KR20010070840A - 작약씨로부터 분리한 골질환용 레즈베라트롤 및 그유도체의 추출방법 - Google Patents

작약씨로부터 분리한 골질환용 레즈베라트롤 및 그유도체의 추출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 작약씨로부터 스틸벤화합물인 레즈베라트롤과 그 유도체의 제조방법 및 이를 골질환 치료에 이용하는 것에 관한 것이다. 보다 상세하게는 건조된 작약씨를 고르게 분쇄한 후 노르말-핵산을 가하여 탈지하는 단계와, 전기의 탈지박에 메탄올 가하여 일주일간 상온에서 3회 반복 추출한 후 여과·농축하여 메탄올추출물을 얻는 단계와, 이 추출물을 메탄올로 가용화하고 미리 수용성 메탄올용액으로 평형화시켜 놓은 다이아이온 HP-20 칼럼에 충진하여 흡착시키는 단계와, 20%∼80% 수용성 메탄올 용액을 차례로 용리하여 얻어진 수용성 메탄올추출액을 감압·농축시키는 단계와, 전기의 농축된 추출물을 메탄올로 용해시키고 미리 메탄올로 평형화시켜 놓은 세파덱스 LH-20 칼럼에 흡착시켜 메탄올로 분획별로 용출시키는 단계와, 이때 자외선 검출기 필터를 통하여 순차적으로 분리되어 나오는 2가지 자외선 흡수분획(Ⅰ,Ⅱ)을 감압·농축하는 단계와, 전기의 분획을 메탄올로 용해한 후 분취-액체크로마토그래피를 반복 실시하여 분획Ⅰ로부터 트란스-레즈베라트롤과 트란스-레즈베라트롤-4'-O-베타-D-글루코사이드을 분리하고, 동일한 방법으로 분획 II로부터 트란스-비니페린 및 시스-비니페린을 분리하는 단계로 구성된 트란스-레즈베라트롤 및 그 유도체의 분리방법에 관한 것이다.
본 발명의 작약씨부터 분리한 트란스-레즈베라트롤 및 그 유도체인 비니페린 성분은 골질환(골절 및 골다공증) 치료용의 의약품 및 기능성 식품의 신소재로 제공할 수 있다. 또한 상기 성분은 통상의 부형제와 함께 수액제, 환제, 정제, 캡슐 형태로 제조되어 골질환 예방용 및 치료용 의약품으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 식품첨가제와 함께 분말 또는 과립 차 및 음료와 같은 형태로 제조되어 기능성 건강보조식품으로도 사용될 수 있다.

Description

작약씨로부터 분리한 골질환용 레즈베라트롤 및 그 유도체의 추출방법{Extract Method for Resveratrol and Its Derivatives isolated from Paeonia lactiflora Seeds and Its Use for Improved Bone Diseases}
본 발명은 골 형성 촉진작용 및 여성호르몬 에스트로겐 활성을 지니고 있어 향후 골질환 치료제로서 사용하기에 유용한 작약씨로부터 스틸벤화합물인 레즈베라트롤 및 그 유도체의 추출방법과 그 용도에 관한 것이다.
작약(芍藥, 영명: Peony, 생약명:Paeoniae radix)은 미나리아재비과 (Ranuculaceae) 작약속(Paeonia)에 속하는 약용작물로서 초본인 작약과 목본인 모란으로 구분된다(윤평섭, 한국원예식물도감, 1989). 작약은 식물 분류면에서 적작약(Paeonia lactifloraPall.), 백작약(Paeonia obovataMax.) 및 산작약(Paeonia japonicaMiyabe et Takeda)으로 구분되며, 국내에서는 적작약의 변종이 주로 재배되고 있다(윤평섭, 한국원예식물도감, 1989).
작약은 국내에서 인삼, 당귀 다음으로 가장 많이 이용되고 있는 약용작물로서 첩약을 비롯한 쌍화탕, 사물탕, 당귀작약산, 계지가작약탕, 작약감초탕, 우황청심환, 소청룡탕 등의 생약제제의 원료(본초학, 이상인, 1980)로서 널리 이용되고 있다. 작약의 국내 재배 규모는 더덕, 당귀, 도라지, 두충, 황기와 더불어 6대 주요 약용작물로서 그 생산량은 2,062 M/T (1998년 기준)으로 다른 약용작물에 비해 그 수요량이 큰 작물중의 하나이다(특용작물생산실적, 농림부통계, 1999).
작약뿌리는 예로부터 한방에서 진통, 진경, 진해, 부인약, 고혈압, 복통, 및 염증 치료제로 널리 이용되어져 왔으며(한대석, 생약학, 동명사, 1995; 이상인, 본초학, 수서원, 1987), 그 주된 생리활성물질로서 페오니프로린(paeoniflorin), 옥시페오니프로린(oxypaeoniflorin), 및 알비노프로린(albinoflorin)을 포함한 여러 가지의 모노터펜 글루코사이드(monoterpene glucosides)(Hattori et al.,Chem. Pharm. Bull. 33: 3838-3846, 1985; Kang et al.,Kor. J. Pharmacogn. 24: 247-250, 1993; Okubo et al.,Biol. Pharm. Bull. 23: 199-203, 2000)와 탄닌 및 페놀산 등이 잘 알려져 있다(Sakai et al.,Eisei Kagaku35: 433-443, 1989; Goto et a.,Planta Medica62: 436-439, 1996; Satoh et al.,Biochem. Pharmacol. 53: 611-614, 1997; Tanaka et al.,Chem. Pharm. Bull. 45: 1891-1897, 1997; Tanaka et al.,Chem. Pharm. Bull. 48: 201-207, 2000). 이와같이 지금까지 작약뿌리로부터 여러 가지 생리활성물질의 검색 및 그들의 생리적·약리적 작용에 관한 많은 연구가 수행되어 온 반면, 작약씨에 관한 연구는 미비한 실정이다.
한편, 폐경기 이후 여성은 호르몬 에스트로겐의 분비 결핍에 따라 골다공증, 심혈관계질환 및 치매(Alzheimer's disease) 등의 여러 생리적장애의 발병이 증가한다 (Ibrahim and Hortogbagyi,Surgical Oncology8: 103-123, 1999). 특히, 골다공증은 폐경기 이후 여성에게 가장 흔히 나타나는 질병으로서 그 예방과 치료를 위해서 현재 에틸닐에스트라디올(ethylnyl estradiol), 17베타-에스트라디올(17β-estradiol)과 같은 합성호르몬 대체요법(hormone replacement therapy, HRT)이 효과적으로 널리 이용되고 있다(Grady et al.,Ann Intern Med., 17: 1016-1037, 1992).
HRT 투여는 골흡수를 억제하여 골밀도를 높이며, 고관절 골절의 위험성을 크게 저해시키며(Michaelsson et al.,British Med. J., 316: 1858-1863, 1998), 아울러 5년 이상 지속적인 장기간의 HRT 투여는 골다공증 예방과 치료에는 탁월한 효과를 나타내지만, 불규칙적인 출혈과 유방암 및 자궁암 등의 부작용이 발생될 위험률이 높다(Genant et al.,Am. J. Obstet. Gynecol., 161: 1842-1846, 1989; Persson et al.,Cancer Causes Control10: 253-260, 1999). 따라서 HRT의 부작용을 최소화하도록 뼈나 심혈관 조직에만 선택적으로 작용하고 유방이나 자궁에는 거의 영향력을 미치지 않는 에스트로겐 대체 물질의 개발이 시급히 요구되고 있다.
지금까지 개발된 에스트로겐 대체물질로서는 합성 분자인 선택적 에스트로겐 결합조절제(selective estrogen receptor modulator, SERM)(Aloysio et al.,Gynecol Endocrinol11: 289-293, 1997)와 식물 유래의 피토에스트로겐(phytoestrogen)(Martini et al.,Nutr. Cancer34: 133-139, 1999) 등이 잘 알려져 있다. SERM는 에스트로겐 수용체(ER)에 대해 길항제 혹은 효현제로서의 두 가지 활성을 가질 수 있는 약제이다(Ibrahim and Hortogbagyi,Surgical Oncology8: 103-123, 1999). SERM은 뼈, 혈관 및 간 등에서는 주로 에스트로겐 효현제로 작용하고, 유방이나 생식기에서는 에스트로겐 길항제 혹은 극히 약한 활성의 효현제로서 작용한다(Kauffman and Bryant,DN & P8: 531-538, 1995).
대표적인 SERM의 화합물인 라로시펜(raloxifen)은 현재 골다공증 치료제로 유일하게 인증된 물질로서(Mark et al.,Am. J. Physiol. Cell Physiol., 279: C1550-C1557, 2000), 뼈에 선택적으로 에스트로겐 작용을 나타내면서 자궁에 미치는 영향은 거의 없는 것으로 보고되고 있다(Black et al.,J. Clin. Invest. 93: 63-69, 1994). 그러나 라로시펜은 혈전증(thromboembolism)이 발생될 가능성이 높아서 에스트로겐 대체물질로써 문제점이 있다(Delmas et al.,New Eng. J. Med., 338: 1313-1314, 1998). 따라서 현재 합성에스트로겐 물질을 대체할 수 있는 천연물 유래의 보다 안전하고 효과있는 피토에스트로겐 물질의 개발이 요구되고 있다.
피토에스트로겐(phytoestrogen)은 여성호르몬 에스트로겐(estrogen)과 유사한 분자구조를 갖고 있는 식물 유래의 디페놀화합물(diphenols)로써(Knight and Eden,Obstet Gynecol., 87: 897-904, 1996), 콩의 이소플라보노이드(isoflavonoid), 클로바 및 알팔파의 큐메스탄(coumestan) 및 아마종자(flaxseed)의 리그난(lignan) 물질이 그 대표적인 화합물(Axelson et al.,Nature12: 298: 659-660, 1982; Setchell and Adlercreutz,Academic Press, London, p315-345, 1988; Aldercreutz et al.,J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 44: 147-153, 1993; Hutchins et al.,J. Am. Diet Assoc., 95a: 545-551, 95b: 769-774, 1995; Draper et al.,J. Nutr., 127: 1795-1799, 1997; Amnon and Debi.Eur.J. Obstet Gynecol Reprod Biol., 85: 47-51, 1999; Chiechi,Int. J. Gynecol & Obstet., 67: 39-40, 1999)이다. 이들 피토에스트로겐 화합물들은 사람의 장내미생물에 의해 포유류 이소플라본(mammalian isoflavones) 및 리그난 성분으로 변형되어 생체의 17β-에스트라디올(estradiol)과 경쟁적으로 에스트로겐 결합자리를 차지함으로서 에스트로겐(estrogen) 및 항에스트로겐(antiestrogen) 작용을 발휘하여(Miksikek,Steroid Biochem. Mol. Biol., 49: 153-160, 1994) 호르몬 의존성의 유방암, 전립선암 및 대장암을 예방해줄 뿐 아니라 폐경기 이후 여성에게 많이 발생하는 심장병, 고혈압 및 골다공증을 예방하는 것으로 밝혀지고 있다(Tang and Adams,J. Endocrinol., 85: 291-297, 1980; Aldercreutz et al.,J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 44: 147-153, 1993; Dwyer et al.,J. Am. Diet. Assoc., 94: 739-743, 1994; Draper et al.,J. Nutr. 127: 1795-1799, 1997; Adlercreutz,Baillieres Clin. Endocrinol. Metab.12: 605-623, 1998).
특히 콩의 이소플라보노이드는 폐경기 이후 여성의 골다공증 동물실험 모델에서 골흡수를 저해하여 골밀도를 높게 유지하는 효과가 있다고 보고하였으며(Arjmandi et al.,J. Nutr., 126: 161-167, 1996; Draper et al.,J. Nutr., 127: 1795-1799, 1997 Potter et al.,Am. J. Clin. Nutr., 68(suppl):1375S-1379S, 1998; AlekelAm. J. Clin. Nutr., 72: 844-852, 2000), 아울러 콩의 이소플라본 성분인 제니스테인은 에스트로겐과 마찬가지로 골 형성 및 분화를 촉진하였다(Anderson and Garner,Baillieres Clin Endocrinol Metab., 12: 543-557, 1998). 그리고 큐메스트롤(coumestrol)은 닭 대퇴부의 조직 배양에서 골흡수를 저해하고 골 석회화를 촉진하였으며(Tsutsumi,Biol. Pharm. Bull. 18: 1012-1015, 1995), 큐메스트롤의 유사체인 KCA-098도 골 분화를 촉진시겼다는 보고가 있다(Kawashima et al.,Biochem. Pharmacol., 26:133-139, 1996).
최근 본 발명자들은 홍화씨에 존재하는 리그난 성분인 마타이레시놀(matairesinol)은 골 형성 및 분화를 촉진할 뿐 아니라 골 결절내의 칼슘 침착도를 강화하여 골다공증 치료 효과가 있음을 처음으로 밝힌 바 있다(최상원 등, 특허 출원번호 00-0003048; 이원정 등 특허 출원번호 00-0017617). 이와같이 피토에스트로겐 화합물은 여성호르몬 에스트로겐의 대체제로써 폐경기 이후 여성에게 많이 나타나는 골절, 골다공증 및 골형성부전증 등의 골질환 치료에 매우 효과적임을 알 수 있다.
한편, 레즈베라트롤(resveratrol, 3,4'5-trihydroxystilbene)은 포도 및 여러 식물에서 발견된 피토알렉신(phytoalexin) 화합물로써(Langcake and Pryce,Physiol. Planta Pathol., 9: 77-86, 1976; Langcake and Pryce,Experientia33: 151-152, 1977; Sanders et al.,J. Agric. Food Chem., 48: 1243-1246, 2000), 항암, 항혈전, 및 항염증 활성 등 여러 생리적·약리적작용을 지니고 있다(Jang et al.,Sci., 275: 218-220, 1997). 특히, 레즈베라트롤은 최근 여성호르몬 에스트로겐 유사작용이 있는 피토에스트로겐(phytoestrogen) 화합물로써(Gehm et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 14138-14143, 1997) 밝혀지면서 갱년기 이후 여성의 심장병, 골다공증, 치매증 및 여러 갱년기증상을 억제해주는 생리활성물질로써 새로이 각광을 받고 있다(Goldberg et al.,Am. J. Enol. Vitic., 46: 159-165, 1995; Jeandet et al.,J. Phytopathology143: 135-139, 1995; Mizutani, K. et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun. 253: 859-863, 1998; Mizutani, K. et al.,J. Nutr. Sci. Vitaminol. 46: 78-83, 2000). 그러나 위와같이 레즈베라트롤의 에스트로겐 표현제(agonist) 작용에 관한 연구보고와 달리 최근 레즈베라트롤의 에스트로겐 길항제(antagonist) 역할에 관한 연구(Turner et al.,Endocrinology140: 50-54, 1999)가 보고되면서 레즈베라트롤의 에스트로겐 작용에 관한 좀 더 자세한 연구가 필요하다.
한편, 몇몇 식물에서는(Dipterocarpaceae,Vitaceae,Cyperaceae,Gnetaceae및Leguminosae) 레즈베라트롤 성분이 산화·중합하여 생성된 여러 가지 레즈베라트롤 소당체(oligostilbenes) 성분이 발견되었며(Kawabata et al.,Tetrahedron Letters30: 3785-3788, 1989; Kurihara et al.,Phytochem., 30: 649-653, 1991), 이들 성분들은 항균 뿐만 아니라 항염증, 간보호 및 항호르몬 작용이 있는 생리활성물질로써 주목을 받고 있다(Kawabata et al.,Tetrahedron Letters30: 3785-3788, 1989; Lee et al.,Planta Med., 64: 204-207, 1998; Oshima et al.,Experientia51: 63-66, 1995; Sarker et al.,Tetrahedron55: 513-524, 1999). 그러나 지금까지 레즈베라트롤 유도체의 골 형성 촉진작용, 에스트로겐 작용 및 그에 따른 골다공증 치료 효과에 관한 연구는 거의 없는 실정이다.
한편, 식물로부터 새로운 피토에스트로겐 물질을 개발하기 위하여 현재 여러 가지in vitro검색방법이 개발되고 있다(Diel et al.,Planta Medica65: 197-203, 1999; Liu et al.,J. Agric Food Chem., 2001), 이 중에서 쥐의 골아세포(osteoblastic cell)를 이용한 뼈 형성 촉진 및 분화 작용을 측정하는 방법(Mizutani et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun. 253: 859-863, 1998)과 에스트로겐 의존성 사람 유방암세포(MCF-7 또는 T47-D)를 이용한 에스트로겐활성 측정방법(Mayr et al.,Toxicology74: 135-149, 1992; Gehm et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 14138-14143, 1997; Tamir et al.,Cancer Research60: 3704-3709, 2000; Chansakaow et al.,Planta Medica66: 572-575, 2000; Yoshikawa et al.,Chem. Pharm. Bull. 48: 1039-1044, 2000; Riby et al.,Biochem. Pharmacol60: 167-177, 2000)이 현재 가장 널리 사용되고 있는 간단한 검색방법이다.
최근 본 발명자는 미활용 작약씨로부터 작약뿌리에 존재하지 않은 항암 및 항돌연변이원성 레즈베라트롤 및 그 유도체를 처음으로 분리 및 동정한 바 있으며(Choi et al.,J. Food Sci. & Nutr., 4: 163-166, 1998), 아울러 그들 화합물의 함량은 품종 및 성숙시기에 따라 상당히 다른 것을 확인한 바가 있다(Choi et al.,J. Food Sci. & Nutr., 4: 163-166, 1998; Choi et al.,J. Agric. Food Chem., 2001, accepted).
이에 본 발명자들은 작약씨로부터 분리된 레즈베라트롤 및 그 유도체의 뼈 형성 촉진작용 및 에스트로겐 작용을 세포배양으로 정립시킨 방법으로 측정한 바,작약씨에 함유되어 있는 레즈베라트롤 및 그 유도체들은 기존의 피토에스트로겐 화합물로 알려진 17베타-에스트라디올(17β-estradiol) 및 콩의 제니스테인 성분과 유사한 골다공증 치료 효과를 지니고 있음을 알게 되었다.
본 발명은 뼈 형성을 촉진하며, 아울러 에스트로겐 활성을 지니고 있어 향후 골질환 치료에 유용한 에스트로겐(estrogen) 대체제로 사용할 수 있는 작약씨로부터 4가지 스틸벤화합물인 레즈베라트롤 및 그 유도체를 분리하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 작약씨로부터 분리된 4가지 스틸벤화합물의 고속액체크로마토그람이다.
작약씨로부터 트란스-레즈베라트롤 및 그 유도체의 추출방법은 작약씨로부터 4가지 스틸벤화합물을 분리함에 있어서, 건조된 작약씨를 고르게 분쇄한 후 노르말-핵산을 가하여 탈지하는 단계와, 전기의 탈지박에 메탄올 가하여 상온에서 반복 추출한 후 여과·농축하여 메탄올추출물을 얻는 단계와, 이 추출물에 메탄올로 가용화하고 미리 수용성 메탄올용액으로 평형화시켜 놓은 다이아이온 HP-20 칼럼에 충진하여 흡착시키는 단계와, 메탄올 용액을 차례로 용리하여 메탄올추출액을 감압·농축시키는 단계와, 전기의 농축된 추출물을 메탄올로 용해시키고 미리 메탄올로 평형화시켜 놓은 세파덱스 LH-20 칼럼에 흡착시켜 메탄올로 분획별로 용출시키는 단계와, 이때 자외선 검출기 필터를 통하여 순차적으로 분리되어 나오는2가지 자외선 흡수분획(Ⅰ,Ⅱ, III)을 감압·농축하는 단계와, 전기의 분획을 메탄올로 용해한 후 분취용 액체크로마토그래피를 반복 실시하여 분획Ⅰ과 II로부터 트란스-레즈베라트롤-4'-O-베타-D-글루코사이드와 트란스-레즈베라트롤을 분리하고, 동일한 방법으로 분획 III로부터 트란스-비니페린 및 시스-비니페린을 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 작약씨로부터 트란스-레즈베라트롤 및 그 유도체의 또다른 추출방법은 작약씨로부터 4가지 스틸벤화합물을 분리함에 있어서, 건조 작약씨를 분쇄하여 메탄올을 가하여 상온에서 추출ㆍ여과하여 얻은 메탄올 혼합 추출액을 감압·농축하여 메탄올추출물을 얻는 단계와, 전기의 메탄올추출물에 메탄올용액을 가하여 용해하고 노르말-핵산을 가하여 탈지하는 단계와, 전기의 탈지된 추출물의 하층을 감압·농축한 후 에테르 및 에틸아세테이트를 각각 넣고 순차적으로 분획하여 에테르추출물과 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계와, 에테르추출물을 클로로포름/메탄올에 현탁시켜 실리카겔로 충진시킨 칼럼으로 옮기고 클로로포름/메탄올로 분획별로 나누어 용출하는 단계와, 전기의 용출액의 분획을 6개의 분획으로 분별하여 그 중 분획 3을 감압·농축한 후 다시 메탄올로 재결정하여 트란스-레즈베라트롤을 얻는 단계와, 분획 4와 5를 감압·농축시키고 메탄올로 용해한 후 세파덱스 LH-20에 충진시킨 칼럼으로 옮기고 메탄올로 분획별로 용출하면서 자외선 검출기 필터를 통하여 순차적으로 분리되어 나오는 시스-비니페린 및 트란스-비니페린 혼합물을 얻는 단계와, 전기의 혼합물을 수용성 메탄올로 용해한 후 분취용 액체크로마토그래피를 반복 실시하여 트란스-비니페린과 시스-비니페린을 각각 얻는 단계와, 전기와 동일한 방법으로 에틸아세테이트 추출물을 메탄올에 용해시켜 세파덱스 LH-20 칼럼크로마토그래피하여 6가지 분획으로 분별하여 용출한 후 이 중 3번째 분획을 농축하여 트란스-레즈베라트롤-4'-O-베타-D-글루코사이드을 얻는 단계를 포함한다.
본 발명에서 사용한 메탄올의 바람직한 농도는 40% 내지 100% 수용액이며 가장 바람직하기는 80% 내지 100% 수용액이다. 이 때 추출용매를 메탄올 대신 에탄올을 사용할 수 있다. 본 발명에서 추출하는 단계에서 바람직한 온도는 20℃ 내지 60℃이며 가장 바람직하기는 50℃이다. 아울러 추출하는 모든 단계에서는 햇빛을 차단하여 실행하는 것이 좋다.
상기의 추출방법에 의해서 작약씨로부터 추출한 4가지 스틸벤화합물은 하기 구조식 Ⅰ의 트란스-베즈베라트롤(trans-Resveratrol), 구조식 Ⅱ의 트란스-레즈베라트롤-4'-글루코사이드(Resveratrol-4'-O-β-D-glucopyranoside), 구조식 Ⅲ의 트란스-비니페린(trans-ε-Viniferin), 구조식 Ⅳ의 시스-비니페린(cis-ε-Viniferin)이다.
(구조식 I) (구조식 II)
(구조식 III) (구조식 Ⅳ)
본 발명에 의해 작약씨로부터 추출한 트란스-레즈베라트롤, 트란스-레즈베라트롤-4'-글루코사이드, 트란스-비니페린 또는 시스-비니페린 중에서 선택된 어느 하나의 단일 화합물을 유효성분으로 함유한 골질환 치료제에 이용할 수 있으며 이러한 골질환 치료제는 트란스-레즈베라트롤, 트란스-레즈베라트롤-4'-글루코사이드, 트란스-비니페린 또는 시스-비니페린를 유효성분으로 함유하는 수액제, 환제, 정제 또는 캡슐제의 형태로 사용할 수 있다.
이하 다음의 실시예로서 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하기로 하며 이들 실시예가 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.
<실시예 1>
건조 작약씨 300g을 고르게 분쇄한 후 노르말-핵산을 가하여 탈지한 다음 얻어진 탈지박에 100% 메탄올 가하여 일주일간 상온에서 3회 반복 추출한 후 여과·농축하여 메탄올추출물(25.5g)을 얻었다. 이것을 20% 수용성 메탄올용액을 가하여 가용화한 후 미리 20% 수용성 메탄올용액으로 평형화시켜 놓은 다이아이온 HP-20 칼럼(직경 6cm × 길이 60cm)에 충진하여 흡착시킨 후 20% 수용성 메탄올(5ℓ), 40% 수용성 메탄올(10ℓ) 및 80% 수용성 메탄올(10ℓ) 용액을 차례로 용리하였다. 여기서 얻어진 80% 수용성 메탄올추출액을 감압·농축시켜 얻은 건조물질(5.15g)을 메탄올(30㎖)로 녹인 후 일정량(5㎖)을 반복하여 미리 메탄올로 평형화시켜 놓은 세파덱스 LH-20(파아마시아, 스웨덴) 칼럼(직경 2.5cm × 길이 1m)으로 옮기고 같은 용매 1리터로 튜브당 3㎖씩 150개 분획으로 나누어 용출하였다. 이때 자외선 검출기 필터(280㎚)를 통하여 순차적으로 분리되어 나오는 3가지 자외선 흡수분획(I, II & III)을 모아 감압·농축하고 이 중 분획 I(분획 20-45)과 분획 II(분획 71-93)로부터 백색의 분말 트란스-레즈베라트롤-4'-O-베타-D-글루코사이드(trans-resveratrol-4'-O-β-D-glucoside, 분자량 390) 0.24g과 연한 갈색의 비결정 트란스-레즈베라트롤(trans-resveratrol, 분자량 228) 0.18g을 각각 얻었다.
다음, 분획 III(분획 112-135)을 메탄올에 다시 녹인 후 분취-고속액체크로마토그래피를 반복 실시하여 연한 갈색의 무결정 트란스-비니페린(trans-viniferin, 분자량 484, 분리시간 22.5분) 2.23g 및 시스-비니페린(cis- viniferin, 분자량 484, 분리시간 27.9분) 1.25g을 각각 얻었다.
이때, 사용된 분취용 액체크로마토그래피의 분리 조건은 다음과 같다:
워터스 델타프렙-4000 고속액체크로마토그래피;
칼럼, RCM Novapak C18(2.5cm × 10cm);
자외선 검출기(UV280nm);
유속, 5.0㎖/분;
용매 (A, 0.1% 트리플로로초산 함유 25% 수용성 아세트니트릴 용액.
<실시예 2>
건조 작약씨 300g을 분쇄한 후 여기에 메탄올 2ℓ를 가하여 상온에서 24시간 추출·여과한다. 위의 추출조작을 3회 반복 실시하여 얻은 메탄올 혼합 추출액을 감압·농축하여 메탄올추출물(37.5g)을 얻었다. 다음, 메탄올추출물에 80% 수용성 메탄올용액 500㎖를 가하여 다시 녹인 후 여기에 노르말-핵산 500㎖를 가하여 2회 반복 탈지한 후 얻어진 하층을 200㎖까지 감압·농축한 다음 여기에 에테르 및 에틸아세테이트 1ℓ를 각각 넣어 순차적으로 2회 반복 분획하여 에테르추출물(7.88g)과 에틸아세테이트 추출물(0.54g)을 각각 얻었다. 에테르추출물 전량을 클로로포름/메탄올(3:1, v/v) 혼액 30㎖에 현탁시킨 후 전량을 실리카겔 60(70-130메쉬, 머어크, 독일) 700그람으로 충진시킨 직경 5cm의 칼럼으로 옮기고 클로로포름/메탄올(3:1, v/v) 혼액 2ℓ로 튜브당 5㎖씩 200개 분획으로 나누어 용출한다. 이들 분획을 6개의 분획(분획 1, 5-15번, 0.1g; 분획 2, 16-45번, 0.59g; 분획 3,46-78, 0.81g; 분획 4, 79-91번, 0.14g; 분획 5, 92-123, 0.62g; 분획 6, 124-167번, 3.2g)으로 나눈 후 그 중 분획 3을 모아 감압·농축한 후 다시 메탄올로 재결정하여 연한 갈색의 트란스-레즈베라트롤(trans- resveratrol, 분자량 228) 0.18g을 얻었다. 다음, 분획 4와 5를 모아 감압·농축시킨 후 다시 메탄올로 녹인 다음 일정량을 세파덱스 LH-20(파아마시아, 스웨덴) 100g으로 충진시킨 직경 2cm의 칼럼에 충진시킨 후 메탄올 1리터로 튜브당 3㎖씩 200개 분획으로 나누어 용출한다. 이때 자외선 검출기 필터(280㎚)를 통하여 순차적으로 분리되어 나오는 비니페린 (시스- 및 트란스-비니페린) 혼합물 4.02g을 얻었다. 다음, 이 혼합물을 메탄올용액으로 녹인 후 분취-액체크로마토그래피를 반복 실시하여 연한 갈색의 무결정의 트란스-비니페린(trans-viniferin, 분자량 484, 분리시간, 17.7분) 2.21g과 시스-비니페린(cis-viniferin, 분자량 454, 분리시간 22.5분) 1.27g을 각각 얻었다. 이때, 분취-액체크로마토그래피(워터스 델타프렙-4000 고속액체크로마토그래피; 칼럼, RCM Novapak C18(2.5cm × 10cm); 자외선 검출기(UV280 & 308nm); 유속, 5.0㎖/분; 용매, 0.1% 트리플로로초산 함유 30% 아세트니트림 용액)로 분리하였다.
상기와 동일한 방법으로 에틸아세테이트 추출물을 메탄올에 녹인 후 세파덱스 LH-20 칼럼크로마토그래피하여 6가지 분획으로 나누어 용출한 후 이 중 3번째 분획을 농축하여 백색 분말의 트란스-레즈베라트롤-4'-O-베타-D-글루코사이드(trans-resvera- trol-4'-O-β-D-glucoside, 분자량 390) 0.23g을 얻었다.
<실시예 3>
건조 작약씨 5g을 분쇄한 후 여기에 메탄올 300㎖를 가하여 50℃로 조정된 자석교반기에서 24시간 2회 반복 추출한 후 여과 및 감압·농축하였다. 다음, 메탄올추출물(0.83g)을 80% 수용성메탄올 100㎖로 녹인 후 여기에 노르말-핵산 300㎖를 가하여 2회 반복 탈지한 다음 하층을 감압·농축하였다. 이 추출물(0.7g)을 메탄올 10㎖로 녹인 후 그 중 1㎖를 취하여 증류수로 10배 희석한 후 미리 메탄올과 증류수로 활성화시켜 놓은 Sep-pak C18 카트리지(워터스, 미국)에 흡착시킨 후 증류수로 세척한 다음 40% 및 60% 수용성 아세트니트릴 5㎖로 각각 용리한 후 분취-고속액체크로마토그래피를 이용하여 40% 수용성 메탄올추출물로부터 트란스-레즈베라트롤-4'-O-베타-D-글루코사이드(trans-resveratrol-4'-O-β-D-glucoside; 분리시간, 16.8분) 11.8mg을 분리하였다. 다음 같은 방법으로 60% 수용성 메탄올 추출물로부터 트란스-레스베라트롤(trans-resveratrol; 분리시간, 24.2분) 7.6mg과 트란스-비니페린(trans-viniferin, 분자량 484, 분리시간, 23.5분] 45mg과 시스-비니페린(cis-viniferin; 분자량 484, 분리시간 32.6분) 39mg을 각각 분리하였다. 이때 분취용 고속액체크로마토그래피(워터스델타프렙 4000 고속액체크로마토그래피; 칼럼, RCM Novapak C18(2.5cm × 10cm); 자외선 검출기(UV280 & 308nm); 속도, 5.0㎖/분; 용매(용매 A, 0.1% 트리프로로초산 함유 10% 수용성 아세트니트릴 용액; 용매 B, 50% 수용성 아세트니트릴 용액, 용매 A --> 용매 B로 50분간 농도구배용출)로 분리하였다. 그리고 이 때 분리된 4가지 화합물의 화학구조는 상기에서 언급한 발명의 상세한 설명과 같으며, 분석용 고속액체크로마토그램의 그래프는 도 1에, 그리고 이들 화합물의 상세한 자외선, 적외선, 핵자기공명 및 질량분광기 스펙트럼 데이터는 표 1 & 표 2에 나타낸 바와 같았다.
이때 분석용 HPLC 조건은 다음과 같다.
칼럼, μBondapak C18(3.9cm ×30cm); 용매 A(0.1% 트리프로로초산 함유 10% 수용성 아세트니트릴 용액) & 용매 B(50% 수용성 아세트니트릴 용액), 용매 A --> 용매 B로 50분간 농도구배용출; 자외선 검출기(UV308nm); 속도, 1.0ml/분.1, 트란스-레즈베라트롤-4'-O-베타-D-글루코사이드;2, 트란스-레즈베라트롤;3, 트란스-비니페린;4, 시스-비니페린.
<표 1> :작약씨로부터 분리된 레즈베라트롤 및 그 유도체의 자외선 및 적외선분광기 스펙트럼 데이터
Instrumental analysis UVλmaxnm(logε) IRνmax(cm-1)
trans-ResveratrolResveratrol-4'-O-β-D-glucopyranosidetrans-ε-Viniferincis-ε-ViniferinSuffruticosol ASuffruticosol B 219(4.28), 308(4.02),320(3.34)219(4.28), 308(4.02),320(3.34)218(4.52), 312(4.29),324(4.32)218(s), 287(s), 308(s),325(4.38)225(4.08), 282(3.42)225(4.10), 282(3.45) 3200-3300, 1587, 1512,1149, 9643200-3300, 1589, 1507,1150, 9663230, 1594, 1510, 1440,1002, 9643230, 1594, 1510, 1440,1002, 9643000-3600, 1600, 1500,1440, 1330, 1230,1160, 1000, 8303000-3600, 1600, 1500,1440, 1330, 1230,1160, 1000, 830
*시료의 자외선 흡수스펙트럼은 메탄올 용액으로 녹인 후 측정함.
*시료의 적외선 흡수스펙트럼은 KBr plate를 이용하여 측정함.
<표 2> :작약씨로부터 분리된 레즈베라트롤 및 그 유도체의 핵자기공명(in CD 3 OD) 및 질량분광기 스펙트럼 데이터
Instrumental analysis trans-Resveratrol Resveratrol-4'-O-β-D-glucopyranoside
1H-NMRH-2H-4H-6H-2'H-3'H-5'H-6'HαHβSugar moietyH-1H-2H-3H-4H-5H-6aH-6b 6.43 (d,J=2.5 Hz)6.14 (t,J=2.5 Hz)6.43 (d,J=2.5 Hz)7.33 (d,J=8.5 Hz)6.75 (d,J=8.5 Hz)6.75 (d,J=8.5 Hz)7.33 (d,J=8.5 Hz)6.79 (d,J=16.5 Hz)6.94 (d,J=16.5 Hz) 6.46 (d,J=2.0 Hz)6.18 (t,J=2.0 Hz)6.46 (d,J=2.0 Hz)7.43 (d,J=8.5 Hz)7.07 (d,J=8.5 Hz)7.07 (d,J=8.5 Hz)7.43 (d,J=8.5 Hz)6.87 (d,J=16.0 Hz)6.98 (d,J=16.0 Hz)4.92 (d,J 1,2=7.5 Hz)3.41 (t,J 2,3=7.8 Hz)3.44 (m,J 3,4=8.4 Hz)3.30 (t,J 4,5=8.4 Hz)3.47 (m,J 5,6a=2.6 Hz,J 5,6b=5.7 Hz)3.90 (dd,J 6a,6b=12.5 Hz)3.71 (dd,J 6a,6b=12.5 Hz)
13C-NMRC-1C-2C-3C-4C-5C-6CαCβC-1'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'Sugar moietyG-1G-2G-3G-4G-5G-6 141.31105.76159.37102.64159.37108.20127.02130.42131.40129.38115.84158.37116.48128.79 141.01105.95159.66102.95159.66105.95128.52128.88133.18128.58117.90158.65117.90128.58102.2174.9078.1371.3677.9762.50
FABMS (m/z) 228[M+] 390[M+]
Coupling constants (Jin Hz) in parentheses.d, doublet;dd, double doublet;t, triplet;m, multiplet.
trans-ε-Viniferin cis-ε-Viniferin
1H-NMRH-2 & H-6 7.14 (d,J=8.5)H-3 & H-5 6.76 (d,J=8.5)H-7 5.36 (d,J=5.5)H-8 4.34 (d,J=5.5)H-10 6.24 (d,J=2.0)H-12 6.16 (t,J=2.0)H-14 6.24 (d,J=2.0)H-2' 7.03 (d,J=8.5)H-3' 6.64 (d,J=8.5)H-5' 6.64 (d,J=8.5)H-6' 7.03 (d,J=8.5)H-7' 6.81 (d,J=16.5)H-8' 6.56 (d,J=16.5)H-12' 6.24 (d,J=2.0)H-14' 6.17 (d,J=2.0 6.93 (d,J=8.5)6.70 (d,J=8.5)5.17 (d,J=6.0)3.77 (d,J=2.0)5.92 (d,J=2.0)6.08 (t,J=2.0)5.92 (d,J=2.0)6.92 (d,J=8.5)6.57 (d,J=8.5)6.57 (d,J=8.5)6.92 (d,J=8.5)6.19 (d,J=12.0)6.02 (d,J=12.0)6.21 (d,J=2.0)6.23 (d,J=2.0)
13C-NMRC-1 133.79C-2 & C-6 128.21C-3 & C-5 116.31C-4 158.55C-7 94.71C-8 57.72C-9 148.25C-10 109.34C-11 159.77C-12 101.76C-13 159.83C-14 109.12C-1' 130.71C-2' 128.78C-3' 116.39C-4' 158.55C-5' 116.39C-6' 128.78C-7' 130.22C-8' 123.72C-9' 136.93C-10' 119.31C-11' 163.01C-12' 96.86C-13' 160.06C-14' 104.35 133.84128.50116.20157.8294.9157.73147.33107.24159.53101.82159.53107.24130.07131.13115.88158.39115.88131.13131.63126.63137.81120.37162.7896.58159.53108.91
FABMS (m/z) 454[M+] 454[M+]
d, doublet;t, triplet.
＜실험예 1＞: 작약씨로부터 분리된 레즈베라트롤 및 그 유도체의 뼈 형성 촉진작용 실험
본 실험예에서 상기 실시예 1, 2, 3에서 얻은 레스베라트롤 및 그 유도체의 뼈 형성 촉진작용은 뼈를 형성하는 골세포인 뼈모세포(osteoblast) 세포주(cell line)인 ROS 17/2.8를 사용하여 측정하였다. 즉, ROS 17/2.8 세포를 페놀레드가 첨가되지 않은 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 항생제-항균제 혼합물(100 IU 페니실린, 100mg 스트렙토마이신, 250 나노그람 암포테리신, Gibco BRL)을 첨가한 덜베코 변형 이글배지(Dulbecco's Modified Eagle medium)에 접종하여 37℃로 유지된 5% CO2배양기에서 배양하면서 세포증식(cell proliferation)을 엠티티(MTT, 3-(4,5- dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolin bromide)의 대사환원에 근거한 엠티티 에세이(MTT assay) 방법으로 측정하였다.
이때 작약씨의 성분이 뼈 형성을 촉진하는지 판단하기 위하여, 골세포 증식을 촉진한다고 이미 알려진 17베타-에스트라디올 (17β-estradiol)과 콩에서 분리한 제니스테인(genistein)를 비교구(positive reference)로, 그리고 시료 무첨가구를 대조구(control)로 설정하여 비교하였다. 엠티티 에세이(MTT assay) 방법은 다음과 같다. ROS 세포를 96 웰(well)에 세포수가 5 ×103되게 이식한 후 소태아혈청의 효과를 배제하기 위하여 24시간동안 0.5% 에스트로겐 결핍-소태아혈청으로 배지조성을 바꾸어 주었으며, 2.5% 에스트로겐 결핍-소태아혈청 조건하에서 에스트로겐, 제니스테인 외에도 볶은 홍화씨으로부터 분리된 6가지 페놀화합물을 10-6∼10-15몰농도로 48시간 동안 자극하였다. 각 웰(well)에 엠티티(1.1 mg/ml) 용액 50㎕를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양했다.
엠티티에 의해 형성된 보랏빛의 침전물인 포르마잔 결정체(formazan crystal)를 녹이기 위하여 디메틸슬폭사이드 dimethylsulfoxide) 150 마이크로리터를 첨가하여 녹인 다음 각 웰(well)의 흡광도를 마이크로프레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 540㎚에서 측정하였다. 이때 각 성분의 뼈 형성 촉진작용은 대조구(control)에 대한 상대치로 나타내었다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
<표 3> : 작약씨로부터 분리된 4가지 스틸벤화합물이 뼈 모세포 유사(osteoblast-like) 세포(ROS 17/2.8)의 증식에 미치는 효과
화합물 농도 (M)
Control 10-15 10-12 10-9 10-6
트란스-레즈베라트롤(trans-Resveratrol) 100 120 122 120 132
트란스-레즈베라트롤-4'-O-베타-D-글루코사이드(trans-Resveratrol 4'-O-β-D-glucoside) 100 110 91 85 92
시스-비니페린(cis-Viniferin) 100 117 120 124 120
트란스-비니페린(trans-Viniferin) 100 113 122 125 120
17베타-에스트라디올*(17β-Estradiol, E2) 100 128 126 138 128
제니스테인*(Genistein) 100 110 113 111 117
상기의 표 3에서 보는 바와 같이 (1) 17베타-에스트라디올(E2)은 낮은 농도인 10-15M에서 이미 130% 정도의 세포증식 효과를 나타내었으며, 생리적 농도인 10-9M에서 약 138%까지 증가하여 농도의존적으로 골세포의 증식을 촉진하였다. (2)콩의 제니스테인 genistein)도 농도의존적으로 ROS 골세포 증식을 최고 117% 정도 증가시켰지만, 에스트라디올(E2)보다 낮은 효과를 나타내었다. (3) 작약씨로부터 분리된 4가지 스틸벤화합물도 모두 농도의존적으로 ROS 골세포의 증식을 촉진하는 경향이었으며, 특히 트란스-레즈베라트롤 및 비니페린 화합물은 각각 에스트라디올(E2)과 제니스테인 만큼의 높은 세포증식률을 나타내었다.
＜실험예 2＞: 작약씨로부터 분리된 레즈베라트롤 및 그 유도체의 에스트로겐 활성 작용 실험
본 실험예에서 상기 실시예 1, 2, 3에서 얻은 레스베라트롤 및 그 유도체의 에스트로겐 활성 작용은 에스트로겐-감수성 유방암세포주(cell line)인 MCF-7을 사용하여 측정하였다.
즉, MCF-7 세포를 페놀레드가 첨가되지 않은 10% 소태아혈청(fetal calf serum, FCS, Biowhittaker)과 1% 항생제-항균제 혼합물(100 IU 페니실린, 100mg 스트렙토마이신, 250nm 암포테리신, Gibco BRL)을 첨가한 덜베코 변형 이글배지(D-MEM, Dulbecco's Modified Eagle medium, Gibco BRL)에 접종하여 37℃로 유지된 5%CO2배양기에서 배양하면서 세포증식(cell proliferation)을 위의 엠티티 에세이(MTT assay) 방법으로 측정하였다.
이때 작약씨 성분의 에스트로겐 활성작용을 측정하기위해 17베타-에스트라디올(17β-estradiol)과 콩에서 분리한 제니스테인(genistein)을 비교구(positive reference)로, 그리고 시료 무첨가구를 대조구(control)로 설정하여 비교하였다.
엠티티 에세이(MTT assay) 방법은 다음과 같다. MCF-7 세포를 일주일에 2∼3회 새로운 배지로 교환하고 PBS 완충액(pH 7.0)로 세척한 후, 0.05% 티로신, 0.002% 이디티에이를 사용하여 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후, 집적된 암세포에 배지를 넣고 암세포가 골고루 분산되도록 피펫으로 잘 혼합하여 75cm 세포배양 플라스크에 10ml씩 일정량 분할하여 주입하고, 4∼5일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. MCF-7 세포주(1×105세포/ml)를 24-웰프레이트(well plate)에 1ml씩 분주하고 24시간 동안 배양(37℃, 5% CO2) 한 후 무처리구인 대조군(control)에는 디메틸슬폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)로 독성실험을 실시하였고, 각각의 시료는 DMSO에 녹여 100, 200, 300, 400 및 500㎍/웰의 농도로 첨가하여 48시간 동안 다시 배양하였다. 이 배양액에 엠티티 용액을 각각 100마이크로리터씩 첨가하여 4시간 동안 배양시킨 후 웰 바닥에 형성된 포마잔(formazan)이 흩어지지 않게 조심스럽게 다루어 아스피레이트로 상등액을 제거하였다.
형성된 포마잔에 DMSO와 EtOH(1:1, v/v) 혼합용액 1ml 첨가하여 충분히 녹인 후 자외선-가시광선 분광광도계(UV-vis spectrophotometer, Pharmacia Biotech 80-1205-20, Sweden)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 각 성분의 에스트로겐 활성은 대조구에 대한 상대치로 나타내었다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
표 4. 작약씨로부터 분리된 4가지 스틸벤화합물의 에스트로겐(estrogen) 활성
화합물 농도 (M)
Control 10-7 10-6 10-5
트란스-레즈베라트롤(trans-Resveratrol) 100 133 175 198
트란스-레즈베라트롤-4'-O-베타-D-글루코사이드(trans-Resveratrol 4'-O- β- D-glucoside) 100 121 143 164
시스-비니페린(cis-Viniferin) 100 126 161 185
트란스-비니페린(trans-Viniferin) 100 128 169 189
17베타-에스트라디올(17β-Estradiol, E2) 100 146 178 201
제니스테인(Genistein) 100 131 167 187
상기의 표 4에서 보는 바와 같이 (1) 17베타-에스트라디올(E2)은 낮은 농도인 10-7M에서 이미 146% 정도의 세포증식 효과를 나타내었으며, 10-5M 농도에서 약 201%까지 증가하여 농도의존적으로 세포증식을 촉진하였다. (2)콩의 제니스테인 genistein)도 농도의존적으로 MCF-7 세포 증식을 최고 187% 정도 증가시켰지만, 에스트라디올(E2)보다 낮은 효과를 나타내었다. (3) 작약씨로부터 분리된 4가지 스틸벤화합물은 모두 농도의존적으로 MCF-7 세포의 증식을 촉진시키는 경향이었으며, 특히 트란스-레즈베라트롤과 비니페린 화합물은 각각 에스트라디올(E2)과 제니스테인 만큼의 높은 세포증식률을 나타내었다.
이상의 결과로부터 작약씨로부터 분리된 4가지 스틸벤화합물은 뼈 형성을 촉진할 뿐만 아니라 에스트로겐 활성을 지니고 있는 피토에스트로겐 화합물로써 현재 널리 사용되고 있는 에스트로겐 화합물 (17β-estradiol, genistein)의 대체제로써 작용할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 작약씨부터 분리한 4가지 스틸벤화합물인 트란스-레즈베라트롤 및 그 유도체의 성분은 골질환(골절 및 골다공증) 치료용의 의약품 및 기능성 식품의 신소재로 제공할 수 있다. 또한 상기 성분은 통상의 부형제와 함께 수액제, 환제, 정제, 캡슐 형태로 제조되어 골질환 예방용 및 치료용 의약품으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 식품첨가제와 함께 분말 또는 과립 차 및 음료와 같은 형태로 제조되어 기능성 건강보조식품으로도 사용될 수 있다.

Claims (7)

  1. 작약씨로부터 4가지 스틸벤화합물을 분리함에 있어서, 건조된 작약씨를 고르게 분쇄한 후 노르말-핵산을 가하여 탈지하는 단계와,
    전기의 탈지박에 메탄올 가하여 상온에서 반복 추출한 후 여과·농축하여 메탄올추출물을 얻는 단계와,
    이 추출물에 메탄올로 가용화하고 미리 수용성 메탄올용액으로 평형화시켜 놓은 다이아이온 HP-20 칼럼에 충진하여 흡착시키는 단계와,
    메탄올 용액을 차례로 용리하여 메탄올추출액을 감압·농축시키는 단계와, 전기의 농축된 추출물을 메탄올로 용해시키고 미리 메탄올로 평형화시켜 놓은 세파덱스 LH-20 칼럼에 흡착시켜 메탄올로 분획별로 용출시키는 단계와,
    이때 자외선 검출기 필터를 통하여 순차적으로 분리되어 나오는 2가지 자외선 흡수분획(Ⅰ,Ⅱ, III)을 감압·농축하는 단계와,
    전기의 분획을 메탄올로 용해한 후 분취용 액체크로마토그래피를 반복 실시하여 분획Ⅰ과 II로부터 트란스-레즈베라트롤-4'-O-베타-D-글루코사이드와 트란스-레즈베라트롤을 분리하고, 동일한 방법으로 분획 III로부터 트란스-비니페린 및 시스-비니페린을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 작약씨로부터 트란스-레즈베라트롤 및 그 유도체의 추출방법
  2. 작약씨로부터 4가지 스틸벤화합물을 분리함에 있어서, 건조 작약씨를 분쇄하여 메탄올을 가하여 상온에서 추출ㆍ여과하여 얻은 메탄올 혼합 추출액을 감압·농축하여 메탄올추출물을 얻는 단계와,
    전기의 메탄올추출물에 메탄올용액을 가하여 용해하고 노르말-핵산을 가하여 탈지하는 단계와,
    전기의 탈지된 추출물의 하층을 감압·농축한 후 에테르 및 에틸아세테이트를 각각 넣고 순차적으로 분획하여 에테르추출물과 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계와,
    에테르추출물을 클로로포름/메탄올에 현탁시켜 실리카겔로 충진시킨 칼럼으로 옮기고 클로로포름/메탄올로 분획별로 나누어 용출하는 단계와,
    전기의 용출액의 분획을 6개의 분획으로 분별하여 그 중 분획 3을 감압·농축한 후 다시 메탄올로 재결정하여 트란스-레즈베라트롤을 얻는 단계와,
    분획 4와 5를 감압·농축시키고 메탄올로 용해한 후 세파덱스 LH-20에 충진시킨 칼럼으로 옮기고 메탄올로 분획별로 용출하면서 자외선 검출기 필터를 통하여 순차적으로 분리되어 나오는 시스-비니페린 및 트란스-비니페린 혼합물을 얻는 단계와,
    전기의 혼합물을 수용성 메탄올로 용해한 후 분취용 액체크로마토그래피를 반복 실시하여 트란스-비니페린과 시스-비니페린을 각각 얻는 단계와,
    전기와 동일한 방법으로 에틸아세테이트 추출물을 메탄올에 용해시켜 세파덱스 LH-20 칼럼크로마토그래피하여 6가지 분획으로 분별하여 용출한 후 이 중 3번째분획을 농축하여 트란스-레즈베라트롤-4'-O-베타-D-글루코사이드을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 작약씨로부터 트란스-레즈베라트롤 및 그 유도체의 추출방법
  3. 제 1 또는 제 2 에 있어서, 메탄올 농도가 40% 내지 100% 수용액임을 특징으로 하는 작약씨로부터 트란스-레즈베라트롤 및 그 유도체의 추출방법
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 추출용매를 메탄올 대신 에탄올을 사용하는 것을 특징으로 하는 작약씨로부터 트란스-레즈베라트롤 및 그 유도체의 추출방법
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 작약씨로부터 추출한 4가지 스틸벤화합물은 하기 구조식 Ⅰ의 트란스-베즈베라트롤(trans-Resveratrol), 구조식 Ⅱ의 트란스-레즈베라트롤-4'-글루코사이드(Resveratrol-4'-O-β-D-glucopyranoside), 구조식 Ⅲ의 트란스-비니페린(trans-ε-Viniferin), 구조식 Ⅳ의 시스-비니페린(cis-ε-Viniferin)임을 특징으로 하는 작약씨로부터 트란스-레즈베라트롤 및 그 유도체의 추출방법
    (구조식 I) (구조식 II)
    (구조식 III) (구조식 Ⅳ)
  6. 작약씨로부터 추출한 트란스-레즈베라트롤, 트란스-레즈베라트롤-4'-글루코사이드, 트란스-비니페린 또는 시스-비니페린 중에서 선택된 어느 하나의 단일 화합물을 유효성분으로 함유한 골질환 치료제
  7. 골질환 치료제에 있어서, 작약씨로부터 추출한 트란스-레즈베라트롤,트란스-레즈베라트롤-4'-글루코사이드, 트란스-비니페린 또는 시스-비니페린를 유효성분으로 함유하는 수액제, 환제, 정제 또는 캡슐제
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