KR20010070923A - 눈꽃동충하초 유래의 아포토시스 유도성 항암성분 - Google Patents

눈꽃동충하초 유래의 아포토시스 유도성 항암성분 Download PDF

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Abstract

본 발명은 눈꽃동충하초(Paecilomyces tenuipes) 자실체에서 분리한 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol이 사람의 T 세포주인 MOLT-4 세포에 대하여 항암작용을 나타내며, 항암작용의 기전은 아포토시스(apoptosis)를 통하여 암세포를 사멸시키는 것임을 발견한 것에 관한 것이다. 아포토시스를 유도하는 것을 입증하기 위하여 유세포분석기(FACS)로 세포주기 분석과 염색체 함량변동을 분석하였으며, 염색체의 DNA 분절화 현상을 분석하였다. Ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol이 MOLT-4 세포를 50% 사멸시킬 수 있는 농도는 MTT법에 의하여 각각 15.0 ug/ml과 0.2 ug/ml 이었다. 세포주기를 분석한 결과 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol은 모두 G1 단계를 차단함으로써 세포 증식을 억제하였으며, 염색체 함량변동을 분석한 결과 hypodiploid DNA가 증가함을 발견함으로써 아포토시스에 의한 항암작용임을 입증하였다. 아포토시스를 일으킨다는 또 다른 증거로 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol이 암세포의 DNA 분절을 일으킨다는 것을 증명하였다.

Description

눈꽃동충하초 유래의 아포토시스 유도성 항암성분{Apoptosis inducing antitumor components from Paecilomyces tenuipes}
본 발명은 눈꽃동충하초(Paecilomyces tenuipes)에서 순수분리한 항암성분인 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol가 암세포에 대하여 아포토시스를 일으켜 암세포사멸을 유도한다는 것에 관한 것이다.
눈꽃동충하초는 누에에서 성장한 자실체이다. Ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol는 눈꽃동충하초에서 보고된 바가 없으며, 그 항암작용이 아포토시스에 의한 것이라는 보고는 없다.
본 발명자들은 눈꽃동충하초 자실체에서 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol을 순수분리하여 그 화학구조를 밝혔으며, 이들이 인체유래의 암세포에 대하여 증식억제 작용을 나타내며, 그 증식억제작용의 기전은 아포토시스에 의한 것임을 다양한 방법으로 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
한 가지 양태로써 본 발명은 눈꽃동충하초 자실체에서 항암성분인 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol을 순수분리하여 그 화학구조를 규명함으로써 인체유래의 암세포 증식억제제 또는 항암제를 제공한다.
또 다른 양태로써 본 발명은 눈꽃동충하초 자실체에서 순수분리한 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol의 항암작용의 기전은 암세포주기의 G1단계 차단, apoptotic body를 형성하여 hypodiploid DNA의 증가, 염색체의 DNA 분절 유발 등에 의한 것임을 제공한다.
[실험방법]
[1] 눈꽃동충하초 자실체의 항암성분 분리와 화학구조 분석
음건시킨 눈꽃동충하초 자실체(300 g)를 에틸알콜로 60 ℃에서 4회 추출한후 1/10의 부피로 감압농축하였다. 증류수 300 ml을 가하고 동량의 에틸아세테이트를 가하여 두 층으로 분리하였다. 에틸아세테이트층을 농축한 결과 6 g이었으며, 70-230 메쉬의 실리카젤칼럼으로 분리하여 A (1.9 g), B (1.38 g), C (0.76 g), D (0.58 g), E (0.78 g), F (0.54 g)의 6 분획으로 나누었다. B 분획을 농축하여 230-400 메쉬의 실리카젤 칼럼으로 분리하여 0.7 g의 ergosterol peroxide를 순수하게 분리하였다. 한편 E 분획을 230-400 메쉬의 실리카젤 칼럼으로 분리하여 0.2 g의 4β-acetoxyscirpenediol을 순수하게 분리하였다. 이상의 과정을 그림 1에 요약하였다. 순수분리한 항암성분의 구조를 밝히기 위하여 기기분석을 수행하였다. 융점 측정은 Thiele 융점측정기를 사용하였으며, 선광회전도(Optical rotation)은 JASCO DIP-370 디지털 폴라리미터를 사용하였다. 적외선 흡수 스펙트럼은 JASCO IR Reporter-100으로 분석하였으며, 수소 핵자기 공명 스펙트럼과 탄소 핵자기 공명 스펙트럼은 Bruker DRX300으로 분석하였다. 질량분석은 VG platform과 JEOL JMS-HX 110A/110A으로 분석하였다.
[그림 1] 눈꽃동충하초 자실체로부터 항암성분의 분리도
[2] 인체유래의 암세포 배양
본 발명에 사용된 인체유래의 암세포인 MOLT-4 세포는 서울대학교 암연구센타에서 분양받아 사용하였다. MOLT-4 세포주는 사람유래의 T 임파구성 백혈병 환자에서 유래한 암세포이다. 배양배지는 RPMI-1640 배지에 2 mM L-glutamine, NaHCO31.5 g/l, 포도당 4.5 g/l, 10 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate, 10% 소태아혈청, 페니실린 100 U/ml, 스트렙토마이신 100 ug/ml 등이 함유된 배지를 사용하였다. 배양시 세포의 농도는 1 X 106 cells/ml을 넘지 않도록 하였다. 세포는 T-25 플라스크내에서 배양하며 유지하였으며, 배양은 37 ℃, 5% 이산화탄소 배양기를 사용하였다.
[3] 항암시료의 희석
눈꽃동충하초 자실체에서 분리한 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol은 모두 물에 불용성이므로 DMSO에 용해하여 사용하였다. Ergosterol peroxide는 10 mg/ml의 농도로 DMSO에 용해하여 멤브레인 필터로 여과하고, 무균화시킨 후 배양세포에 가하여 사용하였다. 사용시 96-well plate에서 200 ul의 배지에 가할 경우에 RPMI 또는 PBS를 사용하여 최종농도가 40 ug/ml, 20 ug/ml, 2 ug/ml, 0.2 ug/ml이 되도록 순차적으로 희석하여 사용하였다. 4β-acetoxyscirpenediol은 10 mg/ml DMSO에 용해시켜 여과멸균하여 사용하였다. 96-well plate에서 200 ul의 배지에 가할 경우에 최종농도가 1000 ng/ml, 500 ng/ml, 50 ng/ml 등으로 순차적으로 희석하여 사용하였다. 이러한 방법으로 암세포의 50%를 억제시킬 수 있는 농도인 IC50을 구하였다.
[4] 세포주기의 측정
세포는 G1, S, G2, M의 과정을 반복한다. 암세포인 경우는 정상세포보다 세포주기가 빠르다. 본 발명에서 분리한 항암성분인 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol이 세포주기의 어느과정을 차단하는지 밝히기 위하여 MOLT-4세포에 항암성분을 IC50의 농도로 처리하여 G1, S, G2, M 단계의 비율을 유세포분석기로 분석하였다. 이를 위하여 세포를 튜브당 1 X 106세포를 취하여 IC50 농도의 시료를 각각 가하여 1, 48, 60, 72시간 배양한 후에 1,500 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. PBS로 2회 세척한 후에 70% 에틸알콜 1 ml을 가하여 4 ℃에서 1시간 동안 처리하였다. 그 후 세포를 PBS-2 mM EDTA 용액으로 2회 세척하여 상등액을 제거한 후에 0.5 ml의 propidium iodide(PI)용액을 가하여 37 ℃의 암실에서 30분간 반응시킨 후에 유세포분석기로 세포주기분포를 분석하였다. PBS-2 mM EDTA 용액의 제조는 PBS 100 ml에 50 mM EDTA 4 ml를 가하여 조제하였다. PI 용액은 상기의 PBS-2 mM EDTA 용액 95 ml에 2 mg/ml의 PI stock 용액 5 ml와 25 mg/ml의 RNase stock 용액 0.4 ml을 가하여 조제하였다. FACS기기는 FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, USA)이었으며, 세포주기분석용 컴퓨터 프로그램은 Cell Quest와 Mod-Fit 이었다.
[5] 염색체의 hypodiploid DNA의 증가
항암성분의 첨가에 의하여 암세포의 유전자 함량 변동을 측정하기 위하여 세포를 튜브당 1 X 106세포를 취하여 IC50 농도의 시료를 각각 가하여 1, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72시간 동안 배양한 후에 1,500 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이후의 과정은 상기의 세포주기 측정법과 동일한 과정을 거처 FACS기기로 분석한 후에 대조군의 G0/G1 의 DNA의 피크면적을 시료처리한 군의 G0/G1 의 DNA의 피크면적과 비교하여 분석하였다. 이를 위하여 DNA지수(DNA index) = (시료처리한 암세포의 G0/G1 DNA 피크면적)/(시료처리하지 않은 암세포의 G0/G1 DNA 피크면적)의 공식을 적용하였다. DNA지수가 1이면 DNA 함량은 2배체이며, DNA지수가 1 이하이면 아포토시스가 일어나서 DNA가 2배체보다 부족한 상태를 나타내는 것이다.
[6] DNA 분절시험
암세포(2.5 x 105세포)에 항암성분인 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol을 처리하여 72시간 경과 후에 세포를 PBS로 세척하고, DNA 추출킷트 (Wako Junyaku, Tokyo, Japan)를 사용하여 총 DNA를 추출하였다. DNA의 크기를 분석하기 위하여 0.1 ug/ml ethidium bromide가 함유된 1.8% agarose gel에서 추출한 DNA의 크기를 50 V에서 전기영동으로 분석하여 DNA의 분절여부를 확인하였다.
[실험 결과]
다음의 실험 예로서 본 발명에 의한 눈꽃동충하초의 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol가 인체유래의 T 임파구에 대하여 항암작용을 나타내며, 그 작용기전은 아포토시스에 의한 것임을 예증한다.
[1] 눈꽃동충하초 자실체의 항암성분의 화학구조
1-1. Ergosterol peroxide : 5α,8α-epidioxy-24(R)-methylcholesta-6,22-
dien-3β-ol
(1) 물질의 성상 : 판상백색결정
(2) 분자량 : 428 달톤
(3) 분자식 : C28H44O3
(4) 융점 : 176 - 179 ℃
(5) 선광도 [α]D 25: -26°
(6) 적외흡수스펙트럼 (IRνmax, KBr) : 3400, 1459 cm-1
(7) 수소핵자기공명 (300 MHz, CDCl3) :: 6.24 (1H,d, J=8.49 Hz, H-6), 6.50 (1H,d, J=8.49 Hz), 5.23 (1H,dd, J=7.05, 15.23 Hz, H-22), 5.14 (1H,dd, J=7.77, 15.23 Hz, 22-H)
(8) 탄소핵자기공명
36.9 (C-1), 30.0 (C-2), 66.4 (C-3), 51.0 (C-4), 79.4 (C-5), 130.7 (C-6), 135.4 (C-7), 82.1 (C-8), 34.7 (C-9), 36.9 (C-10), 20.8 (C-11), 39.3 (C-12), 44.5 (C-13), 51.6 (C-14), 28.6 (C-15), 23.4 (C-16), 56.2 (C-17), 12.8 (C-18), 18.1 (C-19), 39.7 (C-20), 19.6 (C-21), 132.3 (C-22), 135.2 (C-23), 42.7 (C-24), 33.0 (C-25), 19.9 (C-26), 20.6 (C-27), 17.5 (C-28)
(9) 질량분석 (FAB-MS,m/z): 429 [M+H]+, 396 [M-O2]+
(10) 화학구조: 그림 2에 표시
1-2. 4β-acetoxyscirpenediol : 4β-acetoxyscirpene-3α,15-diol
(1) 물질의 성상 : 백색 무정형 분말
(2) 분자량 : 324 달톤
(3) 분자식 : C17H24O6
(4) 융점 : 53 - 55 ℃
(5) 선광도 [α]D 25: +10.0°
(6) 적외선 흡수 스펙트럼 (IRνmax, KBr) : 3600 - 3300, 1730 cm-1
(8) 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 (75 MHz, CD3OD) : 78.50 (C-2), 75.81 (C-3), 82.50 (C-4), 48.13 (C-5), 44.39 (C-6), 19.66 (C-7), 26.92 (C-8), 139.54 (C-9), 117.54 (C-10), 67.58 (C-11), 63.67 (C-12), 45.80 (C-13), 5.14 (C-14),60.12 (C-15), 21.33 (C-16), 170.81 (CO), 19.66 (CH3)
(9) 질량분석 (ESI-MSm/z): 325 [M+H]+
(10) 화학구조 : 그림 2에 표시
[표 1] 눈꽃동충하초에서 분리한 ergosterol peroxide의1H-NMR과13C-NMR 자료
탄소 (1H) 1H 13C (문헌수치)
1 (CH2) 36.9 (39.4)
2 (CH2) 30.0 (30.1)
3 (CH) 3.92 (m) 66.4 (66.3)
4 (CH2) 51.0 (51.2)
5 (C) 79.4 (79.4)
6 (CH) 5.95 (d,J= 8.4) 130.7 (130.7)
7 (CH) 6.29 (d,J= 8.5) 135.4 (135.4)
8 (C) 82.1 (82.7)
9 (CH) 34.7 (34.7)
10 (C) 36.9 (36.9)
11 (CH2) 20.8 (20.9)
12 (CH2) 39.3 (39.4)
13 (C) 44.5 (44.6)
14 (CH) 51.6 (51.7)
15 (CH2) 28.6 (28.6)
16 (CH2) 23.4 (23.4)
17 (CH) 56.2 (56.3)
18 (CH3) 0.61 (s) 12.8 (12.9)
19 (CH3) 0.67 (s) 18.1 (18.7)
20 (CH) 39.7 (39.7)
21 (CH3) 1.00 ( d,J= 6.49) 19.6 (19.6)
22 (CH) 5.25 (dd,J= 7.6,15.3) 132.3 (132.3)
23 (CH) 5.14 (dd,J= 8.4,15.3) 135.2 (135.2)
24 (CH) 42.7 (42.8)
25 (CH) 33.0 (33.0)
26 (CH3) 0.91 (d,J= 6.8) 19.9 (19.9)
27 (CH3) 0.91 (d,J= 6.7) 20.6 (20.7)
28 (CH3) 0.99 (d,J= 6.6) 17.5 (17.5)
s: singlet, d: doublet, m: multiple
[표 2] 눈꽃동충하초에서 분리한 4β-acetoxyscirpenediol의1H-NMR과13C-NMR 자료
탄소 (1H) 1H 13C
2 (CH) 3.41 (1H, d,J= 4.90) 78.50
3 (CH) 4.11 (1H, dd,J= 3.33, 4.90) 75.81
4 (CH) 5.45 (1H, d,J= 3.33) 82.50
5 (C) - 48.13
6 (C) - 44.39
7 (CH2) 1.68 1.91 (2H, m) 19.66
8 (CH2) 1.90 2.10 (2H, m) 26.92
9 (C) - 139.54
10 (CH) 5.36 (1H, brd,J= 5.51) 117.54
11 (CH) 3.88 (1H, brd,J= 5.51) 67.58
12 (C) - 63.67
13 (CH2) 2.72 (1H, d,J= 3.96) 45.80
2.91 (1H, d,J= 3.96)
14 (CH3) 0.71 (3H, s) 5.14
15 (CH2) 3.37 (1H, d,J= 11.95)
3.81 (1H, d,J= 11.95) 60.12
16 (CH3) 1.63 (3H, s) 21.33
CO - 170.81
CH3 2.02 (3H, s) 19.66
[그림 2] 눈꽃동충하초의 자실체에서 분리한 항암성분인 ergosterol peroxide(1)와
4β-acetoxyscirpenediol(2)의 화학구조식
[2] 눈꽃동충하초의 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol의 농도별
항암작용
MOLT-4 세포(7 X 104세포)에 눈꽃동충하초에서 순수분리한 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol를 농도별로 가하여 MOLT-4 세포의 생존율을 MTT법으로 분석함으로써 50% 억제 농도를 구하였다. 96-well plate에 MOLT-4 세포(7 X 104세포)를 넣은 후에 ergosterol peroxide를 0, 5, 10, 15, 20, 30 ug/ml의 농도로 가하여 4일간 배양한 후에 5 ug/ml의 MTT 용액 10 ul를 각각 가하여 4시간 경과 후에 생존한 세포에 의해서 생성된 유색의 결정을 0.04 N HCl-이소프로판올 용액 100 ul로 용해하였다. 결정이 용해된 평판을 37 ℃에서 5분간 놓아둔 후에 540 nm에서 엘라이자(ELISA)판독기로 흡광도를 측정하여 세포생존율을 측정하였다. 4β-acetoxyscirpenediol의 경우는 0, 0.03, 0.06, 0.13, 0.25, 0.50 ug/ml의 농도로 조정하여 ergosterol peroxide와 동일한 방법으로 실험하였다. 항암성분의 농도별 첨가에 의한 MOLT-4 세포의 생존율(%)은 다음의 표 3과 같다. 이 실험으로부터 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol에 의하여 MOLT-4를 50%를 억제시킬 수 있는 농도를 계산하여 표 4에 나타내었다.
[표 3] 눈꽃동충하초의 항암성분의 농도별 첨가에 의한 MOLT-4 암세포의 생존율 변동
항암성분 농도 (ug/ml) 생존율 (%)
Ergosterol peroxide 0 100 ±3.5
5.0 104 ±2.0
10.0 80 ±6.0
15.0 45 ±1.0
20.0 9 ±0.3
30.0 7 ±0.2
4β-Acetoxyscirpenediol 0 100 ±11.0
0.03 110 ±9.0
0.06 90 ±12.0
0.13 34 ±1.0
0.25 13 ±0.4
0.50 12 ±1.0
[표 4] 눈꽃동충하초의 항암성분의 MOLT-4 암세포에 대한 50% 성장억제 농도
항암성분 IC50농도 (ug/ml)
Ergosterol peroxide 14.0
4β-Acetoxyscirpenediol 0.2
[3] 눈꽃동충하초의 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol의 시간별
항암작용
MOLT-4 세포(2.5 X 105cells/well)에 15.0 ug/ml의 ergosterol peroxide와 0.2 ug/ml의 4β-acetoxyscirpenediol를 각각 가하여 시간 경과에 따른 생존 세포의 수를 trypan blue 시약을 가하여 혈구계산기상에서 현미경하에서 계수하였다. 아무 시약도 가하지 않은 대조군의 세포는 24시간 이후부터 급격히 증가하기 시작하여 48시간 후에는 69.25 X 104cells/well, 72시간 후에는 117.50 X 104으로 증가하였다. 이와는 대조적으로 MOLT-4 세포(25 X 104cells/well)에 15 ug/ml의 ergosterol peroxide을 가한 세포군에서는 36시간까지는 매우 완만하게 증가하다가48시간에서는 35.25 X 104cells/well로 감소하였으며, 72시간 후에는 7.00 X 104으로 크게 감소하였다. MOLT-4 세포(2.5 X 105cells/well)에 0.2 ug/ml의 4β-acetoxyscirpenediol를 가한 경우에는 12시간까지 매우 완만히 증가하다가 12시간 이후부터 감소하기 시작하여 48시간에서는 15.25 X 104cells/well로 감소하였으며, 72시간 후에는 7.00 X 104으로 크게 감소하였다. 이러한 결과를 표 5에 나타내었다.
[표 5] 눈꽃동충하초의 항암성분의 시간별 MOLT-4 암세포의 생존율 변동.
시간 (hr) 생존세포수 (X 104)
대조군 Ergosterol peroxide 4β-Acetoxyscirpenediol
0 25.00 ±0.00 25.00 ±0.00 25.00 ±0.00
1 23.50 ±1.85 22.50 ±1.85 30.25 ±2.32
4 34.25 ±1.49 28.50 ±3.75 33.00 ±3.72
8 30.25 ±2.93 30.75 ±1.25 22.00 ±2.89
12 32.25 ±2.36 33.25 ±2.63 29.50 ±3.18
24 33.50 ±2.10 38.50 ±1.66 21.00 ±1.78
36 50.00 ±4.24 39.50 ±2.33 26.50 ±3.95
48 69.25 ±2.43 35.25 ±2.10 15.25 ±2.02
60 92.25 ±3.84 20.50 ±2.40 9.25 ±1.80
72 117.50 ±7.84 7.00 ±1.78 7.00 ±1.35
[4] 항암성분이 암세포의 주기에 미치는 영향
동충하초에서 분리한 항암성분인 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol이 MOLT-4 암세포의 세포주기에 미치는 영향을 분석하기 위하여 ergosterol peroxide 15.0 ug/ml의 농도와, 4β-acetoxyscirpenediol 0.2 ug/ml의 농도를 가하여 1, 48, 60, 72시간 배양한 후에 propidium iodide 시약으로 반응시키고,FACSCalibur flow cytometer로 G0/G1, S, G2/M의 비율을 측정하였다. 대조군에는 PBS를 가하여 동일한 방법으로 실험하였다. 대조군에서는 1시간 경과시에 G0/G1의 비율이 70%이었지만 48시간, 60시간, 72시간 후에는 각각 58%, 59%, 58%로 각각 줄어 들었다. 이에 반하여 15 ug/ml의 ergosterol peroxide를 처리한 세포에서는 1시간 경과시에 G0/G1의 비율이 74%이었으며, 48시간, 60시간, 72시간 후에는 각각 72%, 76%, 79%로 거의 변동이 없었다. 이것은 암세포가 ergosterol peroxide에 의하여 G1 단계에서 차단되었기 때문이다. 한편 0.2 ug/ml의 4β-acetoxyscirpenediol을 처리한 암세포에서는 1시간 경과시에 G0/G1의 비율이 72%이었으며, 48시간, 60시간, 72시간 후에는 각각 70%, 72%, 69%로 거의 변동이 없었다. 따라서 4β-acetoxyscirpenediol도 MOLT-4에 대하여 G1 단계를 차단하여 세포성장을 억제시키는 것을 입증하였다. 이상의 결과를 표 6에 정리하였다.
[표 6] 동충하초의 항암성분이 MOLT-4 암세포의 주기에 미치는 영향
항암성분 농도(ug/ml) 처리시간(hr) G0/G1(%) S(%) G2/M(%)
PBS - 1 70 23 7
Ergosterol peroxide 15.0 1 74 20 6
4β-Acetoxyscirpenediol 0.2 1 72 21 7
PBS - 48 58 33 9
Ergosterol peroxide 15.0 48 72 16 12
4β-Acetoxyscirpenediol 0.2 48 70 29 1
PBS - 60 59 28 13
Ergosterol peroxide 15.0 60 76 11 13
4β-Acetoxyscirpenediol 0.2 60 72 28 0
PBS - 72 58 34 8
Ergosterol peroxide 15.0 72 79 8 13
4β-Acetoxyscirpenediol 0.2 72 69 31 0
[5] 동충하초의 항암성분이 암세포의 hypodiploid DNA 증가 유도현상
동충하초에서 분리한 항암성분인 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol이 MOLT-4 암세포의 유전자 함량에 미치는 영향을 분석하기 위하여 ergosterol peroxide 15.0 ug/ml의 농도와 4β-acetoxyscirpenediol 0.2 ug/ml의 농도를 가하여 1, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72시간 배양한 후에 propidium iodide 시약으로 반응시킨 후에 FACSCalibur flow cytometer로 G0/G1의 peak 면적을 대조군과 비교하여 hypodiploidity의 비율(%)을 측정하였다. 대조군에는 PBS를 가하여 동일한 방법으로 실험하였다. 대조군의 세포에서는 시간이 경과하더라도 hypodiploidity를 일으킨 세포의 비율이 1 - 3%의 비율의 범위이었지만, 15 ug/ml의 ergosterol peroxide를 처리한 세포에서는 48시간부터 hypodiploidity를 일으킨 세포의 비율이 증가하기 시작하였으며 48시간, 60시간, 72시간 배양후에는 hypodiploidity의 비율이 각각 7.2%, 16.0%, 31.5%로 크게 증가하였다. 또한 0.2 ug/ml의 4β-acetoxyscirpenediol를 가한 경우에도 24시간 이후부터 hypodiploidity의 비율이 크게 증가하였는데, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간 경과 후에 hypodiploidity의 비율이 각각 23.4%, 41.2%, 55.4%, 64.2%, 70.2%
한 항암성분에 의하여 아포토시스가 유도되어 세포의 일부가 apoptotic body로 이탈되어 나가면서 염색체의 일부도 함께 떨어져 나가기 때문에 hypodiploid DNA 함량이 증가된 것이다. 이상의 결과를 표 7에 요약하였다.
[표 7] 동충하초의 항암성분이 MOLT-4 암세포의 hypodiploid DNA 증가 비율
시간 (hr) Hypodiploidity 비율 (%)
대조군 Ergosterol peroxide(15.0 ug/ml) 4β-acetoxyscirpenediol(0.2 ug/ml)
0 1.5 ±0.5 1.5 ±0.5 1.5 ±0.5
1 3.3 ±0.6 2.2 ±0.1 2.4 ±0.1
4 1.8 ±0.3 1.2 ±0.5 2.7 ±0.2
8 2.2 ±0.1 2.6 ±0.1 4.5 ±0.2
12 2.1 ±0.1 2.9 ±0.1 7.4 ±0.4
24 3.5 ±0.2 5.6 ±0.5 23.4 ±1.2
36 2.8 ±0.2 6.6 ±1.6 41.2 ±1.7
48 1.7 ±0.3 7.3 ±0.2 55.4 ±2.8
60 1.4 ±0.1 16.1 ±0.1 64.2 ±1.3
72 1.7 ±0.1 31.5 ±0.8 70.2 ±0.3
[6] 동충하초의 항암성분이 암세포의 DNA 분절유도 현상
암세포(2.5 x 105세포)에 동충하초에서 분리한 항암성분인 15.0 ug/ml의 ergosterol peroxide와 0.2 ug/ml의 4β-acetoxyscirpenediol을 처리하여 72시간 경과 후에 세포의 총 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 절편의 생성여부를 0.1 ug/ml ethidium bromide가 함유된 1.8% agarose gel에서 전기영동으로 분석한 결과 PBS로 처리한 세포에서는 DNA의 절편이 일어나지 않았으나 15.0 ug/ml의 ergosterol peroxide와 0.2 ug/ml의 4β-acetoxyscirpenediol을 처리한 세포에서는 DNA의 분절화 현상이 발견되었다. 따라서 동충하초에서 분리한 항암성분인 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol는 아포토시스를 유도한다는 것이 다시 한번 더 입증된 것이다. DNA의 분절화 현상을 촬영한 것을 그림 3에 나타내었다.
[그림 3] 동충하초에서 분리한 항암성분이 MOLT-4 세포에서 72시간이후에 DNAfragmentation을 일으킨 사진. 1번: 대조군, 2번: 15.0 ug/ml의 ergosterol peroxide, 3번: 0.2 ug/ml의 4β-acetoxyscirpenediol.
이상의 결과로부터 눈꽃동충하초에서 분리한 항암성분인 ergosterol peroxide와 4β-acetoxyscirpenediol은 사람유래의 T임파구 계열의 암세포에 대하여 강력한 항암작용을 나타내며 그 항암작용의 기전은 아포토시스(apoptosis)를 일으킴으로써 암세포를 사멸시키는 것을 최초로 발견하게 되었다.

Claims (4)

  1. 각종 동충하초를 이용한 항암제 제조
  2. Ergosterol peroxide 또는 4β-acetoxyscirpenediol를 함유하는 항암제의 제조
  3. 각종 동충하초에서 유래한 ergosterol peroxide 또는 4β-acetoxyscirpenediol를 함유하는 항암제의 제조
  4. Ergosterol peroxide 또는 4β-acetoxyscirpenediol를 함유하는 제제로써 인체의 백혈병을 비롯한 다양한 암치료제로서 건강보조식품, 음료제품, 다른 부형제와 혼합된 주사제, 캅셀제, 정제, 산제, 과립제 등의 제조.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20030016087A (ko) * 2001-08-20 2003-02-26 권태오 눈꽃동충하초 자실체로부터 분리한4-아세틸-12,13-에폭실-9-트리코테신-3,15-디올을함유하는 항암제 조성물
KR100443202B1 (ko) * 2002-01-03 2004-08-04 정헌택 눈꽃동충하초 자실체로부터 분리한(3ｒ,6ｒ)-4-메틸-6-(1-메틸에틸)-3-페닐메틸-1,4-퍼하이드로옥사진-2,5-디온 및 그를 함유하는 아폽토시스 유도제조성물
KR100466522B1 (ko) * 2002-08-03 2005-01-15 대한민국(관리부서:농촌진흥청) 항암활성을 갖는 ｊ 300 동충하초 추출물 및 이를함유하는 약제학적 조성물

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