KR20010021596A - ｒａｓ의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해 - Google Patents

ｒａｓ의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해 Download PDF

Info

Publication number
KR20010021596A
KR20010021596A KR1020007000154A KR20007000154A KR20010021596A KR 20010021596 A KR20010021596 A KR 20010021596A KR 1020007000154 A KR1020007000154 A KR 1020007000154A KR 20007000154 A KR20007000154 A KR 20007000154A KR 20010021596 A KR20010021596 A KR 20010021596A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ras
oligonucleotides
oligonucleotide
expression
cells
Prior art date
Application number
KR1020007000154A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100363475B1 (ko
Inventor
모니아브레트피.
코우서트렉스엠.
마노하란무타이아
Original Assignee
파샬 비. 린네
아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 파샬 비. 린네, 아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드 filed Critical 파샬 비. 린네
Publication of KR20010021596A publication Critical patent/KR20010021596A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100363475B1 publication Critical patent/KR100363475B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/333—Modified A
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3527—Other alkyl chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/125—Modifications characterised by incorporating agents resulting in resistance to degradation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명의 조성물 및 방법은 ras 발현을 조절하기 위하여 제공된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 사람의 ras를 암호화하는 핵산에 표적된다. 본 발명의 사람의 H-ras, Ki-ras 및 N-ras를 암호화하는 mRNA와 특이적으로 잡종화될 수 있는 올리고뉴클레오티드는 연구 목적 뿐 아니라 치료제 및 진단제로 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 세포 및 조직내 ras 유전자의 발현을 조절하기 위한 방법들이 개시되며, 활성화된 ras 유전자의 발현을 특이적으로 조절하는 방법도 제공되고, 그리고 ras 유전자와 관련된 상태의 진단, 검출 및 치료 방법에 관해서도 개시되어 있다.

Description

ｒａｓ의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해{Antisense Oligonucleotide Inhibition of ras}
서 설
본 출원은 미국특허출원 제08/411,734호(1995. 4. 3 출원)의 일부계속출원이며, 상기 미국특허출원 제08/411,734호는 미국특허출원 제958,134호(1992. 10. 5 출원) 및 미국특허출원 제08/007,996호(1993. 1. 21 출원)의 일부계속출원 및 국제특허출원 제PCT/US93/09346호의 미국 국내 단계를 밟은 것이며, 본 발명의 양수인에게 양도되었고, 그리고 상기 출원들은 본 발명의 명세서에서 참고로 인용되었다.
세포 성장 및 분화를 조절하는 세포성 유전자의 변경(alteration)은 직접적으로 또는 간접적으로 암의 주요 원인이 될 것이다. 사람의 종양 형성에 관여하는 종양유전자(oncogene)라 일컬어지는 유전자들의 족(familiy)은 약 30개 정도가 있다. 상기 족 중 하나인 ras 유전자 족은 사람의 종양에서 돌연변이된 것으로 종종 발견된다. 정상적인 상태의 ras 유전자에 의하여 생산되는 단백질은 정상적인 세포 성장 및 성숙을 포함할 것이다. ras 유전자의 돌연변이는 단백질 생성물들의 세 개의 중요한 위치들 중 하나에서 아미노산이 변형됨으로써 발생되며, 상기 돌연변이로 인하여 종양 형성에 관련된 형태로 전환된다. 상기 돌연변이를 갖는 유전자를 "돌연변이된" 또는 "활성화된" 것이라고 부른다. 또한 미성숙된 ras 유전자는 "야생형" 또는 "정상" ras 유전자라고 부른다. ras 활성을 이끄는 상기 주된 돌연변이는 발암물질 또는 다른 주변 환경요인에 의하여 유도될 수 있다. 췌장 선암(pancreatic adenocarcinomas)의 90% 이상, 결장의 선종 및 선암의 약 50% 이상, 폐의 선암 및 갑상선 암종의 약 50% 이상 및 급성 골수 백혈병(acute myeloid leukemia) 및 골수이형성(myelodysplastic) 증후군과 같은 혈액의 악성 거대 절편은 활성화된 ras 발암유전자를 포함한다고 밝혀져 왔다. 전체적으로, 사람의 종양 중 약 10∼20%는 세 가지 ras 유전자(H-ras, Ki-ras 또는 N-ras) 중 하나에서 돌연변이된 것이다.
특정한 종양 세포에 있어서 활성화된 종양유전자의 발현을 저해함으로써 더욱 정상적인 성장을 유도할 수 있을 것이다. 예를 들어, Feramisco 외, Nature 1985, 314, 639-647에서는 활성화된 ras 유전자가 악성으로 형질전환된 세포들에 ras 유전자의 단백질 생성물과 결합한 항체를 현미주사(microinjection)한 경우, 상기 세포들은 증식 속도를 늦추고 더욱 정상적인 외형을 만들게 된다. 이러한 것은 암세포의 전형적인 비조절된 성장상태에 있어서 활성화된 ras 유전자의 생성물이 포함된 다는 것을 뒷받침하는 것으로 해석된다.
본 발명은 ras 유전자의 발현을 조절할 수 있는 조성물을 제공하며, 특히 활성화된 ras 유전자의 발현을 특이적으로 조절하는 조성물을 제공한다. 또한 진단 방법을 제공하고 동물내의 ras 유전자를 암호화하는 핵산을 검출하는 방법을 제공한다. 그리고 ras 활성으로부터 야기된 상태의 진단 및 치료를 위한 방법을 제공한다. 게다가 본 발명에 의하여, ras를 암호화하는 핵산의 검출을 위한 개선된 연구 키트와 시약이 제공되고, 상기 핵산을 검출하기 위한 연구가 바람직하게 이루어진다.
종양유전자 발현의 저해는 안티센스 오리엔테이션(orientation) 내의 Ki-ras 원종양유전자(protooncogene) RNA의 2 킬로베이스(kilobase) 절편을 발현하는 레트로바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터를 이용하여 달성할 수 있다(Mukhopadhyay, T. 외(1991) Cancer Research 51, 1744-1748; 국제특허출원 제PCT/US92/01852호(국제출원공개 제92/15680호); 및 Georges, R.N. 외(1993) Cancer Research, 53, 1743-1746).
종양유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해는 다양한 종양유전자 족의 역할을 이해하는데 있어서 유용한 도구가 되는 것으로 입증되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 "센스"에 대해 상보적인 작은 올리고뉴클레오티드 또는 주어진 유전자의 암호화된 가닥이고, 그리고 그 결과 유전자의 mRNA 전사체와 상보적이며, 안정적이고 특이적으로 잡종화될 수 있다. Holt 외, Mol. Cell Biol. 1988, 8, 963-973에서는 배양된 HL60 백혈병 세포(HL 60 leukemic cell)에 첨가하고, 증식을 저해하고, 그리고 분화를 유도할 때, 종양유전자인 c-myc의 mRNA 전사체와 특이적으로 잡종화할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있다. Anfossi 외, Proc. Natl. Acad. Sci. 1989, 86, 3379-3383에서는 사람의 골수성 백혈병(myeloid leukemia) 세포주의 증식을 억제하는 c-myb 종양유전자의 mRNA 전사체와 특이적으로 잡종화할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대하여 개시하고 있다. Wickstrom 외, Proc. Nat. Acad. Sci. 1988, 85, 1028-1032에서는 c-myc 종양유전자의 단백질 생성물 및 HL60 배양된 백혈병 세포들의 증식은 c-myc mRNA와 특이적으로 잡종화될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 억제된다는 것을 나타내고 있다. 미국특허 제4,871,838호(Bos 외)는 상기 돌연번이를 검출하기 위하여 N-ras의 코돈 13에 있는 돌연변이에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있다. 미국특허 제4,871,838호(Bos 외)는 ras 단백질을 암호화하는 DNA내에 있는 돌연변이를 검출하기 위한 프로브(probe)로 유용한 분자들을 개시하고 있다.
상기 모든 경우에 있어서, 비변형된 올리고뉴클레오티드의 불안정성은 여러 가지 문제점들을 발생시키며, 상기 문제점들 중 주된 문제로 대두되는 것으로는 세포성 효소에 의해 야기되는 분해이다. 국제특허출원 제PCT/US88/01024호(Zon 외)에서는 HL-60 백혈병 세포 성장 및 상기 세포들의 DNA 합성을 억제시키는 증폭된 c-myc 종양유전자의 번역 개시 지역과 잡종화할 수 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 개시한다. Tidd 외, Anti-Cancer Drug Design 1988, 3, 117-127에서는 활성화된 N-ras 종양유전자와 특이적으로 잡종화될 수 있는 메틸포스포네이트 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대하여 평가하였고, 그리고 상기 올리고뉴클레오티드들이 생화학적인 분해에 대해 내성이 있고 배양된 사람의 HT29 세포내에서 비독성인 경우에, N-ras 유전자의 발현이 저해되지 않고, 상기 세포들에 영향을 끼치지 않는 다는 것을 밝혀냈다. Chang 외의 연구자들은 생쥐(mouse)의 Balb-ras 유전자의 mRNA의 전사체와 특이적으로 잡종화되는 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 시험관내에서(in vitro) 상기 유전자 단백질 생성물의 번역을 저해한다는 것을 밝혀냈다(Chang 외, Anti-Cancer Drug Design 1989, 4, 221-232; 및 Brown 외, Oncogene Research 1989, 4, 243-252). 상기 Chang 외에 의해 개시된 바에 따라 이용된 안티센스 올리고뉴클레오티드가 ras 유전자의 번역 개시 지역과 특이적으로 잡종화될 수 있기 때문에, 상기 올리고뉴클레오티드는 활성화된 ras에 대한 선택성(selectivity)을 나타내지 못할 것이며, 정상(야생형) 대 돌연변이(활성화된) ras 유전자에 대한 상기 올리고뉴클레오티드의 결합 능력이 비교될 수 없었다.
Helene과 그 외 공동 연구자들은 아크리딘 인터칼레이팅제 및/또는 소수성 꼬리에 결합된 9-mer 포스포디에스테르를 이용하여 활성화된(코돈 12 G→T 전환) H-ras mRNA의 발현을 선택적으로 저해하는 것에 대하여 개시한 바 있다. 상기 화합물은 낮은 마이크로몰(micromolar)에서 RNase H 및 세포 증식 검정법으로 돌연변이 ras 메세지의 선택적인 표적화를 나타내었다(Saison-Behmoaras, T. 외, EMBO J. 1991, 10, 1111-1118). Chang과 그 외 공동 연구자들은 돌연변이 H-ras 메시지의 선택적인 표적화를 개시하였다; 이때, 상기 표적은 A→T 전환(transversion)이 이루어져 있는 H-ras 61번째 코돈이었고, 상기 이용된 올리고뉴클레오티드는 11-mer 메틸포스포네이트 또는 그 프소라렌(psoralen) 유도체였다. 활성에 필요한 7.5∼150μM 농도를 갖는 상기 화합물들은 정상적인 H-ras p21에 비하여 돌연변이 H-ras p21의 발현에 있어서 선택적인 저해를 나타내는 것을 면역침전(immunoprecipitation) 방식을 통해 알아냈다(Chang 외, Biochemistry 1991, 30, 8283-8286).
본 발명은 종양 형성에 관련한 활성된 형태로 가끔 전환되는 자연적으로 발생하는 단백질인 ras 유전자의 발현을 억제하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 H-, Ki- 및 N-ras에 표적되는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 또한 본 발명은 세포 및 조직내 ras 유전자의 정상적인 그리고 활성화된 형태 모두를 검출하는 것이며, 연구와 진단용 시약 및 키트(kit)의 주성분을 형성할 수 있다. 더욱이, 본 발명은 ras 유전자와 관련된 상태의 예방 및 치료에 관한 것이다.
도 1은 투약 반응 방식에 있어서 ras의 저해를 나타낸 8개 패널의 시리즈이다. 직선은 야생형(정상) ras에 대한 활성을 나타낸 것이고, 점선은 활성화된(돌연변이) ras 유전자에 대한 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 ras-루시페라제(ras-luciferase)에 대한 균일한 데옥시 포스포로티오에이트 및 짧은 키메릭 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성을 나타낸 막대 그래프이다.
도 3은 ras에 표적된 포스포로티오에이트 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드를 이용하여 데옥시 갭 길이에 따라 RNase H가 활성화되는 안티센스 기능 및 활성 사이의 상호관계를 나타낸 선 그래프이다.
도 4는 누드 마우스내의 A549 사람 세포 종양에 대한 ISIS 2503의 항-종양 활성을 나타낸 선 그래프이다.
도 5는 누드 마우스내의 A549 사람 세포 종양에 대한 양이온성 지질과 함께 투여된 ISIS 2503의 항-종양 활성을 나타낸 선 그래프이다.
도 6은 세 가지 사람의 결장 선암 세포주, Calul, SW480 및 SW620에 있어서 Ki-ras mRNA 발현의 안티센스 저해를 나타낸 막대 그래프이다.
도 7은 Ki-ras 특이적인 올리고뉴클레오티드 ISIS 6957 및 ISIS 6958에 의하여 SW480 사람의 선암 세포주 증식이 저해된 것을 나타낸 막대 그래프이다.
도 8은 ISIS 2503(서열번호 2)의 2'-MOE 유사체에 의하여 H-ras mRNA 수준이 감소되는 것을 나타낸 막대 그래프이다(오른쪽 막대: 150nM 올리고뉴클레오티드 투약량; 가운데 막대: 50nM 투약량; 및 왼쪽 막대: 15nM 투약량).
도 9는 ISIS 2503(서열번호 2)의 MMI 유사체에 의하여 H-ras mRNA 수준이 감소되는 것을 나타낸 막대 그래프이다(오른쪽 막대: 500nM 올리고뉴클레오티드 투약량; 가운데 막대: 100nM 투약량; 및 왼쪽 막대: 50nM 투약량).
도 10은 올리고뉴클레오티드 14686∼14694, 14677 및 14678에 의하여 N-ras mRNA 수준이 감소되는 것을 나타낸 막대 그래프이다(오른쪽 막대: 400nM 올리고뉴클레오티드 투약량; 가운데 막대: 200nM 투약량; 및 왼쪽 막대: 100nM 투약량)
발명의 상세한 설명
성장을 하지 않도록 이끄는 상당한 변화 및 여러 단계들을 통하여 발달된 악성 종양은 암세포의 특성, 즉 연속적으로 비조절된 증식, 주변 조직을 침투하는 능력 및 다른 기관 부위로 전위될 수 있는 능력들을 조절한다. 시험관내에서(in vitro) 주의 깊게 행해진 연구들은 정상 및 종양(neoplastic) 세포들의 성장을 특성화하는 인자 및 세포 성장과 분화를 조절하는 특이적 단백질을 동정하는 인자를 한정하는데 도움을 주었다. 게다가, 시험관내(in vitro) 검정법에 있어서 주의 깊게 조절되고 정량된 세포 정보를 연구하는 능력은 형질전환된 세포의 표현형을 유도할 수 있는 특이적인 유전자를 동정하게 할 수 있었다. 그러한 암-유발 유전자 또는 종양유전자들은 그 단백질 생성물의 발현을 조절하는데 나타나는 변화들을 유도하는 돌연변이를 통하여 형질전환-유도 특성을 얻는 것으로 사려된다. 여러 경우, 상기 변화들은 종양유전자의 전사적 활성에 있어서 변형을 이끌어내는 상기 유전자의 생성물을 과도하게 발현하거나 또는 수준 이하로 발현하게 하는 프로모터 또는 인핸서와 같은 즉, 비-암호화 DNA 조절 도메인내에서 발생한다. 이와는 달리, 상기 변화들은 유전자 돌연변이 불활성, 과도한 활성 또는 정상적(야생형) 유전자 생성물과는 다른 활성을 나타내는 변경된 유전자 생성물을 생산하는 종양유전자의 암호화 지역내에서 발생하기도 한다.
최근 30개 이상의 세포성 종양유전자 족(family)이 동정되었다. 상기 유전자들은 그 단백질 생성물의 활성에 대한 추정적인 메카니즘 및 하위세포 위치에 근거를 두고 분류되었다. 상기 ras 종양유전자들은 원형질막의 내부 표면에 위치한 관련 단백질들을 암호화하는 유전자 족을 이루는 것이다. ras 단백질들은 아미노산 수준으로 높게 유지되고, 높은 친화도 및 특이성으로 GTP를 결합시키고, 그리고 GTPase 활성을 갖는 것으로 나타났다. 비록 ras 유전자 생성물의 세포성 기능이 알려지지는 않았지만, GTP 결합 단백질 또는 G 단백질로 알려진 신호-형질도입 단백질의 종류들과 상당한 서열 상동성을 갖으며, 상기한 바와 같은 생화학적 특성은 ras 유전자 생성물이 원형질막을 통과하는 세포외 신호의 형질도입에 관련한 기초적인 세포성 조절 기능들 중 기초적인 역할을 수행한다는 것을 제시한다.
H-ras, Ki-ras, N-ras로 표시되는 세 가지 ras 유전자는 포유류 게놈(genome)에서 동정되었다. 포유류 ras 유전자들은 그것들의 암호화 염기서열 내의 단일의 점 돌연변이에 의해 야기된 형질전환-유도 성질을 갖고 있다. 자연적으로 발생하는 ras 종양유전자의 돌연변이는 코돈 12, 13 및 61에서 일어난다. H-ras, Ki-ras 및 N-ras의 염기서열에 대해서는 이미 알려져 있다(Capon 외, Nature 302 1983, 33-37; Kahn 외, Anticancer Res. 1987, 7, 639-652; Hall and Brown, Nucleic Acids Res. 1985, 13, 5255-5268). 사람의 종양에서 가장 일반적으로 검출되는 활성화된 ras 돌연변이는 GGC에서 GTC로 염기변화가 일어나 H-ras 유전자의 코돈 12에서 ras 단백질 산물의 GTP 분해효소 조절지역의 글리신이 발린으로 치환된다(Tabin, C.J. 외, Nature 1982, 300, 143-194; Reddy, P.E. 외, Nature 1982, 300, 149-152; 및 Taparowsky, E. 외, Nature 1982, 300, 762-765). 이러한 하나의 아미노산이 변화됨으로써 ras 단백질 기능이 정상적인 조절 작용을 하지 못하게 되어, 이로 인하여 정상적으로 조절된 세포 단백질이 연속적으로 활성인 것으로 바뀌게 된다. 정상적인 ras 단백질 기능의 조절 해제는 정상적인 성장에서 악성 성장으로의 전환을 가져오게 하는 것으로 여겨진다. 그러므로 ras 유전자 발현 억제는 악성 상태 즉, 암 및 다른 과증식 상태의 치료 및/또는 예방에 이용된다.
최근에 H-ras 유전자는 즉시 치료하지 않으면 갑작스럽게 사망하는 유전병인 롱(long) Q-T 증후군이라 불리는 심각한 부정맥(不整脈) 심장병을 야기하고 있다. 종종 불규칙한 심장고동이 시작되기 전에 어떤 징후도 나타나지 않는다. H-ras 유전자가 롱 Q-T 증후군의 원인이 되는가는 불확실하다. 그러나 상기 증후군의 유전성과 H-ras 유전자를 둘러싸는 염색체 11 지역의 특이한 변형체의 존재 사이에 상당히 높은 상관 관계가 있다. 그러므로 H-ras 유전자는 롱 Q-T 증후군으로 인한 갑작스런 심장병 사망이라는 심각한 사태의 유용한 지표가 된다.
N-ras는 유전자 전이 실험에서 종양유전자로는 처음으로 동정되었다(Hall 외, Nature 1983, 303: 396-400). 상기 유전자의 활성은 Taparowsky 외. Cell 1983, 34: 581-6에 의하여 특성이 부여되었다. 활성화된 N-ras는 많은 혈액학적 종양 및 고형의 종양에서 발견되었으며, N-ras가 과증식 상태를 발달시키거나 유지시킨다는 것을 제시하였다.
본 발명은 사람의 ras 유전자 발현을 억제시키는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 사람의 ras 유전자로부터 유도된 선택된 DNA 또는 mRNA와 함께 특이적으로 잡종화된다. 또한 본 발명은 ras의 돌연변이 형태를 발현하는 것을 선택적으로 저해하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 잡종화된 올리고뉴클레오티드 및 상보적인 핵산 표적 사이의 이러한 관계는 일반적으로 "안티센스"로 인용된다. 본 발명에 있어서, 선택된 핵산 표적에 대한 올리고뉴클레오티드를 "표적화"하는 것은 다단계 공정을 통하여 이루어진다. 상기 공정은 일반적으로 조절된 기능의 핵산 염기서열을 동정하면서 시작된다. 이러한 것은 예를 들어, 특정한 질병 상태에 관련된 발현을 하는 세포성 유전자(또는 유전자로부터 만들어진 mRNA) 또는 감염제로부터 온 외래 핵산일 수 있다. 본 발명에 있어서, 표적은 ras를 암호화하는 핵산, 다른 말로 ras 유전자 또는 ras 유전자로부터 발현된 mRNA이다. 표적 공정은 유전자 발현의 바람직한 효과-조절이 이루어질 수 있는 올리고뉴클레오티드 상호작용을 위한 핵산의 염기서열내에 있는 부위 또는 부위들을 결정하는 것을 포함한다. 표적 부위 또는 부위들이 동정되면, 올리고뉴클레오티드는 표적에 대하여 충분하게 상보성이 있는 것으로, 즉 충분한 상보성을 갖고 충분하게 잡종화된 것으로 선택되어 바람직한 조절(modulation) 작용을 제공하게 된다.
본 발명의 명세서상에서 "조절(modulation)"이란 저해 또는 촉진을 의미하는 것이다. ras 유전자 발현의 저해는 바람직한 조절의 한 형태이다. 이러한 조절은 본 발명의 기술 분야에서 일반적인 방법으로 측정될 수 있으며, 상기 방법의 예로는 본 발명의 실시예에서 보여주는 바와 같은 단백질 발현의 mRNA 발현의 노던 블랏 검정법 또는 단백질 발현의 웨스턴 블랏 검정법이 있다. 세포 증식 또는 종양 세포의 성장 결과들이 측정될 수 있으며, 본 발명의 실시예에서 설명하고 있다. 본 발명의 명세서상에서 "잡종화"란 왓슨-크릭 염기쌍으로도 알려진, 반대 핵산 가닥 또는 하나의 핵산 가닥의 두 지역상의 상보적인 염기 사이의 수소결합을 의미한다. 구아닌과 시토신은 이들 사이에 세 개의 수소결합을 형성하도록 알려진 상보 염기의 예이다. "특이적으로 잡종화가 가능한" 및 "상보적인"이란 DNA 또는 RNA 표적과 올리고뉴클레오티드 사이에서 발생하는 안정적이고 특이적인 결합이 발생되는 충분한 정도의 상보성을 나타내는 것이다. 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 잡종화 가능한 그 표적 핵산의 염기서열에 100% 상보적일 필요는 없는 것이다. 올리고뉴클레오티드는 표적과 올리고뉴클레오티드의 결합이 표적 분자의 정상적인 기능을 방해하여 유용성을 잃게끔 하는 경우 특이적으로 잡종화될 수 있으며, 특이적 결합이 바람직한 상태하에서, 즉 생체내(in vivo) 분석 또는 치료를 위한 물리적 상태, 또는 시험관내(in vitro) 분석을 위한 물리적 조건하에서, 또는 상기 분석들이 행해지는 조건하에서 비-표적 염기서열과 올리고뉴클레오티드간의 비-특이적 결합을 막을 수 있을 만큼 충분한 상보성이 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 H-ras, Ki-ras 또는 N-ras에 표적된 것으로 제공된다. 본 발명에 부합하도록 본 발명의 기술분야에 있는 통상의 지식을 가진 자에 의하여, mRNA는 번역 개시 및 종결 코돈을 포함한 세 문자의 유전 암호을 이용하여 단백질을 암호화하는 정보를 이끄는 암호화지역 뿐 아니라 5'-비번역 지역, 3'-비번역 지역, 5'-캡 지역, 인트론 지역 및 인트론/엑손 또는 스플라이스 졍션(splice junction) 리보뉴클레오티드로 당업자에게 알려진 지역을 형성하는 것과 관련된 리보뉴클레오티드를 포함한다고 이해된다. 이와 같이, 올리고뉴클레오티드는 관련된 리보뉴클레오티드 및 암호화하는 리보뉴클레오티드의 일부에 또는 전체에 표적되어 본 발명의 목적에 부합하도록 조제될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 ras mRNA의 번역 개시 부위(AUG 코돈) 또는 암호화 지역의 염기서열, 5'-비번역 지역, 또는 3'-비번역 지역에 표적된다. 저해되는 mRNA의 기능에는 RNA에 의해 관여될 수 있는 단백질 번역을 위한 부위에 RNA의 전좌, RNA로부터 단백질의 실질적인 번역, DNA의 스플라이싱 또는 성숙 및 가능한 독립 촉매 활성과 같은 모든 실질적인 기능들이 포함된다. RNA의 상기 기능들을 저해함으로써 야기되는 전체적인 결과들은 ras 단백질 발현을 방해하게 한다.
본 발명은 ras 유전자 발현을 조절하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 ras를 암호화하는 핵산에 표적된다. 여기에서 정의되는 "조절(modulation)"이란 저해 또는 촉진을 의미하는 것이다. ras 유전자 발현의 저해는 조절의 바람직한 형태이다.
본 발명의 명세서상에서, "올리고뉴클레오티드"란 자연적으로 발생하는 염기, 당 및 당간 (주쇄) 결합(intersugar (backbone) linkage)을 이루는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단량체의 올리고머 또는 폴리머를 의미한다. 또한 상기 "올리고뉴클레오티드"는 비-천연 부분을 함유하는 올리고머를 모두 포함하는 것이다. 그러한 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 천연의 형태보다 종종 바람직한데 이는 예를 들어, 증가된 세포내 흡수성 및 뉴클레아제의 존재하에서의 증가된 안정성과 같은 성질 때문이다.
본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드는 키메릭(chimeric) 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 문맥상에서 "키메릭 올리고뉴클레오티드" 또는 "키메라(chimera)"는 각각 하나 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 둘 이상의 화학적으로 독특한 영역들을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 영역들을 포함하며, 상기 영역의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 분해에 대한 내성, 증가된 세포 흡착성 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합력을 위해 변형된다. 상기 올리고뉴클레오티드의 특별한 영역이 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단하는 능력을 갖는 효소에 대한 기질로써 제공될 수도 있다. 예를 들자면, RNase H는 RNA:DNA 이중가닥 중 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다. 그러므로, RNase H가 활성되면 RNA 표적이 절단되며, 유전자 발현의 안티센스 저해 효과는 크게 향상된다. 결과적으로, 동일한 표적 영역과 잡종화될 수 있는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드와는 대조적으로, 키메릭 올리고들이 사용될 때에는 주로 짧은 올리고뉴클레오티드가 획득될 수 있다. RNA 표적 절단은 겔 전기영동에 의해 일상적으로 검출될 수 있고, 필요하다면, 본 발명의 기술분야에서 알려져 있는 관련 핵산 잡종화 기술도 사용될 수 있을 것이다. 바람직한 구체예에서, 키메릭 올리고뉴클레오티드는 표적 결합 친화성을 증가시킬 수 있는 적어도 하나의 지역을 포함하고, 일반적으로 상기 지역은 RNase H에 대한 기질로서 작용한다. 상기 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화도(이러한 경우 ras를 암호화하는 핵산)는 올리고뉴클레오티드와 표적간의 짝이룸의 Tm값을 측정함으로써 알 수 있으며, 상기 온도는 올리고뉴클레오티드 및 표적이 해리되는 온도이고, 그 해리는 분광광도계로 검출된다. Tm값이 높으면 높을수록, 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합력을 증대된다. 더욱 바람직한 구체예에서, ras mRNA 결합 친화도를 증가시키기 위하여 변형된 올리고뉴클레오티드의 지역은 당의 2' 위치가 변형된 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하고, 가장 바람직하게는 2'-O-알킬, 2'-O-알킬-O-알킬 또는 2'-플루오로-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 변형들은 일반적인 방법으로 올리고뉴클레오티드내에서 이루어질 수 있으며, 그러한 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드들은 주어진 표적에 대한 2'-데옥시올리고뉴클레오티드 보다 높은 Tm값(높은 표적 결합 친화도)을 나타내었다. 상기와 같이 향상된 친화력으로 인하여 ras 유전자 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해가 매우 향상된다. RNase H는 RNA:DNA 이중결합의 RNA 가닥을 분열시키는 세포성 엔도뉴클레아제이고, 상기 효소의 활성은 RNA 표적을 분열시키고, 그리고 그럼으로써 안티센스 저해의 효율을 증가시킬 수 있다. RNA 표적의 분열은 겔 전기영동에 의해 일반적으로 증명될 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 키메릭 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 내성을 향상시킬 수 있도록 변형된다. 세포들은 핵산을 분해시킬 수 있는 다양한 엑소- 및 엔도-뉴클레아제를 포함한다. 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 많은 변형들은 자연적인(native) 올리고데옥시뉴클레오티드 보다 뉴클레아제 분해에 대하여 더욱 많은 내성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 만들어내는 것으로 나타났다. 뉴클레아제 내성은 일반적으로 세포성 추출물 또는 분리된 뉴클레아제 용액과 함께 올리고뉴클레오티드를 배양함으로써, 그리고 일반적으로 겔 전기영동에 의하여 초과된 시간 동안 손상되지 않은 완전한 올리고뉴클레오티드의 정도를 측정함으로써 알 수 있다. 뉴클레아제 내성을 향상시킬 수 있도록 변형된 올리고뉴클레오티드는 비변형된 올리고뉴클레오티드보다 긴 시간 동안 완전하게 생존한다. 다양한 올리고뉴클레오티드의 변형들은 뉴클레아제 내성을 향상시키거나 부여하는 것으로 알려져 있다. 적어도 하나의 포스포로티오에이트 변형을 갖는 올리고뉴클레오티드가 더욱 바람직하다. 여러 경우에서, 올리고뉴클레오티드 변형들은 표적 결합 친화력을 향상시키고, 독립적으로 뉴클레아제 내성을 향상시킬 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 여러 바람직한 변형들에 대해서는 De Mesmaeker 외, Acc. Chem. Res. 1995, 28:366-374에서 개시하고 있다.
본 발명의 여러 가지 바람직한 올리고뉴클레오티드는 변형된 주쇄(backbone), 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 당간 결합 또는 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 당간 결합을 포함한다. 가장 바람직한 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 주쇄 및 헤테로원자 주쇄, 특히 CH2-NH-O-CH, CH2-N(CH3)-O-CH2(메틸렌(메틸리미노)로 알려진 또는 MMI 주쇄), CH2-O-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2및 O-N(CH3)-CH2-CH2주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드이며, 여기에서 원래 그대로의 자연적인 포스포디에스테르 주쇄는 O-P-O-CH2로 표현되는 것이다. De Mesmaeker 외, Acc. Chem. Res. 1995, 28:366-374에 개시된 아미드 주쇄 또한 바람직한 것이다. 또한 모폴리노 주쇄 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드도 바람직하다(Summerton 및 Weller의 미국특허 제5,034,506호). 다른 바람직한 구체예에서, 펩티드 핵산(PNA) 주쇄와 같은 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 주쇄는 폴리아미드 주쇄로 치환되고, 상기 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오염기들은 직접적으로 또는 간접적으로 폴리아미드 주쇄의 아자 질소 원자에 결합된다(Nielsen 외, Science, 1991, 254, 1497). 올리고뉴클레오티드들은 하나 이상의 치환된 당 부(moiety)를 포함할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드들은 2' 위치에서 하기의 것들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH3O(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2또는 O(CH2)nCH3(여기에서 n은 1 내지 10임); C1∼C10의 저급 알킬, 알콕시알콕시, 치환된 저급 알킬, 알카릴 또는 아랄킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; RNA 절단기; 수용체기; 인터칼레이터기; 올리고뉴클레오티드의 파마코키네틱(pharmacokinetic) 성질을 향상시키는 기; 올리고뉴클레오티드의 파마코다이나믹(pharmacodynamic) 성질을 향상시키는 기; 및 기타 유사한 특성을 갖는 치환체. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3(2'-O-(2-메톡시에틸)]을 포함한다(Martin 외, Helv. Chem. Acta, 1995, 78, 486). 다른 바람직한 변형들은 2'-메톡시(2'-O-CH3), 2'-프로폭시(2'-OCH2CH2CH3) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형들은 올리고뉴클레오티드의 다른 위치에서 이루어질 수 있으며, 특히 3' 말단 뉴클레오티드의 당의 3' 위치 및 5' 종결 뉴클레오티드의 당의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드들은 펜토푸라노실기에 있는 시클로부틸(cyclobutyl)과 같은 당 유사체들을 가질 수 있다.
올리고뉴클레오티드들은 부가적으로 또는 선택적으로 뉴클레오염기(종종 "염기"라고 간단하게 불리우는) 변형 또는 치환체들을 포함할 수 있다. 여기에서 사용되는 "비변형된" 또는 "천연의" 뉴클레오염기들은 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오염기들은 예를 들어, 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘, 특히 5-메틸시토신(5-me-C 및 5-메틸-2'-데옥시시토신이라 불리우는), 5-히드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC 및 젠토비오실 HMC와 같은 천연의 핵산에서 뿐 아니라 합성된 뉴클레오염기인 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸릴알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 다른 헤테로치환된 알킬아데닌, 2-티오우라신, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-히드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다(Kornberg, A., DNA Replication, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pp75-77; 및 Gebeyehu, G. 외, Nucl. Acid Res. 1987, 15:4513). 당업계에 알려진 "일반적인(universal)" 염기인 이노신 또한 포함될 수 있다. 5-me-C 치환체들은 0.6∼1.2℃에 의해 핵산 이중구조 안성성을 증가시켰고(Sanghvi, Y.S., in Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp276-278), 바람직한 염기 치환체들이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성 또는 세포 흡착력을 향상시키기 위하여 하나 이상의 부(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 결합시키는 것을 포함한다. 상기 부(moeity)들은 콜레스테롤 부 및 콜레스테릴 부(Letsinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553)와 같은 지질 부, 콜린산(Manoharan 외, Bioorg. Med. Chem. Let. 1994, 4, 1053), 헥실-S-트리틸티올과 같은 티오에테르(Manoharan 외, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992, 660, 306; 및 Manoharan 외, Bioorg. Med. Chem. Let. 1993, 3, 2765), 티오콜레스테롤(Oberhauser 외, Nucl. Acids Res. 1992, 20, 533), 도데칸디올 또는 언데실 잔기와 같은 지방성 사슬(aliphatic chain)(Saison-Behmoaras 외, EMBO J. 1991, 10, 111); Kabanov 외, FEBS Lett., 1990, 259, 327; 및 Svinarchuk 외, Biochimie 1993, 75, 49), 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트와 같은 포스포리피드(Manoharan 외, Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651; 및 Shea 외, Nucl. Acids Res. 1990, 18, 3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan 외, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969), 또는 아다맨탄 아세트산(Manoharan 외, Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651)을 포함하며 이에 제한되는 것은 아니다. 리포필릭 부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드의 제조 방법은 본 발명의 분야에서 이미 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호).
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 프로드러그로 제공될 수 있으며, 상기 프로드러그는 활성적인 올리고뉴클레오티드를 만들어 내는 것으로 체내에서 절단되는 하나 이상의 부(moeity)를 포함한다. 프로드러그 접근법 중 하나의 예는 Imbach 외의 국제출원공개 제94/26764호에서 개시된 바 있다.
균일하게 변형된 올리고뉴클레오티드의 모든 부위들 및 앞에서 언급한 변형들이 이루어진 하나 이상의 모든 부위들은 하나의 올리고뉴클레오티드내에 또는 올리고뉴클레오티드 내의 하나의 뉴클레오시드 내에 통합될 수 있다. 본 발명은 여기에서 정의된 키메릭 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에 부합하는 올리고뉴클레오티드는 잘 알려진 고체상 합성 기술을 통해 일반적으로 그리고 편리하게 만들어질 수 있다. 상기 합성을 위한 기기는 Applied Biosystems를 포함한 여러 판매처를 통해 구입할 수 있다. 상기 합성을 위한 다른 수단들이 이용될 수도 있다: 올리고뉴클레오티드의 실질적인 합성은 숙련자의 기술에 따라 좌우된다. 다른 올리고뉴클레오티드 즉 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체와 같은 것들을 제조하기 위한 유사 기술 또한 잘 알려져 있다. 비오틴(biotin), 플루어레신, 아크리딘 또는 프소라렌(psoralen) 변형된 아미디트(amidite)들 및/또는 CPG(Glen Research, Sterling VA)과 상업적으로 변형된 아미디트 및 제어된-포아 글래스(CPG) 생성물 및 이와 같은 유사 기술을 이용하여, 플루어레신으로 표지된, 비오틴으로 표지된 또는 콜레스테롤 변형된 올리고뉴클레오티드와 같은 변형된 올리고뉴클레오티드를 합성하는 것에 대해서는 잘 알려져 있다.
본 발명에 부합하는 올리고뉴클레오티드는 약 8∼50개의 핵산 염기로 이루어지는 것이 바람직하다. 본 발명의 명세서상에서, 상기한 바는 8∼50개의 단량체를 갖는 여기에서 기술된 비-자연적으로 발생된 올리고머를 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 진단제, 치료제 및 연구시약과 키트(kit)로 이용될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 ras 유전자와 잡종화되기 때문에, 샌드위치(sandwich) 및 다른 검정법들이 상기와 같은 사실을 입증하기 위하여 수행될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 올리고뉴클레오티드들은 ras 종양유전자의 돌연변이(활성된) 형태와 우선적으로 잡종화되기 때문에, 상기 검정법들에 의하여 야생형에서 활성화된 형태로 ras 전환되는 세포 및 조직을 스크리닝을 할 수 있다. 상기 검정법들은 형태학적으로 유사한 종양의 차별적인 진단 및 ras 유전자 활성으로부터 암 계통(cancer stemming)이 증가됨으로써 가중되는 위험성을 탐지하는데에 이용될 수 있다. ras 유전자와 올리고뉴클레오티드의 잡종화를 검출하는 수단의 준비는 일반적으로 이루어질 수 있다. 이러한 준비는 효소 컨쥬게이션, 방사선 표지화 또는 다른 적절한 검출 수단을 포함할 수 있다. 또한 ras를 암호화하는 핵산 및 암호화된 ras의 존재 또는 결여를 검출하는 키트(kit)들이 준비될 수 있다.
하기의 특정한 설명들은 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
ras-루시페라제 유전자 발현의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
H-ras 번역 개시 코돈 또는 활성화된 H-ras의 코돈 12의 점 돌연변이에 표적된 일련의 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 실시예 2∼5에 기재된 ras-루시페라제 수용체 유전자 계(system)를 사용하여 검색하였다. 이러한 초기의 일련의 올리고뉴클레오티드 중에서, 6개의 올리고뉴클레오티드는 ras-루시페라제 활성의 상당하고 재생 가능한 저해를 가지는 것으로 밝혀졌다. 이러한 올리고뉴클레오티드(모두 포스포로티오에이트)의 염기서열, 염기서열 참조 번호 및 염기 서열번호를 표 1에 나타내었다.
ras-루시페라제 수용체 유전자 또는 돌연변이 ras-루시페라제 수용체 유전자를 발현하는 세포를 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 2503(서열번호: 2)으로 농도를 증가시키면서 처리하였을 때 투여량-반응에 대하여 실험하였다. 이 화합물은 H-ras 전사체의 번역 개시 코돈에 표적된다. 세포를 이 올리고뉴클레오티드로 처리하면 정상 및 돌연변이 ras 표적 둘 다에 약 50nM의 IC50값을 나타내면서, ras-루시페라제 활성의 투여량-의존성 저해를 나타낸다. ras 번역 개시 코돈에 표적된 올리고뉴클레오티드가 정상 및 돌연변이 ras 발현을 유도하는데 효과적일 것으로 예측되는데 이는 두 표적이 AUG 번역 개시 부위 주변지역에 동일한 염기서열 조성을 가지기 때문이다.
돌연변이된(활성된) H-ras RNA의 코돈 12의 점 돌연변이에 표적된 화합물인 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 2570(서열번호: 3)으로 처리한 세포에서 투여량-반응에 대해 실험하였다. 상기 올리고뉴클레오티드의 농도를 증가시키면서 세포를 처리했을 때 ras-루시페라제의 돌연변이 형태 또는 정상 형태를 발현하는 세포에서 ras-루시페라제 활성의 투여량-의존성 저해를 가져왔다. 그러나 낮은 농도에서 올리고뉴클레오티드 2570이 정상 형태에 비해 돌연변이 형태에 거의 3배의 선택성을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 사실, 2570은 ras-루시페라제의 돌연변이 형태에 대해 약 100 nM의 IC50값을 갖는데 비해, 돌연변이 되지 않은 형태에 대해서는 약 250 nM의 IC50값을 나타내었다.
ras-루시페라제의 정상 형태 또는 돌연변이 형태를 발현하는 세포를 H-ras의 번역 개시 코돈 또는 코돈 12의 점 돌연변이에 표적된 단일 투여량(0.5μM)의 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 테스트를 거친 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 표 1에 나타내었다. ras 번역 개시 코돈에 표적된 화합물 2503(서열번호: 2)이 ras 루시페라제 활성을 저해하는데 가장 효과적이었으며, 정상 및 돌연변이 표적의 약 80% 저해를 제공하였다. ISIS 2502는 두 표적 모두에서 30∼35%의 저해를 나타내었다. 활성화된 H-ras의 코돈 12의 점 돌연변이에 표적된 세가지 화합물 가운데, 17-mer 올리고뉴클레오티드 2570(서열번호: 3)만이 정상 형태에 비하여 ras-루시페라제의 돌연변이된 형태에 대한 선택성을 나타냈으며, 정상 표적에는 약 22% 저해였고 돌연변이 표적에는 약 68% 저해를 나타냈다. ISIS 2571은 두 표적 모두의 약 60% 저해를 나타냈고, ISIS 2566은 두 표적 모두의 65∼70% 저해를 나타냈다. 표 2는 H-ras에 표적된 13개의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 얻어진 결과를 요약한 것이다. 수집된 대조 올리고뉴클레오티드에서는 돌연변이 또는 정상 ras의 저해가 발견되지 않았으며, 정상 ras의 코돈 12 지역에 상보적인 대조 올리고뉴클레오티드(ISIS 2907; 서열번호: 19)는 정상 표적의 70% 저해를 나타냈으나, 돌연변이 ras 상에서는 어떠한 영향도 끼치지 않았다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 그 염기서열, 상보적인 지역, ras-루시페라제 융합 단백질의 발현을 억제하는 활성(ras-루시페라제 발현에 있어서 50%가 억제되는 데에 필수적인 nM 농도 IC50으로 주어진)을 갖는다. ras-루시페라제 발현에 대한 실질적인 안티센스 활성을 나타내면서 코돈 12의 점 돌연변이에 표적된 더 길어진 포스포로티오에이트는 ras-루시페라제의 돌연변이 형태의 발현을 선택적으로 저해하지는 않았다. 17 뉴클레오티드 이하 길이의, 코돈 12의 점 돌연변이에 표적된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 ras-루시페라제의 어떤 형태에도 활성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 ras 염기서열에 표적된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 효과적인 안티센스 활성을 나타낸다는 것을 의미한다.
H-ras AUG와 특이적으로 잡종화가 가능한 안티센스 올리고뉴클레오티드
실시예 2∼5에 기재된 일시적 형질감염 검정법(transient transfection assay)에 의해 H-ras AUG 코돈에 표적된 세 개의 20-염기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 ras-루시페라제 발현 저해 능력에 대하여 비교하였다. 표 2에 나타낸 이들 올리고뉴클레오티드 ISIS 2502(서열번호: 1), 2503(서열번호: 2) 및 6168(서열번호: 7)은 HeLa 세포 중에서 한번의 투여(100nM)로 ras-루시페라제 발현의 저해를 시험하였다. AUG-표적된 세 개의 올리고뉴클레오티드는 모두 ras-루시페라제 발현을 저해하는데 효과적이었다. 이들 세 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 각각의 당에서 2'-O-메틸 변형으로 제조되었다. ISIS 2503(서열번호: 2)의 2'-O-메틸화된 변형 또한 200∼500nM 사이의 IC50을 갖으며 ras-루시페라제 발현을 저해했다. 2'-O-메틸과 같은 서열번호: 7은 가장 높은 투약량(500nM)으로 약 40%의 저해를 나타냈다.
안티센스 활성 및 특이성에 영향을 미치는 올리고뉴클레오티드의 길이
H-ras 코돈 12의 점 돌연변이에 표적된 올리고뉴클레오티드는 ras-루시페라제의 발현을 저해하는데 효과적인 것이었다. 5∼25 염기 길이의 일련의 11개의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 제조하여 실시예 2∼5에 기재된 일시적 형질감염 검정법으로 돌연변이 및 야생형의 ras-루시페라제를 저해하는 능력을 시험하였다. 올리고뉴클레오티드는 표 2에 나타냈다. 100 nM 올리고뉴클레오티드 농도에서 15 염기 길이 이상의 올리고뉴클레오티드는 돌연변이 H-ras 표적의 발현을 저해하였다. 야생형 ras-루시페라제 발현보다 돌연변이체의 선택적인 저해는 15 내지 19 염기 길이에서 관찰되었다. 야생형에 대한 돌연변이의 ras-루시페라제의 저해에 대한 최대의 선택성은 17-mer 2570(서열번호: 3)에서 관찰되었으며 약 4배였다. 2570이 염기서열-특이성 방법으로 작용한다는 것을 확인하기 위해, 야생형 H-ras 표적에 완전히 상보적이도록 이러한 올리고뉴클레오티드를 만들고, 중심의 아데노신 잔기를 시토신으로 치환한 이 화합물의 변종(2907; 서열번호: 19)을 시험하였다. 따라서, 이 올리고뉴클레오티드는 돌연변이 H-ras 염기서열과 완전히 잡종화되었을 때, 올리고뉴클레오티드/RNA 이중나선의 중심에서 하나의 미스매치(mismatch)를 포함하게 된다. 올리고뉴클레오티드 2907은 돌연변이 ras-루시페라제(5% 저해)에 비해 야생형 ras-루시페라제 발현(88% 저해)을 선택적으로 저해하였다.
돌연변이 코돈-12 지역에 상보적인 두 개의 16-mer 및 두 개의 18-mer(표 2)를 실시예 2∼5에 기재한 대로 실험하였다. 도 1은 투여량-의존성 방법으로 13, 15, 16, 17, 18 및 19개의 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성 및 돌연변이 선택성을 측정한 실험결과를 도시한 것이다. 이 실험결과는 돌연변이 H-ras 염기서열에 활성인 화합물이 선택성도 나타낸다는 것을 보여주었으며; 16개의 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드(서열번호: 14 및 서열번호: 15) 및 17개의 염기를 갖는 올리고뉴클레오티드(서열번호: 3)가 최대의 선택성을 나타냈다(각각 4배 및 5배). 13개의 염기 화합물인 2568(서열번호: 12)은 어떤 시험 농도에서도 안티센스 활성을 나타내지 않았다.
데옥시 갭을 갖는 키메릭 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드
돌연변이-선택성 17-mer(2570)의 염기서열에 기초하여, 말단지역이 2'-O-메틸 뉴클레오시드로 구성되고 중심 잔기가 "데옥시 갭"으로 형성된 일련의 키메릭 포스포로티오에이트 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 데옥시 잔기의 수는 0 (충분히 2'-O-메틸) 내지 17(충분히 데옥시)이었다. 2'-O-메틸로 이루어진 말단 지역(진하게 표시)과 중심부에 데옥시 갭(돌연변이 코돈-12 표적)을 가지는 키메릭 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 표 3에 나타내었다.
이러한 올리고뉴클레오티드는 실시예 6에 기재된 잡종화 효율, 실시예 8에 기재된 포유류 RNase H를 사용한 시험관내(in vitro) RNAse H 분해 유도 능력, 및 안티센스 활성에 대해 특정하였다. 전장의 H-ras mRNA에 대한 안티센스 활성은, 실시예 9에 기재된 대로, H-ras 유전자 발현을 수용체 유전자 루시페라제에 연결된 ras-반응 인핸서(enhancer) 요소를 사용해 관찰하는 일시적인 공-형질감염 수용체 유전자 계(system)를 이용하여 측정하였다.
전장 ras mRNA에 대한 데옥시-갭된 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성
안티센스 저해를 제공하는 바람직한 길이의 RNase H-반응성 데옥시 갭이 구비된 상기 화합물을 이용하여 2'-O-메틸 변형에 의해 부여된 향상된 표적 친화도의 긍정적인 특성들을 조사하였다. 실시예 9에 기재된 대로 H-ras 트랜스액티베이션(transactivation) 수용체 유전자 계를 이용하여 2'-O-메틸 데옥시 갭 올리고뉴클레오티드의 전장 H-ras mRNA에 대한 안티센스 활성에 대하여 시험하였다. 안티센스 실험은 초기에 단일 올리고뉴클레오티드 농도 100nM에서 수행되었다. 5개 이상의 잔기들의 데옥시 갭을 포함하는 키메릭 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드들은 H-ras 유전자 발현을 저해하였다. 전장 데옥시 화합물은 약 50%의 저해를 나타내었다. 완전한 2'-O-메틸, 1-데옥시 및 3-데옥시를 갖는 것은 저해를 나타내지 않았다. 5-데옥시, 7-데옥시 및 9-데옥시 화합물은 각각 약 85%, 95% 및 90% 저해를 나타냈다. 이러한 화합물들은 완전한 데옥시 모 화합물(full deoxy parent compound)보다 더 큰 활성을 나타냈다.
투약 반응 실험은 상기 활성 화합물을 이용하여, 4개의 데옥시 잔기를 함유하는 2'-O-메틸 키메라를 이용하여 수행되었다. 상기 올리고뉴클레오티드에 의하여 이루어진 전장 H-ras의 올리고뉴클레오티드-매개된 저해는 투약-의존성을 나타냈다. 가장 큰 활성 화합물은 7개의 잔기 데옥시 키메라였으며, 상기 화합물은 충분히 데옥시를 갖는 올리고뉴클레오티드의 활성보다 5배나 더 큰 활성을 나타내었다.
짧은 키메릭 올리고뉴클레오티드
2'-O-메틸 변형에 의하여 부여된 향상된 표적 친화도는 짧은 키메릭 올리고뉴클레오티드 상에서 활성을 부여하는 것으로 확인되었다. 실시예 9에 개시된 바와 같이 일련의 짧은 2'-O-메틸 키메릭 올리고뉴클레오티드의 Tm및 안티센스 활성 대 전장(full length)에 대하여 측정하였다. 표 4는 5개의 염기 또는 7개의 염기 길이의 데옥시 갭을 갖는 11, 13, 15 및 17 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드에 대한 Tm값들을 나타낸 것이다. 전부 데옥시인 13-mer와 비교해 볼 때, 2'-O-메틸 키메릭 13-mer들은 ras 발현이 저해되고, 11-mer 중 하나는 활성되었다. 상기한 바를 도 2에 도시하였다.
키메릭 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드의 시험관내(in vitro) RNase H 절단을 활성화시키는 능력 및 관련 안티센스 활성은 데옥시 길이와 관계가 있다(도 3).
비대칭 데옥시 갭
키메라 분자의 중심에 데옥시 갭이 꼭 있을 필요는 없다. 결합을 증가시키는 2' 위치에서 변형된 한 말단에 그 지역의 뉴클레오티드를 갖고 나머지는 변형되지 않은(2' 데옥시) 분자도 ras 발현을 저해시킬 수 있는 것으로 나타났다. 7-데옥시 갭이 17-합체의 5' 또는 3' 측면 또는 분자의 중간에 있는 다른 부위에 위치한 올리고뉴클레오티드 (서열번호: 3)(돌연변이 코돈 12에 상보적인 17-mer)는 모두 RNAse H 활성화 및 안티센스 활성을 나타냈다. 그러나, 5-염기 갭은 위치에 보다 민감하였으며, 몇몇의 갭 위치는 RNAse H의 활성화 및 안티센스 저해에 나쁜 영향을 주었다. 따라서, 7-염기 데옥시 갭이 바람직하다.
다른 당 변형
키메릭 올리고뉴클레오티드에서 안티센스 활성에 대한 2'-O-메틸 외의 다른 당 변형의 영향을 조사하였다. 이들 변형은 표 5에 나타냈으며, 실시예 6에 기재된 바와 같이 7-염기 데옥시 갭의 양 측면에 위치하는 2'-변형된 뉴클레오티드를 갖는 17-mer 올리고뉴클레오티드를 25-mer 올리고뉴클레오티드 상보체와 잡종화했을 때 얻어지는 Tm값도 기재하였다. 이들 올리고뉴클레오티드에 대해 2' 위치에서의 알킬 길이와 Tm사이에는 알킬 길이가 증가하면 Tm이 감소하는 관계가 관찰되었다. 2'-플루오로 키메라 올리고뉴클레오티드가 가장 높은 Tm을 나타냈다.
실시예 9에 기재된 트랜스엑티베이션(transactivation) 수용체 유전자 검정법을 이용하여 H-ras에 대한 이들 2' 변형된 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성을 시험하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 이들 2'-변형된 키메라 화합물은 모두 ras 발현을 저해하였으며, 2'-플루오로 7-데옥시-갭 화합물이 가장 활성이 있었다. 중심에 5-데옥시 갭을 가진 2'-플루오로 키메라 올리고뉴클레오티드도 활성이 있었다.
5-염기 또는 7-염기 데옥시 갭 주변에 2'-O-프로필 지역을 갖는 서열번호 3의 키메릭 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 2'-O-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드와 비교하였다. T24 세포내에서의 ras 발현은 7-데옥시 갭 및 균일한 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 2'-O-메틸 및 2'-O-프로필 키메라 올리고뉴클레오티드 모두에 의해 저해되었다. 데옥시 갭이 5 뉴클레오티드로 감소되었을 때는 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드만이 ras 발현을 저해하였다.
암세포의 H-ras 유전자 발현에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
ras AUG 지역에 상보적인 두개의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(2502 및 2503)를 2'-O-메틸 지역이 양측에 존재하는 7-염기 데옥시 갭 및 동일한 염기서열을 갖는 키메라 올리고뉴클레오티드(4998 및 5122)와 함께 실시예 10에 기재된 시험을 하였다. 이러한 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 표 6에 나타내었다.
화합물 2503은 T24 세포에서의 ras 발현을 71%까지 저해하였고 키메라 화합물(4998)은 ras mRNA를 84%까지 저해하였다. 또한 AUG 지역에 상보적인 화합물 2502는 ras RNA 수준을 26%까지 감소시켰고 이 올리고뉴클레오티드의 키메라 변형(5122)은 15% 저해를 나타냈다. 이 검정법에는 또한 돌연변이 코돈 12에 표적된 두 개의 올리고뉴클레오티드도 포함되었다. 화합물 2570(서열번호: 3)은 ras RNA를 82%까지 감소시켰고, 7-데옥시 갭을 가진 이 올리고뉴클레오티드의 2'-O-메틸 키메라 변형(3985)은 ras RNA를 95%까지 감소시켰다.
올리고뉴클레오티드 2570 및 2503에 대해서도 야생형(즉, 활성화되지 않은) H-ras 코돈 12를 갖는 HeLa 세포에서 ras 발현에 대한 효과를 측정했다. 상기 올리고뉴클레오티드 모두가 (활성화된 코돈 12를 갖는) T24 세포에서 ras 발현을 저해하였지만, ras AUG와 특이적으로 잡종화 가능한 올리고뉴클레오티드(2503)만이 HeLa 세포에서 ras 발현을 저해하였다. 활성화된 코돈 12와 특이적으로 잡종화 가능한 올리고뉴클레오티드 2570(서열번호: 3)은 HeLa세포에서 ras 발현을 저해하지 않았는데, 이것은 이들 세포에서 활성화된 코돈 12 표적이 결여되었기 때문이다.
활성화된 H-ras의 코돈 12 지역에 상보적인 17-mer 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드인 2570과, 2570과 동일한 염기서열을 갖고 각각 5, 7 및 9 염기의 데옥시 갭을 갖는 키메라 포스포로티오에이트 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드 3980, 3985 및 3984(표 3에 기재됨)에 대해 (실시예 10에 기재된 대로) T24 세포에서 ras 발현의 저해를 시험하였다. 충분히 2'-데옥시(2'-deoxy)인 올리고뉴클레오티드 2570 및 세 키메라 올리고뉴클레오티드는 T24 세포에서 ras mRNA 수준을 감소시켰다. 화합물 3985 (7-데옥시 갭) 및 3984 (9-데옥시 갭)은 ras mRNA를 81%까지 감소시켰고; 화합물 3980 (5-데옥시 갭)은 ras mRNA를 61%까지 감소시켰다. 이 염기서열을 가지지만, 5-데옥시(4689) 또는 7-데옥시(4690) 갭의 양 측면에 위치하는 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드를 가지는 키메라 올리고뉴클레오티드는 T24 세포에서 ras mRNA 발현을 저해하였고, 7-데옥시 갭이 바람직하였다(82% 저해, vs. 5-데옥시 갭을 가지는 2'-플루오로 키메라에 대해서는 63% 저해).
암세포 증식에 있어서 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
활성화된 ras의 코돈 12 지역에 상보적인, 동일 염기서열(서열번호: 3)을 갖는 세 17-mer 올리고뉴클레오티드에 대해 실시예 11에 기재된 바와 같이 T24 암세포의 증식에 대한 효과 실험을 하였다. 3985는 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 양 측면에 존재하는 7-데옥시 갭을 가지며, 4690은 2'-F 뉴클레오티드가 양 측면에 존재하는 7-데옥시 갭을 갖는다(모두 포스포로티오에이트). 암세포 증식에 대한 이들 올리고뉴클레오티드의 효과는 노던 블랏 분석에 의해 나타난 ras mRNA 발현에 대한 그들의 효과와 상관관계가 있다: 올리고뉴클레오티드 2570은 세포증식을 61%까지 저해하였고, 2'-O-메틸 키메라 올리고뉴클레오티드 3985는 82%까지 세포증식을 저해했으며, 2'-플루오로 키메라 유사체는 93%까지 세포증식을 저해하였다.
세포증식에 대한 이들 올리고뉴클레오티드의 투여량-반응을 연구해 본 결과, 저해는 25∼100nM의 투여량에 의존함을 나타내었다. 올리고뉴클레오티드 4690, 3985 및 2570의 IC50값은 각각 44nM, 61nM 및 98nM이었다. 랜덤 올리고뉴클레오티드 대조군은 시험된 투여량에서 이러한 효과를 나타내지 않았다.
세포증식에 대한 ISIS 2570의 효과는 세포형태에 특이적이었다. 이 올리고뉴클레오티드에 의한 T24 세포증식의 저해는 동일 올리고뉴클레오티드(100nM 올리고뉴클레오티드 농도)에 의한 HeLa 세포의 저해보다 4배나 강했다. ISIS 2570은 T24에 존재하지만 야생형의 코돈 12를 갖는 HeLa 세포에서는 없는 활성화된(돌연변이) ras 코돈 12에 표적된다.
주쇄가 변형된 키메라 올리고뉴클레오티드
상기에서 논의된 올리고뉴클레오티드는 균일한 포스포로티오에이트 주쇄를 가졌다. 상기 2' 변형된 키메라 올리고뉴클레오티드는 균일한 포스포디에스테르 주쇄에서는 활성을 나타내지 않는다. 갭 지역은 P=S 주쇄를 가지며, 양측에 P=O 주쇄를 가지며, 5-뉴클레오티드 데옥시 갭의 양 측면에 존재하는 2'-O-메틸 지역을 갖는 키메라 올리고뉴클레오티드를 합성하였다(ISIS 4226). 갭에서 P=O 주쇄를, 그리고 양 측면 지역에서 P=S 주쇄를 가지는 다른 키메라 올리고뉴클레오티드를 제조하였다(ISIS 4223). 이러한 올리고뉴클레오티드를 표 7에 나타냈다.
전체가 2'-데옥시이고 하나의 포스포디에스테르(ISIS 4248), 두 개의 포스포디에스테르(ISIS 4546), 세 개의 포스포디에스테르(ISIS 4551), 네 개의 포스포디에스테르(ISIS 4593), 다섯 개의 포스포디에스테르(ISIS 4606) 또는 열 개의 포스포디에스테르 결합(ISIS 4241)을 분자 중심에 포함하는 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 또 다른 올리고뉴클레오티드를 합성했다. 이들 올리고뉴클레오티드도 표 7에 나타내었다.
Dignam 외(Nucleic Acids Res. 1983, 11, 1475-1489)는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 분해에 대한 민감성(sensitivity)을 위해 37℃에서 원료(crude) HeLa 세포 추출물에서 배양했다. 포스포로티오에이트/2'-O-메틸 윙(wing) 사이에 5-디에스테르 갭을 가진 올리고뉴클레오티드(4233)의 T1/2는 7시간이었다. 포스포로티오에이트/2'-O-메틸 분자에서 5-포스포로티오에이트 갭을 가진 올리고뉴클레오티드의 T1/2은 30시간이었다. 1∼10의 디에스테르 결합을 가진 올리고뉴클레오티드의 세트에서, 하나의 포스포디에스테르 결합을 가진 올리고뉴클레오티드(4248)는 완전한 포스포로티오에이트 분자인 ISIS 2570과 같이 뉴클레아제에 대해 안정하여 HeLa 세포 추출물 중에서 5시간 경과 후에도 분해되지 않았다. 2, 3 및 4-디에스테르 갭을 가진 올리고뉴클레오티드의 T1/2은 각각 5.5시간. 3.75시간 및 3.2시간이었고 5 및 10 데옥시 결합을 가진 올리고뉴클레오티드의 T1/2은 각각 1.75시간 및 0.9시간이었다.
주쇄(backbone) 변형된 키메릭 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성
안티센스 활성에는 균일한 포스포로티오에이트 주쇄가 필요하지 않다. ISIS 4226 및 ISIS 4233을 ISIS 2570(충분히 포스포로티오에이트/모두 데옥시), ISIS 3980(충분히 포스포로티오에이트/데옥시 갭을 가진 2'-O-메틸 윙) 및 ISIS 3961(충분히 포스포디에스테르/데옥시 갭을 가진 2'-O-메틸 윙)과 함께 실시예 2∼5에 기재된 대로 ras 발현에 대한 영향을 ras-루시페라제 수용체 계로 시험하였다. P=S(즉, 뉴클레아제 내성) 갭 지역을 갖는 모든 올리고뉴클레오티드는 ras 발현을 저해하였다. 분자 중심에 하나의 포스포디에스테르(ISIS 4248) 또는 열 개의 포스포디에스테르 결합(ISIS 4241)을 포함하는 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 두 개의 완전히 2' 데옥시인 올리고뉴클레오티드에 대해서도 활성에 대하여 검정하였다. 하나의 P=O를 포함하는 화합물은 완전한 P=S 분자와 같이 활성이 있었으나, 열 개의 P=O를 포함하는 동일화합물은 완전히 불활성이었다.
7-염기 데옥시 갭 지역에만 포스포로티오에이트 주쇄를 갖고, 양 측면 지역의 각각이 2'-O-메틸 또는 2'-O-프로필인 포스포디에스테르를 갖는 서열번호 3의 키메릭 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 2'-O-프로필 디에스테르 양 측면 지역을 갖는 올리고뉴클레오티드는 ras 발현을 저해할 수 있었다.
변형된 염기를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 ras-루시페라제 유전자 발현의 저해
활성화된 ras의 코돈-12 점 돌연변이에 상보적인 일련의 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 돌연변이된 코돈 12의 우라실에 대해 상보적인 위치에서 2-(아미노)아데닌을 갖도록 합성하였다. 아데닌의 2-위치에서 아미노기가 우라실의 2-위치의 산소와 수소결합을 형성할 수 있기 때문에, 일반적인 두 개의 수소결합 대신 세 개의 수소결합이 형성된다. 이것은 활성화된 ras 유전자에 대한 2-(아미노)아데닌-변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 잡종화를 매우 안정화시키는 반면, 야생형 코돈 12에 대한 이 올리고뉴클레오티드의 안정성에는 아무 효과가 없거나 불안정화시키는데, 이는 이 위치에서의 변형된 A-G 미스매치 때문이다. 이것은 바람직하게 표적에 대한 변형된 올리고뉴클레오티드의 특이성을 증가시키게 된다.
달리 변형되지 않은 균일한 포스포로티오에이트 17-mer에서 이 위치에 단일의 2,6-(디아미노)아데노신을 갖는 올리고뉴클레오티드(염기서열은 2570, 서열번호: 3과 동일)는 최소한 2570 염기서열만큼 RNase H 기질로서 효과적이었다. 따라서, 효과적인 안티센스 분자가 될 것으로 예견된다. 동일 염기서열의 데옥시 갭된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 이 위치에서 단일의 2,-(디아미노)아데노신을 갖는 올리고뉴클레오티드도 RNase H 활성을 나타낸다.
생체내(in vivo) 항-종양 데이터
실시예 13 및 14에 기재된 대로 ISIS 2503(서열번호: 2)의 생체내 사람 종양에 대한 활성을 평가하였다. 이 연구는 누드 마우스들(nude mice)의 피하에 이식되어 이식부위에서 종양을 성장시키는 사람의 폐 선암 세포주(A549)를 사용함으로써 이루어졌다. 상기 세포는 H-ras 유전자에 돌연변이를 발생하게 하지는 않으나 정상 H-ras를 발현시키므로, AUG-배향된 올리고뉴클레오티드 ISIS 2503에 대해서만 항-암 활성을 평가하였다.
첫 번째 연구에서, 식염수에 용해되어 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 20 mg/kg의 투여량으로 복강내 주사를 통하여 투여했다. 투약 치료는 종양이 처음으로 보였을 때(종양세포 접종 후 28일) 시작했고, 2일에 한번씩 처리하였다. 도 4에 도시한 바와 같이, 비상관 대조 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 ISIS 1082(서열번호: 55)로 처리한 후, 종양 성장에 대한 효과는 나타나지 않았다. 그러나, H-ras-특이성 올리고뉴클레오티드 ISIS 2503(서열번호: 2)에 대해서는 현저한 종양 성장의 저해가 관찰되었다. H-ras 화합물의 항-종양 효과는 투약 후 20일째에 처음 관찰되었고 실험 기간동안 계속 지속되었다.
두 번째 연구에서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 양이온 지질 조성물(DMRIE:DOPE)로 제조되어, 실시예 15에 기재한 대로 피하 주사를 통하여 투여되었다. 투약은 종양 세포 접종 후 일주일에 시작하였고 4주 동안만 일주일에 세 번씩 시행하였다. 첫 번째 연구에서 관찰된 바와 같이, H-ras-특이성 화합물 ISIS 2503(서열번호: 2)은 종양 성장에 현저한 감소를 일으키는 반면, 비상관 대조 올리고뉴클레오티드(ISIS 1082)는 뚜렷한 효과를 나타내지 않았다(도 5). 종양 부피의 감소는 종양이 가시적으로 나타난 후 20일에 처음 관찰되었고, 나머지 기간 동안 계속되었다.
2'-변형된 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드의 세포내 안정성
세포내 안티센스 활성을 위하여 뉴클레아제 안전성을 부여하기 위해서는 올리고뉴클레오티드의 변형이 필요하다. 당의 2' 위치에서의 변형은 특정한 주쇄 변형 없이 세포내 안티센스 효과를 나타내기에 충분할 만큼의 뉴클레아제 내성을 부여하는 것을 알 수 있었다. 균일하게 2'-프로폭시 변형된 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드(서열번호: 3)는 같은 염기서열을 갖는 포스포로티오에이트 2'-데옥시올리고뉴클레오티드와 동일한 수준에서 투여 후 24시간에 T24 세포의 H-ras 발현을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 균일한 2'-메톡시 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드도 동일한 활성을 나타냈다. 2'-펜톡시 변형도 적어도 2'-프로폭시 만큼의 활성을 나타냈다.
Ki-ras에 대해 활성을 나타내는 안티센스 올리고뉴클레오티드
올리고뉴클레오티드는 사람의 Ki-ras 종양유전자의 5'-비번역 지역, 3'-비번역 지역 및 암호화 지역에 상보적이 되도록 고안되었다(McGrath, J.P. 외, Nature, 1983, 304, 501-506). 상기 암호화 지역에 상보적인 올리고뉴클레이티드는 Ki-ras-매개된 형질전환을 일으키는 돌연변이 부위로 알려진 코돈 12 및 61, 그리고 형질전환에 관련되지 않는 것으로 알려진 코돈 38에 표적된다. 올리고뉴클레오티드는 표 8에 나타냈다.
Ki-ras 종양유전자에 있어서, 코돈 12에서 돌연변이를 포함하는 세 개의 결장암 세포주를 저해하는 안티센스 활성에 대해 열 두 개의 Ki-ras-특이성 올리고뉴클레오티드를 검색하여, Ki-ras mRNA 수준을 측정, 평가하였다. 도 6에 도시한 바와 같이, 시험 화합물의 절반이 Ki-ras 전사에 대한 현저한 활성(적어도 40% 저해)을 나타냈고 가장 활성인 화합물은 5'- 및 3'-비번역 지역에 표적된 것이다. 그러나 Ki-ras 발현의 현저한 저해는 야생형 코돈 12 및 61에 대해 유도된 화합물에서도 관찰되었다. 뚜렷한 활성을 나타내는 화합물은 시험된 세 개의 암 세포주 모두에 효과적이었다.
이 화합물의 투여량 반응 검정법은 5'-UTR에 표적된 ISIS 6958 및 ISIS 6957이 이 계열의 올리고뉴클레오티드 가운데 가장 강력한 Ki-ras 저해자라는 것을 나타내었다. 상기 올리고뉴클레오티드들에 대해 Ki-ras 형절전환된 세포주의 증식을 저해하는 능력을 관찰하였다. 결장암 세포주 SW480을 단일 투여량의 올리고뉴클레오티드(200nM)로 처리하고, 5일에 걸쳐 세포수를 측정하였다. 도 7에 도시한 바와 같이, Ki-ras 특이성을 나타내는 올리고뉴클레오티드는 양자 모두 SW480 세포의 증식에 대해 효과적인 저해자이며, ISIS 6957(서열번호: 21)이 ISIS 6958(서열번호: 20) 보다 더 큰 활성을 나타낸다. 이러한 활성의 차이는 Ki-ras mRNA 발현의 저해와 상관관계가 있다(도 6).
정상 Ki-ras와 비교한 돌연변이 Ki-ras의 저해 선택성
Ki-ras에 표적된 올리고뉴클레오티드를 관찰하여 정상 Ki-ras에 비해 돌연변이 Ki-ras를 선택적으로 저해하는 능력을 살펴보았다. 두 개의 세포주는 돌연변이 Ki-ras를 발현하는 SW480 세포주(코돈 12, G→T 전환) 및 정상 Ki-ras를 발현하는 세포주(HeLa)를 사용하였다. Ki-ras의 5'-비번역 지역에 표적된 20-mer 포스포로티오에이트인 ISIS 6957(서열번호: 21)과 Ki-ras 코돈 12 지역에 표적된 15-mer 포스포로티오에이트인 ISIS 7453(서열번호: 32)의 두 올리고뉴클레오티드를 시험했다. 처리 후 24시간에 Ki-ras mRNA 수준을 측정하였다. 코돈-12 유도된 화합물을 돌연변이 Ki-ras를 발현하는 세포주에 효과적이었다(87% 저해 vs. HeLa 세포에서는 18% 저해). 그러나 5'-비번역 지역에 표적된 Ki-ras 올리고뉴클레오티드는 두 세포주에서 모두 Ki-ras 발현에 대한 유력한 저해자이다(95% 저해). 돌연변이 Ki-ras에 대한 선택성은 올리고뉴클레오티드 농도와 RNA 표적에 대한 친화도에 의존하는 것을 알 수 있었다.
데옥시 갭을 갖는 Ki-ras 올리고뉴클레오티드
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드(서열번호: 21, Ki-ras의 5'-비번역 지역에 표적됨)를 6 또는 8 뉴클레오티드 길이의 중심 2'-데옥시 갭 지역의 양 측면에 2'-O-메틸 변형을 갖도록 합성하였다. 갭이 형성된 올리고뉴클레오티드는 노던 블랏 분석으로 측정했을 때 양자 모두 Ki-ras 발현에 대해 활성을 나타냈다. 균일하게 2'-O-메틸화된 화합물(데옥시 갭 없음)은 비활성이었다. 다른 올리고뉴클레오티드, ISIS 7679(서열번호: 33, Ki-ras의 5' 비번역/AUG 지역에 상보적임)도 6- 또는 8- 뉴클레오티드 데옥시 갭을 갖도록 합성하였을 때 활성을 나타냈다.
ISIS 2503(H-ras)의 2'-메톡시에톡시 유사체
일련의 키메릭 올리고뉴클레오티드들은 ISIS 2503 염기서열(서열번호: 2) 및 다양한 2'-메톡시에톡시(2'-MOE) 변형의 배열들로 합성되었다. 이와 같은 것을 하기 표 9에 나타내었다. 모든 주쇄 결합은 포스포로티오에이트이다.
상기 올리고뉴클레오티드들(13919 및 13927을 제외한)의 T24 세포내 H-ras mRNA 수준의 감소 능력에 대하여 실시예 10에 기재된 바에 따라서(올리고뉴클레오티드 및 리포펙틴을 OptiMEM내에 혼합하고, 100nM의 올리고뉴클레오티드 당 2.5μg/ml의 리포펙틴이 함유되도록 일정하게 유지한 것을 제외하고는) 시험하였다. 모든 시험된 화합물은 모(parent) 화합물인 ISIS 2503에 견줄만한 활성을 나타내었고, IC50도 50nM 이하로 나타났다. 이러한 이유 때문에, 하나 이상의 2'-MOE 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 ras 발현을 감소시키는 데에 있어서 바람직하다. 상기 화합물에 대한 투약 반응은 도 8에 나타내었다. ISIS 13177(TCAGTAATAGCCCCACATGG; 서열번호: 34)은 서열번호: 2에 대해 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드 스크램블된(scrambled) 대조군이다.
ISIS 2503(H-ras)의 MMI 유사체
일련의 키메릭 올리고뉴클레오티드들은 ISIS 2503 염기서열(서열번호: 2) 및 다양한 메틸렌(메틸리미노) 주쇄 결합으로 합성되었다. 이러한 것은 표 10에 나타내었다. 합성을 용이하게 하기 위하여, MMI 결합을 통합시키는 이량체(dimer)들을 상기 올리고뉴클레오티드를 만드는데 있어서 사용하였다. MMI 주쇄 결합을 포함하는 이량체들은 진한 글씨로 표시하였다. "o" 는 MMI 이량체를 연결하는 포스포디에스테르 결합을 나타낸 것이다. "s" 는 MMI 이량체를 연결하는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸 것이다. 표시가 되지 않은 결합들은 모두 포스포로티오에이트들이다.
상기 화합물들은 T24 세포내 H-ras mRNA 수준을 감소시키는 능력에 대하여 실시예 10에 기재된 바에 따라서(올리고뉴클레오티드 및 리포펙틴을 OptiMEM내에 혼합하고, 100nM의 올리고뉴클레오티드 당 2.5μg/ml의 리포펙틴이 함유되도록 일정하게 유지한 것을 제외하고는) 시험하였다. 도 9에 도시한 바와 같이, 상기 화합물 모두는 500nM 이하의 투약 수준에서 80% 이상까지 mRNA 수준을 감소시킬 수 있었다. ISIS 13177(서열번호: 34)은 서열번호: 2에 대한 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드 스크램블된 대조군이다. ISIS 14899를 제외한, 모든 MMI 화합물들은 ISIS 2503인 모(parent) 데옥시포스포로티오에이트 화합물보다 효과적이었다. 여러 화합물들(ISIS 14896, 14897 및 14898)은 ras mRNA가 거의 완전하게 소멸되었다. 하나 이상의 MMI 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 ras 발현을 감소시키는데 있어서 매우 바람직한 것이다.
N-ras에 대해 활성을 나타내는 안티센스 올리고뉴클레오티드
일련의 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드들은 공개된 염기서열(Genbank 수탁 번호 HSNRASR, x02751)을 이용하여 사람 N-ras를 표적하도록 고안되었다. 상기 화합물들은 T24 세포들의 N-ras 수준을 감소시키는 능력에 대하여 측정되었으며, N-ras cDNA 프로브(Oncogene Science, Cambridge MA로부터 구입한 것으로 카탈로그 번호 HP129)를 이용한 것과, 올리고뉴클레오티드와 리포펙틴이 100nM의 올리고뉴클레오티드 당 2.5μg/ml의 리포펙틴이 함유되도록 일정하게 유지한 것을 제외하고는 실시예 10과 동일한 방법으로 수행되었다.
상기 올리고뉴클레오티드 및 각각의 N-ras mRNA가 감소된 %를 표 11에 나타내었다. 서열번호: 44, 45, 46, 47, 49 및 52를 갖는 올리고뉴클레오티드는 진한 글씨로 표시하였고, 300nM의 투약량으로 스크리닝하였을 때 ras mRNA가 30% 이상 감소되었고, 그리고 이러한 검정법에서 활성을 나타냈다. 그러므로 상기 염기서열들이 바람직하다. 상기 올리고뉴클레오티드 중 14686, 14687, 14688, 14691 및 14694(서열번호: 44, 45, 46, 49 및 52)는 50% 이상 저해됨이 관찰되었다. 올리고뉴클레오티드 14677, 14678, 14686, 14687, 14688, 14689, 14690, 14691, 14692, 14693 및 14694에 대한 투약 반응 곡선이 얻어졌다. 상기 곡선을 도 10에 나타내었다. 도면에서 알 수 있듯이 ISIS 14686 및 ISIS 14691(각각 서열번호: 44 및 49)은 400nM 투약량에서 N-ras mRNA를 거의 완전히 소멸시켰다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며 이를 제한하고자 하는 것은 아니다.
발명의 요약
본 발명은 사람의 ras 유전자에 표적된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그 이용방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 사람의 H-ras, Ki-ras 및 N-ras를 암호화하는 mRNA에 표적된 올리고뉴클레오티드를 제공하며, ras 유전자의 발현을 저해할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 사람의 N-ras의 5' 비번역 지역, 번역 개시 부위, 암호화 지역 또는 3' 비번역 지역에 표적된 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 또한 ras 유전자의 발현을 조절하며, 암세포의 증식을 억제하고, 그리고 ras에 관련된 상태를 치료하는 방법이 제공된다. 이러한 방법들은 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써 가능하다.
실시예 1
올리고뉴클레오티드의 합성 및 특성화
비변형된 올리고데옥시뉴클레오티드들은 자동화된 오요드에 의해 산화된 표준 포스포아미디트(phosphoramidite) 캐미스트리를 이용한 자동화된 DNA 합성기(Applied Biosystems model 380B)상에서 합성되었다. β-시아노에틸디이소프로필-포스포아미디트를 Applied Biosystems(Foster City, CA)로부터 구입하였다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 얻기 위하여, 표준 산화 용기는 포스파이트 결합의 단계적 티에이션(thiation)이 이루어지도록 아세토니트릴에 용해된3H-1,2-벤조디티올-3-원 1,1-디옥사이드의 0.2M 용액으로 교환되었다. 티에이션 순환 정지 단계는 68초까지 증가되었고, 캡핑 단계가 뒤따라 이어졌다.
2'-메톡시 올리고뉴클레오티드는 테트라졸 및 염기의 펄스 전달 후 정지 단계가 360초까지 증가되는 것을 제외한, 2'-메톡시 β-시아노에틸디이소프로필-포스포아미디트(Chemgenes, Needham, MA) 및 비변형된 올리고뉴클레오티드에 대한 표준 순환을 이용하여 합성되었다. 다른 2'-알콕시 올리고뉴클레오티드는 이러한 방법을 변형하여 합성되었고, Glen Research, Inc., Sterling, VA로부터 입수 가능한 바람직한 2'-변형된 아미디트를 이용함으로써 합성되었다.
2'-플루오로 올리고뉴클레오티드는 Kawasaki 외, J. Med. Chem. 1993, 36, 831-841에 기재되어 있는 바와 같이 합성되었다. 간단히 말하자면, 보호된 뉴클레오시드인 N6-벤조일-2'-데옥시-2'-플루오로아데노신은 출발물질인 9-β-D-아라비노푸라노실아데닌을 이용함으로써 합성되었고, 2-α-플루오로 원자가 2'-β-O-트리필 기(group)의 SN2-치환에 의하여 도입되는 변형된 절차에 의하여 합성되었다. 이와 같이 N6-벤조일-9-β-D-아라비노푸라노실아데닌은 3',5'-디테트라히드로피라닐(THP) 중간체로써 적절히 산출되어 선택적으로 보호되었다. THP 및 N6-벤조일 기(group)의 디프로텍션(deprotection)은 표준 방법에 의하여 이루어졌으며, 표준 방법들은 5'-디메톡시트리틸-(DMT) 및 5'-DMT-3'-포스포아미디트 중간체를 얻기 위하여 이용되었다.
2'-데옥시-2'-플루오로구아노신의 합성은 출발물질로 테트라이소프로필디실록사닐(TPDS) 보호된 9-β-D-아라비노푸라노실구아닌을 이용하고 그 결과 중간체인 디이소부티릴-아라비노푸라노실구아노신으로 전환됨으로써 이루어졌다. TPDS 기를 디프로텍션하고, THP로 히드록실기를 보호한 후 디이소부티릴 디-THP 보호된 아라비노푸라노실구아닌을 제공되었다. 선택적 O-디아실화(O-deacylation) 및 트리플레이션(triflation)은 플루오르화물과 함께 원료 생산물에 처리함으로써 이루어졌고, 그 다음 THP 기를 디프로텍션하였다. 표준 방법들은 5'-DMT- 및 5'-DMT-3'-포스포아미디트를 얻기 위하여 이용되었다.
2'-데옥시-2'-플루오로우리딘은 2,2'-안하이드로-1-β-D-아라비노푸라노실우라실을 70% 수소 플루오로화물-피리딘으로 처리한 공지된 방법의 변형에 의하여 합성되었다. 표준 절차들은 5'-DMT 및 5'-DMT-3'-포스포아미디트를 얻기 위하여 이용되었다.
2'-데옥시-2'-플루오로시티딘은 2'-데옥시-2'-플루오로우리딘의 아민화를 통하여 합성되었고, 선택적인 보호를 통하여 N4-벤조일-2'-데옥시-2'-플루오로시티딘을 제공하였다. 표준 절차들은 5'-DMT 및 5'-DMT-3' 포스포아미디트를 얻기 위하여 이용되었다.
2'-(2-메톡시에틸)-변형된 아미디트(amidite)는 Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504에 개시된 바에 의하여 합성되었다. 합성을 용이하게 하기 위하여, 가장 마지막 뉴클레오티드는 데옥시뉴클레오티드로 하였다. 2'-O-CH2CH2OCH3-시토신들은 5-메틸 시토신일 수 있다.
5-메틸 시토신 단량체의 합성:
2,2'-안하이드로[1-(β-D-아라비노푸라노실)-5-메틸루리딘]
5-메틸루리딘(리보실티민, Yamasa(Choshi, Japan)을 통하여 상업적으로 입수 가능함)(72.0g, 0.279M), 디페닐 카보네이트(90.0g, 0.420M) 및 중탄산나트륨(2.0g, 0.024M)을 DMF(300mL)에 첨가하였다. 상기에서 얻어진 혼합물을 역류하도록 교반하면서 가열하고, 이산화탄소를 조절된 방식으로 분출하도록 하였다. 1시간 후, 상기 혼합물은 약간 탁해진 용액이 되었으며, 감소된 압력하에서 농축되었다. 여기에서 생성된 시럽(syrup)을 디에틸에테르(2.5L)에 천천히 교반하면서 부었다. 생성물은 고무질로 형성되었다. 상기 에테르를 가만히 따라 내고, 그 잔여물을 소량의 메탄올(ca. 400mL)에 용해시켰다. 상기 용액을 순수한 에테르(2.5L)에 붓고, 그 결과 단단한 고무질이 형성되었다. 상기 에테르를 가만히 따라 내고, 여기에서 형성된 고무질을 진공 오븐(60℃, 1mmHg, 24시간 동안)에서 건조시켜 밝은 황갈색의 분말이 되도록 부수었다(57g, 85% 초기 수율(crude yield)). 상기 물질은 다음 반응을 위하여 이용되었다.
2'-O-메톡시에틸-5-메틸루리딘
2,2'-안하이드로-5-메틸루리딘(195g, 0.81M), 트리스(2-메톡시에틸)보레이트(231g, 0.98M) 및 2-메톡시에탄올(1.2L)을 2L의 스테인레스 스틸 압력 반응기에 첨가하여 160℃로 예열된 오일 배스에 두었다. 155∼160℃에서 48시간 동안 가열한 후에, 상기 반응기를 개방하여, 상기 용액을 건조하게 증발시켰고, MeOH(200mL)로 분쇄(trituration)하였다. 여기에서 남은 잔여물들을 뜨거운 아세톤(1L)에 현탁하였다. 불용성 염들을 여과하고, 아세톤(150mL)으로 세척하고, 그리고 여과물들을 증발시켰다. 여기에서 남은 잔여물(280g)을 CH3CN(600mL)에 용해시키고, 증발시켰다. 실리카 겔 칼럼(3kg)은 0.5% Et3NH를 함유하는 CH2Cl2/아세톤/MeOH(20:5:3)으로 충진되었다. 잔여물을 CH2Cl2(250mL)에 용해시켰고, 칼럼에 로딩하기 전에 실리카(150g)에 흡착시켰다. 여기에서 생성된 생성물을 충전 용매와 합께 유출시켜 160g(63%)의 생성물이 제공되었다.
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸루리딘
2'-O-메톡시루리딘(160g, 0.506M)을 피리딘(250mL)으로 공증발시켰고, 상기에서 건조된 잔여물을 피리딘(1.3L)에 용해시켰다. 처음으로 디메톡시트리틸 클로라이드(94.3g, 0.278M)를 분주하면서 첨가하였고, 여기에서 생성된 혼합물을 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 두 번째로 디메톡시트리틸 클로라이드(94.3g, 0.278M)를 분주하면서 첨가하였고, 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 메탄올(170mL)을 이용하여 반응을 종결시켰다. HPLC는 약 70% 생성물의 존재를 나타내었다. 용매는 증발되었고, CH3CN(200mL)로 분쇄(trituration)하였다. 상기 잔여물은 CHCl3(1.5L)에서 용해되었고, 포화 NaHCO32×500mL 및 포화 NaCl 2×500mL로 추출되었다. 유기상을 Na2SO4로 건조하였고, 여과한 후 증발시켰다. 275g의 잔여물이 획득되었다. 여기에서 남은 잔여물을 0.5% Et3NH를 함유하는 EtOAc/헥산/아세톤(5:5: 1)으로 충진된 실리카 겔 칼럼(3.5kg)상에서 정제하였다. 순수한 분획들이 증발되어 164g의 생성물을 제공하였다. 약 20g의 부산물이 순수한 분획들로부터 획득되어 183g(57%)의 총 수율이 제공되었다.
3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸루리딘
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸루디린(106g, 0.167M), DMF/피리딘(562mL의 DMF 및 188mL의 피리딘이 3 : 1의 비율인 혼합물 750mL) 및 아세틱 안하이드리드(24.38mL, 0.258M)이 결합되었고 24시간 동안 상온에서 교반되었다. 반응은 MeOH를 첨가하여 종결되었으며, tlc 샘플로 점검하였다. tlc에 의하여 판단해 보았을 때 반응이 종결되었을 때, MeOH(50mL)이 첨가되었고, 혼합물은 35℃에서 증발되었다. 상기 잔여물을 CHCl3(800mL)에서 용해시켰고, 포화 중탄산나트륨 2×200mL 및 포화 NaCl 2×200mL로 추출하였다. 결합된 유기상들은 황산나트륨으로 건조되어 증발된 결과, 122g의 잔여물이 제공되었다(약 90% 생성물). 상기 잔여물을 3.5kg 실리카 겔 칼럼상에서 정제하였고, EtOAc/헥산(4 : 1)을 이용하여 용출시켰다. 순수한 생성물 분획들을 증발시킨 결과 96g(84%)이 생성되었다.
3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-4-트리아졸우리딘
첫 번째 용액은 CH3CN(700mL)에 용해된 3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸루리딘(96g, 0.144M)을 용해시켜 제조하여 두었다. 트리에틸아민(189mL, 1.44M)을 CH3CN(1L)에 용해된 트리아졸(90g, 1.3M) 용액에 첨가하여 -5℃에서 냉각시켰고, 오버헤드 교반기를 이용하여 30분 동안 교반하였다. 0∼10℃에서 유지된 교반 용액에 POCl3를 30분 이상 동안 한 방울씩 첨가하였고 여기에서 생성된 혼합물을 2시간 동안 더 교반하였다. 상기 첫 번째 용액을 나중 용액에 45분 이상에 걸쳐 한 방울씩 떨어뜨리면서 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 냉장고에서 밤새 보관하였다. 반응 혼합물로부터 염들을 여과하였고, 상기 용액을 증발시켰다. 여기에 잔류하는 잔여물을 EtOAc(1L)에 용해시켰고, 불용성 고체들을 여과하여 제거하였다. 그 여과물을 NaHCO31×300mL 및 포화 NaCl 2×300mL로 세척하였고, 황산나트륨으로 건조시켜 증발시켰다. 여기에 잔류하는 잔여물을 EtOAc로 분쇄한 결과 본 실시예의 목적 화합물이 제공되었다.
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘
다이옥산(dioxane)(500mL) 및 NH4OH(30mL)에 용해되어 있는 3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-4-트리아졸우리딘(103g, 0.141M) 용액을 2시간 동안 상온에서 교반시켰다. 상기 다이옥산 용액을 증발시켜 그 잔여물을 MeOH(2×200mL)과 함께 공비혼합하였다. 상기 잔여물을 MeOH(300mL)에 용해시켰고, 2L의 스테인레스 스틸 압력 반응기로 옮겼다. NH3가스로 포화된 MeOH(400mL)를 첨가하였고, 상기 용기를 2시간 동안 100℃에서 가열하였다(tlc는 완벽하게 전환되었음을 나타내었다). 상기 용기에 있는 내용물들을 건조하게 증발시켰고, 그 잔여물을 EtOAc(500mL)에서 용해시켰고, 그리고 포화된 NaCl(200mL)로 한번 세척하였다. 상기 유기상을 황산나트륨으로 건조하였고, 상기 용매를 증발시킨 결과, 본 실시예의 85g(95%)의 목적 화합물이 제공되었다.
N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘(85g, 0.134M)을 DMF(800mL)에 용해시켰고, 벤조익 안하이드리드(37.2g, 0.165M)을 교반하면서 첨가하였다. 3시간 동안 교반한 후에, tlc는 반응이 약 95% 종결되었음을 나타내었다. 상기 용매는 증발되었고, 잔여물은 MeOH(200mL)로 공비혼합되었다. 상기 잔여물을 CHCl3(700mL)에 용해시키고, MgSO4로 건조시키고 증발시켜 96g의 잔여물을 제공하였다. 상기 잔여물을 용출 용매로 0.5% Et3NH를 함유하는 EtOAc/헥산(1 : 1)을 이용한 1.5kg 실리카 칼럼상에서 크로마토그래피하였다. 순수한 분획들이 증발되었고, 90g(90%)의 본 실시예의 목적 화합물이 제공되었다.
N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘-3'-아미디트
N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘(74g, 0.10M)을 CH2Cl2(1L)에 용해시켰다. 테트라졸 디이소프로필아민(7.1g) 및 2-시아노에톡시-테트라-(이소프로필)포스파이트(40.5mL, 0.123M)를 질소대기하에서 교반하면서 첨가하였다. 여기에서 생성된 혼합물을 상온에서 20시간 동안 교반하였다(tlc는 반응이 약 95% 종결되었음을 나타내었다). 상기 반응 혼합물을 포화된 NaHCO3(1×300mL) 및 포화된 NaCl(3×300mL)로 추출하였다. 수성의 세척될 것들은 CH2Cl2(300mL)로 역 추출하였고, 그 추출물들을 결합시켜, MgSO4로 건조시키고 농축하였다. 여기에서 얻어진 잔여물을 용출 용매로 EtOAc/헥산(3 : 1)을 이용한 1.5kg 실리카 칼럼상에서 크로마토그래피하였다. 순수한 분획들이 증발되었고, 90.6g(87%)의 본 실시예의 목적 화합물을 제공하였다.
5-메틸-2'-데옥시시티딘(5-me-C)을 함유한 올리고뉴클레오티드들은 상업적으로 이용 가능한 포스포아미디트(Glen Research, Sterling VA or ChemGenes, Needham MA)를 이용하여 공개된 방법에 따라 합성되었다.
메틸렌(메틸리미노)(MMI) 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드는 미국특허 제5,378,825호에 따라서 합성되었다. 합성을 용이하게 하기 위하여, MMI 결합을 포함하는 다양한 뉴클레오시드 이량체들이 합성되어 올리고뉴클레오티드 내로 통합되었다. 다른 질소-함유 주쇄들은 국제출원공개 제92/20823호에 의하여 합성되었다.
아미드 주쇄들을 갖는 올리고뉴클레오티드는 De Mesmaeker 외, Acc. Chem. Res. 1995, 28, 366-374에 개시된 바에 따라서 합성되었다. 아미드 부(amide moeity)는 간단하고 공지된 합성 방법에 의하여 쉽게 수득할 수 있으며, 올리고뉴클레오티드의 고체상 합성을 위하여 요구된 조건들에 부합할 수 있다.
모폴리노 주쇄(morpholino backbone)를 갖는 올리고뉴클레오티드는 미국특허 제5,034,506호에 따라서 합성되었다(Summerton 및 Weller).
펩티드-핵산(PNA) 올리고머들은 P.E. Nielsen 외, Science 1991, 254, 1497에 따라서 합성되었다.
제어된 포어 글래스 칼럼(Applied Biosystems)으로부터 분리하고 18시간 동안 55℃에서 농축된 암모늄 히드록시드내에서 디블러킹(deblocking)시킨 후, 올리고뉴클레오티드는 0.5M의 NaCl과 2.5배의 에탄올에 침전되어 정제되었다. 합성된 올리고뉴클레오티드를 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의하여 디네이츄링 겔(denaturing gel) 상에서 분석하였고, 적어도 85% 전장 물질임을 확인하였다. 합성을 통하여 얻어진 비교적 많은 양의 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 결합들을31P 핵 자기공명분광기를 이용하여 간헐적으로 점검하였고, 여러 연구들을 위하여 올리고뉴클레오티드들은 Chiang 외, J. Biol. Chem. 1991, 266:18162-18171에 기재된 바대로 HPLC에 의하여 정제되었다. HPLC-정제된 물질로 얻어진 결과들은 비-HPLC 정제된 물질에 의해 얻어진 것들과 유사하였다.
실시예 2
ras-루시페라제 수용체 유전자의 조립(assembly)
본 연구에 있어서 ras-루시페라제 수용체 유전자는 PCR 기술을 이용하여 조립되었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하여, 돌연변이(코돈 12) 및 비-돌연변이(야생형) 사람 H-ras 유전자 둘 다의 엑손 1의 5'-지역의 PCR 클로닝에 프라이머로 사용했다. c-H-ras1 활성화된 종양유전자(코돈 12, GGC→GTC)를 포함하는 플라스미드 pT24-C3, 및 c-H-ras 원시-종양유전자를 포함하는 pbc-N1을 ATCC(Bethesda, MD)로부터 입수하였다. 1.9kb 개똥벌레 루시페라제 유전자를 포함하는 플라스미드 pT3/T7 luc를 Clontech Laboratories(Palo Alto, CA)로부터 입수하였다. 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머는 돌연변이 및 비-돌연변이 H-ras 유전자를 주형으로 사용되었다. 상기 프라이머는 NheⅠ 및 HindⅢ 제한 엔도뉴클레아제 부위에 의해 양 측면이 둘러싸인 정상 및 돌연변이 H-ras의 염기서열 -53 내지 +65(번역개시 자리에 해당)에 상응하는 145 염기쌍의 DNA 생성물을 생성하는 것이다. 표준절차에 따라 PCR 생성물을 겔 정제하여 침전시키고 세척하여 물에 재현탁시켰다.
P. pyralis(개똥벌레) 루시페라제 유전자의 클로닝을 위한 PCR 프라이머는 PCR 생성물이 아미노 말단 메티오닌 잔기가 두 개의 아미노산, 아미노-말단 리신 잔기와 그 뒤의 루이신 잔기로 대치되는 것을 제외하고는 전장의 루시페라제 단백질에 대해 암호화하도록 고안되었다. 루시페라제 유전자의 클로닝에 사용되는 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머는 주형으로써 루시페라제 수용체 유전자를 포함하는 상업적으로 입수 가능한 플라스미드(pT3/T7-Luc)(Clontech)를 이용함으로써 표준 PCR 반응에 사용되었다. 이들 프라이머는 유일한 HindⅢ 및 BsshⅡ 제한 엔도뉴클레아제 자리가 양 측면에 존재하는, 루시페라제 유전자에 상응하는 약 1.9kb의 생성물을 생성시켰다. 표준절차에 따라 이 분획을 정제하고 침전시키고 세척하여 물에 재현탁시켰다.
ras-루시페라제 융합 수용체 유전자의 조립을 완성시키기 위하여, ras 및 루시페라제 PCR 생성물을 적당히 제한 엔도뉴클레아제로 절단하였고, 그리고 제한 엔도뉴클레아제 NheⅠ, HindⅢ 및 BsshⅡ를 이용하여 스테로이드-유도 가능한 쥐의 유방암 비루스 프로모터 MMTV를 함유하는 발현 벡터내에 세 부분을 리게이션(ligation)하여 클론하였다. 그 결과로 생성된 클론은 개똥벌레의 루시페라제 유전자로 프레임에 융합된 H-ras 5' 염기서열(-53 내지 +65)의 삽입을 가져온다. 이렇게 생성된 발현 벡터는 스테로이드-유도 가능한 MMTV 프로모터의 조절하에서 발현되는 ras-루시페라제 융합 생성물을 암호화한다. 상기 플라스미드 구조는 개똥벌레의 루시페라제를 암호화하는 염기서열을 가진 프레임에 융합된 활성화된(RA2) 또는 정상(RA4) H-ras 단백질의 아미노산 1-22를 암호화하는 염기서열을 포함한다. ras-루시페라제 융합 mRNA의 번역 개시 코돈은 천연의(natural) H-ras AUG 코돈에 의존한다. 돌연변이 및 정상 H-ras 루시페라제 융합 구조는 표준 절차를 이용한 DNA 염기서열 분석법에 의해 확인되었다.
실시예 3
플라스미드 DNA 세포의 형질감염
Greenberg, M.E., Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman 및 K. Strahl, eds), John Wiley and Sons. NY에 기재된 바를 다음과 같이 약간 변형하여 형질감염시켰다. HeLa 세포를 60mm 접시에 한 접시당 5×10 세포만큼을 평판하고 10μg 또는 12μg의 DNA를 각 접시에 첨가하였는데, 그 중 1μg은 라우스 육종 비루스(RSV) 프로모터의 조절하에서 쥐의 글루코코르티코이드 수용체를 발현하는 벡터였고 그 나머지는 ras-루시페라제 수용체 플라스미드였다. 칼슘 포스페이트-DNA 공침전물을 3mM EGTA를 함유하는 트리스-완충된 식염수[50mM Tris-C1(pH7.5), 150mM NaCl]로 세척함으로써 16∼20 시간 후에 제거하였다. 10% 우 태아 혈청을 포함한 새 배양액을 세포에 첨가하였다. 이 때, 덱사메타손에 의해 수용체 유전자 발현이 활성화되기 전에 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 전처리하였다.
실시예 4
올리고뉴클레오티드로 처리된 세포
플라스미드 감염 후, 세포를 37℃로 예열된 인산염 완충된 식염수로 세척하고 5μg/mL N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA)를 포함하는 Opti-MEM을 각 플레이트에 가했다(웰 당 1.0ml씩). 각 플레이트에 50μM 용량의 올리고뉴클레오티드를 가하고 37℃에서 4시간 동안 배양했다. 배지를 제거하고 10% 우 태아 혈청을 함유하는 DMEM으로 교환하고 지정된 농도의 적정 올리고뉴클레오티드와 세포를 37℃에서 2시간 더 배양한 후, 덱사메타손으로 세포를 최종 농도가 0.2μM이 되도록 처리하여 수용체 유전자 발현을 활성화시켰다. 세포를 회수하여 덱사메타손 자극 후 15시간 동안 루시페라제 활성에 대하여 검증하였다.
실시예 5
루시페라제 분석
루시페라아제를 Greenberg, M.E., Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman 및 K. Strahl, eds), John Wiley and Sons, NY에서 기재된 대로 세제 트리톤 X-100으로 분해하여 세포로부터 추출하였다. Dynatech ML1000 발광계를 사용해 625μM로 루시페린(Sigma) 부가에 따른 피크 발광을 측정했다. 각 추출물에 있어서, 그 양을 달리 하여 여러 번 루시페라제 분석을 실시했는데 데이터는 분석한 결과 선형 범위로 모아졌다.
실시예 6
용융점 곡선
IBM PC 컴퓨터와 Gilford Response Ⅱ 분광기를 연결한 Gilford 260 분광기를 이용하여 260nm에서 흡광도 대 온도 곡선을 측정했다. 완충액은 100mM Na+, 10mM 인산염 및 0.1mM EDTA(pH7.0)를 함유하였다. 85℃에서 흡광도로부터 측정된 올리고뉴클레오티드 농도는 4μM이었고 흡광계수는 Puglisi and Tinoco, Methods in Enzymol. 1989, 180, 304-325에 기재된 바에 따라 계산했다. Tm값, 이중나선 형성의 자유에너지 및 결합 상수는 선형 기울기의 기본선을 갖는 두 상태 모형에 데이터를 일치시킴으로써 얻는다(Petersheim. M. and Turner, D.H., Biochemistry, 1983, 22, 256-263). 기록된 변수들은 최소한 세 실험의 평균치이다. 여러 개의 올리고뉴클레오티드에 대해 이중나선 형성의 자유에너지도 또한 Tm -1대 log10(농도)의 플롯으로부터 얻었다(Borer P.N., Dengler B., Tinoco I. Jr. 및 Uhlenbeck O.C., J. Mol. Biol. 1974, 86, 843-853).
실시예 7
겔 이동 분석
돌연변이 코돈 12를 포함하는 47-뉴클레오티드 헤어핀 구조의 ras 표적 전사체를 Lima 외, Biochemistry, 1992, 31, 12055-12061에 기재된 바에 따라 제조하고 검출하였다. 100mM 나트륨, 10mM 인산염, 0.1mM EDTA, 100 CPM의 T7-생성 RNA(약 10pM) 및 1 pM 내지 10μM 범위 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 20㎕에서 잡종화 반응이 이루어지도록 하였다. 반응물은 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 잡종화 후에 생성물을 45mM 트리스-보레이트 및 1mM MgCl2(TBM)로 만들어잔 20% 변성되지 않은 폴리아크릴 아미드 겔 상에서 분석결정하였다. 전기영동은 10℃에서 수행하였으며 Molecular Dynamics phosphorimager를 사용하여 정량하였다.
실시예 8
RNase H 분석
활성화된(코돈 12, G→U) H-ras mRNA의 +23에서 +47의 염기에 대응하는 화학적으로 합성한 25-염기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 RNase H 분석을 행하였다. 5' 말단-표지된 RNA를 20nM의 농도로 사용하여 20mM Tris-Cl(pH7.5), 100mM KCl, 10mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨, 10μg tRNA 및 4U RNasin을 함유하는 최종 부피가 10㎕인 반응액에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 10배 과량으로 하여 배양하였다. 반응 성분들을 15분 동안 37℃에서 예열시킨 후 서서히 실온으로 온도가 내려가도록 하였다. HeLa 세포 핵 추출액을 포유류 RNase H의 공급원으로 사용하였다. 반응은 핵 추출액 2μg(5㎕)의 첨가에 의해 개시되었으며 37℃에서 10분간 지속되도록 하였다. 페놀/클로로포름 추출에 의해 반응이 종료되었으며 RNA 성분을 에탄올로 침전시켰다. 7M 우레아를 함유하는 20% 폴리아크릴아마이드 겔 상에 동일 CPM들을 부하시켰고, RNA 분해 산물을 전기영동 후 자동방사선법으로 결정하고 가시화시켰다. 분해 산물의 정량은 Molecular Dynamics Densitometer를 사용함으로써 행해졌다.
실시예 9
ras 트랜스활성화 수용체 유전자계
향상성 SV40 프로모터의 조절하에서 활성화된(코돈 12, GGC→GTC) H-ras cDNA 삽입을 포함하는, 발현 플라스미드 pSV2-oil은 Dr. Bruno Tocque(Rhone-Poulenc Sante, Vitry, France)로부터 기증 받은 것이다. 이 플라스미드는 스테로이드-유도 가능한 쥐의 유방암 비루스(MMTV) 프로모터의 조절하에서 H-ras 발현 플라스미드를 PCR에 의해 제조하기 위한 주형으로 사용되었다. H-ras 암호화 서열을 얻기 위하여, H-ras 유전자의 570bp 암호화 지역을 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 프라이머는 클로닝을 용이하게 하기 위해 5'-지역에 유일한 제한 엔도뉴클레아제를 갖도록 고안되었다. H-ras 코돈 12 돌연변이 종양유전자의 암호화 지역을 포함하는 PCR 산물을 겔 정제하고, 분해하여 클로닝 전에 다시 한번 겔 정제하였다. 이 구조는 발현 플라스미드 pMAMneo(clontech Laboratories, CA)내로 삽입제를 클로닝함으로써 완성되었다.
ras-반응 수용체 유전자인 pRDO53는 ras 발현을 검출하기 위해 사용되었다(Owen 외, Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A. 1990, 87, 3866-3870).
실시예 10
생체내(in vivo) ras 발현의 노던 블랏(Northern blot) 분석
사람의 방광암 세포주 T24를 ATCC(Rockville MD)로부터 분양 받았다. 10% 열-활성화된 우 태아 혈청 및 페니실린과 스트렙토마이신이 각각 50 U/㎖로 보충된 L-글루타민(Gibco BRL, Gaithersburg MD)으로 McCoy's 5A 배지에서 세포를 성장시켰다. 세포를 100mm 평판에 접종하였다. 70%가 채워졌을 때, 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 평판을 예열된 PBS 10ml 및 2.5㎕ DOTMA를 함유하는 Opti-MEM 감소된-혈청 배지 5㎖로 세척하였다. 그 다음 올리고뉴클레오티드를 필요한 농도로 첨가하였다. 처리한지 4시간 후 배지를 McCoy's 배지로 대치하였다. 올리고뉴클레오티드 처리 후 48시간 후 세포를 회수하고 표준 CsCl 정제 방법을 사용하여 RNA를 분리하였다(Kingston R.E., in Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Strahl, eds.), John Wiley and Sons, NY).
사람의 상피 암 세포주인 HeLa 229를 ATCC(Bethesda, MD)로부터 입수하였다. 10% 우 태아 혈청 및 100U/㎖ 페니실린이 보충된 Dulbecco 변성된 Eagle 배지(DMEM)에서 6-웰 평판에 단일층으로 HeLa 세포를 유지시켰다. 올리고뉴클레오티드 처리 및 RNA 분리는 상기 T24 세포에 기재된 바와 같다.
노던 잡종화: 각각의 RNA 10μg을 1.2% 아가로스/포름알데히드 겔 상에서 전기영동을 하였고 표준방법에 따라 GeneBind 45 나일론 막(Pharmacia LKB)에 하룻밤동안 전이시켰다(Kingston, R.E., in Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Strahl, eds.) JohnWiley and Sons, NY). RNA는 막에 UV-교차결합시켰다. 이중-가닥32P-표지된 프로브를 프라임 유전자 표지 키트(Promega)를 사용하여 합성하였다. ras 프로브는 코돈-12에서 GGC가 GTC로 변화되는 돌연변이를 가진 활성화된(돌연변이된) H-ras mRNA의 cDNA 클론의 SalⅠ-NheⅠ분절이다. 대조 프로브는 G3PDH이었다. 블랏은 QuickHyb 잡종화 용액(Stratagene, La Jolla, CA)으로 68℃에서 15분 동안 예비 잡종화되었다. 10mg/㎖ 연어 혈청 DNA 100㎕와 혼합된 열-변성된 방사성 프로브(2.5×106계수/2㎖ 잡종화 용액)를 첨가하여 1시간 동안 68℃에서 막을 잡종화시켰다. 블랏을 실온에서 2×SSC/0.1% SDS에서 15분 동안 두 번 세척하였고 60℃에서 0.1×SSC/0.1% SDS로 30분 동안 한번 세척하였다. 블랏을 자동방사선 사진을 찍고 신호의 강도를 ImageQuant PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 정량하였다. 노던 블랏은 ras 프로브로 우선 잡종화시킨 후, 0.1×SSC/0.1% SDS 내에서 15분 동안 끓여서 떼어버리고, 그리고 대조 G3PDH 프로브로 재잡종화하여 올바르게 샘플이 로딩되었는지를 점검하였다.
실시예 11
암세포 증식에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
실시예 10에 기재된 대로 세포를 배양해 올리고뉴클레오티드로 처리했다. 세포를 60mm 플레이트에 접종하여 70%가 채워졌을 때 DOTMA의 존재하에서 올리고뉴클레오티드로 처리했다. 시간 경과 실험: 첫 날, 세포를 100nM을 최종 농도에서 올리고뉴클레오티드를 단 한번 처리했다. 3일째 성장 배지를 교환하고 5일 동안 매일 계수 챔버를 사용해 세포를 계수했다. 투여-반응 실험: 여러 가지 농도의 올리고뉴클레오티드(10, 25, 50, 100 또는 250nM)를 세포에 첨가하고 3일 후 세포를 회수하여 계수하였다. T24 암세포 증식에 대한 올리고뉴클레오티드 2570, 3985 및 4690의 효과를 시험했다.
실시예 12
2-(아미노)아데닌-치환된 올리고뉴클레오티드의 합성
하기 사항을 제외하고는 실시예 1에 기재한 대로 올리고뉴클레오티드를 합성하였다: 2-(아미노)아데닌이 바람직한 위치에서, 포스포아미디트를 상업적으로 입수 가능한 2-아미노데옥시아데노신 포스포아미디트(Chemgenes)로 치환했다.
실시예 13
A549 세포의 배양
A549 세포(ATCC로부터 입수함)를 1g 글루코스/ℓ 및 10% 우 태아 혈청(FCS, Irvine Scientific, Santa Ana, CA)을 함유하는 Dulbecco 변성된 Eagle 배지(DME)가 들어 있는 6-웰 플레이트(Falcon Labware, Lincoln Park, NJ)가 채워지도록 성장시켰다.
실시예 14
누드 마우스(nude mice)내의 사람의 종양 세포를 올리고뉴클레오티드로 처리 - 복강내 주사
사람의 폐암 세포 A549를 채취하여 5×106세포(200㎕)를 누드 마우스의 안쪽 대퇴에 피하 주사하였다. 뚜렷한 종양이 약 한달 후에 나타났다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 ISIS 2503 및 제조된 비상관 대조 올리고뉴클레오티드 1082(비상관 대조)를 쥐의 복강내로 체중 kg 당 20mg의 투여량으로 투여하였다. 10주간 격일 간격으로 투여했으며 이 기간동안 종양의 성장을 관찰했다.
실시예 15
누드 마우스내의 사람의 종양세포를 올리고뉴클레오티드로 처리함 - 양이온성 지질로 피하 주사함
사람의 폐암 세포 A549를 채취하여 5×106세포(200㎕)를 누드 마우스의 안쪽 대퇴에 피하 주사하였다. 뚜렷한 종양이 약 한달 후 나타났다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 ISIS 2503 및 양이온성 지질 조성물(DMRIE/DOPE, 60mg/kg)에서 제조된 비상광 대조 올리고뉴클레오티드 1082(투여량 5mg/kg)를 쥐의 종양부위에 피하로 투여했다. 암세포 접종 후 일주일에 투약을 시작했으며 4주간만 일주일에 두 번씩 행했고 총 9주 동안 종양 성장을 관찰했다.
실시예 16
T24 세포에서 2' 변형된 올리고뉴클레오티드의 안정성
T24 방광암 세포를 실시예 10에 기재된 대로 성장시켰다. 세포를 단일 투여량(1μM)의 올리고뉴클레오티드로 처리하고 24시간 후 노던 블랏 분석에 의해 H-ras mRNA 발현을 검정하였다. 시험을 거친 올리고뉴클레오티드는 H-ras 코돈 12에 표적된 17-mer, 즉 ISIS 2570(서열번호: 3)의 유사체였다.
실시예 17
세 개의 결장암 세포주에 대한 Ki-ras 올리고뉴클레오티드의 활성
사람의 결장암 세포주 Calu1, SW480 및 SW620을 ATCC로부터 분양받아 실시예 10에서의 HeLa 세포에 대해 기재한 대로 배양하고 보관하였다. 세포를 단일 투여량(200mM)의 올리고뉴클레오티드로 처리하고 24시간 후 노던 블랏 분석에 의해 Ki-ras mRNA 발현이 측정되었다. 증식연구를 위해 0일에서 올리고뉴클레오티드를 세포에 한번 투여하고(200mM) 5일 간격으로 세포수를 관찰했다.
실시예 18
돌연변이 대 야생형 Ki-ras의 올리고뉴클레오티드 저해
SW480 세포를 상기 실시예에서 기재한 대로 배양했다. HeLa 세포는 실시예 10에서 기재한 대로 배양했다. 세포를 100nM의 올리고뉴클레오티드로 한번 투여하여 처리하였고 24시간 후 노던 블랏 분석에 의해 mRNA의 수준을 측정하였다.

Claims (9)

  1. 사람의 N-ras 유전자를 암호화하는 핵산에 표적되고, 사람의 N-ras 유전자 발현을 저해할 수 있는 8∼30 뉴클레오티드 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 사람의 N-ras 유전자를 암호화하는 mRNA의 5' 비번역 지역, 번역 개시 부위, 암호화 지역 또는 3' 비번역 지역에 표적되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 44, 45, 46, 47, 49 또는 52를 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 주쇄 변형(backbone modification)을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 뉴클레오티드 단위체가 당의 2' 위치에서 변형된 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제약학적으로 수용 가능한 담체에 용해된 제1항의 올리고뉴클레오티드.
  7. 사람의 N-ras 유전자의 발현을 조절하는 제1항의 올리고뉴클레오티드의 효과적인 양을 사람의 N-ras 유전자를 포함하는 조직 또는 세포에 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 사람의 N-ras 유전자의 발현을 조절하는 방법.
  8. 암세포의 증식을 억제하는 제1항의 올리고뉴클레오티드의 효과적인 양을 암세포에 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 암세포의 증식을 억제시키는 방법.
  9. 사람의 N-ras 종양유전자가 활성화된 상태를 예방하거나 치료하는 제1항의 올리고뉴클레오티드의 효과적인 양을 상기 상태를 갖는 것으로 의심되는 동물에게 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 사람의 N-ras 종양유전자가 활성화된 상태를 예방하거나 치료하는 방법.
KR1020007000154A 1997-07-08 1998-07-06 ｒａｓ의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해 KR100363475B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/889,296 US5872242A (en) 1992-10-05 1997-07-08 Antisense oligonucleotide inhibition of ras
US08/889,296 1997-07-08
US8/889,296 1997-07-08
PCT/US1998/013966 WO1999002732A1 (en) 1997-07-08 1998-07-06 Antisense oligonucleotide inhibition of ras

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010021596A true KR20010021596A (ko) 2001-03-15
KR100363475B1 KR100363475B1 (ko) 2002-12-16

Family

ID=25394870

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020007000154A KR100363475B1 (ko) 1997-07-08 1998-07-06 ｒａｓ의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해

Country Status (7)

Country Link
US (1) US5872242A (ko)
EP (1) EP1009860A4 (ko)
JP (1) JP2001509394A (ko)
KR (1) KR100363475B1 (ko)
AU (1) AU732144B2 (ko)
CA (1) CA2296535C (ko)
WO (1) WO1999002732A1 (ko)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6784290B1 (en) * 1992-10-05 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
AU4357396A (en) * 1995-02-08 1996-08-27 Takara Shuzo Co., Ltd. Cancer control
US6518017B1 (en) * 1997-10-02 2003-02-11 Oasis Biosciences Incorporated Combinatorial antisense library
US20030165888A1 (en) 2001-07-18 2003-09-04 Brown Bob D. Oligonucleotide probes and primers comprising universal bases for diagnostic purposes
US20030105044A1 (en) * 2001-10-17 2003-06-05 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of matrix metalloproteinase 1 expression
US6140124A (en) * 1999-04-06 2000-10-31 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of P38 mitogen activated protein kinase expression
US20040171566A1 (en) * 1999-04-06 2004-09-02 Monia Brett P. Antisense modulation of p38 mitogen activated protein kinase expression
EP1171634B1 (en) * 1999-04-08 2005-10-26 Gen-Probe Incorporated Amplification and sequencing primer pairs and use thereof
US6632667B1 (en) * 1999-10-28 2003-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of L-selectin shedding via inhibition of tumor necrosis factor-α converting enzyme (TACE)
WO2001052902A1 (en) * 2000-01-24 2001-07-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of inducible nitric oxide synthase expression
US6242590B1 (en) * 2000-04-28 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of zinc finger protein-217 expression
US6365354B1 (en) * 2000-07-31 2002-04-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of lysophospholipase I expression
US20020165196A1 (en) * 2001-05-07 2002-11-07 Eric Wickstrom Oligonucleotide inhibitors of cancer cell proliferation
NZ530360A (en) 2001-07-06 2006-01-27 Topigen Pharma Inc Methods for increasing in vivo efficacy of oligonucleotides and inhibiting inflammation in mammals by substituting an adenosine base for 2'6'-diaminopurine (DAP) and analogs thereof
US6586245B2 (en) * 2001-07-18 2003-07-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of CD40 ligand expression
US20040029274A1 (en) * 2002-08-09 2004-02-12 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of EDG5 expression
WO2004069992A2 (en) * 2003-02-10 2004-08-19 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of ras expression
US7713738B2 (en) 2003-02-10 2010-05-11 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression
US7399853B2 (en) * 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US20050053981A1 (en) * 2003-09-09 2005-03-10 Swayze Eric E. Gapped oligomeric compounds having linked bicyclic sugar moieties at the termini
US8680063B2 (en) 2003-09-12 2014-03-25 University Of Massachusetts RNA interference for the treatment of gain-of-function disorders
US7919472B2 (en) * 2004-09-17 2011-04-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced antisense oligonucleotides
MX2007005083A (es) 2004-10-29 2007-10-03 Topigen Pharmaceuticals Inc Oligonucleotidos antisentido para tratar alergias y proliferacion celular neoplastica.
MX2007005557A (es) 2004-11-09 2008-02-15 Santaris Pharma As Oligonucleotidos lna y el tratamiento de cancer.
US20060160758A1 (en) * 2005-01-20 2006-07-20 Bennett C F Antisense modulation of CD40 ligand expression
EA200800868A1 (ru) * 2005-09-19 2008-10-30 ДЖОНСОН ЭНД ДЖОНСОН ФАРМАСЬЮТИКАЛ РИСЕРЧ ЭНД ДИВЕЛОПМЕНТ, Эл. Эл. Си. Модуляция экспрессии глюкокортикоидного рецептора
AU2012312433B2 (en) 2011-09-20 2017-07-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of GCGR expression
BR112014009790A2 (pt) 2011-10-25 2018-05-15 Isis Pharmaceuticals Inc composto para modulação antisense da expressão de gccr, seu uso e composição
WO2018146316A1 (en) * 2017-02-13 2018-08-16 Astrazeneca Ab Combination of a mapk pathway inhibitor and an antisense compound targeted to kras
US20230193274A1 (en) * 2019-08-14 2023-06-22 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles with stat3-antisense oligonucleotides
JP7427227B2 (ja) 2020-01-21 2024-02-05 学校法人産業医科大学 腫瘍細胞の生存を低下させるｋｒａｓアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用途

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4871838A (en) * 1985-07-23 1989-10-03 The Board Of Rijks Universiteit Leiden Probes and methods for detecting activated ras oncogenes
NZ221244A (en) * 1986-07-31 1990-01-29 Patrick Yelverton Williams Self-locking split nut with conical base
US5087617A (en) * 1989-02-15 1992-02-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides
US5459255A (en) * 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5218105A (en) * 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5378825A (en) * 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5138045A (en) * 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
EP0575518A1 (en) * 1991-03-06 1993-12-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
WO1994008003A1 (en) * 1991-06-14 1994-04-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE INHIBITION OF THE ras GENE
FR2705099B1 (fr) * 1993-05-12 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Oligonucléotides phosphorothioates triesters et procédé de préparation.
US6083923A (en) * 1997-10-31 2000-07-04 Isis Pharmaceuticals Inc. Liposomal oligonucleotide compositions for modulating RAS gene expression

Also Published As

Publication number Publication date
CA2296535C (en) 2004-12-14
JP2001509394A (ja) 2001-07-24
CA2296535A1 (en) 1999-01-21
EP1009860A1 (en) 2000-06-21
AU732144B2 (en) 2001-04-12
AU8289998A (en) 1999-02-08
WO1999002732A1 (en) 1999-01-21
EP1009860A4 (en) 2002-07-10
KR100363475B1 (ko) 2002-12-16
US5872242A (en) 1999-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100363475B1 (ko) ｒａｓ의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
US5801154A (en) Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US6238921B1 (en) Antisense oligonucleotide modulation of human mdm2 expression
KR100354610B1 (ko) 키메라 및 교호결합 올리고뉴클레오티드를 갖는 ｒａｓ 유전자의 안티센스 저해
US5948902A (en) Antisense oligonucleotides to human serine/threonine protein phosphatase genes
US6187585B1 (en) Oligonucleotide inhibition of epidermal growth factor receptor expression
US5985558A (en) Antisense oligonucleotide compositions and methods for the inibition of c-Jun and c-Fos
US6391636B1 (en) Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
US5968748A (en) Antisense oligonucleotide modulation of human HER-2 expression
US5981731A (en) Antisense oligonucleotide modulation of B-raf gene expression
WO1994008003A1 (en) ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE INHIBITION OF THE ras GENE
JP2003507051A (ja) フォーカルアドヒージョンキナーゼ発現のアンチセンスモジュレーション
US6339066B1 (en) Antisense oligonucleotides which have phosphorothioate linkages of high chiral purity and which modulate βI, βII, γ, δ, Ε, ζ and η isoforms of human protein kinase C
JP2002526093A (ja) ｂｃｌ−ｘ発現のアンチセンスモジュレーション
JP2003521913A (ja) Ｓｕｒｖｉｖｉｎ発現のアンチセンスモジュレーション
US6117848A (en) Antisense oligonucleotide inhibition of ras
US6087489A (en) Antisense oligonucleotide modulation of human thymidylate synthase expression
US6784290B1 (en) Antisense oligonucleotide inhibition of ras
AU728674B2 (en) Decreasing cell proliferation by decreasing levels of PP5
US6117847A (en) Oligonucleotides for enhanced modulation of protein kinase C expression
US20030013670A1 (en) Antisense oligonucleotide inhibition of ras

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee