체내 전사시킬 수 있는 DNA 또는 cDNA를 전달하여 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 아폽토시스 폴리펩타이드를 생체내에서 생성하기 위하여 아폽토시스 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 진핵성 프로모터(예를 들면, pol III 프로모터, CMV 또는 SV40 프로모터)의 조절하에 배치한다. 보다 특이적으로 전사를 조절하고자 하는 경우에는, 조직 또는 세포 특이적인 프로모터(예를 들면, 간에 존재하는 세포를 표적으로하는 프로모터), 또는 메탈로티오네인과 같은 유도성 프로모터의 조절하에 아폽토시스 폴리펩타이드를 배치할 수 있다.
핵산을 세포로 도입시키는 기법으로는 다양한 방법이 알려져 있다. 이러한 방법은 레트로바이러스 벡터와 후속 레트로바이러스 감염, 아데노바이러스 또는 아데노 관련 바이러스 벡터와 후속 감염, 및 응집제(예, 폴리리신)와 핵산의 혼합물을 포함한다. 이러한 혼합물 또는 바이러스 벡터는 비히클에 포함된 리간드에 의하여 특정 세포 종류에서만 작용할 수 있다. 종양 세포 및 기타 세포에 특이적인 많은 리간드에 대해서는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 다양한 벡터에는, 예를 들면, 플라스미드, 바이러스, 레트로트랜스포죤 및 코스미드 등이 있다. 대표적인 예로는 아데노바이러스 벡터[예를 들면, WO 제94/26914호, WO 제93/9191호; Yei et al., Gene Therapy I:192-200, 1994; Kolls et al., PNAS 91(1):215-219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90(24): 11498-502, 1993; Guzman et al., Circulation 88(6):2838-48, 1993; Zabner et al., Cell 75(2):207-216, 1993; Li et al., Hum Gene Ther. 4(4):403-409, 1993; Caillaud et al., Eur.J.Neurosci. 5(10):1287-1291, 1993], 아데노 관련 유형 1("AAV-1") 또는 아데노 관련 유형 2("AAV-2") 벡터[WO 제95/13365호; Flotte et al., PNAS 90(22):10613-10617, 1993], 델타형 간염 벡터, 약독화된 생 델타 바이러스 및 헤르페스 바이러스 벡터[예를 들면, 미국 특허 제5,288,641호], 및 문헌[미국 특허 제5,166,320호]에 개시된 벡터를 포함한다. 기타 다른 대표적인 벡터로는 레트로바이러스 벡터[예를 들면, EP 제0 415 731호;WO 제90/07936호; WO 제94/03622호; WO 제93/25698호; WO 제93/25234호; 미국 특허 제5,219,740호; WO 제93/11230호; WO 제93/10218호]를 포함한다.
본 발명의 특정 양태에 있어서, 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 비히클, 또는 다양한 물리적 방법을 이용하여 숙주 세포로 도입시킬 수 있다. 이러한 방법의 대표적인 예로는 인산칼슘 침전법을 이용한 형질전환[Dubensky et al., PNAS 81:7529-7533, 1984], 천연 표적 세포내로 상기 핵산 분자의 직접적인 미량주입법[Acsadi et al., Nature 352:815-818, 1991] 및 전도성 용액 중에 현탁된 세포를 강한 전기장으로 처리하여 막을 일시적으로 편극화하고, 이로써 핵산 분자를 유입시키는 전기침투법이 있다. 다른 방법으로는 불활성 아데노바이러스에 결합된 핵산 분자 이용법[Cotton et al., PNAS 89:6094, 1990], 리포펙션[Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989], 미세발사체 충격법[Williams et al., PNAS 88:2726-2730, 1991], 폴리리신과 같은 다중 양이온 화합물, 수용체 특이적 리간드, 핵산 분자를 포획시킨 리포솜, 핵산 분자를 함유하는 이. 콜라이의 외부 세포벽을 제거하고 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 동물 세포에 융합시키는 스페로플라스트 융합법, 바이러스 형질도입법[Cline et al., Pharmac. Ther., 29:69, 1985; 및 Friedmann et al., Science 244:1275, 1989], DNA 리간드[Wu et al., J of Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989], 솔라렌 (psoralen) 불활성화된 바이러스(예를 들면, 센다이 또는 아데노바이러스) 등을 포함한다. 또한, 적합한 비히클로는 문헌[미국 특허 제5,763,416호, WO 제97/38729호, 미국 특허원 제08/631,334호]에 개시된 유전자 활성화된 매트릭스를 포함한다.
다음 실시예는 본 발명을 제한하려는 것이 아니라 예시하기 위한 것이다.
실시예 I
IAP를 함유하는 이중 벡터의 작제
벡터 pOPIAPRC[Birmbaum et al., J of Virology 68:2521-2528, 1994]내의 개방 판독 프레임(ORF)을 PCR로 조작하여 5' 말단에 NcoI 부위와 3' 말단에 BamHI 부위를 도입시켰다. 이 조작으로 천연 단백질의 Met(위치 1) 및 Ser(위치 2) 잔기 사이에 Ala 잔기가 도입되었다. 사용된 PCR 조건은 다음과 같다: 94℃ 1분, 45℃ 1분, 72℃ 2분을 2회 반복한 다음, 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분을 35회 반복하였다.
프라이머 pre-5: 5'-gttgcagaccatggccagctcccgagcattggc-3'
프라이머 pre-3: 5'-ttttggatccttttattgttacacttgg-3'
PCR 생성물을 NcoI 및 BamHI으로 분해하고 식물 발현 카세트 pRTL2(pRTLGUS로서 문헌[Carrington et al., J. of Virology 64:1590-1597, 1990]에 기술되어 있음)에 서브클로닝하였다. 수득되는 벡터를 pPTN144(도 1A)라 명명하였다. pPTN144의 35S-IAP 카세트는 HindIII를 사용하여 이중 벡터 pZP212[Hajdukiewicz et al., Plant Mol.Bio 25:989-994, 1994]내로 서브클로닝하였다. 수득되는 벡터는 pPTN148(도 1B)라 명명하였다.
실시예 II
CED-9를 함유하는 이중 벡터의 작제
Ced-9의 ORF를 PCR로 조작하여 5' 말단에 NcoI 부위와 3' 말단에 XbaI 부위를 도입시켰다. 이 조작으로 천연 단백질의 Met(위치 1)와 Thr(위치 2) 잔기 사이에 Ala 잔기가 도입되었다. PCR 조건은 pOPIAPRC ORF의 조작에서 설명한 바와 같다.
프라이머 ced-5: 5'-gaattccggtttgagccatggcgacacgctgcacggcg-3'
프라이머 ced-3-2: 5'-ttttttctagaaatacgttacttcaagctg-3'
PCR 생성물을 NcoI 및 XbaI으로 분해하고 식물 발현 카세트 pRTL2 (문헌[Carrington et al., J. of Virology 64:1590-1597, 1990]에 기술되어 있음)에 서브클로닝하였다. pPTN143에서 수득되는 ced-9 식물 발현 카세트를 HindIII 단편으로서 이중 벡터 pZP212[Hajdukiewicz et al., Plant Mol. Bio 25:989-994, 1994]내로 서브클로닝하였다. 수득되는 벡터는 pPTN147(도 3B)라 명명하였다.
실시예 III
BCL-2를 함유하는 이중 벡터의 작제
bcl-2의 cDNA를 조작하여 bcl-2 ORF의 5' 말단에 NcoI 부위와 ORF의 3' 말단에 XbaI 부위를 도입시켰다. PCR 반응은 실시예 I에 기재된 조건과 동일하게 하여 다음과 같은 프라이머를 사용하여 실시하였다.
프라이머 Bcl2-5: 5'-tttttcctctgggagggccatggcgcacgctgg-3'
프라이머 Bcl2-3: 5'-ttttttctagatgctcttcgggcgtgg-3'
이러한 조작으로 천연 단백질의 Met(위치 1) 및 Ser(위치 2) 잔기 사이에 Ala 잔기가 도입되었다. PCR 생성물을 NcoI 및 BamHI으로 분해하고 식물 발현 카세트 pRTL2에 서브클로닝하였다. 수득되는 벡터를 pPTN157(도 2A)라 명명하였다. 그 다음, 전체 bcl-2 식물 발현 카세트를 제한효소 HindIII를 사용하여 이중 벡터 pZP212 내로 서브클로닝하고 연결시켰다. 수득되는 벡터는 pPTN161(도 2B)이라 명명하였다.
실시예 IV
E1B-19K를 함유하는 이중 벡터의 작제
벡터 pCMV19K[White and Cipriani, Mol. Cell. Biol. 10:120-130, 1990]내에 존재하는 EcoRI/BamHI 단편을 pBluescript KS에 서브클로닝하여 서열 분석하였다. 수득되는 벡터는 pPTN145(도 4C)라 명명하였다. 주형 pPTN145 프라이머로부터 수득되는 서열 데이터에 근거하여 ORF의 5' 말단에 NcoI 부위와 ORF의 3' 말단에 BamHI 부위를 PCR로 도입시켰다. 이 조작에 의해서는 단백질내에 추가 잔기가 첨가되지 않았다.
프라이머 pPTN 145-5: 5'-gcttcctgaaactccatggaggcttggg-3'
프라이머 pPTN 145-3: 5'-tttttggatccaacattcattcccgaggg-3'
E1B-19K ORF내에 존재하는 내부 NcoI 부위로 인하여 pPTN145 유래의 단편을 3중 연결 NcoI/KpnI 및 KpnI/BamHI로서 pRTL2(NcoI/BamHI)내로 서브클로닝하였다.수득되는 벡터를 pPTN160(도 4A)이라 명명하였다. pPTN160 유래의 35S-19k 카세트를 HindIII 단편으로서 이중 벡터 pZP212내로 서브클로닝하였다. 수득되는 벡터를 pPTN162(도 4B)라 명명하였다.
실시예 V
식물 형질전환 프로토콜
아그로박테리움 균주: 모든 담배 형질전환에는 아그로박테리움 튜머패시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 균주 C58C1[Mol. Gen. Genet 204:383, 1986]을 사용하였다. 3중 양친 교배[tri-parental mating; Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7347-7351, 1980]로 C58C1에 이중 벡터 pPTN147, pPTN148, pPTN161 및 pPTN162를 고정시켰다. 아그로박테리움 트랜스접합체는 스트렙토마이신 100㎎/L, 스펙티노마이신 100㎎/L, 리팜피신 50㎎/L, 젠타마이신 50㎎/L 및 1.5 슈크로오스가 보충된 AB 최소 배지에서 선별하였다.
병원균 접종과 형질전환된 식물의 작제에는 야생형 담배 니코티아나 타바컴(Nicotiana tabacum) 재배변종 Glurk(유전형 NN) 또는 엔. 타바컴 재배변종 Turkish(유전형 nn)를 사용하였다(Glurk 및 Turkish 재배변종은 링컨 네브라스카 대학을 비롯한 다양한 수집소에서 수득할 수 있다).
담배 형질전환은 잎 침지 프로토콜[Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985]의 변법을 사용하여 실시하였다. 30 내지 40일된 식물의 처음 2개의 잎으로부터 외식편을 제조하였다. 3일간 공배양한 후, 외식편을 BAP 1㎎/L, NAA 0.1㎎/L및 카나마이신 100㎎/L이 보충된 MS/B5 배지에 서브클로닝하였다. 아그로박테리움에 대하여 대비 선별을 위하여 항생제 카르베니실린과 세포탁심(Cefotaxime)을 첨가하였다. 외식편을 2주마다 새 배지에 계대배양하였다. 분화된 카나마이신 내성의 어린가지를 배양 6 내지 8주 후에 절제하였다. 이 어린가지를 NAA 0.1㎎/L과 카나마이신 50㎎/L가 보충된 MS/B5계 배지에 정착시켰다.
실시예 VI
형질전환 세포주의 선별 분석
카나마이신 내성의 형질전환된 식물을, 카나마이신 황산염(100㎎/L), NAA(옥신) 0.1㎎/L 및 BAP(사이토키닌) 1㎎/L이 보충된 뮤라시게(Murashige)-5k00G 기본염 배지(제조원: Sigma) 상에서 증식시켰다.
발현을 조사하기 위하여, 담배 잎을 수거하여 액체 질소에서 동결시킨 후 분말화하였다. 식물 RNA를 실시예 VIII에 기재된 바와 같이 분리하였다. RNA 블롯은 방사능 표지된 pPTN147, pPTN148, pPTN161 또는 pPTN162와 하이브리드화하였다. RNA 블롯 하이브리드화 및 막 세척은 엄격한 조건하에 실시하였다[Sambrook et al., 상기 문헌 설명 참조].
웨스턴 분석: 쿠마시 블루 염색 및/또는 SDS PAGE 유래의 면역분석으로 TMV 단백질을 검출하였다. 감염된 식물 조직을 2차 증류수(0.2g 조직/1㎖)에서 분쇄하고 램리 충전 완충액[Laemmli, Nature 227:680-685, 1970] 5 용적 중에서 1 내지 5분 동안 가열하였다. 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔에 약 15㎕를 충전하였다. 단백질을 니트로셀룰로스 막에 전기영동적으로 전달시킨 뒤, 1:1000으로 희석한 비리온(ATCC PVAS-135로서 입수용이, Manassass, VA)에 대하여 제작한 TMV 폴리클로날 항체를 사용하여 비색(Immun-Blot kit, BioRad) 분석(도 11A 및 11B)으로 검출하였다.
노던 및 서던 분석 : 서던 분석(데이터는 제시안됨) 및 노던 블롯 결과 4개의 돌연변이 유전자의 존재와 발현을 나타내었다.
실시예 VII
병원균 접종 및 내성 분석
병원균에 대한 식물 내성의 평가에는 담배 모자이크 바이러스(TMV)를 사용하여 관찰하였다. 이 실험에는 TMV 내성에 대한 N 유전자를 가진 담배 재배 변종(Glurk)과 갖지 않은 담배 재배변종(Turkish)을 사용하여 형질전환시켰다. 4개의 돌연변이 유전자 각각에 의해 최소 10개의 카나마이신 내성의 Glurk 및 Turkish 주가 얻어졌다. 서던 분석(데이터 제시 안됨) 및 노던 분석 결과 4개 돌연변이 유전자의 존재 및 발현을 확인하였다(도 5는 IAP 및 Ced-9의 발현을 나타내는 반면, 도 8과 9는 각각 Bcl-2와 Ced-9의 발현을 나타낸다). 복사체 수, 발현 정도 및 식물 반응 간에는 상관관계는 없다. 형질전환된 식물과 야생형 대조군 사이에도 검출할 수 있는 생리적 차이는 없었다. 모든 식물은 유사한 방식으로 개화하고 종자를 뿌렸다. 단일 복사체 삽입된 카나마이신 내성 담배를 무작위 선별하여 병원균 투여에 대한 반응을 평가하였다.
형질전환된 담배를 가지고 담배 모자이크 바이러스(TMV), 담배 괴사 바이러스(TNV), 담배 식각 바이러스(TEV), 토마토 반점 입고병 바이러스(TSWV), 스클레로티니아 스클레로티오룸 1980[Dickman and Mitra, Physiol. Mol. Plant Pathol. 41:255-263, 1992]; 보트리티스 시네레아(ATCC), 세르코스포라 니코티아네 및 글로멜렐라 신귤라타에 대한 내성에 대하여 시험하였다. 형질전환된 담배 및 대조용 담배는 모두 25℃하의 온실에서 광주기를 16시간으로 하여 증식시켰다.
바이러스 분석: 분리한 담배 잎에 카보런덤을 뿌리고 H2O 50㎕ 중의 TMV 110㎍을 마찰 접종시켰다. 5분 후, 잎을 물로 충분히 세척하고 페트리 디쉬에 놓고 일정한 조도하에 25℃에서 유지시켰다. TNV와 TSWV의 접종은 10mM Na 인산염 완충액(pH 7) 중에 1/25(w/v)로 희석시킨 감염된 식물의 수액을 접종에 사용한다는 점을 제외하고는 유사한 방법으로 실시하였다.
내성(NN) 담배주와 감수성(nn) 담배주 모두에 있어서 TMV에 대한 아폽토시스 억제 유전자 발현의 효과가 나타났다. N 유전자는 TMV 감염에 대하여 초민감성 반응을 부여하여 바이러스의 전신적 전파를 방지한다. 괴사적 병변은 TMV를 접종한 후 4 내지 5일 후에 나타나서 시간이 경과할수록 계속 크기가 팽창하였다. 국부적 병변 발달은 본래 2상적으로 나타난다. 초기의 작은(1 내지 2㎜) 수침지된 병변은 2 내지 3일 후에 성장하여 균일하게 괴사되기 시작한다. 그 다음, 괴사는 수침지된 둘레 보다는 백화와 함께 계속 팽창한다. 바이러스 이동은 성장한 뒤 합체하는 병변 근접부에 제한되어 전체 잎을 사멸시킨다. TMV는 N 유전자가 없는 담배의 접종된 잎에는 가시적인 증상을 유도하지 않지만 잎을 통해 복제하고 전파한다. TMV는 2개의 Turkish(nn)주 뿐만 아니라 4개의 상이한 형질전환 Glurk(NN)주(최소 3개의 다른 주를 사용함)에 접종하였다. 형질전환시키지 않은 담배 및 벡터만을 함유하는 담배 및 벡터 단독물을 대조군으로서 사용하였다.
또한, 분리한 잎 분석은 실험적으로 유리하기 때문에 대부분의 실험에 사용하였고, 온실에서의 전체 식물과 비교하였을 때 병원균 투여에 대한 반응으로 100% 상관관계를 나타내었다.
TMV 접종은 Bcl-2, CED9 및 IAP 유전자를 보유한 Glurk주와 보유하지 않은 Glurk주 모두에 국소적 병변을 발생시켰다. 이와 같은 연구 모두에서, 상기 담배 재배변종 중에 아데노바이러스 E1B-19k를 함유하는 형질전환된 식물은 이 병원균에 대한 내성을 나타내지 않아서 더 이상 평가하지 않았다. 2차 병변 성장은 다른 돌연변이 유전자를 발현하는 재배변종주(도 7, 도 10A 및 도 10B)에서는 상당히 제한되었다. 따라서, Bcl-2, CED-9 및 IAP는 N 유전자에 의해 제공된 내성을 강화시켜 병변의 팽창을 예방하는 것으로 보인다. 따라서, 괴사를 더 이상 유도함이 없이 초기 병변부로부터 TMV를 전파시킬 수 있을 것으로 생각되었다. 이를 측정하기 위하여 국소 병변부와 주위 조직에 대하여 별도로 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다(도 11A). 병변부에는 바이러스가 많은 반면, 병변부 경계의 외측에서는 바이러스가 검출되지 않았고, 이로써 N 유전자의 내성이 Bcl-2와 ced-9에 의해 강화된다는 것을 확인하였다. 한편, Bcl-2와 ced-9는 Turkish주에 대한 TMV 접종에는 어떤 영향도 미치지 않았다(도 11B).
또한, 많은 식물 숙주-바이러스 조합도 괴사성의 국소 병변부를 발생시키며특정 숙주 유전자형에 제한되지 않는다. 이와 같은 조합에서 식물은 바이러스의 국소 병변부 숙주라고 부른다. 담배는 담배 괴사 바이러스(TMV) 및 토마토 반점 입고병(TSWV)을 비롯한 다양한 바이러스의 국소 병변부 숙주이다. TMV 및 N 유전자와 달리, 상기 모든 괴사성 반응의 유전자적 기초에 대해서는 알려져있지 않으나 국소 병변부의 형태가 매우 상이하기 때문에 바이러스 마다 상이한 것으로 추정된다. 따라서, 이종의 식물 바이러스에 대한 숙주 반응에 미치는 돌연변이 유전자의 효과의 측정이 요구되었다. 놀랍게도, Bcl-2 또는 ced-9를 발현하는 담배주의 잎에서는 TNV 또는 TSWV의 접종 후 가시적인 증상이 관찰되지 않았다(도 12). 괴사 역시 상기 바이러스를 각각 접종한 후 IAP를 발현하는 식물에서만 제한적으로 관찰되었다. 따라서, 돌연변이 유전자를 보유한 담배는 더 이상 상기 두 바이러스에 대한 국소 병변부 숙주가 아니다. 예상한 바와 같이 N 유전자는 TMV 특이성이기 때문에 NN 및 nn 유전자 배경에서는 동일한 표현형이 관찰되었다.
또한, 담배 식각 바이러스(TEV)도 전술한 다른 바이러스에서와 같이 시험하였고, TSWV와 유사한 N 유전자 독립성을 나타내었다. 따라서, Bcl-2와 Ced-9를 발현하는 세포는 TEV 접종에 의한 가시적인 증상을 나타내지 않았다(데이터 제시 안됨).
선별된 담배 식물을 자가수분시켰다(즉, 동일 유전자형과 교배시켰다). 중요한 것은, 자손 식물들 중에서 카나마이신 내성이 없고 돌연변이 유전자의 발현이 결실된 식물은 모두 민감성이었다.
돌연변이 유전자를 발현하는 카나마이신 내성 자손[도 13(Ced-9 전형적,Bcl-2 및 IAP 유사함), 도 14A(Bcl-2 발현 및 TMV 접종), 도 14B(Ced-9 발현 및 TMV 접종), 도 14C(Ced-9 발현 및 TSWV 접종)]은 사실상 모두 내성적이었고 양친에서 관찰된 바와 같은 표현형이 바이러스 투여후에도 동일하였다.
진균 분석: 분리된 잎 분석을 위하여, 양 재배변종 마다 10개 식물/돌연변이 유전자로부터 식물당 최소 2개의 잎을 분리하고, 여기에 감자 덱스트로스 아가에서 3일간 증식시킨 에스. 스클레로티오룸 또는 비. 시네레아 콜로니로부터 활동적으로 성장하는 균사 말단을 함유하는 5㎜ 아가 플러그를 배치하여 접종하였다.
잎은 유리 페트리 디쉬에 놓인 습윤화된 멸균 여과지 상에 배치하고 25℃의 고습도하에 3 내지 7일 동안 접종하였다. 전체 식물 접종(에스. 스클레로티오룸의 경우만)을 위하여 자낭포자(약 104/㎖)를 YPSS 액체 배지[Tuite, 1968]에서 2시간 동안 항온 배양하고 유거수(runoff)가 생길때까지 담배 잎에 분무하였다. 접종된 식물을 암실에 놓인 25℃, 100% 상대 습도하에 연무에 싸인 챔버에 배치하였다. 최소 5개의 식물/주을 사용하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복하였다.
스클레로티니아 스클레로티오룸을 이용한 분석에서는 형질전환된 담배가 매우 내성적이며, 대부분 고도 민감성인 야생형 담배와 달리 완전한 내성인 것으로 나타났다. 이 진균은 물이나 완충액만에 의해서도 전달될 수 있는 많은 다른 진균과 달리 영양원을 통한 접종을 필요로 한다. 도 15에 도시된 바와 같이, 풍부한 영양원과 함께 접종하였을 때 이 진균은 담배 잎 표면을 따라 성장하지만 감염이나 숙주 군집화는 일으키지 않았다. 이 진균은 사실상 영양원의 고갈로 인하여 성장을 중지하는 것으로 추정되며 중요한 것은 연장된 접종 기간 동안에도 진균은 군집화하거나 식물 조직을 감염시킬 수 없었다. 이에 반해, 동일한 시간 동안 야생형 진균은 완전하게 군집하여 잎 조직을 쇠약화시켰다(도 15).
또한, 자가수분시킨 전술한 담배 식물도 에스. 스클레로티오룸 투여에 대한 반응에 대해 조사하였다(도 16). 역시, 카나마이신 내성과 돌연변이 유전자 발현이 결실된 자손 식물은 모두 민감성이었다. 카나마이신 내성과 돌연변이 유전자 발현에 대하여 선별된 식물은 일반적으로 내성적이었고 양친인 1차 형질전환체와 표현형이 동일하였다.
넓은 숙주 범위를 가진 괴사성 진균 병원균인 보트리스 시네레아 역시 세 가지 돌연변이 유전자 중 임의의 유전자를 함유하는 형질전환된 담배에 접종했을 때 유사한 반응을 나타내었다. 상기 진균 실시예는 모두 분리된 잎 분석에서와 동일한 표현형 반응을 전체 식물 접종에서도 나타내었다(도 17A, Bcl-2 발현, 도 17B, Ced-9 발현).
또한, 3개의 돌연변이 유전자, Ced-9, Bcl-2 및 IAP를 암호화하는 식물은 에스. 스클레로티오룸에 대해서 기재한 것과 유사한 방식으로 세르코스포라 니코티아네(도 19) 및 글로메렐라 신귤라타(데이터는 제시안됨) 양자에 대해 실험한 결과 모두 내성을 나타내었다.
마지막으로, 에스. 스클레로티오룸에 노출시킨 후, 야생형 bcl-xL을 암호화하는 벡터 및 전술한 바와 같은 양친 벡터에 있어 bcl-xL의 비기능적 돌연변이 형태 G138A로 식물을 형질전환시켰다.
실시예 VIII
형질전환된 담배주 유래의 RNA의 분리 및 블롯팅
형질전환된 담배 식물로부터 재생시킨 카나마이신 내성의 균주는 아폽토시스 경로의 단백질을 암호화하는 목적 유전자를 포함하는 방사능 표지된 프로브와 RNA 시료를 하이브리드화하여 분석하였다[Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2, 603-618, 1990].
형질전환된 담배 식물의 잎에서 수득되는 전체 RNA는 문헌[Strommer et al., in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, pp 49-65, CRC Press, Boca Raton, FL., 1993]에 기재된 바와 같이 분리하였다. 상기 식물로부터 약 600 내지 700㎎의 잎을 절단하여 주맥은 제거한 뒤 잎을 얼음위에 방치하였다. 잎을 액체 질소하에 마쇄하고 미세원심분리 튜브로 옮겼다. TRIzol 1㎖를 첨가하고 잎을 동결시켰다. 시료를 실온에서 5분간 항온처리한 뒤, 클로로포름 0.2㎖를 첨가하고, 혼합한 뒤 3분간 더 항온처리하였다. 그 다음, 이 시료를 4℃, 12,000 x g에서 15분간 원심분리시킨 후 상청액을 다른 튜브에 옮겼다. 상청액에 이소프로필 알콜 0.5㎖를 첨가하고 수득되는 용액을 부드럽게 혼합한 뒤 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 시료를 4℃, 12,000xg에서 10분 동안 원심분리하고 상청액은 제거하였다. 펠릿을 75% 에탄올 1㎖로 세척하고 부드럽게 혼합하였다. 세척한 펠릿을 4℃, 7,500 x g에서 5분 동안 침전시키고, 상청액을 제거한 뒤 수득되는 펠릿을 3 내지 5분 동안 진공 건조시키거나 실온에서 10분 동안 건조시켰다. 이어서, DEPC H2O 또는 포름아미드 20 내지 50㎕를 첨가하고, 55℃에서 10분동안 항온처리하였다. 이 시료를 사용하거나 필요할 때까지 -80℃에 보관하였다.
RNA 제조물을 표준 프로토콜에 따라 겔 전기영동하여 분리하고 하이브리드화용 막에 전달시켰다[Sambrook et al., 상기 문헌 설명 참조]. 먼저, 막을 1M NaHPO4pH 7.2, BSA 0.25g, EDTA 50㎕(0.5M 스톡 용액), SDS 1.75g과 최종 용액의 양을 25㎖로 채우는 양의 ddH2O(약 11.5㎖)을 함유하는 용액 25㎖와 함께 막을 65℃의 회전식 오븐에서 예비 하이브리드화하였다. 프로브는32P-dCTP를 사용하여 클레나우 라벨링으로 제조하였다. 그 다음, 이 프로브를 하이브리드화 용액에 직접 첨가하여 회전식 오븐에서 65℃하에 하룻밤 동안 항온처리하였다. 그 후, 막을 저엄격성 세척 용액(1M NaHPO4, pH 7.2, BSA 0.25g, EDTA 100㎕(0.5M 스톡용액), SDS 2.5g과 최종 용액의 양을 50㎖로 채우는 양의 ddH2O) 50㎖으로 실온에서 10분 동안 세척하였다. 그 다음, 이 막을 고엄격성 세척 용액(1M NaHPO4pH 7.2, EDTA 400㎕(0.5M 스톡용액), SDS 2g, 및 최종 용액의 양을 200㎖로 채우는 양의 ddH2O)으로 실온에서 10분 동안 1회 그리고 65℃에서 10분 동안 2회 세척하였다. 그 다음, 막을 집광 스크린을 사용하여 -80℃에서 5 내지 10시간 동안 X-OMAT AR 필름에 노출시켰다.
이상, 본 발명을 예시하기 위하여, 본 발명의 특정 구체 예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않는 범위내에서 다양한 변형을 실시할수 있다는 점은 자명한 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부되는 청구의 범위에 의해서만 제한된다.
본 명세서에 인용된 정기 간행물, 특허 및 특허출원을 비롯한 모든 참조문헌은 그 전체 내용이 본 발명에 참고 인용된 것이다.

Claims (79)

  1. 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오타이드 서열을 함유한 식물 세포를 포함하는 형질전환된 식물(transgenic plant).
  2. 제1항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질을 추가로 포함하는 형질전환된 식물.
  3. 제1항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 아폽토시스 억제 단백질을 암호화하는 형질전환된 식물.
  4. 제3항에 있어서, 아폽토시스 억제 단백질이 Ced-9, Bcl-2, Bcl-xL, IAP 및 E1B 19K로 이루어진 그룹중에서 선택되는 형질전환된 식물.
  5. 제3항에 있어서, 아폽토시스 억제 단백질이 Ced-9 또는 Bcl-2인 형질전환된 식물.
  6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 조직 특이적 프로모터를 포함하는 형질전환된 식물.
  7. 제6항에 있어서, 조직 특이적 프로모터가 알파 아밀라제 프로모터, 파타틴 프로모터 및 글루테닌 프로모터로 이루어진 그룹중에서 선택되는 형질전환된 식물.
  8. 제1항 또는 제3항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 유도성 프로모터를 포함하는 형질전환된 식물.
  9. 제8항에 있어서, 유도성 프로모터가 상해 유도성 프로모터, 알콜 데하이드로게나제 프로모터 및 칼콘 신타제 프로모터로 이루어진 그룹중에서 선택되는 형질전환된 식물.
  10. 제1항 또는 제3항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 구성성 프로모터를 포함하는 형질전환된 식물.
  11. 제10항에 있어서, 구성성 프로모터가 아데닌 메틸 트랜스퍼라제 프로모터, 35S 프로모터 및 유비퀴틴 프로모터로 이루어진 그룹중에서 선택되는 형질전환된 식물.
  12. 제1항에 있어서, 아폽토시스 경로 단백질이 카스파제, rev-카스파제, Bcl-2 패밀리 구성원들, Apaf-1, Bad, Bax, Ced-9 및 Ced-4로 이루어진 그룹중에서 선택되는 형질전환된 식물.
  13. 제1항에 있어서, 쌍자엽 식물인 형질전환된 식물.
  14. 제1항에 있어서, 단자엽 식물인 형질전환된 식물.
  15. 제1항에 있어서, 생물학적 손상 내성인 형질전환된 식물.
  16. 제15항에 있어서, 생물학적 손상이 곤충에 의해 유도되는 형질전환된 식물.
  17. 제15항에 있어서, 생물학적 손상이 병원균에 의해 유도되는 형질전환된 식물.
  18. 제17항에 있어서, 병원균이 진균, 선충류, 세균 및 바이러스로 이루어진 그룹중에서 선택되는 형질전환된 식물.
  19. 제17항에 있어서, 병원균이 바이러스인 형질전환된 식물.
  20. 제19항에 있어서, 바이러스가 담배 모자이크 바이러스(TMV), 담배 괴사 바이러스(TNV), 담배 식각 바이러스(TEV) 및 토마토 반점 입고병 바이러스(TSWV)로 이루어진 그룹중에서 선택되는 형질전환된 식물.
  21. 제17항에 있어서, 병원균이 진균인 형질전환된 식물.
  22. 제21항에 있어서, 진균이 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)인 형질전환된 식물.
  23. 제21항에 있어서, 진균이 스클레로티니아 스클레로티오룸, 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 세르코스포라 니코티아내(Cercospora nicotianae) 및 글로메렐라 신귤라타(Glomerella cingulata)로 이루어진 그룹중에서 선택되는 형질전환된 식물.
  24. 제1항에 있어서, 비생물학적 손상 내성인 형질전환된 식물.
  25. 제24항에 있어서, 비생물학적 손상이 고수분, 저수분, 염분, 영양 결핍, 대기 오염, 온도, 토양 독성, 제초제 및 살충제로 이루어진 그룹중에서 선택된 인자에 의해 유도되는 형질전환된 식물.
  26. 제1항에 있어서, 식물의 일부분 이상이 감소된 노화 정도를 나타내는 형질전환된 식물.
  27. 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질 또는 이의 기능성 변이체를 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 식물 세포.
  28. 제27항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질을 추가로 포함하는 식물 세포.
  29. 제27항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 아폽토시스 억제 단백질을 암호화하는 식물 세포.
  30. 제29항에 있어서, 아폽토시스 억제 단백질이 Ced-9, Bcl-2, Bcl-xL, IAP 및 E1B 19K로 이루어진 그룹중에서 선택되는 식물 세포.
  31. 제29항에 있어서, 아폽토시스 억제 단백질이 Ced-9 또는 Bcl-2인 식물 세포.
  32. 제27항 또는 제29항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 조직 특이적 프로모터를 포함하는 식물 세포.
  33. 제32항에 있어서, 조직 특이적 프로모터가 알파 아밀라제 프로모터, 파타틴 프로모터 및 글루테닌 프로모터로 이루어진 그룹중에서 선택되는 식물 세포.
  34. 제27항 또는 29항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 유도성 프로모터를 포함하는 식물 세포.
  35. 제34항에 있어서, 유도성 프로모터가 상해 유도성 프로모터, 알콜 데하이드로게나제 프로모터 및 칼콘 신타제 프로모터로 이루어진 그룹중에서 선택되는 식물 세포.
  36. 제27항 또는 제29항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 구성성 프로모터를 포함하는 식물 세포.
  37. 제36항에 있어서, 구성성 프로모터가 아데닌 메틸 트랜스퍼라제 프로모터, 35S 프로모터 및 유비퀴틴 프로모터로 이루어진 그룹중에서 선택되는 식물 세포.
  38. 제27항에 있어서, 아폽토시스 경로 단백질이 카스파제, rev-카스파제, Bcl-2 패밀리 구성원들, Apaf-1, Bad, Bax, Ced-9 및 Ced-4로 이루어진 그룹중에서 선택되는 식물 세포.
  39. 제27항에 있어서, 쌍자엽 식물 세포인 식물 세포.
  40. 제27항에 있어서, 단자엽 식물 세포인 식물 세포.
  41. 제27항에 있어서, 생물학적 손상 내성인 식물 세포.
  42. 제41항에 있어서, 생물학적 손상이 곤충에 의해 유도되는 식물 세포.
  43. 제41항에 있어서, 생물학적 손상이 병원균에 의해 유도되는 식물 세포.
  44. 제43항에 있어서, 병원균이 진균, 선충류, 세균 및 바이러스로 이루어진 그룹중에서 선택되는 식물 세포.
  45. 제43항에 있어서, 병원균이 바이러스인 식물 세포.
  46. 제45항에 있어서, 바이러스가 담배 모자이크 바이러스(TMV), 담배 괴사 바이러스(TNV), 담배 식각 바이러스(TEV) 및 토마토 반점 입고병 바이러스(TSWV)로 이루어진 그룹중에서 선택되는 식물 세포.
  47. 제43항에 있어서, 병원균이 진균인 식물 세포.
  48. 제47항에 있어서, 진균이 스클레로티니아 스클레로티오룸, 보트리티스 시네레아, 세르코스포라 니코티아내 및 글로메렐라 신귤라타로 이루어진 그룹중에서 선택되는 식물 세포.
  49. 제43항에 있어서, 병원균이 진균 스클레로티니아 스클레로티오룸인 식물 세포.
  50. 제27항에 있어서, 비생물학적 손상 내성인 식물 세포.
  51. 제50항에 있어서, 비생물학적 손상이 고수분, 저수분, 염분, 영양 결핍, 대기 오염, 온도, 토양 독성, 제초제 및 살충제로 이루어진 그룹중에서 선택된 인자에 의해 유도되는 식물 세포.
  52. 제27항에 있어서, 감소된 노화 정도를 나타내는 식물 세포.
  53. 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질을 암호화할 수 있는 이종 핵산 서열을 게놈내에 갖는 식물로 발아할 수 있는 종자.
  54. 생물학적 기능성 아폽토시스 억제 단백질을 암호화할 수 있는 이종 핵산 서열을 함유하는 형질전환된 생물학적 손상 내성 식물.
  55. 제54항에 있어서, 아폽토시스 억제 단백질이 Ced-9, Bcl-2, Bcl-xL, IAP, E1B 19K 및 이의 동족체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 식물.
  56. 제54항에 있어서, 생물학적 손상이 병원균인 식물.
  57. 생물학적 기능성 아폽토시스 억제 단백질을 암호화하는 이종 핵산 서열을 함유하는 형질전환된 비생물학적 손상 내성 식물.
  58. 제57항에 있어서, 아폽토시스 억제 단백질이 Ced-9, Bcl-2, Bcl-xL, IAP, E1B 19K 및 이의 기능성 변이체로 이루어진 그룹중에서 선택되는 식물.
  59. (a) 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하는 하나 이상의 이종 핵산 서열과 이와 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 단계;
    (b) 이와 같이 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 생성시키는 단계; 및
    (c) 생물학적 또는 비생물학적 내성을 가진 형질전환된 식물을 선별하는 단계를 포함하여, 형질전환된 생물학적 또는 비생물학적 내성 식물을 생성시키는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 형질전환된 식물이 병원균 내성인 방법.
  61. 제59항에 있어서, 형질전환시키는 단계가 물리적 방법에 의해 실시되는 방법.
  62. 제59항에 있어서, 형질전환시키는 단계가 화학적 방법에 의해 실시되는 방법.
  63. 제59항에 있어서, 식물 세포가 원형질체, 생식세포 생성 세포 및 완전한 식물로 재생할 수 있는 세포로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  64. 제59항에 있어서, 프로모터가 구성성 프로모터인 방법.
  65. 제59항에 있어서, 프로모터가 유도성 프로모터인 방법.
  66. 제59항에 있어서, 프로모터가 조직 특이적 프로모터인 방법.
  67. 제59항에 있어서, 식물이 쌍자엽 식물인 방법.
  68. 제59항에 있어서, 식물이 단자엽 식물인 방법.
  69. 제59항의 방법에 의해 생성된 식물.
  70. 제59항의 방법에 의해 생성된 식물 유래의 식물 조직.
  71. (a) 정상적으로는 식물 세포에 의해 생산되지 않는 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 이와 작동적으로 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 벡터로 식물 세포를 형질전환시키는 단계;
    (b) 형질전환된 식물 세포를 식물 형성에 적합한 조건하에 배양하는 단계; 및
    (c) 핵산 서열의 전사를 유도하기에 충분한 조건과 시간 동안 식물을 성장시키는 단계를 포함하여, 식물에서 아폽토시스를 조절하는 방법.
  72. (a) cDNA 라이브러리의 각 구성원이 프로모터에 작동적으로 연결된 식물 cDNA 라이브러리로 동물 세포(들)를 형질전환시키는 단계;
    (b) 형질전환된 세포(들)를 아폽토시스 유도제와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 세포(들)의 아폽토시스 활성을 검출하고 이 활성을 대조군 세포주와 비교하는 단계를 포함하여, 아폽토시스 활성의 증가 또는 감소로 식물 cDNA 라이브러리내 아폽토시스 경로 단백질을 암호화하는 유전자의 존재를 알 수 있는, 아폽토시스 경로 활성을 가진 식물 유전자를 동정하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 동물 세포가 세포 사멸을 위해 준비된 것인 방법.
  74. (a) 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 이종 핵산 분자로 하나 이상의 식물 세포를 형질전환시키는 단계;
    (b) 형질전환된 세포를 아폽토시스 유도제와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 세포의 아폽토시스 활성을 검출하고 이 활성을 대조군 세포주와 비교하는 단계를 포함하여, 아폽토시스 활성의 증가 또는 감소로 식물내에서 기능하는 아폽토시스 경로 유전자 존재를 알 수 있는, 식물내에서 기능하는 아폽토시스 유전자를 동정하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 이종 핵산 분자가 cDNA 라이브러리의 각 구성원이 프로모터와 작동적으로 연결된 이종 cDNA 라이브러리를 포함하는 방법.
  76. 제74항에 있어서, 아폽토시스의 유도제가 생물학적 손상인 방법.
  77. 제76항에 있어서, 생물학적 손상이 병원균인 방법.
  78. 제74항에 있어서, 아폽토시스 유도제가 비생물학적 손상인 방법.
  79. 생물학적 기능성 아폽토시스 경로 단백질의 기능성 변이체를 암호화하는 하나 이상의 이종 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 식물 세포를 포함하는 형질전환된 식물.
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