KR20010024027A

KR20010024027A - β-락탐 항생제의 회수방법

Info

Publication number: KR20010024027A
Application number: KR1020007002762A
Authority: KR
Inventors: 보에스텐빌헬무스후베르투스조셉; 무우디해롤드몬로; 그루텐후베르투스마리아조제프
Original assignee: 윌리암 로엘프 드 보에르; 디에스엠 엔.브이
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-18
Publication date: 2001-03-26
Also published as: EG21220A; WO1999015532A1; NL1007076C2; IN187839B; AU9189898A; BR9812338A; EP1017699A1; TR200000881T2; CN1279684A

Abstract

본 발명은 용액내 β-락탐 항생제 및 D-페닐 글리신(FG)을 함유하는 혼합물로부터 β-락탐 항생제를 회수하는 방법에 관한 것으로, -5 내지 20℃ 사이의 온도에서, FG가 용액내에 잔류하는 농도에서 혼합물의 pH가 3 내지 8 사이가 되도록 하고, 수득된 고체 β-락탐 항생제를 회수하고, 잔류 액체의 온도를 10 내지 60℃ 사이로 올리고, 고체 FG를 형성하고, FG를 고체로 분리하여 석출시키고, 모액을 재순환시키고, 바람직하게, 상응하는 β-락탐 핵, 특히 6-아미노페니실란산, 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산 및 7-아미노-3-클로로-세프-3-엠-4-카르복실산이 D-페닐 글리신 유도체로 아실화되는 효소 아실화반응으로부터 비롯되는 β-락탐 항생제 및 FG를 실질적으로 함유하는 초기 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 한다.

Description

β-락탐 항생제의 회수방법{PROCESS FOR RECOVERY OF A β-LACTAM ANTIBIOTIC}

본 발명은 -5 내지 20℃ 사이의 온도에서, FG가 용액내에 잔류하는 농도에서 혼합물의 pH가 3 내지 8 사이가 되도록 하고, 수득된 고체 β-락탐 항생제를 회수하고, 잔류 액체의 온도를 10 내지 60℃ 사이로 올리고, 고체 FG를 형성하고, FG를 고체로 분리하여 석출시키고, 모액을 재순환시키는 것으로 이루어진 용액내 β-락탐 항생제 및 D-페닐 글리신(FG)을 실질적으로 함유하는 혼합물로부터 β-락탐 항생제를 회수하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로, D-페닐 글리신 유도체를 갖는 β-락탐 핵의 아실화를 포함하는 δ-락탐 항생제의 제조에 있어서, β-락탐 항생제는 회수하기 어렵고, 반응혼합물은 집성(集成)하기 어렵다. 종종, 집성시 유용한 성분, 특히 β-락탐 항생제의 상당한 손실이 포함되는데, 일부는 용해도 손실의 형태이고, 일부는 β-락탐의 한정된 안정성으로 인한 분해때문이다.

본 발명은 산업적 규모에 적용할 수 있는 간단한 방법으로 β-락탐 항생제의 손실이 매우 감소되고, 또한 유용한 D-페닐 글리신을 회수할 수 있는 β-락탐 항생제의 회수방법을 제공한다. 본 발명은 FG가 비교적 낮은 온도에서, 그리고 FG 및 항생제를 함유하는 용액에서 매우 과포화가능하고, 그리고 침전되거나 또는 결정화되어 석출되지 않고 장시간 동안 잔류가능하다는 사실에 기초한다. 결과적으로, 낮은 온도에서 β-락탐 항생제를 결정화후 FG가 결정화되어 석출되지 않는 pH 변화를 통해 분리함으로써 선택적으로 β-락탐 항생제를 회수할 수 있다. 게다가, 모액의 온도를 높임으로써 FG는 급속하게 결정화되어 석출되지만, 반면에 β-락탐 항생제는 결정화되어 석출되지 않는다는 것을 발견하였다. 이러한 방법으로, FG는 선택적으로 회수될 수 있다. 상기에 언급한 방법으로, β-락탐 항생제와 FG를 완전하게 분리시킬 수 있다.

락탐 핵과 적당한 아실화제의 아실화 반응, 특히, 예를 들면, D-페닐 글리신 아미드(FGA)와 같은 D-페닐 글리신의 아미드, 또는 D-페닐 글리신 메틸 에스테르(FGM)와 같은 D-페닐 글리신의 에스테르와의 효소 아실화반응 동안, 아실화제는 β-락탐 항생제와 가수분해되어 D-페닐 글리신(FG)을 형성한다.

아실화 반응후 수득된 혼합물은 β-락탐 항생제 및 FG 외에 가령 아직까지 변환되지 않은 β-락탐 핵 및/또는 아실화제, 가령 FGA 또는 FGM을 함유한다. 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 혼합물의 정확한 조성은 특별하게 중요하지 않다. 본 발명에 따른 방법에 적당하게 사용될 수 있는 혼합물은 바람직하게 10-1500mM, 특히 50-1000mM β-락탐 항생제; 0-1500mM, 특히 0-1000mM FG, 0-1000mM, 특히 0-200mM β-락탐 핵, 0-1000mM, 특히 0-400mM D-페닐 글리신 유도체를 함유하는 혼합물이다.

β-락탐 항생제 및 FG의 혼합물은 모든 성분, 특히 상기에 언급한 성분이 모두 용해되는 농도 및 pH가 되도록 한다. 이 때문에, pH는 바람직하게 낮게, 예를 들어 0 내지 3, 특히 0.3 내지 2 사이로 선택된다. 본 방법이 대규모로 실시되는 경우, 다소 연속적인 집성 방법을 선택하는 것이 바람직하다. 연속적인 용해 방법에서는 비교적 높은 pH 또는 낮은 pH에서 체류시간이 더 짧다. 소망한다면, 여전히 존재하는 특정 고체 성분은 예를 들어 여과 또는 한외여과에 의해 분리가능하다.

본 발명에 따라서, 여전히 고체 β-락탐 항생제를 함유하는 혼합물을 먼저 pH 3 내지 8, 바람직하게 5.5 내지 8, 특히 6.5 내지 7이 되도록 하고, 반응물 특히 FG의 농도가 선택적으로 β-락탐 항생제를 제외한 반응물이 용액내에 잔류하거나, 또는 과포화되지 않도록 물의 첨가와 같은 조치를 취한다. 온도는 -5 내지 20℃, 바람직하게 -3 내지 10℃ 사이이다. 온도는 비교적 낮게 유지되는데, 왜냐하면 놀랍게도 이러한 조건하에서 FG가 침전됨이 없이 매우 과포화가능하기 때문이다.

게다가, β-락탐 항생제 분리후 모액의 온도를 올림으로써 FG는 용이하게 여과될 수 있는 큰 결정 형태로 급속하게 결정화된다는 것을 발견하였다. 온도는 10 내지 60℃, 바람직하게 12 내지 50℃, 특히 15 내지 40℃ 사이로 상승시키고, 이 반응에서 혼합물의 pH는 일반적으로 3 내지 8의 범위에서 변화될 수 있다. pH는 바람직하게 5.5 내지 8, 특히 6.5 내지 7.5 사이이다.

FG는 결정화되어 석출되어 농도가 감소되기 때문에 FG의 결정화 및 분리후 잔류하는 모액은 냉각시킨 후 예를 들어 용해 용기에 적어도 부분적으로 재순환되고, 이 용기에는 또한 β-락탐 항생제 및 FG의 새혼합물이 공급된다. 상기 재순환은 FG가 용해 용기내 용액에 잔류하고, β-락탐 항생제 결정화 용기에 과포화되어 잔류하는 속도로 실시하는 것이 바람직하다. FG 모액은 적어도 부분적으로 β-락탐 항생제 결정화에 재사용가능하기 때문에 용해도 손실이 적게 유지될 수 있다. 분해 손실 역시 유리한 반응 조건으로 인해 비교적 적다.

상기 방법은 바람직하게 연속적으로 실시되는데, β-락탐 항생제 및 FG의 새혼합물은 항시 첨가되고, 가령 FG 결정화 모액의 소량은 항시 방출된다. 바람직하게, 방출 스트림의 흐름은 상기 방법의 여러 지점에서 스트림의 부피가 항시 일정하게 유지되도록 선택된다. 연속 방법에 있어서, 방출 스트림은 일반적으로 더 작다. 가능한 공정 도해를 실례로서 도 1에 나타내었다.

본 발명에 따른 방법은 가령 세팔렉신(cefalexin), 암피실린(ampicillin), 세파클롤(cefaclor), 피브암피실린(pivampicillin), 베크암피실린(becampicillin), 탈암피실린(talampicillin) 및 세팔로글리신(cefaloglycine)과 같은 페닐 글리신 곁사슬을 갖는 β-락탐 항생제의 제조에 적당하게 사용될 수 있다.

일반적으로, 임의의 β-락탐 핵이 사용될 수 있는데, 특히 하기 일반식을 갖는 β-락탐 핵이 사용될 수 있다.

(일반식)

(상기 일반식 1에서, R₀는 H 또는 1-3 C를 갖는 알콕시기를 나타내고; Y는 CH₂, O, S 또는 산화된 형태의 황을 나타내며; Z는 하기를 나타내고; 카르복실산기는 소망한다면 에스테르기이다.)

(상기에서, R₁은 예를 들면 H, OH, 할로겐, 1-5 C원자를 갖는 알콕시기, 1-5 C원자를 갖는 알킬기, 4-8 C원자를 갖는 시클로알킬기, 1-8 C원자를 갖는 알킬, 아릴, 카르복시 또는 알콕시 기로 치환되거나 또는 치환되지 않은 6-10 C원자를 갖는 아릴기 또는 헤테로아릴기를 나타낸다.)

본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 β 락탐 핵의 적당한 예는 6-아미노페니실란산(6-APA : 6-aminopenicillanic acid)과 같은 페니실린 유도체, 3-위치에 치환기를 갖거나 또는 갖지 않는 7-아미노세팔로스포란산(7-aminocephalosporanic acid)과 같은 세팔로스포란산 유도체, 가령 7-아미노세팔로스포란산(7-ACA), 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA : 7-aminodesacetoxycephalosporanic acid) 및 7-아미노-3-클로로-세프-3-엠-4-카르복실산(7-ACCA : 7-amino-3-chloro-cef-3-em-4-carboxylic acid)가 있다.

일반적으로, 커플링 반응의 촉매로 적당한 임의의 효소가 촉매로 사용될 수 있다. 상기 효소에는 총괄적으로 페니실린 아미다제 또는 페니실린 아실라제라 지칭되는 효소가 포함된다. 상기 효소는 예를 들면 제이.지. 쉬웨일(J.G. Shewale)외 다수, Process Biochemistry, 1989년 8월, 페이지 146-154, 그리고 제이.지. 쉬웨일 외 다수, Process Biochemistry International, 1990년 6월, 페이지 97-103에 기술되어 있다. 적당한 효소로는 아세토박터(Acetobacter) 특히 아세토박터 파스테우리안움(Acetobacter pasteurianum), 에어로모나스(Aeromonas), 알칼리게네스(Alcaligenes) 특히 알칼리게네스 패컬리스(Alcaligenes faecalis), 아파노클라디움(Aphanocladium), 바실러스종(Bacillus sp.) 특히 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 세팔로스포리움(Cephalosporium), 에스케리시아(Escherichia) 특히 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli), 플라보박테리움(Flavobacterium), 푸사리움(Fusarium) 특히 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 클루이베라(Kluyvera), 미코플라나(Mycoplana), 프로타미노박터(Protaminobacter), 프로테우스(Proteus) 특히 프로테우스 렛트가리(Proteus rettgari), 슈도모나스(Pseudomonas), 및 크산토모나스(Xanthomonas) 특히 크산토모나스 시트리이(Xanthomonas citrii)를 예로 들 수 있다.

바람직하게, 고정화 효소가 사용되는데, 왜냐하면 쉽게 분리되고, 재사용가능하기 때문이다. 적당한 고정화 효소 기술은 예를 들면 EP-A-222462에 개시되어 있다. 또 다른 적당한 기술은 젤라틴과 같은 젤라틴화제, 및 아르긴산 아민, 키토산 또는 폴리에틸렌 이민과 같은 자유 아미노기를 가는 중합체를 함유하는 캐리어 상에서 페니실린 G 아실라제를 고정화하는 것이다. 부가적으로, 효소는 결정물질(CLEC's™)로 사용될 수도 있다.

상업적으로 입수가능한 고정화 효소 중에서 특히 적당한 효소에는 엔지겔(Enzygel)이라는 상표명으로 상업적으로 입수가능한 보에링거 만하임 GmbH(Boehringer Mannheim GmbH)제 에스케리시아 콜라이 효소, 레코르다티(Recordati)제 고정화 페니실린-G 아실라제 및 팔머 바이오테크날러지 한오버(Pharma Biotechnology Hannover)제 고정화 페니실린-G 아실라제가 있다.

(효소) 아실화반응에 있어서, 아실화제로는 활성화된 형태의 D-페닐 글리신, 바람직하게 (1차, 2차 또는 3차) 아미드 또는 그의 염, 또는 메틸 에스테르와 같은 낮은 알킬(1-4C)을 예로 들 수 있다.

일반적으로 효소 아실화반응이 실시되는 온도는 40℃ 이하, 바람직하게 -5 내지 35℃ 사이이다. 일반적으로 효소 아실화반응이 실시되는 pH는 5.5 내지 9.5, 바람직하게 6.0 내지 9.0 사이이다.

최대의 변환에 거의 도달했을때, 반응을 거의 완전히 종결하는 것이 바람직하다. 반응을 종결하는 적당한 구체예는 바람직하게 4.0 내지 6.3, 특히 4.5 내지 5.7 사이로 pH를 낮추는 것이다. 또 다른 적당한 구체예는 최대의 변환에 도달하자마자 온도를 낮추는 것이다. 상기 두가지를 조합한 것도 가능하다.

최대의 변환에 도달하자마자 반응을 종결하는 경우, 일반적으로 반응혼합물은 항생제, D-페닐 글리신 및 가능한 고정화 효소와 같은 다수의 고체로 이루어진 현탁액 형태로 존재한다. 바람직하게, 고정화 효소는 방법의 경제적 측면을 고려하여 회수된다. 이는 예를 들면 교반기의 회전 방향을 현탁액이 교반기의 중심에서 위쪽으로 펌핑되도록 선택하여 교반하면서 반응혼합물을 체에 여과시킴으로써 적당하게 달성될 수 있다. 따라서, 항생제 및 FG와 같은 유용한 성분은 가능하게 고체 항생제를 제외한 고체 성분을 먼저 용해하고, 예를 들면 pH를 변화시킴으로써 본 발명에 따른 방법에 의해 회수될 수 있다.

pH는 본 발명의 기조내 여러 방법으로 예를 들어, 혼합물에 산을 첨가함으로써 낮출 수 있다. 적당한 산으로는 예를 들어, 무기산, 특히 황산, 염산 또는 질산이 있다. 염산을 사용하는 것이 바람직하다. pH는 혼합물에 염기를 첨가함으로써 높일 수 있다. 적당한 염기로는 예를 들어, 무기염기, 특히 수산화 암모늄, 수산화 칼륨 또는 수산화 나트륨이 있다. 수산화 암모늄을 사용하는 것이 바람직하다.

실제로, 반응혼합물의 효소 아실화반응 및 집성은 보통 물안에서 실시된다. 소망한다면, 반응혼합물은 또한 유기용매 또는 유기용매의 혼합물을 30vol.% 이하 함유하는 것이 바람직하다. 사용될 수 있는 적당한 유기용매로는 1-7 C원자를 갖는 알콜, 예를 들어 일가알콜, 특히 메탄올 또는 에탄올; 디올, 특히 에틸렌 글리콜, 또는 트리올, 특히 글리세롤이 있다.

본 발명에 따른 방법은 6-APA가 D-페닐 글리신의 아미드, 예를 들어 FGA, 또는 D-페닐 글리신의 에스테르, 예를 들어 FGM으로 아실화되는 효소 아실화반응후에 얻은 반응혼합물을 집성하는데 사용하기에 특히 적합하다.

상기 방법의 바람직한 구체예에서, 용해된 6-APA의 농도가 가능한한 높게 선택될 경우보다 높은 전환율이 얻어질 수 있도록 반응혼합물내 용해된 6-APA의 농도가 비교적 낮게 유지되도록 한다.

그리고, 반응혼합물의 교반능력은 용해된 6-APA의 농도가 비교적 낮은 경우보다 상당히 높다는 것을 알았다.

본 명세서에서, '전환율'이라는 용어는 형성된 암피실린과 사용된 6-APA의 양의 몰비를 의미한다. 용해된 6-APA의 농도는 반응혼합물 ㎏당 6-APA의 양(mole)으로 나타내며; 용해된 것과 용해되지 않은 6-APA의 전체농도는 전체 반응혼합물 ㎏당 6-APA와 암피실린의 양의 합(mole)으로 나타내고; 전체 반응혼합물은 용액외에, 여러 고체물질, 예를 들어 6-APA, 암피실린, 페닐 글리신 및 고정화 효소를 함유한다.

첨가된 페닐 글리신 유도체의 전체 양을 첨가된 6-APA의 전체 양(mole)으로 나눈, 아실화제와 6-APA의 몰비는 2.5 이하인 것이 바람직하다. 몰비는 1.0 내지 2.0, 특히 1.2 내지 1.8이 바람직하다.

효소 아실화반응은 배치(batch) 공정으로 실시되는 것이 바람직하다. 소망한다면, 반응은 또한 용해된 6-APA의 농도를 인라인 조절하면서 연속적으로 실시될 수 있다.

반응혼합물내 6-APA와 암피실린의 전체농도합(용해된 형태 및 용해되지 않은 형태)은 바람직하게 250mM 이상, 더 바람직하게 300mM 이상, 특히 350mM 이상이다.

상기 바람직한 구체예에서, 암피실린을 제조하는 동안, 용해된 6-APA의 농도는 바람직하게 300mM 이하, 특히 250mM 이하로 유지된다. 고농도의 아실화제에서, 용해된 6-APA의 농도는 저농도에서보다 높게 임의로 선택된다. 이는 반응속도가 아실화제의 농도가 높을때 보다 높아 6-APA가 비교적 단시간동안만 고농도로 용해되기 때문이다.

반응혼합물내에 용해된 6-APA의 농도는 여러가지 방법에 의해 낮게 유지될 수 있다. 용해된 6-APA의 농도를 낮게 유지할 수 있는 한가지 방법은 초기에 6-APA의 전체양중 일부만 공급하고, 반응동안 균형을 맞추면서 미터링(metering)하는 것이다. 상기 방법의 단점은 6-APA가 고체형태로 미터링될 필요가 있을 경우에 실제적인 문제가 나타난다는 점이다. 그러므로, 배치 공정에서 6-APA의 전체양은 반응시작시에 공급되는 것이 바람직하며, 그결과 효소 아실화반응동안 반응혼합물내 6-APA의 농도는 감소하고, 암피실린의 농도는 증가하게 된다. 저농도의 용해된 6-APA를 얻기 위해 적당한 방법은 반응물의 최대용해도가 이루어질때보다 낮은 값에서 pH를 유지하는 것이다. 용해된 6-APA의 농도를 낮게 유지하기 위해 특히 적당한 방법은 예를 들어 반응동안 페닐 글리신 유도체내에 부분적으로 미터링함으로써 페닐 글리신 유도체의 농도를 낮게 유지시키는 것이다.

본 명세서에서, 페닐 글리신 유도체의 농도가 낮게 유지된다면 약간의 6-APA만 용해되어, 용해된 6-APA 농도가 페닐 글리신 유도체를 미터링함으로써 조절될 수 있다는 것을 발견하였다.

특히 적당한 구체예는 FGA가 그의 염중 하나의 형태, 바람직하게 FGA와 무기산의 염, 예를 들어 FGA.HCl, FGA.1/2H₂SO₄및 FGA.HNO₃의 형태로 첨가될 경우 얻어진다. 상기 방법에서, pH를 일정하게 유지함으로써 FGA의 최적미터링을 미리 확인할 수 있다. 바람직하게, FGA.1/2H₂SO₄는 매우 높은 용해도를 가지기 때문에 많이 사용된다.

본 발명의 기조내에서, 여러 성분들은 유리형태로 또는 염으로 반응혼합물내에 존재한다. 언급된 pH값은 모든 경우에 실온에서 측정된 pH값이다.

본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 설명되지만, 이에 한정되지는 않는다.

약어:

AMPI = 암피실린

AMPI.3H₂O = 암피실린 삼수화물

6-APA = 6-아미노-페니실란산

FGA = D-페닐 글리신 아미드

FG = D-페닐 글리신

FGHM = D-p-히드록시페닐 글리신 메틸 에스테르

어셈블라제(Assemblase)^TM는 WO-A-97/04086에 기술되어 있는 E. coli ATCC 1105로부터의 고정화 에스케리키아 콜라이 페니실린 아실라제이다. 고정화는 EP-A-222462에 정의된 바와 같이 실시되며, 젤라틴과 키토산은 젤라틴화제로 사용되며, 글루타르알데히드는 가교제로 사용된다.

에스케리키아 콜라이 페니실린 아실라제의 최종활성은 활성 소구체에 첨가된 효소의 양에 의해 측정되며, 3ASU/건조중량(g)으로 정량되었으며, 여기서 1ASU(아목시실린(Amoxicillin) 합성 단위)는 시간당 6-APA 및 FGHM으로부터 아목시실린.3H₂O 1g을 제조할 수 있는 효소의 양으로 정의된다(20℃에서; 6.5% 6-APA 및 6.5% FGHM)

실시예 1

FGA.1/H₂SO₄용액의 제조

T=5℃에서 FGA 301.6g(2.00mol)을 물 650g에 현탁했다. 1시간후 교반하면서 96-%H₂SO₄102.1g(1.00mol)을 적하첨가하고, 냉각에 의해 온도를 T＜25℃로 유지하였다.

실시예 2

암피실린의 효소적 합성

175㎛ 메쉬 체 바닥을 구비한 효소반응기(1.5ℓ, 직경 11㎝)에 네트-웨트(net-wet) 어셈블라제^TM('네트-웨트'란 용어는 유리필터에 의해 효소 슬러리로부터 효소를 분리하여 얻은 효소덩어리를 의미함) 300g을 채웠다.

제조반응기(1.2ℓ)에 6-APA 131.6g(0.600mol), FGA 30.2g(0.200mol) 및 물 400㎖을 채웠다(T=10℃). 상기 혼합물을 T=10℃에서 15분간 교반하고, t=0에서 물 100㎖에 의해 효소반응기에 옮겼다(T=10℃).

효소반응기내 교반기는 t=0에서 작동시켰다. 온도는 그동안 내내 10℃로 유지하였다. FGA.½H₂SO₄용액 423.7g(0.800mol)을 233분동안 일정한 속도로 첨가했다. pH는 6N H₂SO₄로 적정하여 약 6.3에서 일정하게 유지하였다. t=570분에, AMPI의 양은 최대였으며, pH는 6N H₂SO₄를 첨가함으로써 5.0으로 감소되었다. 효소반응기는 이제 AMPI 575mmol, 6-APA 15mmol, FGA 50mmol 및 FG 365mmol을 함유한다.

실시예 3

효소반응기로부터 AMPI/FG 슬러리의 분리

실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된 AMPI/FG 슬러리를 교반여과에 의해 체 바닥을 통해 효소반응기로부터 제거하였다. 이는 체 위의 0.5㎝에 위치되어 있는 경사진-날 교반기를 사용하여 실시하였다. 교반은 약 500rpm에서 윗방향으로 실시하였다. 반응기로부터 분리된 AMPI/FG 슬러리를 G3 유리 여과기에 여과시켰다. AMPI/FG 습윤 케이크를 치우고, 모액을 효소 반응기로 다시 보내고, AMPI/FG 슬러리의 G3 여과에 후속하여 교반여과를 재시작하였다. 이러한 방법으로, 반응기로부터 고체 물질이 더이상 나오지 않을 때까지 효소 반응기를 AMPI/FG 모액으로 세척하였다. G3 여과에서 모인 최종 모액을 AMPI/FG 슬러리를 형성하기 위해 AMPI/FG 습윤 케이크와 조합하였다.

상기와 같이 얻어진 AMPI/FG 슬러리는 효소 반응기에서 제조된 AMPI의 전체양의 ＞99.0% 및 효소 반응기에서 제조된 FG의 전체양의 ＞95.5%를 함유하였다. 상기 교반여과후, 어셈블라제^TM의 ＞99.5%가 효소반응기내에 존재하였다.

실시예 4

암피실린의 재결정화

저장 용기(V₁; 2ℓ), 펌프, 용해 용기(V₂; 0.05ℓ), 자이츠(Seitz) 여과기 플레이트가 설치된 여과기(F₀), 펌프, AMPI 결정화 용기(V₃; 0.5ℓ), 평행하게 배열된 2개의 유리 여과기 1A, 1B(F_1A, F_1B), 펌프, 열교환기, FG 결정화 용기((V₄; 0.5ℓ), 평행하게 배열된 2개의 유리 여과기 2A, 2B(F_2A, F_2B), 펌프, 마지막으로 용해 용기와 연결된 열교환기로 구성된 장비에서 결정화를 실시하였다. 여과기 2A, 2B와 용해 용기 사이의 선에는 스트림의 일부를 방출가능하게 하는 3방향밸브가 포함되어 있다. 모든 용기는 교반기, 온도계 및 pH 전극을 갖고 있다.

실시예 3에 개시된 바와 같이 분리한 AMPI/FG 슬러리를 저장 용기로 정량적으로 전달하고, 교반하면서 2℃까지 냉각시켰다.

재결정화 루프(저장 용기로부터 열교환기 포함장치까지)를 0.6% AMPI 및 0.6% FG의 수용액으로 구성된 초기 용액 총 약 1350g을 채웠다. 재결정화 루프(FG 결정화 용기 및 유리 여과기 2A, 2B 제외)를 1-2℃까지 냉각시켰다. FG 결정화 용기 및 유리 여과기 2A, 2B를 20℃로 유지하였다. 재결정화 루프내 순환(흐름 = 1.2ℓ/h)을 시작하였다. 용해 용기내 pH를 8N HCl 용액으로 적정하여 pH=1.25로 조정하였다. AMPI 결정화 용기내 pH는 25 wt.% NH₃용액으로 적정하여 pH=6.5로 조정하였다. 핵으로서 AMPI.3H₂O 13.0g을 AMPI 결정화 용기에 첨가하였다. FG 핵 10.0g을 FG 결정화 용기에 첨가하였다.

저장 용기로부터 용해 용기까지(흐름 = 0.14ℓ/h)의 AMPI/FG 슬러리를 미터링함으로써 t=0에서 재결정화를 시작하였다. 약 8시간 지나서 저장 용기의 내용물을 용해 용기에 첨가하였다. 용해 용기 및 AMPI, FG 결정화 용기내 수준은 시종일관 일정하게 유지하였다. 이는 FG 모액의 일부를 재순환하기보다는 용해 용기로 방출함으로써 달성되었다.

AMPI 결정화 용기로부터의 AMPI 슬러리를 유리 여과기 1A에 여과시키고, 한편 모액을 FG 결정화 용기로 펌핑하였다. FG 결정화 용기로부터의 FG 슬러리를 유리 여과기 2A에 여과시키고, 모액을 저장 용기로 역펌핑하였다. 저장 용기 및 FG 모액으로부터의 AMPI/FG 슬러리를 실험의 시종일관 1 내지 8.6의 비율로 용해 용기에서 혼합하였다. 약 8시간 후 저장 용기를 비우고, 총 330㎖의 8N HCl 용액을 용해 용기로 미터링하였다.

t=8시간에서 저장 용기를 실시예 3에 개시된 바와 같이 분리된 새로운 AMPI/FG 슬러리로 채웠다. 재결정화 루프내 AMPI 분리는 유리 여과기 1A에서 1B로 전환되고, FG 분리는 유사하게 유리 여과기 2A에서 2B로 전환되었다.

유리 여과기 F_1A상의 AMPI 습윤 케이크를 2×175㎖의 물(T=5℃)로 세척하고, 건조시켰다. 유리 여과기 2A상의 FG 습윤 케이크를 2×60㎖의 물로 세척하고, 건조시켰다.

재결정화는 저장 용기를 8 시간마다 AMPI/FG 슬러리로 채우고, 그리고 유리 여과기 1A, 1B 및 2A, 2B를 교대로 삽입하고 비움으로써 연속적으로 실시하였다. FG 및 모액의 흐름은 평균 약 0.18ℓ/h이었다.

저장 용기(실시예 2의 효소 반응기로 미터링된 600mM 6-APA)내 차지(charge)당 평균 수율은 220g AMPI.3H₂O(AMPI 핵 제외; 600mM 6-APA에 대해서 91%) 및 30g FG(FG 핵 제외)이었다.

Claims

-5 내지 20℃ 사이의 온도에서, FG가 용액내에 잔류하는 농도에서 혼합물의 pH가 3 내지 8 사이가 되도록 하고, 수득된 고체 β-락탐 항생제를 회수하고, 잔류 액체의 온도를 10 내지 60℃ 사이로 올리고, 고체 FG를 형성하고, FG를 고체로 분리하여 석출시키고, 모액을 적어도 부분적으로 재순환시키는 것으로 이루어진 용액내 β-락탐 항생제 및 D-페닐 글리신(FG)을 함유하는 혼합물로부터 β-락탐 항생제의 회수방법.
제 1 항에 있어서,

상기 혼합물의 온도는 -3 내지 15℃ 사이인 것을 특징으로 하는 회수방법.
제 2 항에 있어서,

상기 혼합물의 온도는 0 내지 10℃ 사이인 것을 특징으로 하는 회수방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 온도는 12 내지 50℃ 사이의 값으로 상승되는 것을 특징으로 하는 회수방법.
제 4 항에 있어서,

상기 온도는 15 내지 40℃ 사이의 값으로 상승되는 것을 특징으로 하는 회수방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 혼합물의 pH는 4 내지 7 사이인 것을 특징으로 하는 회수방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 잇어서,

상기 모액은 용해된 β-락탐 항생제 및 FG를 함유하는 혼합물로 재순환되는 것을 특징으로 하는 회수방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 방법은 연속적으로 실시되는 것을 특징으로 하는 회수방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,

β-락탐 항생제 및 FG를 실질적으로 함유하는 초기 혼합물은 상응하는 β-락탐 핵이 D-페닐 글리신 유도체로 아실화되는 효소 아실화반응으로부터 비롯되는 것을 특징으로 하는 회수방법.
제 9 항에 있어서,

상기 아실화반응후 수득된 혼합물은 0 내지 3의 pH로 pH 감소를 실시하는 것을 특징으로 하는 회수방법.
제 10 항에 있어서,

상기 혼합물은 0.3 내지 2의 pH로 pH 감소를 실시하는 것을 특징으로 하는 회수방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 혼합물은 10-1500mM β-락탐 항생제, 0-1500mM FG, 0-1000 mM D-페닐 글리신 유도체 및 0-1000mM β-락탐 핵을 함유하는 것을 특징으로 하는 회수방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 β-락탐 핵은 6-아미노페니실란산(6-APA)이고, 상기 β-락탐 항생제는 암피실린인 것을 특징으로 하는 회수방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 락탐 핵은 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA)이고, 상기 β-락탐 항생제는 세팔렉신인 것을 특징으로 하는 회수방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 락탐 핵은 7-아미노-3-클로로-세프-3-엠-4-카르복실산(7-ACCA)이고, 상기 β-락탐 항생제는 세파클롤인 것을 특징으로 하는 회수방법.