KR20010022649A - 에르위니아 아밀로보라 유래의 과민성 반응 유발인자, 그 용도, 및 코딩 유전자 - Google Patents

에르위니아 아밀로보라 유래의 과민성 반응 유발인자, 그 용도, 및 코딩 유전자 Download PDF

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KR20010022649A
KR20010022649A KR1020007001243A KR20007001243A KR20010022649A KR 20010022649 A KR20010022649 A KR 20010022649A KR 1020007001243 A KR1020007001243 A KR 1020007001243A KR 20007001243 A KR20007001243 A KR 20007001243A KR 20010022649 A KR20010022649 A KR 20010022649A
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KR
South Korea
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plant
protein
dna molecule
leu
ser
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KR1020007001243A
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복다노브아담제이
김지현프란시스
웨이종-민
비어스티븐브이.
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해우슬러 에이치 월터, 리처드 에스. 카훈
코넬 리서치 파운데이션 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 식물에서 과민성 반응을 유발하는 분리된 단백질 또는 폴리펩티드 및 상기 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 분리된 DNA 분자에 관한 것이다. 이 분리된 단백질 또는 폴리펩티드 및 분리된 DNA 분자는 식물에서 질병에 대한 내성을 부여하고, 식물의 성장을 촉진하고, 및/또는 식물에서 해충을 방제하는데 사용될 수 있다. 이것은 식물에서 또는 상기 식물종자로부터 성장시킨 식물들에서 질병에 내성을 부여하고, 식물 성장을 촉진하고, 및/또는 해충을 방제하는 효과적인 조건하에서 식물 또는 식물종자에 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 비감염성 형태로 적용하여 달성될 수 있다. 또한 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 트랜스진 식물 또는 식물종자를 제공하고 식물에서 또는 상기 식물종자로 부터 상장시킨 식물들에서 질병에 대한 내성을 부여하고, 식물 성장을 촉진하고, 및/또는 해충을 방제하는 효과적인 조건하에서 상기 트랜스진 식물종자로부터 유래하는 식물 또는 트랜스진 식물을 성장시킨다.

Description

에르위니아 아밀로보라 유래의 과민성 반응 유발인자, 그 용도, 및 코딩 유전자 {HYPERSENSITIVE RESPONSE ELICITOR FROM ERWINIA AMYLOVORA, ITS USE, AND ENCODING GENE}
＜110＞ CORNELL RESEARCH FOUNDATION, INC.
＜120＞ HYPERSENSITIVE RESPONSE ELICITOR FROM ERWINIA AMYLOVORA, ITS USE,
AND ENCODING GENE
＜130＞ IPP006004US
＜150＞ US 60/055,105
＜151＞ 1997-08-06
＜160＞ 5
＜170＞ KOPATIN 1.5
＜210＞ 1
＜211＞ 5517
＜212＞ DNA
＜213＞ Erwinia amylovora
＜400＞ 1
atggaattaa aatcactggg aactgaacac aaggcggcag tacacacagc ggcgcacaac 60
cctgtggggc atggtgttgc cttacagcag ggcagcagca gcagcagccc gcaaaatgcc 120
gctgcatcat tggcggcaga aggcaaaaat cgtgggaaaa tgccgagaat tcaccaccca 180
tctactgcgg ctgatggtat cagcgctgct caccagcaaa agaaatcctt cagtctcagg 240
ggctgtttgg ggacgaaaaa attttccaga tcggcaccgc agggccagcc aggtaccacc 300
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acgcagcaaa aacggcatca gctgaacaat tttggccaga tgcgccaaac gatgttgagc 540
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acggcccacg cagacagagt ggaaatcgct caggaagatg acgacagcga attccagcaa 720
ctgcatcaac agcggctggc gcgcgaacgg gaaaatccac cgcagccgcc caaactcggc 780
gttgccacac cgattagcgc caggtttcag cccaaactga ctgcggttgc ggaaagcgtc 840
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gataatccac ccgcgctcaa tacgttgttg aagcagacat tgggtaaaga cacccagcac 1020
tatctggcgc accatgccag cagcgacggt agccagcatc tgctgctgga caacaaaggc 1080
cacctgtttg atatcaaaag caccgccacc agctataccg tgctgcacaa cagccacccc 1140
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ccgggggaag cgcaccgttc cttattaacc ggcatttggc agcatcctgc tggcgcagcg 1320
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ctgggcgtat ggcaatctgc ggataaagat acccacagcc agctgtctcg ccaggcagac 1440
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gggaagtcgg agcttgaggc acaatctgtc gcgatcagcc atgggcgact ggttgtggcc 1740
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tctggatttt tccatgacga ccacggccag cttaatgcgc tggtgaaaaa taacttcagg 1920
cagcagcatg cctgcccgtt gggtaacgat catcagtttc accccggctg gaacctgact 1980
gatgcgctgg ttatcgacaa tcagctgggg ctgcatcata ccaatcctga accgcatgag 2040
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caaaccgtct ttaaccgact aatgcagggg gtgaaaggca aggtgatccc aggcagcggg 2820
ttgacggtta agctctcggc tcagacgggg ggaatgaccg gcgccgaagg gcgcaaggtc 2880
agcagtaaat tttccgaaag gatccgcgcc tatgcgttca acccaacaat gtccacgccg 2940
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aagccgttgt acgagatgca gggagcgctg attaaacaac tggatgcgca taacgttcgt 3060
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agcgaattta agccatcgcc cggcaaggcg ttggtccaga gctttaacgt caatcgctct 3300
ggtcaggatc taagcaagtc actgcaacag gcagtacatg ccacgccgcc atccgcagag 3360
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tcgcgtttaa ttttagatac cgtgaccatc ggtgaactgc atgaactggc cgataaggcg 3540
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cgtatcggcg ctgctgtgag tggcaccctg caaggaacgc tacaaaacag cctgaagttt 4200
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＜213＞ Erwinia amylovora
＜400＞ 2
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Ser Ser Ser Ser Pro Gln Asn Ala Ala Ala Ser Leu Ala Ala Glu Gly
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50 55 60
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Gly Cys Leu Gly Thr Lys Lys Phe Ser Arg Ser Ala Pro Gln Gly Gln
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Arg Asp Asp Gly Glu Thr Gln His Glu Ala Ala Ala Pro Asp Ala Ala
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Arg Leu Thr Arg Ser Gly Gly Val Lys Arg Arg Asn Met Asp Asp Met
130 135 140
Ala Gly Arg Pro Met Val Lys Gly Gly Ser Gly Glu Asp Lys Val Pro
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Leu His Asp Asp Lys Ile His Ile Leu His Pro Glu Leu Gly Val Trp
450 455 460
Gln Ser Ala Asp Lys Asp Thr His Ser Gln Leu Ser Arg Gln Ala Asp
465 470 475 480
Gly Lys Leu Tyr Ala Leu Lys Asp Asn Arg Thr Leu Gln Asn Leu Ser
485 490 495
Asp Asn Lys Ser Ser Glu Lys Leu Val Asp Lys Ile Lys Ser Tyr Ser
500 505 510
Val Asp Gln Arg Gly Gln Val Ala Ile Leu Thr Asp Thr Pro Gly Arg
515 520 525
His Lys Met Ser Ile Met Pro Ser Leu Asp Ala Ser Pro Glu Ser His
530 535 540
Ile Ser Leu Ser Leu His Phe Ala Asp Ala His Gln Gly Leu Leu His
545 550 555 560
Gly Lys Ser Glu Leu Glu Ala Gln Ser Val Ala Ile Ser His Gly Arg
565 570 575
Leu Val Val Ala Asp Ser Glu Gly Lys Leu Phe Ser Ala Ala Ile Pro
580 585 590
Lys Gln Gly Asp Gly Asn Glu Leu Lys Met Lys Ala Met Pro Gln His
595 600 605
Ala Leu Asp Glu His Phe Gly His Asp His Gln Ile Ser Gly Phe Phe
610 615 620
His Asp Asp His Gly Gln Leu Asn Ala Leu Val Lys Asn Asn Phe Arg
625 630 635 640
Gln Gln His Ala Cys Pro Leu Gly Asn Asp His Gln Phe His Pro Gly
645 650 655
Trp Asn Leu Thr Asp Ala Leu Val Ile Asp Asn Gln Leu Gly Leu His
660 665 670
His Thr Asn Pro Glu Pro His Glu Ile Leu Asp Met Gly His Leu Gly
675 680 685
Ser Leu Ala Leu Gln Glu Gly Lys Leu His Tyr Phe Asp Gln Leu Thr
690 695 700
Lys Gly Trp Thr Gly Ala Glu Ser Asp Cys Lys Gln Leu Lys Lys Gly
705 710 715 720
Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Leu Leu Lys Asp Gly Glu Val Lys Arg Leu
725 730 735
Asn Ile Asn Gln Ser Thr Ser Ser Ile Lys His Gly Thr Glu Asn Val
740 745 750
Phe Ser Leu Pro His Val Arg Asn Lys Pro Glu Pro Gly Asp Ala Leu
755 760 765
Gln Gly Leu Asn Lys Asp Asp Lys Ala Gln Ala Met Ala Val Ile Gly
770 775 780
Val Asn Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Asp Ile Arg Ser Phe
785 790 795 800
Gln Ile Lys Pro Gly Thr Gln Gln Leu Glu Arg Pro Ala Gln Thr Leu
805 810 815
Ser Arg Glu Gly Ile Ser Gly Glu Leu Lys Asp Ile His Val Asp His
820 825 830
Lys Gln Asn Leu Tyr Ala Leu Thr His Glu Gly Glu Val Phe His Gln
835 840 845
Pro Arg Glu Ala Trp Gln Asn Gly Ala Glu Ser Ser Ser Trp His Lys
850 855 860
Leu Ala Leu Pro Gln Ser Glu Ser Lys Leu Lys Ser Leu Asp Met Ser
865 870 875 880
His Glu His Lys Pro Ile Ala Thr Phe Glu Asp Gly Ser Gln His Gln
885 890 895
Leu Lys Ala Gly Gly Trp His Ala Tyr Ala Ala Pro Glu Arg Gly Pro
900 905 910
Leu Ala Val Gly Thr Ser Gly Ser Gln Thr Val Phe Asn Arg Leu Met
915 920 925
Gln Gly Val Lys Gly Lys Val Ile Pro Gly Ser Gly Leu Thr Val Lys
930 935 940
Leu Ser Ala Gln Thr Gly Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Arg Lys Val
945 950 955 960
Ser Ser Lys Phe Ser Glu Arg Ile Arg Ala Tyr Ala Phe Asn Pro Thr
965 970 975
Met Ser Thr Pro Arg Pro Ile Lys Asn Ala Ala Tyr Ala Thr Gln His
980 985 990
Gly Trp Gln Gly Arg Glu Gly Leu Lys Pro Leu Tyr Glu Met Gln Gly
995 1000 1005
Ala Leu Ile Lys Gln Leu Asp Ala His Asn Val Arg His Asn Ala Pro
1010 1015 1020
Gln Pro Asp Leu Gln Ser Lys Leu Glu Thr Leu Asp Leu Gly Glu His
1025 1030 1035 1040
Gly Ala Glu Leu Leu Asn Asp Met Lys Arg Phe Arg Asp Glu Leu Glu
1045 1050 1055
Gln Ser Ala Thr Arg Ser Val Thr Val Leu Gly Gln His Gln Gly Val
1060 1065 1070
Leu Lys Ser Asn Gly Glu Ile Asn Ser Glu Phe Lys Pro Ser Pro Gly
1075 1080 1085
Lys Ala Leu Val Gln Ser Phe Asn Val Asn Arg Ser Gly Gln Asp Leu
1090 1095 1100
Ser Lys Ser Leu Gln Gln Ala Val His Ala Thr Pro Pro Ser Ala Glu
1105 1110 1115 1120
Ser Lys Leu Gln Ser Met Leu Gly His Phe Val Ser Ala Gly Val Asp
1125 1130 1135
Met Ser His Gln Lys Gly Glu Ile Pro Leu Gly Arg Gln Arg Asp Pro
1140 1145 1150
Asn Asp Lys Thr Ala Leu Thr Lys Ser Arg Leu Ile Leu Asp Thr Val
1155 1160 1165
Thr Ile Gly Glu Leu His Glu Leu Ala Asp Lys Ala Lys Leu Val Ser
1170 1175 1180
Asp His Lys Pro Asp Ala Asp Gln Ile Lys Gln Leu Arg Gln Gln Phe
1185 1190 1195 1200
Asp Thr Leu Arg Glu Lys Arg Tyr Glu Ser Asn Pro Val Lys His Tyr
1205 1210 1215
Thr Asp Met Gly Phe Thr His Asn Lys Ala Leu Glu Ala Asn Tyr Asp
1220 1225 1230
Ala Val Lys Ala Phe Ile Asn Ala Phe Lys Lys Glu His His Gly Val
1235 1240 1245
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Val Leu Glu Ser Gln Gly Ser Ala Glu Leu
1250 1255 1260
Ala Lys Lys Leu Lys Asn Thr Leu Leu Ser Leu Asp Ser Gly Glu Ser
1265 1270 1275 1280
Met Ser Phe Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gly Val Ser Thr Val Phe Val
1285 1290 1295
Pro Thr Leu Ser Lys Lys Val Pro Val Pro Val Ile Pro Gly Ala Gly
1300 1305 1310
Ile Thr Leu Asp Arg Ala Tyr Asn Leu Ser Phe Ser Arg Thr Ser Gly
1315 1320 1325
Gly Leu Asn Val Ser Phe Gly Arg Asp Gly Gly Val Ser Gly Asn Ile
1330 1335 1340
Met Val Ala Thr Gly His Asp Val Met Pro Tyr Met Thr Gly Lys Lys
1345 1350 1355 1360
Thr Ser Ala Gly Asn Ala Ser Asp Trp Leu Ser Ala Lys His Lys Ile
1365 1370 1375
Ser Pro Asp Leu Arg Ile Gly Ala Ala Val Ser Gly Thr Leu Gln Gly
1380 1385 1390
Thr Leu Gln Asn Ser Leu Lys Phe Lys Leu Thr Glu Asp Glu Leu Pro
1395 1400 1405
Gly Phe Ile His Gly Leu Thr His Gly Thr Leu Thr Pro Ala Glu Leu
1410 1415 1420
Leu Gln Lys Gly Ile Glu His Gln Met Lys Gln Gly Ser Lys Leu Thr
1425 1430 1435 1440
Phe Ser Val Asp Thr Ser Ala Asn Leu Asp Leu Arg Ala Gly Ile Asn
1445 1450 1455
Leu Asn Glu Asp Gly Ser Lys Pro Asn Gly Val Thr Ala Arg Val Ser
1460 1465 1470
Ala Gly Leu Ser Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Gly Ser Arg Glu Arg
1475 1480 1485
Ser Thr Thr Ser Gly Gln Phe Gly Ser Thr Thr Ser Ala Ser Asn Asn
1490 1495 1500
Arg Pro Thr Phe Leu Asn Gly Val Gly Ala Gly Ala Asn Leu Thr Ala
1505 1510 1515 1520
Ala Leu Gly Val Ala His Ser Ser Thr His Glu Gly Lys Pro Val Gly
1525 1530 1535
Ile Phe Pro Ala Phe Thr Ser Thr Asn Val Ser Ala Ala Leu Ala Leu
1540 1545 1550
Asp Asn Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Leu Glu Leu Lys Arg Ala Glu
1555 1560 1565
Pro Val Thr Ser Asn Asp Ile Ser Glu Leu Thr Ser Thr Leu Gly Lys
1570 1575 1580
His Phe Lys Asp Ser Ala Thr Thr Lys Met Leu Ala Ala Leu Lys Glu
1585 1590 1595 1600
Leu Asp Asp Ala Lys Pro Ala Glu Gln Leu His Ile Leu Gln Gln His
1605 1610 1615
Phe Ser Ala Lys Asp Val Val Gly Asp Glu Arg Tyr Glu Ala Val Arg
1620 1625 1630
Asn Leu Lys Lys Leu Val Ile Arg Gln Gln Ala Ala Asp Ser His Ser
1635 1640 1645
Met Glu Leu Gly Ser Ala Ser His Ser Thr Thr Tyr Asn Asn Leu Ser
1650 1655 1660
Arg Ile Asn Asn Asp Gly Ile Val Glu Leu Leu His Lys His Phe Asp
1665 1670 1675 1680
Ala Ala Leu Pro Ala Ser Ser Ala Lys Arg Leu Gly Glu Met Met Asn
1685 1690 1695
Asn Asp Pro Ala Leu Lys Asp Ile Ile Lys Gln Leu Gln Ser Thr Pro
1700 1705 1710
Phe Ser Ser Ala Ser Val Ser Met Glu Leu Lys Asp Gly Leu Arg Glu
1715 1720 1725
Gln Thr Glu Lys Ala Ile Leu Asp Gly Lys Val Gly Arg Glu Glu Val
1730 1735 1740
Gly Val Leu Phe Gln Asp Arg Asn Asn Leu Arg Val Lys Ser Val Ser
1745 1750 1755 1760
Val Ser Gln Ser Val Ser Lys Ser Glu Gly Phe Asn Thr Pro Ala Leu
1765 1770 1775
Leu Leu Gly Thr Ser Asn Ser Ala Ala Met Ser Met Glu Arg Asn Ile
1780 1785 1790
Gly Thr Ile Asn Phe Lys Tyr Gly Gln Asp Gln Asn Thr Pro Arg Arg
1795 1800 1805
Phe Thr Leu Glu Gly Gly Ile Ala Gln Ala Asn Pro Gln Val Ala Ser
1810 1815 1820
Ala Leu Thr Asp Leu Lys Lys Glu Gly Leu Glu Met Lys Ser
1825 1830 1835
＜210＞ 3
＜211＞ 420
＜212＞ DNA
＜213＞ Erwinia amylovora
＜400＞ 3
atgacatcgt cacagcagcg ggttgaaagg tttttacagt atttctccgc cgggtgtaaa 60
acgcccatac atctgaaaga cggggtgtgc gccctgtata acgaacaaga tgaggaggcg 120
gcggtgctgg aagtaccgca acacagcgac agcctgttac tacactgccg aatcattgag 180
gctgacccac aaacttcaat aaccctgtat tcgatgctat tacagctgaa ttttgaaatg 240
gcggccatgc gcggctgttg gctggcgctg gatgaactgc acaacgtgcg tttatgtttt 300
cagcagtcgc tggagcatct ggatgaagca agttttagcg atatcgttag cggcttcatc 360
gaacatgcgg cagaagtgcg tgagtatata gcgcaattag acgagagtag cgcggcataa 420
420
＜210＞ 4
＜211＞ 139
＜212＞ PRT
＜213＞ Erwinia amylovora
＜400＞ 4
Met Thr Ser Ser Gln Gln Arg Val Glu Arg Phe Leu Gln Tyr Phe Ser
1 5 10 15
Ala Gly Cys Lys Thr Pro Ile His Leu Lys Asp Gly Val Cys Ala Leu
20 25 30
Tyr Asn Glu Gln Asp Glu Glu Ala Ala Val Leu Glu Val Pro Gln His
35 40 45
Ser Asp Ser Leu Leu Leu His Cys Arg Ile Ile Glu Ala Asp Pro Gln
50 55 60
Thr Ser Ile Thr Leu Tyr Ser Met Leu Leu Gln Leu Asn Phe Glu Met
65 70 75 80
Ala Ala Met Arg Gly Cys Trp Leu Ala Leu Asp Glu Leu His Asn Val
85 90 95
Arg Leu Cys Phe Gln Gln Ser Leu Glu His Leu Asp Glu Ala Ser Phe
100 105 110
Ser Asp Ile Val Ser Gly Phe Ile Glu His Ala Ala Glu Val Arg Glu
115 120 125
Tyr Ile Ala Gln Leu Asp Glu Ser Ser Ala Ala
130 135
＜210＞ 5
＜211＞ 29
＜212＞ DNA
＜213＞ Erwinia amylovora
＜400＞ 5
ggaaccnnnn nnnnnnnnnn ncaacataa 29
박테리아 병원체와 그것들의 식물 숙주 사이의 상호작용은 일반적으로 두 개의 카테고리로 나뉜다: (1) 숙주 식물 내에서 세포간 박테리아의 성장, 증상(symptom)의 전개, 및 질병의 전개로 진전되는 적합성(compatible: 병원체-숙주) 상호작용; 및 (2) 진행성 질병 증후 없이 일어나는 특정 타입의 과민성 반응으로 나타나는 비적합성(non-compatible: 병원체-비숙주) 상호작용. 숙주 식물에 대한 적합성 상호작용 도중에, 박테리아 집단은 상당히 증가하며, 진행성(progressive) 증후도 일어나게 된다. 비적합성 상호작용 중에는 박테리아의 집단이 증가하지 않으며 진행성 증후도 나타나지 않는다.
상기 과민성 반응은 많은 병원체에 대한 식물의 능동적 방어와 관련된 빠르고 국부적인 괴사(necrosis)이다(Kiraly, Z., "Defenses Triggered by the Invader: Hypersensitivity," page 201-224 in: Plant Disease: An Advanced Treatise, Vol 5, J.G. Horsfall and E.B. Cowling, ed. Academic Press New York (1980); Klement, Z., "Hypersensitivity," page 149-177 in: Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2, M.S. Mount and G.H. Lacy, ed. Academic Press, New York (1982)). Pseudomonas syringae 또는 Erwinia amylovora 와 같은 제한된 숙주를 가지는 고농도의(107이상의 cells/ml) 병원체가 비숙주의 식물의 잎에 침윤되면 박테리아에 의하여 유도되는 과민성 반응이 조직 붕괴와 같은 현상으로 용이하게 관찰된다(괴사 현상은 분리된 식물세포에서만 낮은 수준의 접종원으로도 일어난다)(Klement Z., "Rapid Detection of Pathogenicity of Phytopathogenic pseudomonas," Nature 199:299-300; Klement, et al., "Hypersensitive Reaction Induced by Phytopathogenic Bacteria in the Tabacco Leaf," Phytopathology 54:474-477(1963); Turner, et al., "The Quantitative Relation Between Plant and Bacterial Cells Involved in the Hypersensitive Reaction," Phytopathology 64:885-890(1974); Klement, Z., "hypersensitivity," 149-177 in Phytopathogenic Prokaryotes, Vol 2., M.S. Mount and G.H. Lacy, ed. Academic Press, New York(1982)). 비숙주에서의 과민성 반응을 유도하는 능력과 숙주에서의 병원성인 능력은 서로 관련이 있는 것으로 보인다. Klement, Z., "Hypersensitivity," pages 149-177 in Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2., M.S. Mount and G.H. Lacy, ed. Academic Press, New York에 기재된 바와 같이 이들 병원체는 적합한 숙주와의 상호작용에서 지연되어 나타나긴 하지만 물리적으로 유사한 괴사 현상을 유발시킨다. 또한, 과민성 반응 또는 병원성(pathogenesis)의 생성능은 hrp로 명명된 공통된 유전자 세트에 의존한다(Lindgren, P.B., et al., "Gene Cluster of Pseudomonas syringae pv. 'phaseolicola' Conrtrols Pathogenicity of Bean Plants and Hypersensitivity on Nonhost Plants," J. Bacteriol. 168:512-22(1986); Willis, D.K., et al., "hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria," Mol. Plant-Microbe Interact. 4:132-138(1991)). 결론적으로 과민성 반응은 식물 방어의 속성과 박테리아 병인론(病因論)에 대한 단서를 포함한다고 볼 수 있다.
상기 hrp 유전자는 그람-음성 식물 병원체에 널리 분포되어 있으며, 상기 병원체에 군락을 형성하고, 보존되어 있고 몇몇 경우에 상호 교환 가능하다(Willis, D.K., et al., "hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria," Mol. Plant-Microbe Interact. 4:132-138(1991); Bonas, U., "hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria," pages 79-98 in: Current Topics in Microbiology and Immunology: Bacterial Pathogenesis of Plants and Animals-Molecular and Cellular Mechanism, J.L. Dangl, ed. Springer-Verlag, Berlin(1994)). 몇몇 hrp 유전자는 동물 질병에서 필수적인 단백질을 분비하는 Yersinia, Shigella 및 Salmonella spp.에 유사한 단백질 분비 경로의 성분들을 코드한다(Van Gijsegem, et al., "Evolutionary Conservation of Pathogenicity Determinants Among Plant and Animal Pathogenic Bacteria," Trends Microbiol. 1:175-180(1993)). E. amylovora, P. syringae, 및 P. solanacearum에서, hrp 유전자는 과민성 반응을 유도하는 글리신이 풍부한 단백질의 생성과 분비를 조절하는 것으로 알려져 있다(He, S.Y., et al. "Pseudomonas Syringae pv. Syringae HarpinPss: a Protein that is Secreted via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants," Cell 73:1255-1266(1993), Wei, Z.-H., et al., "HrpⅠ of Erwinia amylovora Functions in Secretion of Harpin and a Member of a New Protein family," J. Bacteriol. 175:7958-7967(1993); Arlat, M. et al. "PopA1, a Protein Which Induces a Hypersensitive-like Response on Specific Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum," EMBO J. 13:543-553(1994)).
이들 단백질중 첫 번째가 장미과 식물의 불마름병(fire blight)을 야기하는 박테리아 E. amylovora Ea321에서 발견되었으며, 하핀(harpin)으로 명명되었다(Wei, Z.-M., et al, "Harpin, Elicitor of Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora," Science 257:85-88(1992)). hrpN을 코드하는 유전자에서의 돌연변이는 E. amylovora가 비숙주인 담배 잎에서 과민성 반응을 유도하고 매우 민감한 과일인 배에서 질병 증후를 야기하는데 과민성 반응 유발인자가 필요하다는 사실이 밝혀졌다. P. solanacearum GMI1000 PopA1 단백질은 유사한 물리적 성질을 가지며 그 균주의 숙주가 아닌 담배 잎에서 과민성 반응을 유도한다(Arlat, et al. "PopA1, a Protein which Induces a Hypersensitive-like Response on Specific Petunia Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum" EMBO J. 13:543-53(1994)). 그러나 P. solanacearum popA 돌연변이는 담배에서 과민성 반응을 여전히 유도하고 토마토에서도 질병을 유발시킨다. 이와 같이 이들 글리신이 풍부한 과민성 반응 유발인자의 역할은 그람-음성 식물 병원체에 널리 다양하게 나타난다.
다른 식물 병원성 과민성 반응 유발인자는 분리되고 그들의 코딩 유전자는 클론되어 서열분석 되었다. 이들은 Erwinia chrysanthemi(Bauer, et al., "Erwinia chrysanthemi HarpinEch: Soft-Rot Pathogenesis," MPMI 8(4):484-91(1995)); Erwinia carotovora(Cui, et al.,"The RsmA Mutants of Erwinia carotovora subsp. carotovora Strain Ecc71 Overexpress hrpNEccand Elicit a Hypersensitive Reaction-like Response in Tabacco Leaves," MPMI 9(7): 565-73 (1996)); Erwinia stewartii(Ahmad, et al., "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize," 8th Int'l. Cong. Molec. Plant-Microb. Inter. July 14-19, 1996 and Ahmad, et al., "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize," Ann. Mtg. Am. Phytopath. Soc. July 27-31, 1996); 및 Pseudomonas syringae pv. syringae(Cornell Research Foundation, Inc.의 WO 94/26782)를 포함한다.
본 발명은 식물 병원체로부터 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드를 동정하고, 클론하고 서열분석하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 에르위나 아밀로보라(Eriwina Amylovora) 유래의 과민성 반응 유발인자(hepersensitive response elicitor) 및 그 용도에 관한 것이다.
도 1(A) 내지 도 1(D)는 돌연변이 유발, 상보성 및 이종 발현 구조체, 및 E. amylovora의 dspE 오페론에 대한 P. syringae의 avrE 유전자 자리에 의한 돌연변이체의 상동성 및 상보성을 나타낸 도면이다. 빗금 친 상자는 특정화되지 않은 ORF; 검게 채워진 삼각형은 hrp(과민성 반응을 유도하는 유전자); 채워지지 않은 상자는 많은 hrp 유전자의 앞에 위치하는 조절인자 염기서열; 및 검게 채워지지 않은 삼각형은 그 밖의 프로모터를 나타낸 것이다. 굵은 선은 염기서열이 등록된 DNA를 도시한 것이다. 도 1(A)는 pCPP430에 삽입된 E. amylovora의 dsp/hrp 유전자 무리를 나타낸 것이다. 코딩된 단백질의 오페론 이름 및 유형은 상단에 도시하였다. B = BamHI; E = EcoRI; H = HindⅢ. 반쪽 화살표는 hrp 상자 일치 유사성이 없는 내부 프로모터를 나타낸 것이다. 도 1(B)는 dspE 오페론을 함유하는 hrpN의 업스트림 영역을 나타낸 도면이다. 원은 결실 돌연변이 및 대표적인 트랜스포존 삽입을 표시한 것이다: 검정색 = 비-병원성 및 HR+(즉, 과민성 반응 유도) 또는 HR 감소성(dsp); 회색 = 독성 감소 및 HR; 흰색 = 야생형. T104는 빗금 친 이중 화살표로 표시된 영역 내에 위치한다. K = Tn5minikm; P = Tn5phoA; T = Tn10tetr; △ = 결실돌연변이. 회색 상자는 A/T가 풍부한 DNA이다. 도 1(C)는 dspE 오페론의 클론 및 서브클론을 도시한 것이다. 플라스미드의 명칭은 왼쪽에 표시하였으며, 벡터에서 생성된 프로모터는 오른쪽에 표시하였다. 상기에 도시되지 않은 서브클로닝에 사용되는 제한효소절단 자리는 괄호 안에 도시하였다. B에서의 돌연변이를 나타내는 일직선상에 있는 "+"는 서브클론이 그 돌연변이와 상보적임을 나타내는 것이다. 도 1(D)는 pCPP2357내의 P. syringae Pv. tomato DC3000의 avrE 유전자 자리(전사 단위 Ⅲ 및 Ⅳ)를 도시한 것이다. DspE 및 DspF에 대한 예측한 단백질 AvrE 및 AvrF 각각의 아미노산 동일성 퍼센트를 나타낸 것이다. 검은색 직사각형은 전사 종결자이다(역 반복). 도 1(B)에 도시된 돌연변이의 상보성은 도 1(C)에 도시하였다.
도 2는 재조합 E. coli DH5α내에서의 DspE의 전체 길이 및 N-말단 반쪽의 발현을 도시한 것이다. dspE 오페론 전체를 함유하는 pCPP1259(레인 A); 클로닝 벡터인 pCPP50(레인 B); 또는 dspE 유전자의 5' 반쪽만을 함유하는 pCPP1244(레인 C)를 운반하는 세포 용해액(lysate)을 SDS-PAGE에 주입한 후, 쿠마시 염색하였다. DspE(레인 A) 및 DspE의 N-말단 반쪽(레인 C)에 해당하는 띠를 화살표로 표시하였다. 분자 중량 표지의 이동도는 왼쪽에 표시하였다.
도 3(A) 내지 도 3(D)는 병원성 및 HR 유도에서의 dspe의 역할을 도시한 것이다. 도 3(A)는 균주 Ea321, Ea321dspE△1554, 또는 pCPP1237 상에 dspE의 5' 반쪽을 함유하는 Ea321dspE△1554를 (왼쪽에서 오른쪽으로) 접종한 후 4일된 미성숙한 배 열매를 도시한 것이다. 도 3(B)는 노르치프 대두 잎에 (1) Ea321, (2) Ea321dspE△1554, (3) Ea321hrpN::Tn5(Wei et al., Science, 257:85-88 (1992), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨), 및 (4) Ea321hrpL::Tn5(Wei, et al., J. Bacteriol., 177:6201-19 (1995), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)를 침윤시키고 24시간 후의 상태를 도시한 것이다. 도 3(C)는 담배 잎에 균주 (왼쪽) Ea321 및 (오른쪽) Ea321dspE△1554의 현탁액의 일련의 수평 희석액을 침윤시킨 후, 48시간 된 담배 잎을 도시한 것이다. 침윤된 희석액의 농도는 (상에서 하로) 1 × 1010, 1 × 109, 5 × 108, 및 5 × 107cfu/㎖이다. 도 3(D)는 독성이 보다 강한 균주인 Ea273 및 상응하는 돌연변이 Ea273dspE△1554가 사용된 것과 농도 범위를 5 × 109에서부터 5 × 105cfu/㎖까지 로그 증가 방식으로 증가시킨 것을 제외하고는 도 3(C)와 같은 것이다.
도 4는 E. amylovora Ea273에서 dspE와 융합된 프로모터가 없는 GUS의 발현을 도시한 것이다. Ea273 및 Ea273dspE::uidA(uidA 유전자와 융합된 야생형 dspE 및 일부가 절단된dspE를 모두 함유하는 부분 이합체(merodiploid); 검은색 막대)를 LB 또는 Hrp MM에서 배양하거나 미성숙 배 열매에 접종한다. 또한, Ea273dspE::uidAhrpL::Tn5(진회색 막대) 및 Ea273hrcV::Tn5uidA(연회색 막대)도 hrp MM에서 배양하였다. 수치는 박테리아 세포 농도를 위해 표준화한 시료 3개의평균값을 도시한 것이다. 표준편차는 각각의 막대에서 연장된 선들로 나타내었다. 각각의 분석에서 3개의 Ea273 샘플에 대한 평균값을 다른 균주에서 얻어진 상응하는 값에서 빼고 여기에 표준편차를 더해주었다.
도 5(A) 내지 도 5(C)는 dspE 오페론의 속을 초월한 무독성 기능 및 avrE 유전자 자리를 가지는 dspE 돌연변이의 상보성을 도시한 것이다. 노르치프 대두 잎에 pCPP1250(dspE 오페론 함유)을 운반하는 (왼쪽) P. syringae pv. glycinea race 4의 1 × 108cfu/㎖ 현탁액 또는 (오른쪽) pML 122(클로닝 벡터)를 침윤시키고 상온에서 24시간 동안 방치한 후에 사진을 찍거나(도 5(A) 참조), 또는 동일한 균주의 8 × 105cfu/㎖ 현탁액을 침윤시키고 22℃의 비교적 높은 습기에서 7일 동안 방치한 후 사진을 찍었다(도 5(B) 참조). pCPP1250을 운반하는 균주를 침윤시킨 잎들 모두에서 조직 붕괴가 확실하게 나타났다. 7일 동안 배양된 잎에서, 단지 벡터만을 운반하는 균주가 반정도 침윤된 곳에서 침윤된 범위를 넘는 영역까지 확장된 전형적인 질병인 백화현상이 뚜렷하게 나타났다. pCPP1250을 운반하는 균주가 침윤된 잎의 한쪽 면에 있는 어두운 부분에 잎의 뒤틀림에 의하여 그림자가 생겼다. 도 5는 (왼쪽에서 오른쪽으로)Ea321, Ea321dspE△1521(pCPP2357, avrE 유전자 자리를 함유함), 또는 Ea321dspE△1521(pCPP2357avrE::Tn5uidA)을 접종하고 7일 후에 사진을 찍은 배의 반쪽을 도시한 것이다. 비록 증상은 야생형에 비하여 크게 감소되었지만, 괴사가 뚜렷하였으며 완전한 avrE 유전자 자리를 운반하는 dspE 균주가 접종된 과일의 웰에서는 분비물 방울을 관찰할 수 있었다. avrE의 파괴된 클론을 운반하는 dspE 균주가 접종된 과일에서는 증상이 나타나지 않았다.
본 발명은 과민성 반응 유발 단백질 또는 폴리펩티드를 코드하는 분리된 DNA 분자뿐만 아니라 식물에서 과민성 반응을 유도하는 분리된 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다.
과민성 반응을 유발시키는 단백질 또는 폴리펩티드는 식물에 질병 내성을 부여하고, 식물 생장을 향상시키고 또는 해충을 방제하는(control)데 사용될 수 있다. 이것은 비감염성(non-infectious) 형태로 식물 또는 식물 종자에 상기 과민성 반응 유발 단백질 또는 폴리펩티드를 적용하는 것을 포함하며, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 식물이나 상기 식물 종자에서 자란 식물에 대하여 질병 내성을 부여하고, 식물 생장을 향상시키고 또는 해충을 방제하는데 효과적인 조건하에서 적용된다.
식물에 질병 내성을 부여하고, 식물 생장을 향상시키고, 해충을 방제하기 위하여 식물 또는 식물 종자에 상기 과민성 반응 유발 단백질 또는 폴리펩티드를 적용시키는 다른 방법으로는 트랜스진(transgenic) 식물 또는 식물 종자를 이용하는 것을 들 수 있다. 트랜스진 식물의 이용시, 식물에서 과민성 반응을 유도하는 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 분자로 형질전환된 트랜스진 식물을 제공하고, 식물 또는 식물 종자로부터 자란 식물에 질병 내성을 부여하고, 식물 생장을 향상시키고 또는 해충을 방제하는데 효과적인 조건하에서 상기 식물을 성장시키는 단계를 포함한다. 또한, 대안적인 방법으로 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 분자로 형질전환된 트랜스진 병원성 식물 종자가 제공되고 이것을 토양에 심을 수 있다. 그런 다음 식물 또는 식물 종자에서 성장된 식물에서 질병 내성을 증가시키고, 식물 생장을 향상시키고 또는 해충을 방제하는데 효과적인 조건하에서 상기 식물을 자라게 한다.
본 발명은 하기의 SEQ.ID.No. 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 분리된 DNA 분자에 관한 것이다:
이 DNA 분자는 dspE 유전자로 공지되어 있다. 본 발명의 분리된 DNA 분자는 하기의 SEQ.ID.No. 2의 아미노산 서열을 갖는 식물 발병의 과민성 반응을 유발하는 단백질 또는 폴리페티드를 코딩한다:
이 단백질 또는 폴리펩티드는 약 198 kDa이며 8.98의 pI를 갖는다.
본 발명은 하기의 SEQ.ID.No. 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 분리된 DNA 분자에 관한 것이다:
이 DNA 분자는 dspF 유전자로 공지되어 있다. 본 발명의 분리된 DNA 분자는 하기의 SEQ.ID.No. 4의 아미노산 서열을 갖는 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리페티드를 코딩한다:
이 단백질 또는 폴리펩티드는 약 16 kDa이며 4.45의 pI를 가진다.
상기 과민성 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질의 단편은 본 발명의 범위에 포함된다.
적합한 단편은 다수의 방법으로 생성될 수 있다. 첫째, 본 발명의 유발인자 단백질을 코드하는 유전자의 서브클론은 유전자 단편을 서브클론하는 통상적인 분자적 수준에서의 유전자 조작으로 생성될 수 있다. 상기 서브클론은 시험관내에서 또는 생체내에서 박테리아 세포에 발현되어 하기에 기술된 절차에 따라서 유발인자의 활성을 시험하기 위해서 사용될 수 있는 작은 단백질 또는 펩티드를 생성시킨다.
다른 방법으로서, 유발인자 단백질의 단편은 키모트립신(chymotrypsin) 또는 스타필로코커스 프로테이나아제(Staphylococcus proteinase) A, 또는 트립신(trypsin) 등의 단백질분해 효소로 완전한 길이의 유발인자 단백질을 처리하여 생성될 수 있다. 다른 단백질분해 효소는 유발인자 단백질의 아미노산 서열을 기초로하여 다른 위치에서 유발인자 단백질을 절단할 가능성이 있다. 단백질 분해로 생성되는 일부 단편은 저항성의 활성 유발인자일 수 있다.
다른 접근 방법으로는, 단백질의 주요 구조에 대한 지식을 기반으로 한 것으로서, 유발인자 단백질 유전자의 단편은 단백질의 특정 부위을 나타내도록 선택된특정 프라이머(primers) 세트와 함께 PCR 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 그후, 이것들은 끝이 절단된(truncated) 펩티드 또는 단백질의 향상된 발현을 위하여 적합한 벡터로 클론될 수 있다.
또한 적합한 단편을 제조하기 위해서 화학적 합성법이 사용될 수 있다. 이러한 합성법은 유발인자가 생성되도록 공지된 아미노산 서열을 사용하여 수행될 수 있다. 대안적인 방법으로, 완전한 길이의 유발인자를 고온 및 고압에 처리하여 단편이 제조될 수 있다. 그후에 이들 단편들은 통상적인 절차(예를 들어, 크로마토그래피, SDS-PAGE 등)를 사용하여 분리될 수 있다
변형체는 또한 (또는 대안적으로) 예를 들어 폴리펩티드의 성질, 이차 구조 및 물에 대한 작용성(hydropathic nature)에 최소 영향을 미치는 아미노산을 제거 또는 첨가함으로써 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 단백질의 N-말단(N-terminal end)에 시그널 (또는 리더) 서열이 결합(conjugated)될 수 있는데, 이것은 단백질이 번역과 동시에 또는 번역 후에 전달되도록 지시한다. 또한 폴리펩티드의 합성의 용이성, 정제 또는 동정을 위해서 상기 폴리펩티드에 링커(linker) 또는 다른 서열이 결합될 수 있다.
적합한 DNA 분자들은 가혹한 조건하에서 뉴클레오티드 서열 SEQ.ID.No. 1을 포함하는 DNA 분자에 혼성화되는 것들이다. 가혹한 조건의 적합한 예로는 1M NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM EDTA, 0.1% 소듐 도데실 설페이트, 0.2% 피콜, 0.2% 폴리비닐피롤리돈, 0.2% 소혈청 알부민, 50㎛ g/ml E. coli DNA를 포함하는 배지에서 65℃에서 20 시간 동안 혼성화를 수행하는 것이다. 그러나, 이러한 가혹한 조건에서 뉴클레오티드 서열 SEQ.ID.No. 1 및 3을 포함하는 DNA 분자에 혼성화되는 DNA 분자중 어느것도 E. amylovora)(Wei, Z.-M. R.J.Laby, C.H. Zumoff, D.W.Bauer, S.-Y.He, A. Collmer, 및 S.V.Beer의 "Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora," Science 257:85-88(1992)에 기재되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용됨), Erwinia chrysanthemi(Bauer, et al., "Erwinia chrysanthemi HarpinEch: Soft-Rot Pathogenesis," MPMI 8(4):484-91(1995)에 기재되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용됨), Erwinia carotovora(Cui, et al.,"The RsmA Mutants of Erwinia carotovora subsp. carotovora Strain Ecc71 Overexpress hrpNEccand Elicit a Hypersensitive Reaction-like Response in Tabacco Leaves,"MPMI 9(7): 565-73 (1996)에 기재되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용됨), Erwinia stewartii(Ahmad, et al., "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize," 8th Int'l. Cong. Molec. Plant-Microb. Inter. July 14-19, 1996 and Ahmad, et al., "Harpin is not Necessary for the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize," Ann. Mtg. Am. Phytopath. Soc. July 27-31, 1996에 기재되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨), 및 Pseudomonas syringae pv. syringae(Cornell Research Foundation, Inc.의 WO 94/26782에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에서 참조로 인용됨)의 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드를 코드하는 핵산과 혼성화시키는 것과 동일하지 않아야 한다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 종래의 방법에 의하여 정제된 형태(바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 바람직하게는 90%의 순수한 형태)로 생성되는 것이 바람직하다. 일반적으로 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 생성되기는 하나 성장배지로 분비되지는 않는다. 분비되지 않는 단백질의 경우 상기 단백질을 분리하기 위하여 재조합 플라스미드를 가지는 숙주 세포(예를 들어 E. coli)를 성장시키고, 초음파 처리, 열처리, 또는 화학적 처리하고, 균등액을 원심분리하여 박테리아 파편을 제거한다. 그 후, 상층액을 연속적으로 암모늄 설페이트 침전물로 처리한다. 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 상층 분액은 적당히 크기의 덱스트란 또는 폴리아크릴아미드 컬럼에서 겔 여과하여 단백질을 분리한다. 필요에 따라 단백질 분액을 고성능 액체크로마토그래프(HPLC)를 사용하여 추가적으로 정제할 수 있다.
과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 코드하는 DNA 분자는 종래의 재조합 DNA 기술을 이용하여 세포에 도입될 수 있다. 일반적으로 이 방법은 DNA 분자가 이질적인(heterologous)(정상적으로는 존재하지 않는) 발현 시스템에 상기 DNA 분자를 삽입시키는 것을 포함한다. 상기 이질적인 DNA 분자는 적당한 센스 방향(sense orientation)과 정확한 리딩 프레임의 발현 시스템 또는 벡터에 삽입된다. 상기 벡터는 삽입된 단백질-코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 포함한다.
미국특허 제4,237,224호(Cohen and Boyer)는 제한 효소와 DNA 리가제에 의한 접합을 이용한 재조합 플라스미드 형태의 발현 시스템을 제조하는 것에 대하여 기재하고 있으며, 본 명세서에 참고로 인용된다. 그런 다음, 이들 재조합 플라스미드는 형질전환과 같은 방법에 의하여 도입되어 조직 배양액에서 성장하는 진핵생물 세포 및 원핵생물 유기체를 포함하는 단세포 배양액에서 복제된다.
또한 재조합 유전자는 우두(vaccina) 바이러스와 같은 바이러스에 도입될 수도 있다. 재조합 바이러스는 바이러스에 감염된 세포 내로 플라스미드를 도입함으로써 생성될 수 있다.
적절한 벡터로는 하기의 람다 백터 시스템 gt11, gtWES.tB, Charon 4와 같은 바이러스 벡터 및 pBR322, pBR325, pVAYC177, pACYC1084, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKC101, pBluescript Ⅱ SK +/- 또는 KS +/-와 같은 플라스미드 벡터, SV 40("Stratagene Cloning Systems" Catalog(1993) from Stratagene, La Jolla, Calif 참조, 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨), pQE, PIH821, pGEX, pET 시리즈(F.W. Studier et al., "Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes," Gene Expression Technology vol. 185(1990) 참조, 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨), 및 이들의 유도체가 사용될 수 있으며, 이들에 한정되는 것은 아니다. 재조합 분자는 형질전환, 특히 형질도입, 접합(conjugation), 이동(mobilization) 또는 전기천공법(electroporation)에 의하여 세포에 도입될 수 있다. DNA 서열은 본 명세서에 참고로 인용된 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, New York (1989)에 기재된 이 분야의 표준 클로닝 방법에 따라 벡터에 클론된다.
단백질-코딩 서열(들)을 발현하기 위하여 다양한 숙주-벡터 시스템이 사용될 수 있다. 1차적으로 상기 벡터 시스템은 사용된 숙주 세포와 적합성이 있어야 한다. 숙주-벡터 시스템은 하기의 시스템을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다: 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아; 효모 벡터를 포함하는 효모와 같은 미생물; 바이러스(예를 들어 우두 바이러스, 아데노 바이러스 등)에 감염된 포유류 세포 시스템; 바이러스(예를 들어 배쿨로바이러스)로 감염된 해충 세포 시스템; 및 박테리아로 감염된 식물 세포. 이들 벡터의 발현 인자들은 그것들의 강도와 특이성에 있어서 다양하다. 사용된 숙주-벡터 시스템에 따라 많은 적당한 전사 및 번역 인자들중 어느 것이라도 사용될 수 있다.
서로 다른 유전 신호 및 프로세싱 현상이 유전자 발현중 많은 단계(예를 들어 DNA 전사 및 mRNA 번역)를 조절한다.
DNA의 전사는 RNA 폴리머라제를 결합하게 하여 mRNA 합성을 향상시키는 DNA서열인 프로모터의 존재 여부에 의존한다. 진핵생물의 프로모터의 DNA 서열은 원핵생물의 프로모터의 서열과 다르다. 또한, 진핵생물 프로모터와 이에 수반되는 유전 신호는 원핵생물 시스템에서 인식되지 못하거나 기능을 나타내지 못할 수 있다. 또한 원핵생물 프로모터는 진핵생물 세포에서 인식되지 못하고 기능을 나타내지 못한다.
유사하게, 원핵생물에서의 mRNA의 번역은 진핵생물의 신호와 다른 적당한 원핵생물 신호의 존재에 의존한다. 원핵생물에서 효과적인 mRNA의 번역은 mRNA 상에 샤인-달가노("SD") 서열로 불리는 리보솜 결합 자리를 필요로 한다. 이 서열은 단백질의 아미노 말단 메치오닌을 코드하는 개시 코돈, AUG의 앞에 위치하는 mRNA의 짧은 뉴클레오티드 서열이다. 상기 SD 서열은 16S rRNA(리보솜 RNA)의 3' 말단에 상보적이며, rRNA와 이중나선을 형성함으로써 리보솜에 mRNA의 결합을 향상시켜 리보솜이 정확하게 위치하도록 한다. 유전자 발현을 최대화하는 방법은 Robert and Lauer, Method in Enzymology, 68:473(1979)에 기재되어 있으며, 본 명세서에 참고로 인용된다.
프로모터는 그것의 "강도(strength)"(즉, 전사를 향상시키는 능력)에 있어서 다양하다. 클론된 유전자를 발현시키기 위하여 강한 프로모터를 사용하여 높은 수준의 전사에 의하여 유전자 발현을 얻도록 함이 바람직하다. 사용된 숙주 세포 시스템에 따라 다수의 적절한 프로모터중 어느 것이라도 사용될 수 있다. 예를 들어 E. coli, 그것의 박테리오파아지, 또는 플라스미드에서 클로닝될 때, T7 파아지 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, rec A 프로모터, 리보솜 RNA 프로모터, 콜리파아지 람다 PR및 PL프로모터와 및 다른 lacUV5, ompF, bla, lpp 등과 같은 프로모터가 인접한 DNA 분절의 높은 수준의 전사를 유도하기 위하여 이용될 수 있다. 또한 재조합 DNA 또는 다른 합성 DNA 기술에 의하여 생성되는 하이브리드 trp-lacUV5(tac) 프로모터 또는 다른 E. coli 프로모터가 삽입된 유전자를 전사하기 위하여 사용될 수 있다.
박테리아 숙주 세포 균주 및 발현 벡터는 특이적으로 유도되지 않는다면 프로모터의 작용을 저해하도록 선택될 수 있다. 일정 작동에 있어서는 삽입된 DNA의 효과적인 전사를 위하여 특이적인 유도인자(inducer)의 부가가 필요하다. 예를 들어 lac 오페론은 락토오스 또는 IPTG(이소프로필티오-베타-D-갈락토사이드)의 결합에 의하여 유도된다. trp, pro 등과 같은 다양한 오페론은 서로 다른 조절하에 있다.
원핵생물에서 효과적인 유전자 전사 및 번역을 위해서 특이적 개시 신호를 필요로 한다. 이러한 전사 및 번역 개시 신호는 각각 합성된 유전자 특이적 mRNA 및 단백질의 양에 의하여 측정된 바와 같이 "강도"가 서로 다르다. 프로모터를 포함하는 DNA 발현 벡터는 다양한 "강한" 전사 및/또는 번역 개시 신호의 어떠한 조합이라도 포함할 수 있다. 예를 들어 E. coli에서 효과적인 번역은 리보솜 결합 자리를 제공하기 위한 개시 코돈("ATG")에서 5' 쪽으로 약 7-9 염기 앞에 위치하는 SD 서열을 필요로 한다. 이와 같이 숙주 세포 리보솜에 의하여 사용될 수 있다면 어떠한 SD-ATG 조합이라도 이용될 수 있다. 그러한 조합은 SD-ATG 조합에 한정되는 것은 아니며, 콜리파아지 람다의 cro 유전자 또는 N 유전자, 또는 E.coli 트립토판 E, D, C, B 또는 A 유전자로부터도 조합이 이루어질 수 있다. 또한 재조합 DNA 또는 합성 뉴클레오티드의 도입을 포함하는 다른 기술에 의하여 생성된 SD-ATG 조합도 이용될 수 있다.
과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 코드하는 분리된 DNA가 발현 시스템에 클로닝되면, 이것은 숙주 세포로 용이하게 도입된다. 이러한 도입은 벡터/숙주 세포 시스템에 따라 상기 언급된 형질전환과 같은 다양한 형태에 의하여 수행될 수 있다. 적당한 숙주 세포는 박테리아, 바이러스, 효모, 포유류 세포, 해충, 식물 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 식물에 질병 내성을 부여하고, 식물 생장을 향상시키며, 식물에 대한 해충을 효과적으로 방제할 수 있는 방법에 관한 것이다. 이들 방법들은 과민성 반응을 유도하는 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 질병 내성을 부여하고 생장을 향상시키고 해충을 방제하기에 효과적인 조건하에서 식물 또는 식물 종자의 일부 또는 전부에 비감염된 형태로 적용하는 것을 포함한다. 대안적인 방법으로 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드의 단편들이 식물에 적용되어 그러한 식물로부터 회수된 종자 그 자체가 식물에 질병 내성을 부여하고, 식물 생장을 향상시키고, 해충을 효과적으로 방제하도록 할 수 있다.
식물에 질병 내성을 부여하고, 식물 생장을 향상시키고 식물 또는 종자로부터 자란 식물에 대한 해충을 방제하기 위하여 식물 또는 식물 종자에 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 적용하는 다른 방법으로는 트랜스진 식물 또는 식물 종자가 이용될 수 있다. 상기 트랜스진 식물을 이용할 때, 과민성 반응을 유도하는 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 코드하는 DNA 분자로 형질전환된 트랜스진 식물을 제공하고, DNA 분자가 식물에 질병 내성을 부여하고, 식물 생장을 향상시키고, 해충을 방제하도록 하는 효과적인 조건하에서 상기 식물을 자라게 하는 단계를 포함한다. 대안적인 방법으로 과민성 반응을 유도하는 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 DNA 분자로 형질전환된 식물 종자를 토양에 심을 수 있다. 그후 DNA 분자가 식물에 질병 내성을 부여하고, 식물 생장을 향상시키고, 해충을 방제하기에 효과적인 조건하에서 심어진 종자로부터 식물이 자라난다.
과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질이 식물 또는 식물 종자에 적용된 본 발명은 다음 방법들을 포함하는 수많은 방법으로 구현될 수 있다: 1) 분리된 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질의 적용; 2) 질병을 야기하지 않으나 폴리펩티드 또는 단백질을 코드하는 유전자로 형질전환된 박테리아의 적용; 및 3) 일부 식물 종에는 질병을 야기시키고(그러나 그들이 적용된 식물 종에는 질병을 야기시키지 않음), 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 자연적으로 포함하는 박테리아의 적용.
본 발명의 한 구현예에 따르면 본 발명의 과민성 반응 유발인자 또는 단백질은 Erwina amylovora로부터 하기 실시예에서 기술된 infra로서 분리될 수 있다. 그러나, 본 발명의 분리된 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합적으로 생성되고 supra로 정제되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면 본 발명의 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질은 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 박테리아를 적용함으로써 식물 또는 식물 종자에 적용될 수 있다. 이러한 박테리아는 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 분비 또는 용출(exporting)시켜 유발인자가 식물 또는 식물 종자 세포에 접촉할 수 있게 하는 능력이 있어야 한다. 본 발명의 이와 같은 구현예에서 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질은 식물 또는 종자에 있는 박테리아에 의해서 생성되거나 또는 상기 식물 또는 식물 종자에 박테리아를 도입하기 전에 생성된다.
본 발명의 상기 박테리아 적용 형태의 한 예에서 박테리아는 질병을 야기시키지 않고 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 코드하는 유전자로 형질전환(재조합적)된다. 예를 들어, 과민성 반응 폴리펩티드 또는 단백질을 유발하지 않는 E. coli는 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 코드하는 유전자로 형질전환된 후 식물에 적용될 수 있다. 또한 E. coli를 제외한 다른 박테리아 종도 본 발명의 이러한 구현에 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 박테리아 적용 형태의 또 다른 구현예에 따르면 박테리아가 질병을 야기시키여 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 코드하는 유전자를 포함한다. 이러한 박테리아의 예는 상기에서 기술하지 않았다. 그러나, 이 구현예에서 이들 박테리아는 박테리아에 의해서 전염되는 질병에 민감하지 않은 식물 또는 식물 종자에 적용된다. 예를 들어 Eriwinia amylovora는 사과 또는 배에서 질병을 야기시키나 토마토에서는 질병을 야기시키지 않는다. 그러나, 이러한 박테리아는 토마토에서 과민성 반응을 유발할 것이다. 따라서 본 발명의 이러한 구현에 따르면 Eriwinia amylovora는 토마토 식물 또는 종자에 질병을 야기시키지 않으면서 생장을 촉진시키거나 또는 해충을 방제하기 위해서 적용될 수 있다.
본 발명의 방법은 다양한 식물 또는 식물 종자를 처리하여 질병 내성을 부여하고, 생장을 향상시키며, 해충을 방제하기 위하여 사용될 수 있다. 적당한 식물로는 쌍덕잎 식물 및 외떡잎 식물을 포함한다. 자주개자리, 쌀, 밀, 보리, 호밀, 목화, 해바라기, 땅콩, 옥수수, 감자, 고구마, 강낭콩, 완두, 치코리, 상추, 꽃상추, 캐비지, 양배추, 비트, 파스닙, 순무, 콜리플라워, 브로콜리, 무, 시금치, 양파, 마늘, 가지, 후추, 샐러리, 당근, 스쿼시, 호박, 서양호박, 오이, 사과, 배, 메론, 감귤, 딸기, 포도, 나무딸기, 파인애플, 대두, 담배, 토마토, 수수(sorghum), 및 사탕수수(sugarcane)와 같은 농작물이 특히 유용하다. 적당한 장식용 나무의 예로는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 세인트폴리아(Saintpaulia), 페츄니아, 펠라고늄, 포인세티아, 국화, 카네이션, 및 지니아를 들 수 있다.
질병 내성을 부여하는 데 있어서, 본 발명의 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드를 사용하게 되면, 감염에 대하여 절대적인 면역은 가져올 수 없으나, 질병의 심한 정도는 경감되고 증후 전개도 지연된다. 손상된 수(lesion number), 손상된 크기 및 곰팡이성 병원체의 포자 형성의 정도는 모두 감소된다. 질병 내성을 부여하는 이 방법은 이전에는 치료할 수 없었던 질병을 치료하고, 비용 때문에 분리되어 치료하지 못했던 질병을 조직적으로 치료하기 위한 효과적인 방법으로, 감염성 약제 또는 환경학적으로 해로운 물질의 사용을 피할 수 있다.
본 발명에 따른 식물에 병원체 내성을 부여하는 방법은 바이러스, 박테리아, 및 곰팡이를 비롯한 다양한 병원체에 대한 내성을 부여하는 데 유용하다. 바이러스 중에서도 특히 토바코 모자이크 바이러스 및 토마토 모자이크 바이러스에 대한 내성은 본 발명에 의하여 얻어질 수 있다. 박테리아 중에서는 Pseudomonas solancearum, Pseudomonas syringae pv. tabaci, 및 Xanthamonas campestris pv. pelargonii 에 대한 내성이 본 발명에 의하여 얻어질 수 있다. 곰팡이 중에서는 Fusarium oxysporum 및 Phytophthora infestans과 같은 곰팡이에 대한 내성을 가지는 식물이 제조될 수 있다.
식물 생장을 향상시키기 위한 본 발명의 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드의 용도와 관련하여 다양한 형태의 식물 생장 향상 또는 증진이 얻어졌다. 이것은 식물 생장이 종자에서 시작되는 만큼 빠르게 나타나거나, 식물의 생존 후반기에 나타날 수 있다. 예를 들어 본 발명에 따른 식물 생장은 더 큰 수확률, 생성된 종자의 양 증가, 발아된 종자의 비율 증가, 식물 크기 증가, 더 큰 생물양(biomass), 더 많고 더 큰 과일, 더 이른 과일 착색, 및 더 이른 과일과 곡식의 성숙을 포함한다. 결과적으로 본 발명은 상당한 경제적 이익을 제공한다. 예를 들어 이른 발아와 성숙은 짧은 생장 시기가 그 장소에서 자라게 하는 것을 저해하는 지역에서 농작물이 자랄 수 있도록 한다. 종자 발아율의 증가는 농작물 입목(stands)을 향상시키고, 더 효율적인 종자 사용이 되게 한다. 증가된 수확량, 증가된 크기, 및 향상된 생물양 생성은 일정 토지로부터 더 큰 수입을 올리는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 또 다른 특징은 식물에 대한 해충을 효과적으로 방제하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어 본 발명에 따른 해충 방제는 과민성 반응 유발인자가 적용된 식물과 해충이 접촉하는 것을 방지하고, 상처를 주어 그러한 식물로부터 해충이 떨어지도록 하고, 그러한 식물에 근접한 해충들을 죽이고, 그러한 식물에서의 해충 애벌레 사육을 방지하고, 해충이 숙주 식물을 이식시키지 못하도록 하고, 이식시키는 해충이 피토톡신(phytotoxin)을 방출하지 못하도록 하는 등의 방법에 의하여 식물에 직접적인 해충 피해를 방지하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 해충 감염으로 야기되는 식물에 질병 피해를 방지하기 위한 것이다.
본 발명은 다양한 해충에 대하여 효과적이다. 유럽의 옥수수 나무좀(borer)은 옥수수(덴트(dent) 및 스위트 콘)의 주요 해충이나, 그린, 왁스, 리마콩(lima beans) 및 식용 소이빈, 후추, 감자, 및 토마토와 많은 잡초를 비롯한 200 여종의 식물에서 자란다. 다양한 식물성 농작물을 손상시키는 부가적인 해충 애벌레를 공급하는 해충으로는 사탕무 행렬구더기(beet armyworm), 캐비지 자벌레, 큰 담배밤나방의 유충, 폴 행렬구더기(fall armyworm), 다이아몬드 무늬가 있는 나방, 캐비지 근 구더기, 양파 구더기, 시드 콘 구더기, 피클벌레(메론벌레), 후추 구더기, 토마토 요충, 및 구더기를 포함한다. 이러한 해충 해충의 집단들은 총괄적으로 세계적인 식물 생산에 대한 가장 경제적으로 중요한 해충의 집단을 나타낸다.
과민성 반응을 유도하는 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질의 적용을 포함하는 본 발명의 방법은 잎, 줄기, 뿌리 등을 비롯한 전부 또는 일부의 식물의 처리시 다양한 절차를 통하여 수행될 수 있다. 이것은 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 식물에 침윤시키는 것을 포함할 수 있으나 꼭 필요한 것은 아니다. 적절한 적용방법으로는 유발인자 적용이 일어날 시기에 고압 또는 저압 분사법, 주입법 및 입의 마모법을 포함한다. 본 발명에 따르는 식물 종자 또는 프로파글루(propagule)를 처리할 때(예를 들어 커팅(cuttings)), 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질은 저압 또는 고압 분사, 코팅, 침지 또는 주입법에 의하여 적용될 수 있다. 식물 또는 식물 종자와 상기 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 효과적으로 접촉시킬 수 있는 다른 적당한 적용방법이 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 실시될 수 있다. 본 발명의 과민성 반응 유발인자로 일단 처리되면, 종자가 천연 또는 인조 토양에 심어질 수 있고 종래의 방법에 의하여 재배되어 식물을 생산한다. 식물이 본 발명에 따라 종자로부터 증식한 후에 상기 식물은 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드 또는 전체 유발인자를 하나 이상 적용하여 식물에 질병 내성을 부여하고, 식물 생장을 향상시키고, 식물에 대한 해충을 방제하도록 한다.
상기 본 발명에 따른 과민성 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질은 단독으로 또는 다른 물질과 혼합되어 적용될 수 있다. 추가적으로 상기 과민성 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질은 다른 물질과 분리하여 서로 다른 시간에 식물에 적용될 수도 있다.
본 발명의 구현예의 적용방법에 따라 식물 또는 식물 종자를 처리하기 위한 적당한 조성물은 담체내의 과민성 반응을 유도하는 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 적당한 담체로는 물, 수용액, 슬러리 또는 건조된 분말을 포함한다. 이 구현예에서 상기 조성물은 500nM 이상의 단편을 포함한다.
필요한 것은 아니지만, 상기 조성물은 비료, 살충제, 살균제, 살선충제(nematacide) 및 이들의 혼합물을 비롯한 부가적인 첨가제를 포함할 수 있다. 적당한 비료로는 (NH4)2NO3를 들 수 있다. 적절한 살충제로는 말라티온(Malathion)을 들 수 있다. 살균제로는 캅탄(Captan)이 유용하게 사용된다.
다른 적당한 첨가제로는 완충제, 습윤제, 코팅제, 및 마모제를 포함한다. 이들 물질들은 본 발명의 방법을 용이하게 하기 위하여 사용되는 것이다. 또한 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질은 종래의 종자 제제(formulation) 및 점토와 폴리사카라이드를 비롯한 처리물질과 함께 식물 종자에 적용될 수 있다.
트랜스진 식물 및 트랜스진 종자를 사용하는 본 발명의 다른 구현예에서 과민성 반응을 유도하는 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질은 상기 식물이나 종자에 일반적으로 도입될 필요는 없다. 그 대신에 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 코드하는 DNA 분자로 형질전환된 트랜스진 식물이 이 분야의 공지된 방법에 의하여 생성된다.
상기 기재된 벡터는 재조합 DNA를 기계적으로 전달하는 마이크로피펫을 사용하여 식물세포에 직접 미세주입될 수 있다(Crossway, Mol. Gen. Genetic, 202:179-85(1985) 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 인용된다). 상기 유전 물질은 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 식물세포에 전달될 수 있다(Krens, et al., Nature, 296:72-74(1982) 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 인용된다).
병원체에 대한 내성을 부여하는 유전자로 식물 세포를 형질전환하는 다른 방법으로 숙주 세포의 입자 충격법(particle bombardment; biolistic transformation라고도 함)이 있다. 이것은 몇몇 방법중 하나로 수행될 수 있다. 그 첫 번째로는 세포에서 불활성 또는 생물학적으로 활성인 입자를 추진시키는(propelling) 것을 포함한다. 이 방법은 미국특허 제4,945,050호, 제5,036,006호 및 제5,100,792호(Sanford et al.)에 기재되어 있으며, 상기 특허들은 본 명세서에 참고로 인용된다. 일반적으로 이들 방법은 세포의 외부 표면을 관통하여 그 내부에 도입되기에 효과적인 조건하에서 세포에서 불활성 또는 생물학적으로 활성인 입자를 추진시키는 것을 포함한다. 불활성 입자가 사용될 때, 벡터는 이질적인 DNA를 포함하는 벡터로 입자를 코팅하여 세포로 도입될 수 있다. 또한, 상기 표적 세포는 벡터로 둘러싸여 상기 벡터가 입자의 웨이크(wake)에 의하여 세포내로 도입되도록 할 수 있다. 생물학적으로 활성인 입자(예를 들어, 벡터 또는 이종구조의 DNA를 포함하는 건조된 박테리아 세포)도 식물 세포내로 추진될 수 있다.
또 다른 도입 방법으로 미니셀, 세포, 리소좀 또는 다른 융합 가능한 지질-표면 물질 중 어느 하나와 원형질체(protoplast)를 융합시키는 방법이 있다(Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:1859-63(1982) 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 인용된다).
DNA 분자는 전기천공법에 의하여 식물 세포내로 도입될 수 있다(Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5284(1985) 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 인용된다). 이 방법에서 식물 원형질체는 발현 카세트를 포함하는 플라스미드의 존재하에서 전기천공된다. 높은 필드(field) 강도의 전기 충격은 생체막을 가역적으로 투과성이 있도록 하여 플라스미드가 도입되게 한다. 전기 천공된 식물 원형질체는 세포벽을 재형성하고, 분열하고, 재생한다.
DNA 분자를 식물 세포로 도입시키는 또 다른 방법은 상기 유전자로 미리 형질전환된 Agrobacterium tumefaciens 또는 A. rhizogenes를 포함하는 식물 세포를 감염시키는 것이다. 이 분야의 적당한 조건하에서 상기 형질전환된 식물 세포는 가지(shoot)와 뿌리를 형성하고 식물로 더 자란다. 일반적으로 이 과정은 박테리아의 현탁액을 식물조직에 접종하고 항생제가 존재하지 않는 25-28℃의 재생(regeneration) 배지에서 48 내지 72 시간동안 상기 조직을 배양한다.
아그로박테리아는 그람-음성류 라이조비애세아(Rhizobiaceae)의 대표적인 종이다. 이 종들은 근두암종(A. tumefaciens) 및 모근(hairy root) 질환(A. rhizogenes)의 원인이 된다. 근두암종 종양과 모근내의 식물 세포는 오파인(opines)이라 알려진 아미노산 유도체를 생성시키도록 유도되며, 상기 오파인은 박테리아에 의해서만 대사 분해된다. 오파인을 발현시키기 위한 박테리아 유전자는 키메라 발현 카세트에 대한 간편한 대조 요소(control elements)를 제공한다. 또한 오파인의 존재여부에 대한 분석은 형질전환된 조직을 동정하는 데 사용될 수 있다.
이종구조의 유전자 서열은 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드 또는 A. rhizogenes의 Ri 플라스미드에 의하여 적당한 식물 세포에 도입될 수 있다. 상기 Ti 또는 Ri 플라스미드는 아그로박테리아에 의하여 감염된 식물 세포에 전달되어 식물 게놈에 안정적으로 통합된다(J. Schell, Science, 237:1176-83(1987), 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨).
형질전환된 후에 상기 형질전환된 식물 세포는 재생산되어야 한다.
배양된 원형질체로부터의 식물 재생산은 Evans et al., Handbook of Plant Cell, Vol. 1: (MacMillan Publishing Co., New York, 1983); 및 Vasil I.R.(ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. Ⅰ, 1984, and Vol. Ⅲ(1986)에 기재되어 있으며 상기 문헌들은 본 명세서에 참고로 인용된다.
실질적으로 모든 식물들은 사탕수수, 사탕무, 목화, 과일나무, 및 콩과식물의 모든 주요한 종들을 비롯한 배양 세포 또는 조직에서 재생산될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
재생산 수단은 식물에 종에 따라 다양하나, 일반적으로 형질전환된 원형질체의 현탁액 또는 형질전환된 외식편(explant)을 포함하는 페트리 접시가 1차적으로 제공된다. 유합(癒合) 조직이 형성되고 가지가 유합 조직에서 유도된 다음 뿌리가 형성된다. 대안적인 방법으로, 배(embryo) 형성이 상기 유합 조직에서 유도될 수 있다. 이들 배는 자연적으로 형성된 배로서 발아하여 식물을 형성한다. 상기 배양액은 다양한 아미노산 및 옥신과 시토키닌과 같은 호르몬을 포함하는 것이 일반적이다. 또한 옥수수 및 자주개자리와 같은 종들에 대하여는 특히 글루타민산과 프롤린을 배지에 첨가하는 것이 유리하다. 효과적인 재생산은 배지, 유전자형, 배지에 의존할 것이다. 이들 세가지 변수가 조절 가능하다면 재생산은 재현 가능하고 반복 가능하다.
상기 발현 카세트는 트랜스진 식물에 안정적으로 도입된 후에 성 혼성화에 의하여 다른 식물에 옮겨진다. 다수의 표준 육종(breeding) 방법이 혼성화되는 종에 따라 선택되어 사용될 수 있다.
이들 타입의 트랜스진 식물이 생산되면, 상기 식물 그 자체는 식물에 질병 내성, 식물 생장 증가, 및/또는 해충 방제능을 부여하는 과민성 반응 유도성 단편을 코드하는 유전자가 존재하도록 종래의 방법에 의하여 재배될 수 있다. 대안적인 방법으로 트랜스진 종자 또는 프로파글루(예를 들어 cuttings)는 트랜스진 식물에서 회수된다. 그런 다음 상기 종자는 토양에 심어지고 종래의 방법에 따라 재배되어 트랜스진 식물을 생산한다. 이 트랜스진 식물은 식물에 질병 내성을 부여하고, 식물 생장을 향상시키고, 해충을 방제하기에 효과적인 조건하에서 심은 트랜스진 종자로부터 증식된다. 특정 이론에 구속되고자 하는 것은 아니나, 질병 내성, 생장 증가, 및/또는 해충 방제와 같은 것은 RNA에 의하여 매개될 수 있으며, 또한 폴리펩티드 또는 단백질의 발현에 기인될 수도 있다.
트랜스진 식물 또는 식물 종자가 본 발명에 따라 사용될 경우, 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질이 적용되는 식물 및 종자를 처리하는 데 사용된 것과 동일한 물질로 상기 트랜스진 식물 또는 식물 종자를 추가적으로 처리할 수 있다. 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 이들 다른 물질들은 고압 또는 저압 분사법, 주입법, 코팅법, 및 침지법을 비롯한 상기 기재한 방법에 의하여 트랜스진 식물 및 식물 종자에 적용될 수 있다. 유사하게 식물이 트랜스진 식물 종자에서 증식된 후에 상기 식물은 하나 또는 그 이상의 과민성 반응 유발인자 폴리펩티드 또는 단백질이 적용되도록 처리하여 식물 내성을 부여하고, 생장을 향상시키고 해충을 방제하도록 할 수 있다. 그러한 식물들은 또한 종래의 식물 처리제(살충제, 비료 등)로 처리될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 주요 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드를 이들 단백질 또는 폴리펩티드를 불활성화 또는 파괴하거나 이들에 결합하는 분자를 디자인하는데 사용하는 것이다. 이러한 유발인자는 식물 병원체, 특히 Erwinia amylovora에서 발견되기 때문에, 병원체 자체가 상기 디자인된 분자에 의하여 스스로 중화되어 질병 및/또는 과민성 반응을 예방 또는 개선시킬 수 있다. 질병을 예방하는 분자의 예로는 모노클론 또는 폴리클론 항체와 같이 본 발명의 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 이들의 결합 부위에 대항하여 증가되는 항체가 있다. 질병을 예방하는 분자의 다른 예로는 항체 단편, 반쪽-항체(half-antibody), 혼성 유도체, 프로브, 및 다른 분자 구조체가 있다.
모노클론 항체 생성물은 당 기술 분야에 공지된 방법에 의하여 효과적이어 질 수 있다. 기본적으로, 이 방법은 다음과 같은 과정을 수반한다: 먼저, 생체내 또는 시험관내에서 대상 항원(예를 들면, 본 발명의 유발인자 단백질이나 폴리펩티드, 또는 이들의 결합 부위)을 미리 면역접종한 포유동물(예를 들면, 생쥐)의 지라에서 면역 세포(림프구; lymphocyte)를 얻은 다음, 항체를 분비하는 림프구를 (생쥐의) 골수종(myeloma) 세포 또는 형질전환 세포와 융합시킨다. 이는 세포 배지에서 무한정 복제되어 영구적인 면역글로불린 분비 세포를 만들어낼 수 있다. 이리하여 얻어지는 융합 세포 또는 하이브리도마(hybridoma)를 배양하고, 여기서 얻어지는 콜로니를 원하는 모노클론 항체 군집에 대하여 스크린한다. 이러한 항체를 만들어내는 콜로니를 클론하고, 생체내 또는 시험관내에서 이들을 배양하여 다량의 항체를 만들어낸다. 이러한 세포 융합에 대한 이론적 근거 및 실질적인 방법은 본 명세서에 참고로 인용된 Kohler and Milstein, Nature 256:495(1975)에 기재되어 있다.
포유류의 림프구는 본 발명의 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 이들의 결합 부위를 동물(예를 들면, 생쥐)의 생체내에 면역접종하면 면역된다. 이러한 면역접종은 필요에 따라 몇 주 간격으로 반복 실시하여 충분한 양의 항체를 얻어낸다. 최종의 항원을 증가시킨 다음, 동물을 죽여 지라 세포를 제거한다.
포유류의 골수종 세포 또는 세포 배양시 무한정으로 복제될 수 있는 다른 융합 짝의 융합은 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 또는 다른 융합 제제를 사용하는 공지된 방법을 사용하면 효과적이다(Milstein and Kohler, Eur.J. Immunol. 6:511(1976) 참조, 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨). 이러한 영구적인 세포―여기서 세포로는 쥐과 동물의 것이 바람직하지만, 포유류 세포로부터 유도된 것일 수도 있으며, 쥐로 제한되는 것은 아님―는 몇몇 영양소의 이용에 필요한 효소가 결핍되고 빠르게 성장할 수 있으며 양호한 융합 가능성을 갖는 것으로 선택된다. 이런 세포는 다수가 당업자에게 공지되어 있으며, 다른 것들은 하기에 기재하였다.
또한, 폴리클론 항체의 증식 방법도 공지되어 있다. 일반적으로, 이러한 항체는 본 발명의 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 이들의 결합 부위를 먼저 혈액을 채취해 예비 면역 혈청을 얻은 뉴질랜드 흰토끼의 피하에 투여하여 증가시킬 수 있다. 항원은 사이트 당 전체 부피 100 ㎕씩 여섯 곳의 상이한 사이트에 투여될 수 있다. 투여되는 각각의 물질은 합성 계면활성제 쥬반트(ajuvant) 플루론산 폴리올, 또는 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 후 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 분쇄된 아크릴아마이드 겔을 함유할 것이다. 투여 2주일 후, 토끼에서 혈액을 채취하고, 6주에 한번씩 3회에 걸쳐 정기적으로 동일한 항원을 투여한다. 그런 다음, 각각의 투여 10일 후에 혈청 샘플을 수집하고 해당하는 항체를 포획하는 항원을 사용하는 친화성 크로마토그래피를 이용하여 폴리클론 항체를 회수한다. 궁극적으로는 150 ㎎/Kg의 펜토바비탈(pentobarbital) Ⅳ을 사용하여 토끼를 우량화(euthenize)하는 것이다. 폴리클론 항체 증식에 관한 상기의 방법 및 그 밖의 방법은 본 발명에 참고로 인용된 E. Harlow, et. al., etitors, Antibiodies: A Laboratory Manual(1988)에 기재되어 있다.
온전한 항체 전체를 사용하는 방법 외에도, 본 발명의 방법에는 이러한 항체의 결합 부위가 사용될 수 있다. 이러한 결합 부위는 Fab 단편, F(ab')2단편, 및 Fv 단편을 포함한다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 절단법(proteolytic fragmentation procedure)과 같은 종래의 방법으로 제조될 수 있다(J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 98-118(N.Y. Academic Press 1983) 참조, 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨).
또한, 본 발명의 방법은 천연에서 발견되었거나 재조합 DNA법 또는 다른 생물학적 분자적 방법에 의하여 합성 제조된 프로브 또는 리간드를 사용할 수도 있다. 적당한 프로브 또는 리간드는 본 발명의 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 이들의 결합 부위에 결합하는 분자들이다.
무독성(avr) 유전자(Vivian, A., et al., Microbiology, 143:693-704(1997); Leach, J. E., et al., Annu. Rew. Phytopathol., 34:153-179(1996); Dangl, J. L., "Bacterial Pathogenesis of Plants and Animals: Molecular and Cellular Mechanisms", in Current Topics in Microbiology and Immunology, Dangl. J. L., ed.(Springer, Berlin), Vol. 192, pp. 99-118(1994) 참조, 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)는 이에 상응하는 내성(R) 유전자를 가지는 식물에서 질병내성을 유도하는 방어 반응을 일으키는 신호를 전달한다. 일반적으로, arv 유전자는 병원체내에서 다른 병원체로부터 코스미드 라이브러리(cosmid library)를 발현시키고 제한된 숙주 범위를 스크린하여 분리한다. 통상적으로, arv 유전자는 많은 박테리아성 작은 병원체 Pseudomonas syringae pathovar(pv.) tomato의 arvE 유전자 자리(locus)를 포함하는 동일-품종 레벨에서 숙주 특이성의 음성 결정인자로 여겨져 왔으나(Kobayashi, D. Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:157-61 (1989), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨), 몇몇은 pathovar-종 또는 종-종 수준으로 숙주 범위를 제한한다(Whalen, M. C., et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 85:6743-47(1988); Swarup, S., et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 5:204-13(1992), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨). gae pathova(pv.) arvE를 포함하는 많은 arv 유전자는 조절된 Hrp이다. arvE 및 arvPphE는 hrp 유전자에 물리적으로 결합되어 있다(Mansfield, J., et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 7:726-39(1994), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨).
전이 발현되는 경우, arvE 유전자 자리는 모든 품종에 대하여 독성을 가지는 대두의 박테리아성 마름병(bacterial blight)을 유발하는 P. syringae pv. glycinea를 만든다(Lorang, J. M., et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 8:49-57(1995), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨). 이 유전자 자리는 두 개의 수렴 전사 단위(convergent transcription unit)를 포함하며, 그중 하나는 추정되는 σ54프로모터 뒤에 위치하며 다른 하나는 대체적인 시그마 인자 HrpL에 의하여 양성 조절되는 많은 hrp 및 avr 유전자의 업스트림에서 발견되는 서열인 hrp 박스 뒤에 위치한다(Innes, R. W., et al., J. Bacteriol.,175:4859-69(1993); Shen, et al., J. Bacteriol., 175:5916-24(1993); Xiao, Y., et al., J. Bacteriol., 176:3089-91(1994), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨). 두 전사체의 발현에는 HrpL이 요구된다. avrE 유전자 자리는 P. syringae pv. tomato 균주 DC3000을 제외한 균주 PT23의 토마토 잎에 정량적으로 독성을 부여한다(Lorang, J. M., et al., Mol. Plant-Mcrobe Interact., 8:49-57(1995); Lorang, J. M., et al., Mol. Plant-Mcrobe Interact., 7:508-515(1994)).
따라서, 식물 병원체내의 arv 유전자는 이러한 병원체에 감염되지 않는 식물내의 질병내성 유전자에 결합한다. 식물 병원체내의 avr 유전자에 대한 본 발명의 DNA 분자 상동성의 관점에서, 이들 DNA 분자는 상응하는 식물의 질병내성 유전자를 동정하는데 사용될 수 있다. 이러한 동정은 종래의 식물 육종법(plant breeding technique)에 의하여 수행될 수 있으며, 이 방법은 스크린시 avr 유전자를 운반하는 병원체를 식물에 접종하여 유전을 탐지하고 내성의 훼손을 동정하는 것이다. 동정되면, 내성 유전자는 최근에 그 효과가 확실하게 입증된 두 가지 방법중 하나를 사용하여 분리될 수 있다(Staskawicz et al., Science, 68:661-67(1995), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨). 이 방법은 위치 또는 유전자 지도를 기준으로 클로닝하는 방법과 삽입에 의한 돌연변이의 유발 또는 트랜스포존 태깅(transposon tagging)하는 방법이다. 거기에는 DspE-비반응성 품종(dspE를 함유하는 Pseudomonas에 감염되기 쉬움; dspE에 반응하는 테스트된 4종류의 대두 품종)이 전혀 존재하지 않을 수 있으므로, 유전자 지도를 기준으로 하는 클로닝(다른 유전자에 대한 내성 유전자의 위치를 동정하기 위해서는 감염 가능성과 내성 라인 사이의 교차가 요구됨)은 적당하지 않을 수 있다. 바람직한 접근법은 스크린시에 dspE 유전자 또는 단백질을 사용하여 해당하는 내성 유전자의 트랜스포존 태깅에서 기인되는 dspE 생성물의 소실된 라인을 동정하는 삽입에 의한 돌연변이 유발법일 수 있다.
실시예 1 - 재조합 DNA 방법
Sambrook 등이 고안한 방법(Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A Laboratory manual,(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)(1989), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)에 따라 DNA를 분리하고 제한 효소로 분해하여 연결시킨(ligation) 후, Escherichia coli를 형질전화시켜 콜로니 만들고 혼성화(hybridization)하여 P. syringae pv. tomato DC3000 유전자 라이브러리를 스크린하였다. 이 라이브러리는 pCPP47(Bauer, D. W., et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 10:369-379(1997), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)을 사용하여 조립하였다. 그러나 여기서는 E. coli DH5 및 E. coli DH5α가 DNA 클론에 대한 숙주로 사용되었으며, pBluescript 또는 pBC 플라스미드(Stratagene, La Jolla, CA)가 벡터(vector)로 사용되었다. 본 명세서에 참고로 인용된 Bauer, D. W. in "Molecular Genetics of Pathogenicity of Erwinia amylovora: Techniques, Tools and Their Applications", (Ph. D. Thesis), Cornell University, Ithaca, NY(1990)에 기재된 바에 따라 전기천공법을 이용하여 E. amylovora를 형질전환시켰다. pRK2013(Friguski, D., et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 76:1648-1652(1979), 본 명세서에 인용 참조됨)을 사용하여 플라스미드를 E. amylovora 및 P. syringae로 옮겨놓았다.
실시예 2 - 뉴클레오티드 염기서열 결정(sequencing) 및 분석
E. amylovora Ea321 균주의 dsp 영역의 뉴클레오티드의 염기서열(sequence)은 pCPP430(Beer, S. V., et al., in Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions, Hennecke, H., et al., eds. (Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands), pp. 53-60(1991), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)의 서브클론을 사용하여 결정하였다. avrE 유전자 자리의 뉴클레오티드 염기서열은 pCPP2357의 서브클론을 사용하여 결정하였다. pCPP2357의 서브클론은 avrE 유전자 자리를 함유하는 부분 염기서열에서 발견되며 P. syringae pv. syringae의 hrpRS 오페론(operon)과 혼성화된 P. syringae pv. tomato DC3000의 게놈 코스미드 라이브러리에서 선택된 클론이다. 뉴클레오티드 염기서열 결정은 Cornell Biotechnology Sequencing Facility on Model 377 Sequencer(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA)에서 수행되었다. GCG software package, version 7.1(Genetics Computer Groups, Inc., Madison, WI) 및 DNASTAR(DNASTAR, Inc., Madison, WI)의 프로그램을 사용하여 염기서열을 조립, 분석, 및 비교하였다. BLAST(Altschul, S. F., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:5509-5513(1990) 참조, 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)을 사용하여 데이터 베이스를 검색하였다.
실시예 3 - DspE 발현 및 E. coli 내의 DspE
확장된 폴리링커(polylinker)를 가지는 PINⅢ113-A2 유도체인 pCPP50(Duffaud, G. D., et al., in Methods in Enzymology, Wu, R., et al., eds.(Academic Press, New York), 153:492-50(1987) 참조, 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)에 클로닝하여 dspE 오페론 두 벌(piece)을 pCPPR59를 얻었다. lac 오퍼레이터에 의하여 조절되는 E. coli의 Ipp 프로모터를 사용하여 pCPP1259 내에서의 발현을 유도하였다. 오페론의 시작 부위에서 dspE의 중간 부분에 있는 BamHI 자리까지 연장되는 중간 클론인 pCPP1244를 분리하였다. pCPP1259 및 pCPP1244를 함유하는 E. coli DH5α 균주를 37℃ LB에서 OD620이 0.3이 될 때까지 배양하였다. 그런 후에, 이소프로필티오-β-D-갈락토사이드를 1 mM로 첨가하고 OD620이 0.5가 될 때까지 세포를 추가 배양하였다. 세포를 두 배로 농축한 다음 용해시켜 상기에 언급된 바와 같이 7.5%의 아크릴아마이드를 사용하여 SDS-PAGE에 걸었다(Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)(1989), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨). 비교용으로 pCPP50을 함유하는 세포를 포함시켰다. 쿠마시 염색(Coomassie staining)을 하여 단백질을 가시화하였다.
실시예 4 - dspE의 결실에 의한 변이유발
StuⅠ 및 SmaⅠ을 사용하여 pCPP1237내 dspE의 5'HindⅢ-BamHI 분절에서 1554 bp를 결실시켰다. 그런 후에, pCPP1241을 생산하는 E. coli SM10λpir을 숙주로 사용하여 변이가 유발된 클론을 자살(suicide) 벡터 pKNG101(Kaniga, K., et al., Gene, 109:137-42(1991) 참조, 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)에 삽입하였다. 이어서, 상기에 기재된 마커 축출법(marker eviction)(Bogdanove, A. J., et al., J. Bacteriol., 178:1720-30(1996), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)을 사용하여 Δ1554로 지정된 돌연변이를 E. amylovora 균주에 전이시켰다. 크레노우 단편(Kenow fragment)으로 브런트된(blunted) 두 개의 BstEⅡ 자리를 사용하여 3'HindⅢ 단편에서 1521 bp를 결실시켰다. Δ1521로 지정된 이 돌연변이를 상기 E. amylovora 균주에 전이시켰다.
실시예 5 - 병원성 분석
E. amylovora에 대하여, ㎖당 5 × 108의 콜로니 형성 단위를 가지는 세포 현탁액을 피펫을 사용하여 미성숙 바틀렛 배(Bartlett pear)의 열매를 자른 웰(well)에 옮기거나 조나막 사과(Jonamac apple)에 접종하고 코톤이스터(cotoneaster)를 쏘아 상기에 기재된 바와 같이 분석하였다(Beer, S. V., in Methods in Phytobacteriology Interact., Klement, Z., et al., eds.(Adaemiai Kiadoo, Budapest), pp. 373-374(the"1990"); Aldwinckle, H. S., et al., Phytophathology, 66:1439-44(1976), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨). P. syringae pv. glycinea에 대하여, 하기 HR 분석을 위하여 8 × 105cfu/㎖의 박테리아 현탁액을 2주된 대두 묘목(Glycine max, cultivar Norchief)의 첫번째 잎 패널에 침윤시켰다. 그런 다음, 투명한 플라스틱 봉지로 식물을 덮고 22℃, 형광 하에서 5 내지 7일간 배양하였다. 잎의 괴사(necrosis) 및 백화(chlorosis)를 계측하였다.
실시예 6 - HR 분석
담배 잎 패널(Nicotiana tabacum L. 'xanthi')에 상기에 기재된 바와 같이(Wei, Z. M., et al., Science, 257:85-88(1992); Bauer, D. W., et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 4:493-99(1991), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨) 박테리아 세포 현탁액을 침윤시켰다. 담배에 대해서는 2주된 대두 묘목(두 번째 잎이 나오고 있는)의 첫 번째 잎에 박테리아 세포 현탁액을 침윤시켰다. 24 내지 28 후, 실험대에서 HR(조직 붕괴)을 계측하였다. E. amylovora 균주는 pH 6.8, 5 mM의 KPO4완충용액으로 현탁하고 P. syringae 균주는 10 mM의 MgCl2으로 현탁하였다.
실시예 7 - GUS 분석
다음과 같은 세 가지 방법으로 각각 세포를 처리하였다:
1) 세포를 0.9 내지 1.0 OD620이 될 때까지 LB에서 배양함; 2) 세포를 0.5 OD620이 될 때까지 LB에서 배양한 후, 세척하여 0.2 OD620이 될 때까지 hrp 유전자를 유도하는 최소 배지(Hrp MM; Huynh, T. V., et al., Science, 345:1374-77(1989), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)로 재현탁한 다음, 0.9 내지 1.0 OD620가 될 때까지 21℃, LB에서 36시간 동안 배양함.
3) 세포를 0.5 OD620이 될 때까지 LB에서 배양한 후, 세척하고 pH 6.5, 5 mM의 KPO4완충용액으로 2배로 농축하여 배를 반으로 자른 신선한 웰로 옮기고 병인성 분석을 위하여 36시간 동안 배양함.
Jefferson(Jefferson, R. A., Plant Molecular Biology Reporter, 5:387-405(1987), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)에 따라 세포의 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase; GUS)의 활성을 분석하였다. LB 또는 Hrp MM 내의 세포 50 ㎕를 기질로서 2 mM 4-메틸움벨리페릴 β-D-글루쿠로나이드(4-methylumbelliferyl β-D-glucuronide)를 함유하는 200 ㎕의 GUS 추출 완충용액(50 mM의 NaHPO4, pH 7.0, 10 mM β-메르캡토에탄올, 10 mM Na2EDTA, 0.1% 쇼듐 라우릴 사코신, 0.1% Triton X-100)과 혼합하여 37℃에서 100분 동안 배양였다. 배 열매 내의 세포에 대하여, #4 코르크 보어(cork borer)를 사용하여 웰을 둘러싸고 있는 조직을 제거하고 pH 6.8, 5 mM의 KPO4완충용액으로 균질화하였다. 200 ㎕의 균질액을 기질을 함유하는 800 ㎕의 GUS 추출 완충용액과 혼합하여 상기에서와 같이 배양하였다. Na2CO3를 전체 부피 2 ㎖의 0.2 M 최종 농축액에 첨가하여 반응을 중단시켰다. TKO 100 Mini-Fluorometer(Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA)를 사용하여 형광을 측정하였다. 희석 플레이팅하여 모든 샘플에 대한 세포 농도를 측정하고, Miller법(Miller, J. H., A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)에 따라 형광 측정값을 혼성화된 기질의 pmol/108cfu/min로 전환시켰다.
실시예 8 - E. amylovora의 "질병 특이성"(dsp) 영역은 6.6 kb이며, 두 개의 유전자 오페론으로 이루어진다.
HR-유도 능력을 제외한 병인성을 없애는 상기 트랜스포존 삽입부(Steinberger, E. M., et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 1:135-44(1988), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)의 유전자 지도작성은 CFBP1430 균주(Barny, A. M., et al., Mol. Microbiol., 4:777-86(1990), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)로서 보고된 Ea321 균주 내 hrpN 유전자의 다운스트림에 위치하는 "질병 특이성"(dsp) 영역의 존재를 뒷받침한다. Ea321에서 얻은 hrpN의 다운스트림에 위치하는 대략 15 kb의 DNA 서열을 결정하여 몇 개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)(ORF 도 1)이 존재함을 밝혀내었다. 작은 ORF를 가지는 6.6 kb의 오페론 내에서 하나의 ORF는 dsp 삽입부가 위치하는 영역에 걸쳐있었다. 이들 두 ORF는 dspE 및 dspF로 지정하고 오페론은 dspE로 지정하였다. dspE는 GGAACCN15CAACATAA 서열(개시 코돈의 업스트림에 위치하는 처음 70 bp)의 뒤에 위치하며, 이 서열은 HrpL에 의존하는 프로모터 유사 서열 또는 E. amylovora의 "hrpbox"(Kim, J.H., et al., J. Bacteriol., 179:1690-97(1997); Kim, J.H., et al., J. Bacteriol.,179:1690-97(1997), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)와 일치하며 P. syringae hrp의 hrp 박스 및 avr 유전자(Xiao, Y., et al., J. Bacteriol., 176:3089-91(1994), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)와 매우 유사하다. depF의 다운스트림은 A/T가 풍부한 DNA이며 그 뒤에는 lvsR 군의 조절 유전자(Caldwell, A. L. ＆ Gulig, P. A., J. Bacteriol., 173:7176-85(1991), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨) 중 하나인 Salmonella Typhimurium 유전자 spvR과 매우 유사한 ORF(ORF7)가 위치한다. dspE 오페론의 업스트림에는 Hrp에 의하여 조절되는 유전자인 hrpW이 존재하며, 이는 새로운 하핀(harpin)을 코딩한다.
dspE에서 유래되는 생성물은 1838개의 아미노산 잔기를 함유하며 친수성이다. 예상된 198 kD의 분자량은 E. coli에서의 발현으로 확인하였다(도 2). 단지 dspE의 5' 반쪽만을 함유하는 중간 클론의 발현으로는 해당하는 예상된 이동성 단백질이 얻어졌으며, 이는 그 단백질의 N-말단쪽 반이 독립적으로 안정한 도메인을 형성할 수 있음을 의미한다. 16 kD의 분자량을 가지며 산성(pI, 4.45) 이고 C-말단에 양쪽성 α-헬릭스를 가지면서 α-헬릭스가 우세하리라 예상되는 DepF는 동물-병원체 박테리아독성 인자 샤페론(chaperon)(Wattiau, P., et al., Mol. Microbiol., 20:255-62(1996), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)과 물리적으로 유사하다.
실시예 9 - dspE는 화염 마름병에 요구된다.
Ea321 및 Ea273(각각 약한 독성 및 강한 독성을 가지는 균주) 내에서 dspE 내에 두 개의 프레임내에 결실(도 1)을 만들었다. 전자(Δ1554)는 아미노산 잔기 G203내지 G720에 해당하며 후자(Δ1521)는 아미노산 잔기 T1064내지 V1570에 해당한다. 미성숙된 배 열매(도 3), 사과 발아, 또는 코톤이스터 발아에 접종하는 경우, 각각의 결실은 두 균주 모두의 능력을 없애 화염 마름병을 유발하였다. Δ1554는 dspE의 중첩되는 5' 반쪽을 운반하는 클론과 상보적이었으며, 이는 그 단백질의 N-말단이 안정한 도메인을 형성한다는 것을 의미하는 것이다(도 1 및 도 3).
실시예 10 - dspE 오페론은 정량적이고 균주 의존적인 방식으로 담배에서의 E. amylovora에 의한 HR 유도에 관여하며 대두에서의 E. amylovora에 의한 HR 유도에는 요구되지 않는다.
dsp 영역의 트랜스포존 삽입체는 담배에서의 E.amylovora의 HR 유도 능력을 감소시킨다(Barny, A. M., et al., Mol. Microbiol., 4:777-86(1990), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨). Ea321 및 Ea273의 dspEΔ1554 돌연변이 균주 현탁액의 일련의 희석액을 담배 잎의 정상 타입의 모체를 따라 침윤시켜, HR 유도에 대한 dspE의 기능을 평가하였다(도 3). 모든 균주는 HR을 유도할 수 있었으나, Ea321 dspEΔ1554는 세포 기본 단위에 대하여 유도 조직 붕괴에 있어 정상 타입보다 대략 10배 효과적이었다. 그러나, HR-유도 활성에 있어 Ea273 및 Ea273 dspEΔ1554간에 인식될 수 있을 정도의 차이점은 없었다. Ea321dspEΔ1554은 애크미(Acme), 센테니얼(Centennial), 하라소이(Harasoy), 및 노르치프 대두 잎(Norchief soybean leaf)에서 정상 타입의 HR을 유도하였다(도 3).
실시예 11 - dspE 오페론은 Hrp에 의하여 조절된다.
프로모터가 없는 uidA 유전자 구조체를 Δ1554 돌연변이(도 1)를 정상 타입의 E. amylovora 균주에 삽입하는데 사용되는 pCPP1241내의 dspE 단편의 다운스트림에 클로닝하였다(이 구조체는 내부 결실을 가지는 3'-절단된 dspE 유전자로 이루어짐). 얻어진 플라스미드 pCPP1263을 Ea321 및 Ea273에 옮겨놓았다. 완전한 dspE의 복사체를 간직하는 플라스미드 통합체를 함유하는 병원성 균주 및 돌연변이된 dspE 천연 복사체를 함유하는 비병원성 균주를 분리하였다. 모든 균주에 대하여 Luria Bertani 배지(LB) 및 Hrp MM에서의 GUS 활성을 분석하고, 병원성 균주에 대하여 배 열매에서의 활성을 분석하였다. Hrp MM에서 배양된 균주에서는 높은 활성이 얻어졌으나, LB에서는 높은 활성이 얻어지지 않았다. Hrp MM에서의 발현 정도는 양성 대조예로서 사용된 hrcV-uidA 융합체("G73", Wei, et al., J. Bacteriol., 177:6201-10(1995), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)의 발현 수준과 같았다. 야생형 및 dspE 돌연변이 존재 하에서 dspE-uidA 융합체의 발현 정도에는 그다지 큰 차이가 나타나지 않았으며, 이는 dspE가 자가조절되지 않기 때문이다. hrp MM에서 Ea321 및 Ea273의 hrpL 돌연변이체 내에서의 dspE-uidA 융합체의 발현은 HrpL + 균주의 발현 수준보다 두 등급정도 낮았다. Ea273 및 이들의 유도체에 대한 데이터를 도 4에 도시하였다.
실시예 12 - dspE 및 dspF는 Pseudomonas syringae pv. tomato의 avrE 유전자 자리에 위치하는 유전자에 유사성을 가진다.
유전자 데이터베이스의 BLAST(Altschul. S. F., et al., J. Mol. Biol., 215:403-10(1990), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨) 검색으로 P. syringae pv. tomato의 avrE 유전자 자리(Lorang, J. M., et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 8:49-57(1995), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)의 부분 서열에 대한 dspE의 유사성을 밝혀내었다. P. syringae pv. tomato DC3000의 게놈 DNA의 코스미드 라이브러리를 만들고, avrE 유전자 자리를 함유하며 hrp 유전자 크러스터에 중첩되는 클론을 분리하였다(pCPP2357). avrE 유전자 자리의 완전한 뉴클레오티드 서열을 결정하여 상기에서 전사 단위 Ⅲ로 지정된 오페론에서 dspE와 유사함을 확인하였으며(195 kD, 1795 아미노산 단백질과 30% 동일), 상기에서 전사 단위 Ⅳ로 지정된 병렬하는 반대 오페론의 말단에서 dspF와 유사함을 확인하였다(도 1). 이들 유전자를 avrE 및 avrF로 지정하였다. DspE 및 AvrE 일련의 C-말단 반(DspE의 V845로부터)은 N-말단의 반(26% 동일성)보다 잘 보존되어 있는 것으로 나타났다(33% 동일성). AvrE는 ATP-결합 단백질 또는 GTP-결합 단백질("P-루프"; Saraste, M., et al., Trends Biochem. Sci., 15:430-34(1990), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)에 보존되어 있는 모티브(아미노산 잔기 A450내지 T457)를 함유한다. 이 모티브는 DspE 내에 보존되어 있지 않지만, AvrE 내에서의 이들의 기능에 대한 중요성은 명백하지 않다. 아미노산의 동일성은 일련의 DspF 및 AvrF 전체에 걸쳐 동일하게 분포되어 있으며, AvrF는 DspF의 예상되는 물리적 특성을 공유한다. 오페론을 완성하는 avrF의 업스트림은 유전자 데이터베이스내의 서열과 유사성이 전혀 없는 2.5 kb의 유전자이다.
실시예 13 - dspE 오페론은 무독성 유전자 자리로 작용한다.
dspE 오페론을 nptⅡ 프로모터의 다운스트림에 위치하는 pML 122(Labes, M., et al., Gene, 89:37-46(1990), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨) 내로 클로닝하고, 이 구조체 pCPP1250을 P. syringae pv. glycinea race 4에 옮겨놓았다. pML 122를 함유하는 대조 균주를 제외하고, 이리하여 얻어진 균주는 양호한 상태에서 배양된 애크미, 센테니얼, 하라소이, 및 노르치프 대두 잎에서 HR을 유도하였으며, 대조 균주가 접종 지점으로부터 확산되는 괴사 및 백화를 유발하는 반면, pCPP1250을 함유하는 race 4는 질병의 증후를 유발시키지 못하였다(도 5).
실시예 14 - avrE는 dspE 돌연변이체와 상보적이다.
코스미드 pCPP2357을 Ea321 dspE 돌연변이 균주 Δ1554 및 Δ1521로 옮겨놓았다. 얻어진 전이 접합체(transconjugant)는 병원성이었으나 독성은 낮았다. avrE 유전자 내에 트랜스포존 삽입체를 함유하는 pCPP2357을 운반하는 Ea321dspEΔ1521은 병원성을 나타내지 않았으며, 이는 관찰된 상보성(complementation)이 avrE 특이성이었음을 뒷받침한다(도 1 및 도 5). Ea273dspΔ1521 돌연변이체의 전이 접합체에서도 동일한 결과가 관찰되었다.
30종에 걸쳐 박테리아성 avr 유전자가 발견되었다. avr 유전자 과다는 "진화상의 경쟁(evolutionary tug-of-war)"(Dangl, J. L., in Bacterial Pathogeneesis of Plant and Animals: Molecular and Cellular Mechanisms(Current Topics in Microbiology and Immunology), Dangl, J. L., ed.(Springer, Berlin), 192:99-118(1994), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨), 반복적인 선택 과정, R 유전자에서 기인되는 반대선택(counterselection), 및 Flor에 의하여 근원적으로 밝혀진 avr 유전자의 변형 또는 치환에서 기인된 것으로 간주된다. Flor는 "평행 진화(parallel evolution)하는 동안, 숙주 및 기생체는 그들의 유전자 체계를 상보적으로 발달시켜 왔다"는 가설을 제창하였다(Flor, H. H., Adv. Genet., 8:29-54(1956), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨). 그러나, 단지 (PT23 균주 내에 avrE를 포함하는) 몇몇 avr 유전자만이 그들 본연의 유전자 바탕에서 독성 또는 병원체 적합성에 대한 검출 가능한 역할을 수행하며(Lorang, J. M., et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 7:508-15(1994); Kearney, B. , et al., Nature, 346:385-86(1990); Swarup, S., et al., Phytopathology, 81:802-808(1991); De Feyter, R. D., et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 6:225-37(1993); Ritter, C., et al., Mol. Plant-Micribe Interact., 8:444-53(1995), 이 문헌들은 본 명세서에 참고로 인용됨), 이러한 숙주의 범위를 제한하는 많은 인자들의 병원체 게놈 내에 보존하는 선택력은 아직도 미스테리로 남아있다. 현재에는 몇몇 Avr 단백질이 Hrp 경로를 통해 식물 세포로 전달된다(Gopalan, S., et al., Plant Celli, 8:1095-1105(1996); Tang, X., et al., Science, 274:2060-63(1996); Scofield, S. R., et al., Science, 274:2063-65(1996); Leister, R. T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:15497-15502(1996); Van Den Ackerveken, G., et al., Cell, 87:1307-16(1996), 이 문헌들은 본 명세서에 참고로 인용됨)고 밝혀져 있다. 따라서, 이들 몇몇 단백질은 숙주 표적과 (효소 생성물을 통해 직접 또는 간접적으로) 상호 작용하여 기생생활을 촉진하는 근본적인 독성 인자일 수 있다. 이러한 표적의 돌연변이(감염 가능성이 낮기 때문에 선택됨)뿐 아니라 Avr 단백질을 인식하는 R 단백질의 진화는 새로운 Avr 단백질 또는 변형된 Avr 단백질의 획득 또는 진화를 강제하여 avr 유전자의 증식을 초래한다. 점증적으로, 이러한 공동진화 과정(coevolutionary process)은 정량적으로 avr 유전자를 향하는 추이로 진행되어 결정적인 중요한 역할보다 병원체 형성에 과다한 효과를 유도하는 것 같다(Alfano, J. R., et al., Plant cell, 8:1683-1696(1996), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨).
dspE 및 avrE 상동체는 상당한 정도 차를 가지면서 질병에 관여한다고 밝혀졌다. 무독성 유전자 자리는 속(屬)을 초월해(transgenerically) 병원성 오페론을 대체할 수 있으며, dspE의 무독성 기능은 병원체 속을 넘어 확장된다. 이러한 발견은 avr 유전자가 질병에 대한 1차 기능을 가진다는 가설을 뒤받침 한다. 또한, 이는 앞에서 언급된 avr 유전자 증식에 관한 공동진화 모형을 뒤받침하고 확장시키며, 다년생 식물의 불마름병 및 그 밖의 박테리아성 질병의 억제와 관련된 실질적인 의미를 가진다.
우리는 상기 모형으로부터 특정한 인자의 병원성에 대한 상대적인 기여가 병원체, 특히 이들 숙주와의 공동 진화 정도에 관한 유전적 역사를 부분적으로 반영하고 있음을 예측할 수 있다. dspE는 병원성에 요구된다; avrE는 정량적으로 균주에 의존하는 독성 표현형질을 가진다. 앞에서 예상한 바와 일치하여, 해당하는 R 유전자의 진화 및 병원체 독성 인자에 대한 표적의 변형은 진화된 E. amylovora를 함유하는 목본 숙주에서보다 보통 P. syringae pathovar에 의하여 감염되는 초본 숙주에서 시간에 걸쳐 더 자주 발생해 왔고 더 널리 확대된 것 같다. 선택적 또는 부가적으로, 보다 최근에는 P. syringae에 의한 avrE 획득보다 E. amylovora의 의한 (진화 또는 수평 전달을 통한) dspE 획득이 상대적으로 더 많이 발생해 왔으며, 이는 과다한 기능의 변형 또는 전개를 초래하는 공동진화에 대해 시간이 적게 소요되게 하였다.
또한, 우리는 상기 모형으로부터 독성 인자가 특정한 숙주 상에서 검출되지 않도록 개별적으로 적응된 병원체 사이에 보존될 수 있음을 가정할 수 있다. 서던 블럿 혼성화(Southern blot hybridization)에서 도출된 결론은 P. syringae pv. glycinea가 avrE 상동성을 함유하고 있음을 암시하며, 이는 이러한 가설을 뒤받침 한다. 마찬가지로, P. syringae pv. tomato에서 얻어지는 대두 품종 특이성 유전자 avrA 및 avrD의 상동성이 P. syringae pv. glycinea에 존재한다(Kobayashi, D. Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:157-161(1989), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨).
기능에 대한 dspE 및 avrE의 상동성 및 능력은 avr 유전자 증식 모형을 속을 초월하여 확대시킨다. 다중 인자 독성을 향하는 진화의 주요 성분은 이종 병원체로부터 얻어지는 새로운 독성 인자를 코딩하는 유전자를 치유할 수 있으며, 이들을 전개시킬 수 있는 기능적으로 전세계적인(cosmopolitan) 독성 인자 전달 시스템(및 인자 자체에 대한 전반적인 Hrp-경로 표적 신호)을 보존할 수 있다. 사실, 많은 avr 유전자가 플라스미드 상에 존재하며 병원체 균주 사이에 널리 퍼져있다(Dangl, J. L., in Bacterial Pathogenesis of Plant and Animal: Molecular and Cellular Mechanisms(Current Topics in Microbiology and Immunology), Dangl. J. L., ed.(Springer, Berlin), 192:99-118(1994), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨), 개개의 hrp 유전자는 보존되며 서로 교환 가능하다(Arlat, M., et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 4:593-601(1991); Laby, R. J., et al., Mol. Plant-Microbe Interact., 5:412-19(1992), 이 문헌들은 본 명세서에 참고로 인용됨). 별개의 속에 존재하는 dspE 및 avrE의 존재는 조상으로부터 전래된 유전자 자리의 수평 전달을 암시하며, dspE 및 avrE가 상동하며 hrp와 연결된다 하더라도, 이러한 유전자의 속을 초월한 기능은 E. amylovora 및 P. syringae내의 Hrp 경로가 진화를 거치면서 DspE 및 AvrE에서 발생된 차이에 대하여 반응하지 않았음을 의미한다. 상동성이 전혀 없는 Avr 같은 단백질은 식물 병원성 박테리아 속에 넘어 작용할 것이다.
dspE 유전자 자리의 무독성 작용이 Hrp-경로에 의존하는지를 확인해야 한다. 식물과 박테리아의 상호작용에서의 dspE 및 dspF 유전자 생성물의 위치를 결정하는 것이 중요할 것이다. 동물-병원성 박테리아에서 기인되는 독성 인자의 타입 Ⅲ 분비에 요구되는 샤페론에 대한 DspF(및 AvrF)의 물리적인 유사성(Wattiau, P., et al., Mol. Microbiol., 20:255-62(1996), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)은 흥미를 자아내며 식물 병원성 박테리아에서는 새로운 것이다. 이러한 샤페론에 대한 필요는 분비 경로를 표적하는 것(Woestyn, S., et al., Mol. Microbiol., 20:1261-71(1996), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨) 외의 다른 역할에서 기인된 것 같다: 샤페론은 단백질을 안정화시키거나 분비에 적합한 형태로 단백질을 유지시키며, 조기 중합되거나 다른 단백질과 회합되는 것을 막아줄 수 있다. 아마도, DspF는 DspE에 결합하여(또한, AvrF는 AvrE에 결합함) 이들의 큰 크기 및 가능한 멀티도메인 특성에서 기인되는 후기 단백질에 보다 중요할 수 있는 유사한 역할을 할 것이다.
dspE 오페론은 E. amylovora내에 존재하는 언급된 무독성 유전자 자리이다. Xanthomonas campestris로부터 얻어지는 avrRxv의 상동체(Whalen, M. C., et al., Proc. Natl. Acad. USA, 85:6743-47(1988), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)가 dspE 오페론 근처에서 발견되었다(Kim, J. F., in Molecular Characterization of Novel Harpin and Tow hrp Secretory Operon of Erwinia amylovora, and a hrp Operon of E. chrysanthemi(Ph.D. Thesis), Cornell University, Ithaca, NY (1997). 불마름병에 대한 단일 유전자(R-유전자에 의하여 매개되는) 내성은 보고되지 않았으나, 사과류에 대한 E. amylovora 균주의 차별적인 독성이 발견되었다(Norelli, J. L., et al., Phytopathology, 74:136-39(1984), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨). 또한, 역으로 몇몇 E. amylovora 균주는 Rubus spp.에는 감염되지만, 사과류 식물에는 감염되지 않는다(Starr, M. P., et al., Phytopathology, 41:915-19(1951), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨). dspE 오페론 및 avrRxc 상동체 또는 잠재된 다른 유발인자중 어느 것이 이러한 특이성에 작용하는가를 결정해야 한다.
대두에서 P. syringae pv. glycinea에서 발현되는 경우에는 dspE 오페론이 방어 반응을 유발할지라도, E. amylovora에 의하여 유발되는 대두의 HR에는 필요하지 않으며, 이들 중 어느 것도 hrpN을 필요로 하지 않는다(도 3). E. amylovora는 반드시 dspE 또는 hrpN 중 하나 이상을 가져야 만이 대두에서 HR을 유도할 수 있다. 그러나, 정제된 하핀은 대두에서 HR을 유도하지 못하는 것으로 관찰되었으며, 이는 E. amylovora가 이 식물에 의하여 인식되는 다른 avr 유전자를 간직함을 암시한다.
대두에서의 E. amylovora 무독성 신호의 인식은 불마름병 내성 사과 및 배나무를 조작하는데 유용할 수 있는 하나 또는 그 이상의 R 유전자가 존재함을 의미한다. 사과의 붉은 곰팡이병(scab) 병원체인 Venturia inaequalis 에 대한 R-유전자 매개 내성(Williams, E: B., et al., Ann. Rev. Phytopathol., 7:223-46(1969), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)및 불마름병 억제용 아태신 E(attacin E)를 가지는 사과의 성공적인 형질전환(Norelli, J. L., et al., Euphytica, 77:123-28(1994), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨)은 이러한 연구의 가능성을 증명한다. 사과의 붉은 곰파이병에 대한 R 유전자 매개 내성은 이 분야를 정복하였으나(Parisi, L., et al., Phytopathology, 83:533-37(1993), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨), 질병에 대한 dspE 요구는 dspE-특이성 R 유전자의 상대적인 내구성을 조력한다(Kearney, B., et al., Nature, 346:385-86(1990), 이 문헌은 본 명세서에 참고로 인용됨). 아라비돕시스(Arabidopsis)와 같이 유전자적으로 다루기 쉬운 식물의 병원체내에서 dspE 및 다른 E. amylovora 유전자를 무독성 스크린하면 후보 R 유전자 풀(pool)를 확장시킬 수 있으며 그들의 분리를 촉진할 수 있다. 유사한 접근법이 목본 식물의 다른 질병에 효과적인 R 유전자를 분리하는데 사용될 수 있다. 또한, dspE 오페론은 avrE 유전자 자리와 상동하다고 제안된 만큼 광범위하게 보존된다면, 해당하는 R 유전자는 목본 및 초본 식물 모두의 다양한 병원체에 대하여 효과적이 수 있을 것이다.
천연(변성되지 않은) DspE 단백질은 과민성 반응 유발인자와 유사한 방법(즉, 외인성 적용법)에 의해서는 HR(즉, 과민성 반응) 유도 능력을 테스트할 만큼 충분한 양으로 생성되지 않는다. 따라서, 세포를 함유하지 않은 분리된 물질로서 식물에 적용되는 경우에 E. amylovora의 dspE가 HR을 유도한다는 것은 누구도 확인하지 못하였다. 그러나, 단백질을 코딩하는 유전자가 다른 박테리아(작은 dspF 유전자를 많이 가지는), 예를 들면 보통 몇몇 식물에서 질병을 유발하는 Pseudomonas syringae에 옮겨지는 경우, 이를 수용한 박테리아는 더 이상 질병을 유발하지는 않았으나, 그 대신 HR을 유도한다. 이에 대한 메커니즘은 확실하게 알려져 있지 않으며, 다만 박테리아 세포가 실질적으로 DspE 단백질을 살아있는 식물 세포에 주입시켜 식물의 세포 파괴(즉, HR)를 유발하는 메커니즘(이를 뒷받침하는 증거가 있음)과 관련되어 있을 것이라고 추측할 뿐이다. 아마도, DspE 단백질이 살아있는 식물 세포 내에 존재하는 경우, 이것이 식물에 곤충 및 병원체에 대한 내성의 전개를 신호로 보낼 수 있다.
동물 병원체로부터 얻어지는 공지된 샤페론 단백질에 대한 DspF의 물리적 특징의 유사성을 근거하면, 다소 작은 이러한 단백질이 DspF의 샤페론일 수 있다고 여겨진다. 동물 병원체내의 샤페론은 세포질에서 분비되는 특정 단백질에 결합한다. 그들은 단백질 분비에 요구되지만 그들 자체가 분비되는 것은 아닌 것 같다. 이러한 증거는 샤페론이 분비 조직으로 분비되는 단백질을 표적화하는데 직접적으로는 관여하지 않음을 의미한다. 그 보다도, 샤페론은 세포질 내에서 단백질을 안정화시키고 이들이 조기 응집되거나 다른 단백질(예를 들면, 숙주의 세포막을 통해 직접 전달되는 박테리아 단백질)과 회합되는 것을 방지하는 역할을 할 수 있다.
dspE 유전자는 avrE를 제외한 공지된 다른 유전자에 대한 유사성이 전혀 없다. DspE의 효소적 기능(즉, HR을 유도하는 이차 분자의 생성을 초래하는 기능)은 본 발명에서 제외될 수 있다. 사실, avr 유전자 생성물은 확산성 유발인자 분자의 합성을 촉매하여 간접적으로 HR을 유도하는 것으로 알려져 있다. 그러나, Pseudomonas 종에서 발현되는 dspE 오페론의 HR 유도 기능에 대한 가장 간단한 설명은 dspE 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이 박테리아에서 분비되어 HR을 유도하는 식물의 방어 반응이 간접적으로 개시되는 식물 세포로 전달되며, 이 과정은 DspE 단백질을 인식하는(수용체로 작용하는) 특정한 내성 유전자 생성물에 의하여 매개된다는 것이다. 사실, 박테리아에서 발현되는 경우 Hrp 분비 기구에 의존하는 4개의 avr 유전자가 식물 세포 내에서 속을 초월하여 발현되는 경우에 HR을 유도하는 것이 밝혀졌다. 이들 중 하나가 이에 해당하는 내성 유전자 생성물과 직접적으로 상호 작용하는 단백질을 코딩하는 것으로 밝혀졌다. 궁극적으로, 이러한 단백질의 실질적인 적용 및 식물 방어 유발인자로서 이들을 코딩하는 유전자를 규정짓기 위해서는 DspE가 직접 또는 간접적으로 이차 분자를 통하여, 식물 세포의 내부 또는 내부 중 어느 곳에서 식물 방어 반응을 유도하는지를 결정해야 한다.
본 발명은 예시를 목적으로 상세히 설명되어 있으며, 첨부된 특허청구범위에 한정된 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 이 분야의 당업자에 의하여 본 발명의 변형이 이루어질 수 있다.
서열표
(1) 일반 정보
(i) 출원인: 코넬 리서치 파운데이션 인코포레이티드
(ii) 발명의 명칭: ERWINIA AMYLOVORA에서 유래된 과민성 반응 유발인자,
그 용도, 및 코딩 유전자
(iii) 서열의 갯수: 5
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: Nixon, Hargrave, Devans ＆ Doyle LLP
(B) 번지: clinton Square, P.O. Box 1051
(C) 시: Rochester
(D) 주: New York
(E) 국가: U.S.A.
(F) 우편번호: 14603
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 형태: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM Pc 호환가능
(C) 작동 시스템: Pc-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi) 현 출원 자료:
(A) 출원번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(vii) 우선권 자료:
(A) 출원번호: US 60/055,105
(B) 출원일: 1997. 8. 06
(viii) 대리인 정보:
(A) 이름: Goldman, Michael L.
(B) 등록번호: 30,727
(C) 참고/서류 번호: 19603/1662
(ix) 통신 정보:
(A) 전화: (716) 263-1304
(B) 팩스: (716) 263-1600
(2) SEQ ID NO:l에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 5517개의 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 사슬형태: 단일
(D) 토폴로지: 선상
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(xi) 서열 기재: SEQ ID NO:l:
(2) SEQ ID NO:2에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1838개의 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 사슬형태:
(D) 토폴로지: 선상
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 기재: SEQ ID NO:2:
(2) SEQ ID NO:3에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 420개의 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 사슬형태: 단일
(D) 토폴로지: 선상
(ii) 분자 형태: DNA(게놈)
(xi) 서열 기재: SEQ ID NO:3:
(2) SEQ ID NO:4에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 139개의 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 사슬형태:
(D) 토폴로지: 선상
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 기재: SEQ ID NO:4:
(2) SEQ ID NO:5에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29개의 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 사슬형태: 단일
(D) 토폴로지: 선상
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 기재: SEQ ID NO:5:
GGAACCNNNN NNNNNNNNNN NCAACATAA

Claims (43)

  1. 과민성 반응 유발 단백질 또는 폴리펩티드를 코드하는 분리된 DNA 분자에 있어서,
    상기에서 분리된 DNA 분자는 (a) SEQ. ID. No 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA 분자, (b) SEQ. ID. No 2 또는 4의 아미노산을 포함하는 단백질을 코드하는 DNA 분자, (c) 가혹 조건하에서 SEQ. ID. No 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자에 혼성화하는 DNA 분자 및 (d) 상기 (a), (b) 및 (c)의 DNA 분자에 상보적인 DNA 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 분리된 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 분자가 SEQ. ID. No 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 DNA 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 DNA 분자가 SEQ. ID. No 2 또는 4의 아미노산을 포함하는 단백질을 코드하는 분리된 DNA 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 DNA 분자가 가혹 조건하에서 SEQ. ID. No 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자에 혼성화하는 분리된 DNA 분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 DNA 분자가 상기 (a), (b) 및 (c)의 DNA 분자에 상보적인 분리된 DNA 분자.
  6. 제1항에 따른 DNA 분자로 형질전환된 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 DNA 분자가 적절한 센스(sense) 방향 및 정확한 리딩 프레임을 가지는 발현 벡터.
  8. 제1항에 따른 DNA 분자로 형질전환된 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 숙주 세포가 식물 세포 및 박테리아 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
  10. 제8항에 있어서, DNA 분자가 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  11. 제1항에 따른 DNA 분자로 형질전환된 트랜스진(transgenic) 식물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 식물이 자주개자리, 쌀, 밀, 보리, 호밀, 목화, 해바라기, 땅콩, 옥수수, 감자, 고구마, 강낭콩, 완두, 치코리, 상추, 꽃상추, 캐비지, 양배추, 비트, 파스닙, 순무, 콜리플라워, 브로콜리, 무, 시금치, 양파, 마늘, 가지, 후추, 샐러리, 당근, 스쿼시, 호박, 서양호박, 오이, 사과, 배, 메론, 감귤, 딸기, 포도, 나무딸기, 파인애플, 대두, 담배, 토마토, 수수(sorghum), 및 사탕수수(sugarcane)로 이루어진 군으로부터 선택되는 트랜스진 식물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 식물이 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 세인트폴리아(Saintpaulia), 페츄니아, 펠라고늄, 포인세티아, 국화, 카네이션 및 지니아로 이루어진 군으로부터 선택되는 트랜스진 식물.
  14. 제1항의 DNA 분자로 형질전환된 트랜스진 식물 종자.
  15. 제14항에 있어서, 상기 식물 종자가 자주개자리, 쌀, 밀, 보리, 호밀, 목화, 해바라기, 땅콩, 옥수수, 감자, 고구마, 강낭콩, 완두, 치코리, 상추, 꽃상추, 캐비지, 양배추, 비트, 파스닙, 순무, 콜리플라워, 브로콜리, 무, 시금치, 양파, 마늘, 가지, 후추, 샐러리, 당근, 스쿼시, 호박, 서양호박, 오이, 사과, 배, 메론, 감귤, 딸기, 포도, 나무딸기, 파인애플, 대두, 담배, 토마토, 수수(sorghum), 및 사탕수수(sugarcane)로 이루어진 군으로부터 선택되는 트랜스진 식물 종자.
  16. 제14항에 있어서, 상기 식물 종자가 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 세인트폴리아(Saintpaulia), 페츄니아, 펠라고늄, 포인세티아, 국화, 카네이션, 및 지니아로 이루어진 군으로부터 선택되는 트랜스진 식물.
  17. SEQ. ID. No. 2 또는 4를 포함하는 아미노산 및 SEQ. ID. No. 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자에 혼성화하는 핵산에 의하여 코드되는 아미노산을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 분리된 과민성 반응 유발 단백질 또는 폴리펩티드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드가 SEQ. ID. No. 2 또는 4를 포함하는 아미노산을 가지는 분리된 단백질 또는 폴리펩티드.
  19. 제17항에 있어서, 상기 단백질 또는 폴리펩티드가 SEQ. ID. No 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자에 혼성화하는 핵산에 의하여 코드되는 분리된 단백질 또는 폴리펩티드.
  20. 질병 내성을 부여하기 위한 효과적인 조건하에서 제17항에 따른 단백질 또는 폴리펩티드를 비감염성(non-infectious) 형태로 식물 또는 식물 종자에 적용하는 단계를 포함하는 식물에 질병 내성을 부여하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 적용단계 중에 식물을 처리하는 식물 질병 내성 부여 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    과민성 반응 유발인자로 처리된 종자를 천연 또는 인조 토양에 심는 단계; 및
    상기 토양에 심어진 종자로부터 식물을 증식시키는 단계
    를 추가로 포함하는 상기 적용단계 중에 식물종자를 처리하는 식물 질병 내성 부여 방법.
  23. 식물 생장을 향상시키기 위한 효과적인 조건하에서 제17항에 따른 단백질 또는 폴리펩티드를 비감염성(non-infectious) 형태로 식물 또는 식물 종자에 적용하는 단계를 포함하는 식물의 생장을 향상시키는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 적용단계 중에 식물을 처리하는 식물 생장 향상 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    과민성 반응 유발인자로 처리된 종자를 천연 또는 인조 토양에 심는 단계; 및
    상기 토양에 심어진 종자에서 식물을 증식시키는 단계
    를 추가로 포함하는 상기 적용단계 중에 식물 종자를 처리하는 식물 생장 향상 방법.
  26. 해충을 효과적으로 방제(control)하기 위한 조건하에서 제17항에 따른 단백질 또는 폴리펩티드를 비감염성(non-infectious) 형태로 식물 또는 식물 종자에 적용하는 단계를 포함하는 식물에 대한 해충 방제 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 적용단계 중에 식물을 처리하는 해충 방제 방법.
  28. 제26항에 있어서,
    과민성 반응 유발인자로 처리된 종자를 천연 또는 인조 토양에 심는 단계; 및
    상기 토양에 심어진 종자에서 식물을 증식시키는 단계
    를 추가로 포함하는 상기 적용단계 중에 식물 종자를 처리하는 해충 방제 방법.
  29. 제1항에 따른 DNA 분자로 형질전환된 트랜스진 식물 또는 식물 종자를 제공하는 단계; 및
    질병 내성을 부여하기에 효과적인 조건하에서 상기 트레스진 식물 또는 상기 트랜스진 식물 종자로부터 생성된 트랜스진 식물을 생장시키는 단계
    를 포함하는 식물에 질병 내성을 부여하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 트랜스진 식물을 제공하는 질병 내성 부여 방법.
  31. 제29항에 있어서, 트랜스진 식물종자를 제공하는 질병 내성 부여 방법.
  32. 제1항에 따른 DNA 분자로 형질전환된 트랜스진 식물 또는 식물 종자를 제공하는 단계; 및
    식물 생장을 향상시키기에 효과적인 조건하에서 상기 트레스진 식물 또는 상기 트랜스진 식물 종자로부터 생성된 트랜스진 식물을 생장시키는 단계
    를 포함하는 식물의 생장을 향상시키는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 트랜스진 식물을 제공하는 식물 생장 향상 방법.
  34. 제32항에 있어서, 트랜스진 식물종자를 제공하는 식물 생장 향상 방법.
  35. 제1항에 따른 DNA 분자로 형질전환된 트랜스진 식물 또는 식물 종자를 제공하는 단계; 및
    해충을 방제하기 위한 효과적인 조건하에서 상기 트레스진 식물 또는 상기 트랜스진 식물 종자로부터 생성된 트랜스진 식물을 생장시키는 단계
    를 포함하는 식물에 대한 해충 방제 방법.
  36. 제35항에 있어서, 트랜스진 식물을 제공하는 대한 해충 방제 방법.
  37. 제35항에 있어서, 트랜스진 식물종자를 제공하는 해충 방제 방법.
  38. 제17항에 따른 단백질 또는 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 비료, 살충제, 살균제, 살선충제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 첨가제를 추가로 포함하는 조성물.
  40. 제17항에 따른 단백질 또는 폴리펩티드를 인식하는 항체 또는 이들의 결합 부위.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 항체가 모노클론 항체인 항체 또는 이들의 결합 부위.
  42. 제40항에 있어서,
    상기 항체가 폴리클론 항체인 항체 또는 이들의 결합 부위.
  43. 제40항에 따른 항체 또는 이들의 결합 부위를 식물에 제공하는 단계; 및
    질병 또는 과민성 반응을 개선시키기 위한 효과적인 조건하에서 상기 항체 또는 이들의 결합 부위를 과민성 반응 유발인자 단백질 또는 폴리펩티드에 결합시키는 단계
    를 포함하는 식물에 대한 질병 또는 과민선 반응을 개선시키는 방법.
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