KR100443202B1

KR100443202B1 - 눈꽃동충하초 자실체로부터 분리한(3ｒ,6ｒ)-4-메틸-6-(1-메틸에틸)-3-페닐메틸-1,4-퍼하이드로옥사진-2,5-디온 및 그를 함유하는 아폽토시스 유도제조성물

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Publication number: KR100443202B1
Application number: KR10-2002-0000242A
Authority: KR
Inventors: 오현철; 배현옥; 오기수; 장선일; 채규윤; 정헌택; 이호섭; 권태오
Original assignee: 정헌택; 이호섭; 권태오
Priority date: 2002-01-03
Filing date: 2002-01-03
Publication date: 2004-08-04
Also published as: KR20030059644A

Abstract

본 발명은 눈꽃동충하초(Isaria japonicaY_ASUDA) 자실체의 추출물로부터 분리한 신규한 화합물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 눈꽃동충하초로부터 분리한 성분으로서 (3R,6R)-4-메틸-6-(1-메틸에틸)-3-페닐메틸-1,4-퍼하이드로옥사진-2,5-디온(이하, 'MMPPD'라 함)을 함유하는 아폽토시스 유도제 조성물에 관한 것이다.

Description

눈꽃동충하초 자실체로부터 분리한 (3Ｒ,6Ｒ)-4-메틸-6-(1-메틸에틸)-3-페닐메틸-1,4-퍼하이드로옥사진-2,5-디온 및 그를 함유하는 아폽토시스 유도제 조성물{(3R,6R)-4-methyl-6-(1-methylethyl)-3-phenylmethyl-1,4-perhydrooxazine-2,5-dione from the Fruiting Bodies of Isaria japonica and apoptosis-inducing composition containing the same}

현재 상당한 의학기술, 생명공학 및 유전공학의 발전으로 암치료의 길이 열렸음에도 불구하고, 암은 아직 완치될 수 없는 질환으로 인식되고 있다.

이러한 암치료 방법으로 화학요법, 방사선요법, 절개술 등의 많은 방법이 개발되었지만, 방사선 요법이나 절개술 등은 주로 암의 초기진단이 이루어졌을 때에만 효과가 있다. 그러나, 말기암으로의 진행상태가 보이면 화학요법으로 암을 치료하여야 하지만, 완치율은 상당히 낮다.

따라서, 임상분야에서는 기존의 항암제보다 항암 효능이 더욱 뛰어난 새로운 항암제를 요구하고 있으나, 이러한 항암제를 개발하기 위해서는 항암제의 새로운 표적에 대한 개발이 요구된다.

최근, 이러한 항암제의 표적으로 아폽토시스에 관여하는 여러 유전자 및 단백질에 대한 연구가 진행되었다. 이러한 연구의 시발은, 지난 수년동안 화학요법에 이용되었던 항암제들이 암세포의 유전자를 손상시켜 아폽토시스(apoptosis), 즉 계획된 세포사멸(programmed cell death)을 유발시킨다는 발견에서부터 시작되었다.

비록, 아폽토시스를 통해 종양세포들을 죽일 수 있다는 기전에는 논쟁의 여지가 있을지라도, 아폽토시스를 유발할 수 있는 물질을 찾는 것은 새로운 항암제의 동정방법으로 인식되고 있다.

아폽토시스는, 모든 세포에서 나타나는 세포 사멸의 한 형태로, 아폽토시스를 통해 세포사멸이 이루어지면, 뚜렷한 형태적, 생화학적 특징이 나타난다. 이러한 아폽토시스 세포사멸은 일반적으로 수명이 다한 일반세포들에서 여러 유전자들의 작용에 의해 일어나며, 미분화 조세포(stem cell)로부터 새로운 세포가 생성되는 것만큼 중요하다. 아폽토시스를 통해 세포사멸이 이루어지는 세포는 염증반응 등에 의해 인접한 세포에 어떠한 영향도 미치지 않고, 계획된 사멸을 수행하여 자신만이 파괴된다. 이러한 아폽토시스의 생리적인 과정은 심각한 세포 손상과 팽배(swelling) 및 파손(lysis)이 일어난 후, 염증반응을 유발하여 주위 세포들마저도 파괴하는 세포괴사(necrotic cell death)와는 구별된다.

아폽토시스는, 생명체의 발달동안 잠깐 존재해야되는 세포들이 사라질 때, 바이러스, 박테리아 등에 감염된 세포(virus-infected cells) 및 자연적인 돌연변이에 의해 종양(tumor)으로 변형된 세포들을 효과적으로 사멸시키는 계획된 세포사멸이다.

따라서, 아폽토시스를 유도할 수 있는 물질의 개발은 염증반응을 통한 일반세포의 사멸을 유도하지도 않으면서, 효과적으로 종양세포만을 사멸시킬 수 있는 특징을 가질 수 있다.

이에, 본 발명자들은 아폽토시스를 유발할 수 있는 새로운 물질을 찾고자 많은 연구를 수행하였으며, 이전의 연구에서 눈꽃동충하초의 자실체의 메탄올 추출물로부터 신규히 분리한 성분으로서 4-아세틸-12,13-에폭실-9-트리코테신-3,15-디올 (AETD)이 암세포, 특히 백혈병 세포의 아폽토시스를 유발할 수 있다는 것을 발견하고, AETD를 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물에 관해서 2001년 8월 20일자로 특허출원(KR 제 2001-50001호)을 하였다.

본 발명자들은, 눈꽃동충하초의 약효성분들에 대해서 연구를 더 수행하던 중에, 눈꽃동충하초로부터 분리한 신규한 화합물로서 (3R,6R)-4-메틸-6-(1-메틸에틸)-3-페닐메틸-1,4-퍼하이드로옥사진-2,5-디온(이하, 'MMPPD'라 함)이 아폽토시스 유도활성이 매우 우수하여, 이를 함유하는 조성물이 아폽토시스 유도제 조성물로서 이용될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 눈꽃동충하초로부터 분리한 신규한 화합물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 눈꽃동충하초로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 유도제 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 화합물의 처리에 의해 백혈병 세포주인 HL-60 세포에서 아폽토시스가 유도됨을 핵염색에 의해서 보여주는 도면이다(도 1에서, *의 표시는 아폽토시스가 나타난 세포에서 전형적으로 보여지는 아폽토시스 바디(apoptotic bodies)를 나타낸다).

도 2는 본 발명의 화합물의 처리에 의해 농도 의존적으로 백혈병 세포주인 HL-60세포에서 아폽토시스가 유도됨을 DNA 절편화 검사를 통해 보여주는 도면이다(도 2에서, Marker는 φx174 RF DNA/Hae III 크기 마커를 사용한 것으로, 위에서부터 1,353 bp, 1,078bp, 872 bp, 603 bp의 크기를 나타낸다).

도 3는 본 발명의 화합물의 처리에 의해서 백혈병 세포주인 HL-60 세포가 아폽토시스의 전형적인 특징인 서브-G1기의 세포주기로 전이되는 것이 증가됨을 보여주는 도면이다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 눈꽃동충하초(Isaria japonicaY_ASUDA)로부터 분리한 신규한 화합물로서, 하기 화학식 1로 표시되는 (3R,6R)-4-메틸-6-(1-메틸에틸)-3-페닐메틸-1,4-퍼하이드로옥사진-2,5-디온(이하, 'MMPPD'라 함)을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에 따른 아폽토시스 유도제 조성물에서 유효성분인 MMPPD의 유효량은 투여방법, 제제형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택되어질 수 있으며, 구체적으로 제한되는 것은 아니지만, 일반적으로 MMPPD를 0.001∼100㎎/㎏체중의 농도로 투여되도록 제형화 될 수 있다. 물론, 유효성분의 투여량이 상기 범위를 벗어난 양일 수도 있다.

MMPPD를 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약, 캅셀 형태나 드링크제, 주사제, 의약품 등의 형태로 사용할 수 있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여경로를 통해서 아폽토시스 유도를 시키고자 하는 부위에 투여될 수 있으며, 투여제형에 따라 적합한, 그리고 당업자에게 주지되어 있으며, 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

동충하초, 특히 이사리아(Isaria)에 속하는 진균은 코디세프속의 불완전균형태(anamorphic fungus)로서 곤충의 유충을 감염시킨 후 숙주의 사체에서 번식한다. 이러한 형태의 진균 자실체는 전통적으로 많은 질병의 치료제로 사용되어 왔다. 코디세핀, 아데노신 유도체 등의 많은 생리활성 물질이 코디세프속의 진균류에서 밝혀졌지만, 이사리아 속의 진균에서는 강력한 면역억제제(미이리오신) 외에는 그다지 많은 물질이 보고된바 없다.

본 발명자들은 이전의 연구에서 밝힌 4-아세틸-12,13-에폭실-9-트리코테신-3,15-디올(AETD) 외에 아폽토시스를 유도할 수 있는 다른 성분을 찾고자 연구를 수행한 결과, 눈꽃동충하초로부터 분리한 신규한 화합물로서 MMPPD가 부작용을 유발하지 않으면서, 기존의 물질들보다 우수한 아폽토시스 유도활성을 갖고 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 이러한 연구결과를 토대로 MMPPD를 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 유도제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명에서 신규히 밝혀낸 MMPPD는 암세포에서 당업계에 통상적으로 주지되어 있는 아폽토시스의 특징들, 예를 들면 (1) 염색질과 핵분열을 포함한 전형적인 아폽토시스 세포의 형태학적 변화; (2) DNase들의 활성화에 의한 암세포 DNA의 절편화; 및, (3) 세포주기상 서브 G1기로의 전이 활성화 등을 현저하게 유발할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 여러 질환들의 치료에서 아폽토시스를 유발시키기 위한 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.

MMPPD를 유효성분으로 함유하는 본원 발명에 따른 조성물은 아폽토시스가 발생하는 질환들, 바람직하게는 백혈병, 유방암, 간암, 자궁경부암, 위암, 난소암,방광암, 폐암, 상피종암 등의 각종 암, 더욱 바람직하게는 백혈병에 원인이 되는 세포들의 아폽토시스를 유발할 수 있으므로, 암, 특히 백혈병의 치료에 유용하게 투여될 수 있다.

즉, 암은 대부분 아폽토시스에 의한 세포사멸 및 세포내 신호전달 기전에 의한 세포증식 사이의 불균형에 의하여 발생하며, 일반적으로 암조직에서는 세포 증식에 관련된 신호전달 기전은 활성화되는 반면, 아폽토시스에 관련된 세포 내 신호전달은 억제된다는 것이 당업계에 주지되어 있다. 따라서, 아폽토시스 유도제는 암세포에서 아폽토시스를 활성화시켜, 암세포에서 계획된 세포사멸을 유도시킴으로써, 암을 치료할 수 있다.

이러한 관점에서 본 발명에 따른 아폽토시스 유도제 조성물은 암세포, 바람직하게는 백혈병 세포에서 아폽토시스를 활성화시킴으로써, 암치료, 바람직하게는 백혈병 치료에 유용하게 이용될 수 있지만, 본원 발명의 조성물을 적용할 수 있는 질환은 이에 한정되지 않고, 당업계에 통상적으로 주지되어 있는 아폽토시스의 과다억제에 의해 발생하는 질환들의 치료를 위해서도 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 아폽토시스 유도제 조성물은 암치료에 적용할 경우, 그 자체를 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 다른 암치료제 또는 암치료제 조성물, 약제 및 다른 여러 물리학적, 의학적 치료방법과 병행하여 사용함으로써, 그 효과를 극대화시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예와 도면에 의해서 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이에 의해서 한정되는 것은 아니다. 비록 하기의 실시예에서는 본원에 따른화합물의 아폽토시스 유도효과에 대해서, 백혈병 세포중인 HL-60 세포에 적용한 결과만을 보여주었지만, 본 발명의 화합물이 적용되는 범위는 상기 HL-60 세포 또는 백혈병 세포에만 적용되는 것이 아니라, 각종 암세포에서도 아폽토시스를 유발함으로써 그 해당 암질환을 치료할 수 있다는 것은 당업자에게 자명하게 인식될 수 있을 것이다.

하기의 실시예 중 실험예들은 각각의 실험들을 적어도 3번 이상 실행하여 얻어진 결과들이며, Student's t-test를 이용한 통계 분석을 이용하였다. 유의성의 한계는 p값이 <0.05를 기준으로 정하였다.

[참고 실시예 1] 재료

하기의 실시예에서 이용되는 시약 및 시료는 다음과 같이 입수하였다.

RPMI-1640과 우테아혈청(fetal bovine serum; FBS)은 Gibco/BRL (Grand Island. NY. U.S.A)로부터 구입하였다. 디메틸 설폭사이드(Dimethy sulfoxide; DMSO), 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드, 트립판 블루(trypan blue), DAPI 및 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide; PI)는 시그마사(Sigma Chemical, St. Louis, MO, U.S.A)로부터 구입하였다. 그 외 모든 용매는 분석등급인 것을 사용하였으며, 머크사(Merck, Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다.

[참고 실시예 2] 세포배양

HL-60 세포주(CCL-240)는 ATCC(American Type Culture Collection, ATCC; Rockville. MD. U.S.A)의 기탁기관으로부터 분양 받았으며, 하기에서 특별한 언급이 없는 한, HL-60 세포주는 10% 우테아혈청(FBS)이 첨가된 RPMI-1640 배양배지에서, 95% 공기 및 5% 이산화탄소 (CO₂)가 소통되는 습기가 충분한 대기에서 37℃를 유지하며 배양하였다. 세포는 지수 성장을 유지하기 위해, 2∼3일 마다 새로운 배양배지에 분주하면서 배양하였다.

[참고 실시예 3] 눈꽃동충하초의 수집 및 배양

본 발명에서 사용한 동충하초의 균종은 한국의 전라북도에 소재한 모악산에서 분리한 균종을 이용하였으며, 한국 우석대 생물학과 조덕현 교수에 의해서 눈꽃동충하초로 동정되었다.

동정된 눈꽃동충하초(I. japonica, voucher No. CHO-6133)는 감자 포도당 배지에 접종한 후, 균 집락의 직경이 5㎝가 될 때까지 25℃에서 약 10일간 배양을 지속하였다. 형성된 균 집락은 회색을 나타내었다.

상기 얻어진 균 집락은 약 4℃의 온도에서 보관하여 저장용 배양체(stock culture)로 이용하고, 하기의 시험 배양에 사용하였다. 그런 다음, 1ℓ플라스크에 500㎖의 배양배지를 채우고, 121℃ 에서 20분간 멸균한 다음, 15℃로 냉각시켜 제조한 배양액에, 상기 저장용 배양체로부터 얻은 4개의 5㎜ 아가 플러그(agar plugs)를 접종시켜 계대배양(second culture)을 수행하였다. 플라스크 배양은 25℃에서 3일간 140 rpm하에서 배양하였고, 그런 다음 4일간 160rpm하에서 배양하는 방식으로 수행하였다. 이때, 배양배지는 200g/ℓ의 감자 및 30g/ℓ의 설탕으로 구성된 것을 이용하였다. 모든 배양은 암실에서 수행하였다.

그런 다음, 세 번째 무사분열(fermentation)은 100g의 누에 번데기에서 수행되었다. 무사분열 배지는, 121℃에서 40분간 멸균한 것을 이용하였으며, 멸균을 수행한 무사분열 배지를 15℃로 냉각시킨 후, 5㎖의 포자용액을 접종하였다. 그런 다음, 25℃의 암실에서 8일간 배양하였다. 배양 후, 배양 조건을 60%의 습도로 바꾸어서 10일간 암실에서 더 배양한 뒤, 이후 20℃, 80%의 습도 및 2000lux의 밝기가 유지되는 배양조건에서 30일간 더 배양하여, 눈꽃동충하초의 자실체를 얻어내었다.

[실시예 1] 추출 및 분리

공기 건조된 자실체 1,000g를 5ℓ의 메탄올로 48시간 동안 추출하였다. 그런 다음, 메탄올 추출물을 농축한 후 물로 현탁하고, n-헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올로 차례대로 추출하여, 2.9g의 EtOAc 용해성 분획을 얻었다. 그런 다음, EtOAc 용해성 분획을 C18 플래쉬 컬럼크로마토그래피(C₁₈flash column chromatography)에 적용한 후, 증류수로 희석시킨 0%, 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90% 및 100%(v/v)의 메탄올 농도구배로 용출하였다(8개의 분획, 각 분획당 200㎖). 그런 다음 90%의 메탄올 용액에서 용출된 분획(305㎎)에 대하여 실리카겔(Merck Kieselgel 60; 0.063-0.2㎜ 입자) 컬럼크로마토그래피(silica gel column chromatography; 3㎝ 직경, 20㎝ 높이)에 적용하고, CH₂Cl₂-MeOH 농도구배(CH₂Cl₂로 희석시킨 0∼50%의 메탄올 용액으로 용출)로 용출하였다(각 분획당 50㎖; 15개의 분획이 얻어짐). TLC 분석결과(실리카겔, CH₂Cl₂/MeOH = 9:1)를 토대로, CH₂Cl₂로희석시킨 4% 및 5% 메탄올 용액으로 용출시킨 분획(300∼400㎖ 사이에서 용출된 분획; 164.2㎎)을 섞고, H₂O로 희석한 60∼100%의 CH₃CN 용액의 농도구배를 사용하는 준대량 역상 HPLC(Alltech HS Hyperprep 100 BDS C₁₈(1.0㎝의 직경, 25㎝의 높이; 8-m 입자크기; 2㎖/min; 210㎚에서 UV 검출)에 60분간 적용하여, 화합물 1(42.5㎎, t_R= 36.8 min)을 순수하게 분리하였다.

또한, 화합물 1의 분자식은 NMR및 FABMS 자료 분석을 근거로 규명하였으며, 그 결과 화합물 1은 (3R,6R)-4-메틸-6-(1-메틸에틸)-3-페닐메틸-1,4-퍼하이드로옥사진-2,5-디온(MMPPD)임을 확인하였다. 전체적인 화합물 1의 평면 구조는 이차원 NMR 자료(COSY 및 HMBC) 분석을 통하여 확인하였다.

한편, 본 발명에서 신규히 밝혀낸 화합물 1의 스펙트럼 분석결과는 다음과 같다.

MMPPD(화합물 1):

[α]²³ _D: 48.8^o(c 0.43, CHCl₃);

UV (MeOH):_max(log) = 209 (5056)㎚;

IR(film):_max= 2964, 1745, 1660, 1483, 1413, 1371, 1263, 1180, 1109, 1018 ㎝^-1;

¹H 및¹³C NMR: 하기 표 1 참조;

C/H no.	MMPPD
C/H no.	¹³C^aδ	¹H_bδ(multiplicity, Jin Hz)	HMBC	NOESY
2	170.2	--	--	--
3	57.6	5.47 (br d)	2	10
4-CH₃	32.6	3.00 (s)	3, 5	--
5	169.5		--	--
6	75.7	4.92 (d, 8.7)	2, 7, 8	7
7	29.9	2.02 (m)	5, 6, 8	6
8	17.8	0.42 (d, 6.9)	6, 7, 9	9, 12, 13
9	18.5	0.80 (d, 6.9)	6, 7, 8	8
10	35.0	3.36 (dd, 14.5, 5.1)2.98 (dd, 14.5, 11.9)	2, 3	3
11	136.9	--	--	--
12,16	129.1	7.23 - 7.26 (m)	10	8
13,15	128.8	7.23 - 7.26 (m)	10	8
14	127.0	7.17 (m)	--	--
^aRecorded at 500 MHz^bRecorded at 125 MHz^cAssignments may be interchanged

LRESIMS: m/z = 262 [M + H]⁺

[실시예 2] MMPPD 및 종래 화합물과의 스펙트럼 결과 비교

화합물 1은 흰색 가루의 성상을 지닌다. 탄소 핵 자기공명분석 및 질량 분석 결과를 토대로 화합물 1의 분자식은 C₁₅H₁₉NO₃이라는 것이 확인되었다.

한편, 표 1에 나타낸 화합물 1의 양성자 및 탄소 NMR 분석결과는 하기 화학식 4로 나타내지는 종래의 라터리틴(lateritin)에 대한 결과와 거의 동일하였다(11).

[화학식 4]

비록 본 발명의 화합물이 라터리틴의 구조를 가질 것이라는 의심이 제기되기도 하였지만 (11), 1차 및 2차 NMR 자료 분석을 통하여 다시 한번 화합물 1의 구조를 확인하였다.

또한, 약염기 반응조건(1N NaOH in MeOH, rt, 80 min)에서 생성(72% 수득율)되는 화합물 2의 구조를 동정하여 다시 한번 화합물 1의 구조를 확인할 수 있었다. 화합물 2의 구조는 NMR 및 ESIMS 자료 ([M H]^-atm/z278)를 통하여 규명되었다. 화합물 2의 번호는 화합물 1에 사용된 방식에 따랐다. 화합물 2의 스펙트럼 결과와 구조식은 다음과 같다.

(3R, 6R)-N-메틸-[(1-히드록시-2-메틸)프로필]페닐알라네이트:

[α]²³ _D: + 25^o(c 0.12, CHCl₃);

UV (MeOH):_max(log) = 206 (5296)㎚;

IR (film):_max= 3474, 2966, 1747, 1664, 1496, 1377, 1253, 1182, 1136, 1043㎝^-1;

¹H and¹³C NMR: 하기 표 2 참조;

C/Hno.	(3R, 6R)-N-메틸-[(1-히드록시-2-메틸)프로필]페닐알라네이트
C/Hno.	¹³C^aδ	¹H^bδ(multiplicity, Jin Hz)
2	165.9
3	61.9	4.40 (dd, 5.1, 5.1)
4-CH3	32.9	2.99 (s)
5	164.5	--
6	83.8	4.36 (d, 7.4)
7	32.4	1.18 (m)
8	17.5	0.59 (d, 6.5)
9	18.9	0.85 (d, 6.9)
10	38.1	3.34 (dd, 14.2, 5.1)3.30 (dd, 14.2, 5.1)
11	134.8	--
12, 16	129.8	7.26 - 7.34 (m)c
13, 15	129.1	7.15 - 7.16 (m)c7.26 - 7.34 (m)c
14	127.8	7.15 - 7.16 (m)c

LRESIMS: m/z = 278 [M - H]^-.

[화학식 2]

화합물 1의 3차 구조는 규명된 바 없으며, 본 발명에서는 NOESY 자료(표 1 참조) 분석하여 이를 확인하였다. 방향성(aromatic) 구조의 수소에 해당하는 NMR 신호(7.23-7.26)와 메틸 그룹에 해당하는 수소의 NMR 신호(0.42) 간의 NOESY 연결 피크는 위의 두 그룹이 공간적으로 가까이 존재함을 의미한다. 따라서, 벤질 그룹과 메틸 그룹은 1,4-옥사진(1,4-oxazinane) 고리의 같은 면에 위치함을 알 수 있다. 이는 화합물 1의 탄소 3과 6번 위치의 상대적 배향이 보고된 하기의 화학식 3을 갖는 바시아틴(bassiatin)과 3차 구조가 다름을 알 수 있다.

[화학식 3]

화합물 1의 양성자 NMR 자료와 공지된 바시아틴의 양성자 NMR 자료(11)의 비교 분석을 통하여, H-6(2.98 vs. 4.92) 및 H₃-9 (0.74 vs. 0.42)에 해당하는 신호가 현격한 차이가 있음을 알 수 있다.

또한, 바시아틴의 x-선 구조(9)와 본 발명의 MMPPD의 분자 모델 비교를 통하여 관찰된 NMR 신호의 차이점을 비교하였다. 바시아틴의 X-ray선 구조에 의하면, H-6은 벤질 그룹의 차폐영역(shielding region)에 위치함을 알 수 있고, 이는 상대적으로 바시아틴의 H-6이 상위 화학이동(up-field chemical shift) 영역에서 공명이 일어남을 나타낸다. 반면, MMPPD의 경우는 H-6보다는 메틸 그룹이 벤질 그룹의 차폐영역에 위치함을 알 수 있고, 이는 메틸 그룹이 상대적으로 상위 화학이동 영역에서 공명이 일어난다는 것을 나타낸다. 따라서, 화합물 1과 바시아틴의 NMR 자료가 상이한 것은 H-3과 메틸기에 대한 벤질기의 상대적 배향이 다른 것에 기인함을 알 수 있다.

한편, 본 발명의 MMPPD의 C-3 및 C-6의 절대 배향을 규명하기 위하여 DDMMP의 가수 분해 산물에 대한 광학 활성도를 측정하였다. 우선, 화합물 1을 산성조건(6N HCl, 103℃, 12시간 반응)에서 가수분해시켰을 때,N-메틸페닐알라닌 및 2-히드록시-3-메틸 부틸산(butyric acid)이 생성됨을¹H NMR 및 ESIMS 자료 분석을 통하여 규명하였다. 생성된N-메틸페닐알라닌의 광학 활성도([α]²³ _D20^o,c0.05, 1M HCl)는 표준 물질R-N-메틸페닐알라닌([α]²⁵ _D24.7^o,c1.6, 1M HCl)의 수치에 상응하므로, 화합물 1의 C-3은R배향을 가짐을 알 수 있다. 비슷한 방법으로, 생성된 2-히드록시-3-메틸 부틸산의 광학 활성도([α]²³ _D50^o,c0.02, CHCl₃)는 문헌에 보고된S-2-히드록시-3-메틸 부틸산의 수치 ([α]²⁵ _D+ 19^o,c1, CHCl₃)와 비교하였을 때, MMPPD의 C-6은R배향을 지님을 알 수 있다. 반면, MMPPD의 광학활성도([α]²³ _D48.8^o,c0.43, CHCl₃)는 합성된 (3S, 6S)-바시아틴 이성질체의 값([α]²³ _D24.3^o,c1.0, CHCl₃)과 상응한다.

또한, 본 발명에서 분리한 MMPPD의 평면 및 상대 구조를 명확하게 구분하기 위해서, 본 발명의 MMPPD의 NMR 측정자료와 문헌에 보고된 바시아틴 이성질체의 NMR 자료를 면밀히 조사하였다. 본 발명의 MMPPD의 NMR 측정자료는, 특히 H-3과 H-6의 화학 이동값은 보고된 (3R, 6R) 혹은 (3S, 6S) 이성질체의 NMR 자료와 상이함을 알 수 있다. 반면, 화합물 2의 NMR 측정자료는 보고된 (3R, 6R) 혹은 (3S, 6S) 이성질체의 NMR 자료와 일치함을 알 수 있다. 따라서, 실질적으로 보고된 바시아틴의 합성 이성질체들은 바시아틴의 이성질체들이 아니라, 디케토모르핀(diketomorphine) 고리를 갖는 열린 화합물, 즉 N-메틸-[(1-히드록시-2-메틸)프로필]페닐알라네이트임을 알 수 있다. 추가적으로 보고된 (3R, 6R)-바시아틴 이성질체로서 4-메틸-6-(1-메틸에틸)-3-페닐메틸-1,4-퍼하이드록옥사진-2,5-디온의 광학활성도 값은 화합물 2의 값과 상응한다([α]²³ _D+ 25^o,c0. 12, CHCl₃). 따라서, 화합물 1의 절대 배향을 포함한 전체적인 3차 구조는 (3R, 6R)-4-메틸-6-(1-메틸에틸)-3-페닐메틸-1,4-퍼하이드록옥사진-2,5-디온으로 명확히 동정되었다.

[실시예 3] DAPI/PI를 이용한 핵 염색

1×10⁶cells/㎖ 농도의 HL-60 세포를, 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI 1640 배지에 10nmol/ℓ의 MMPPD를 함유시키거나 함유시키지 않은 상태에서, 6웰 접시(6-well dishes)에서 4시간 배양하였다. 배양 후, 1㎖의 세포부유액을 1,000rpm에서 3분동안 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 그런 다음, 세포침전물에 4%의 중성 완충된 100㎕의 포르말린을 첨가하여 고정하였다. 고정된 50㎕의 세포 부유액을 슬라이드에 옮기고, 실온에서 건조하였다. 고정된 세포를 PBS로 세척한 다음, 건조시키고, DNA-특이적 플루오로크롬(fluorochrom) DAPI(4,6-Diamidino-2-phenylindole)/PI으로 1분간 염색하였다. 부착된 세포는 PBS로 세척한 다음, 건조시키고, 90% 글리세롤(glycerol)로 마운트(mount)시켰다. 슬라이드는 형광현미경을 이용해 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, MMPPD는 아폽토시스를 통한 세포 사멸의 전형적인 형태학적 특징으로서 핵염색질의 응축, 핵절편화 및 아폽토시스 바디 등을 유발시켰다.

[실시예 4] DNA 절편화 분석(DNA Fragmentation Analysis)

1×10⁶cells/㎖의 HL-60 세포를 다양한 농도의 MMPPD로 6시간 동안 처리하였다. 그런 다음, MMPPD 처리세포를 1,000rpm에서 3분간 윈심분리하고, PBS로 세척하였다. 세포침전물에 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM EDTA, 0.5% SDS, 0.5 mg/ml proteinase K(Sigma Chemical Co., St. louis. MO. U.S.A))을 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시켜 용해했다. 그런 다음, 25㎎/㎖의 RNaes A를 첨가한 후, 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 단백질 침전용액(40% 암모니움 설페이트 )을 첨가한 다음, 4℃에서 1,300rpm으로 10분간 원심분리하여 모든 단백질을 침전시켰다. 그런 다음, 상청액을 페놀/클로로포름(1:1, v/v)으로 추출하고, 수상(aqueous phaes)을 클로로포름/이소아밀알콜(24:1, v/v)으로 한번 더 추출하였다. 그런 다음, 2배 부피의 이소프로판올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 원심분리를 통해 회수한 DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척한 후, 공기 중에서 건조시킨 다음, 10mM 트리스-HCl(pH8.0) 및 1mM EDTA로 구성된 TE 완충액으로 용해시켰다. DNA를 정량한 후, 10㎍의 DNA를 5V/㎝에서 1.5%의 아가로즈 겔로 전기영동시켰다. 그런 다음, EtBr(ethidium bromide)로 DNA를 염색한 후, 자외선 아래에서 관찰하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

MMPPD를 처리한 세포에서 약 180∼200bp 위치에서, 다수의 올리고뉴클레오조말(oligonucleosomal) DNA 절편화(ladder)을 확인하였으며, 이러한 결과는 MMPPD 처리 세포에서 아폽토시스가 일어났음을 나타낸다.

[실시예 4] 흐름세포 분석(Flow Cytometric Analysis)

지수성장을 하는 세포들을 1×10⁶cells/㎖의 밀도가 되도록 RPMI 1640 배지로 현탁하고, 0, 5, 20, 50 또는 100㎍/㎖의 MMPPD를 처리한 후, 37℃에서 6시간동안 배양하였다.

상기 MMPPD로 처리된 1×10⁶cells/웰의 HL-60세포를 80% 냉장 에탄올로 30분간 고정시킨 다음, PBS로 세척하고, 1㎎/㎖ RNase A를 함유하고 있는 0.5% 트립톤 X-100 용액 0.25㎖로 37℃에서 30분간 처리하였다. 그런 다음, 50㎎/㎖ 농도의 PI 용액 0.25㎖을 첨가하고, 암실에서 30분간 방치하였다. 그런 다음, 표본으로부터 세포수를 측정하기 위해 FACS Vantage(Becton Dickinson, San jose, CA, U.S.A) 흐름세포분석기에 통과시켜, 시료 세포로부터 서브-G1기의 DNA량을 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, MMPPD의 농도 증가에 따라 서브-G1기의 아폽토시스피크도 증가하였다. 이러한 결과는, MMPPD가 HL-60 세포의 아폽토시스를 농도에 의존적으로 유발시킨다는 것을 나타낸다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 눈꽃동충하초의 자실체로부터 분리한 신규한 화합물로서 (3R,6R)-4-메틸-6-(1-메틸에틸)-3-페닐메틸-1,4-퍼하이드로옥사진-2,5-디온은 암세포에서 아폽토시스 유도활성이 매우 우수하여, 이를 함유하는 조성물이 아폽토시스 유도제 조성물, 특히 항암제로서 이용될 수 있다.

References

1. Takano F, Kikuchi Y, Fushiya S, Hojo H, Nozoe S, Yahagi N, Kondo Y. The culture fluid ofIsaria japonicaYasuda augments anti-sheep red blood cell antibody response in mice. Biological & Pharmaceutical Bulletin 1996; 19: 641-3

2. Bok JW, Lermer L, Chilton J, Klingeman HG, Neil Towers GH. Antitumor sterols from the mycelia ofCordyceps sinensis. Phytochemistry 1999; 51: 891-8

3. Cory JG, Suhadolink RJ, Resnick B, Rich MA. Incorporation of cordycepin (3'-deoxyadenosine) into ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid of human tumor cells. Biochimica et Biophysica Acta 1965; 103: 646-53

4. Furuya T, Hirotani M, Matsuzawa M.N ⁶-(2-hydroxyethyl)adenosine, A biologically active compound from cultured mycelia ofCordycepsandIsariaspecies. Phytochemistry 1983; 22: 2509-12

5. Fusita T, Inoue K, Yamamoto S, Ikumoto T, Sasaki S, Toyama R, Chiba K, Hoshino Y, Okumoto T. Fungal metabolites. Part II. A potent immunosuppressive activity found inIsaria sinclairiimetabolites. Journal of Antibiotics 1994; 47: 208-15

6. Story M, Kodym R. Signal transduction during apoptosis: Implications for cancer therapy. Frontiers in Bioscience 1998; 3: 365-75

7. McConkey DJ. Biochemical determinants of apoptosis and necrosis. Toxicology Letters 1998; 99: 157-68

8. Fadeel B, Orrenius, S, Zhivotovsky, B. Apoptosis in human disease: A new skin for the old ceremony? Biochemical and Biophysical Research Communications 1999; 266: 699-717

9. Oh G-S, Hong, K-W, Oh H, Pae H-O, Seo W-G, Kim I-K, Kim N-Y, Kwon T-O, Shin M-K, Chung H-T. 4-Acetyl-12,13-epoxyl-9-trichothecene-3,15-diol isolated from the fruiting bodies ofIsaria japonicaYasuda induces apoptosis of human leukemia cells (HL-60). Biological & Pharmaceutical Bulletin 2001; 24: 785-9

10. Hasumi K, Shinohara C, Iwanaga T, Endo A. Lateritin, a new inhibitor of acyl-CoA: Cholesterol acyltransferase produced byGibberella lateritiumIFO 7188. Journal of Antibiotics 1993; 46: 1782-7

11. Kagamizono T, Nishino E, Matsumoto K, Kawashima A, Kishimoto M,Sakai N, He B-M, Chen Z-X, Adachi T, Morimoto S, Hanada K. Bassiatin, a new platelet aggregation inhibitor produced byBeauveria basianaK-717. Journal of Antibiotics 1995; 48: 1407-12

Claims

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하기 화학식 1로 나타내어지는 (3R,6R)-4-메틸-6-(1-메틸에틸)-3-페닐메틸-1,4-퍼하이드로옥사진-2,5-디온을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 아폽토시스 유도제 조성물.

[화학식 1]
제 3항에 있어서, 상기 아폽토시스 유도제 조성물은 암세포에서 아폽토시스를 유발함을 특징으로 하는 아폽토시스 유도제 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 암세포는 백혈병 세포, 유방암 세포, 간암 세포, 자궁경부암 세포, 위암 세포, 난소암 세포, 방광암 세포, 폐암 세포 및 상피종암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 암 세포임을 특징으로 하는 아폽토시스 유도제 조성물.
제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (3R,6R)-4-메틸-6-(1-메틸에틸)-3-페닐메틸-1,4-퍼하이드로옥사진-2,5-디온은 눈꽃동충하초의 자실체로부터 분리되는 것임을 특징으로 하는 아폽토시스 유도제 조성물.