JP2001509394A - Ｒａｓのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害 - Google Patents

Ｒａｓのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害

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Abstract

(57)【要約】 ｒａｓ発現を調節するための組成物および方法が提供される。ヒトｒａｓをコードする核酸を標的とするオリゴヌクレオチドが提供される。ヒトＨ−ｒａｓ，Ｋｉ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓをコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが提供される。そのようなオリゴヌクレオチドは、治療および診断、ならびに研究目的で使用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、細胞および組織においてｒａｓ遺伝子発現を調節する方法、および活性化ｒａｓの発現を特異的に調節する方法もまた開示される。ｒａｓに関連する状態を診断，検出および治療する方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、米国特許出願第０８／４１１，７３４号（１９９５年４月３日出願
）の一部継続出願であり、これはＰＣＴ／ＵＳ９３／０９３４６（１９９３年１
０月１日出願）の米国国内段階であり、これは、米国特許出願第９５８，１３４
号（１９９２年１０月５日出願）および米国特許出願第０８／００７，９９６（
１９９３年１月２１日出願）の一部継続出願かつ外国出願である。これらの全て
は本出願と同一の出願人に譲渡されており、その内容の全体を本明細書の一部と
してここに引用する。 発明の分野 本発明は、ｒａｓの発現の阻害のための組成物および方法に関する。ｒａｓは
、天然に生ずる蛋白質であり、時おり、腫瘍形成との関連が暗示される活性化形
態に転換する。Ｈ−，Ｋｉ−およびＮ−ｒａｓを標的とするアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、細胞および組織における正常型お
よび活性化型の両方のｒａｓ遺伝子の検出に関し、これは研究および診断の両方
のための研究試薬およびキットの基礎を形成する。さらに、本発明は、ｒａｓに
関連する状態の予防および治療に関する。 発明の背景 細胞増殖と分化を直接的または間接的に調節する細胞遺伝子の変化は、癌の主
要な原因であると考えられる。ヒトの腫瘍形成との関係が示唆される、癌遺伝子
と呼ばれる遺伝子は約３０ファミリーある。そのようなファミリーのメンバーで
あるｒａｓ遺伝子ファミリーは、しばしば、ヒト腫瘍中で突然変異を起こしてい
ることが見いだされる。正常状態においては、ｒａｓ遺伝子によって産生される
蛋白質は、正常な細胞増殖と成熟に寄与していると考えられる。蛋白質産物中の
３つの重要な部位の１つにおいてアミノ酸の変換を生ずるｒａｓ遺伝子の突然変
異は、腫瘍形成との関係が示唆される型への変換を起こす。そのような突然変異
を有する遺伝子は、”変異型”または”活性型”と呼ばれる。変異していないｒ
ａｓは”野生型”または”正常”ｒａｓと呼ばれる。そのようなｒａｓ活性化を
引き起こす点突然変異は、発癌性物質や他の環境因子によって引き起こされ得る
と考えられる。９０％以上の膵腺癌、およそ５０％の結腸腺腫と腺癌、およそ５
０％の肺腺癌と甲状腺腫、および、急性骨髄性白血病や脊髄異形成症候群といっ
た血液の悪性腫瘍の大部分が活性化されたｒａｓ癌遺伝子を有することが見つか
っている。全体としておよそ１０から２０％のヒト腫瘍が３つのｒａｓ遺伝子（
Ｈ−ｒａｓ，Ｋ−ｒａｓ，Ｎ−ｒａｓ）の１つに突然変異を有している。
【０００２】 現在のところ、特定の腫瘍細胞中で活性化されている癌遺伝子の発現を阻害す
ることにより、細胞をより正常な増殖状態に戻しうると考えられている。例えば
、Ｆｅｒａｍｉｓｃｏら（Ｎａｔｕｒｅ，３１４：６３９ー６４２、１９８５年
）は、活性化ｒａｓ遺伝子により悪性状態に形質転換した細胞に、ｒａｓ遺伝子
によって産生される蛋白質に結合する抗体をマイクロインジェクションすると、
細胞は増殖速度を低下させ、より正常な形態に変化する。このことは、典型的な
癌細胞の制御されない増殖における、活性化ｒａｓ遺伝子産物の関与を支持する
ものと説明されている。
【０００３】 ｒａｓ遺伝子の発現を調節しうる構成物の提供と、そして特に活性化型ｒａｓ
遺伝子の発現を特異的に調節する構成物の提供が強く望まれている。動物におけ
るｒａｓをコードする核酸の診断と検出の方法の提供が強く望まれている。また
、ｒａｓ活性化から生ずる病態の診断と治療の方法を提供することが望まれてい
る。加えて、ｒａｓをコードする核酸の検出と研究のための、改良された研究キ
ットと試薬が望まれている。
【０００４】 癌遺伝子発現の阻害はアンチセンス配向のＫｉ−ｒａｓ前癌遺伝子の２−キロ
ベースのセグメントを発現するレトロウイルスベクターまたはプラスミドベクタ
ーを用いて達成されている。Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｔ．ら（１９９１）Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１，１７４４−１７４８；ＰＣＴ特許出願Ｐ
ＣＴ／ＵＳ９２／０１８５２（ＷＯ９２／１５６８０）；Ｇｅｏｒｇｅｓ，Ｒ．
Ｎ．ら．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３，１７４３−１７
４６。
【０００５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドによる癌遺伝子の阻害は、様々な癌遺伝子フ
ァミリーの役割を理解するための有用な道具であるということが証明されている
。アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、ある遺伝子の”センス”、またはコー
ディング鎖に相補的な小さなオリゴヌクレオチドを意味し、これは結果としてそ
の遺伝子のｍＲＮＡ転写物に対してもまた相補的であり、これに対しても特異的
にハイブリダイズしうる。Ｈｏｌｔら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、８、９
６３ー９７３、１９８８年）は、癌遺伝子ｃ−ｍｙｃのｍＲＮＡ転写物に特異的
にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを培養ＨＬ−６０白血病
細胞に添加すると、増殖が阻害され、分化が誘導されることを示した。Ａｎｆｏ
ｓｓｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６，３３７９−３３８
３、１９８９年）は、ｃ−ｍｙｂ癌遺伝子のｍＲＮＡ転写物に特異的にハイブリ
ダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒト骨髄性白血病細胞株の増殖
を阻害することを示した。Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，８５，１０２８−１０３２，１９８８年）は、ｃ−ｍｙｃ癌遺伝
子の蛋白質産物の発現ならびに培養ＨＬ６０白血病細胞の増殖が、ｃ−ｍｙｃ
ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドによっ
て阻害されることを示した。米国特許４８７１８３８（Ｂｏｓら）は、Ｎ−ｒａ
ｓの第１３コドン中の突然変異を検出するための、その変異に相補的なオリゴヌ
クレオチドを開示する。米国特許４８７１８３８（Ｂｏｓら）は、ｒａｓ蛋白質
をコードするＤＮＡ中の突然変異を検出するためのプローブとして有用な分子を
開示する。
【０００６】 これら全てのケースにおいて、修飾されていないオリゴヌクレオチドの不安定
性が主要な問題点である。これらは細胞内酵素により分解されるからである。Ｐ
ＣＴ／ＵＳ８８／０１０２４（Ｚｏｎら）は、ＨＬ−６０白血病細胞の増殖およ
びこれらの細胞中のＤＮＡ合成を阻害するための、増幅されたｃ−ｍｙｃ癌遺伝
子の翻訳開始領域にハイブリダイズするホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
の作用を開示する。Ｔｉｄｄら（Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉ
ｇｎ，３，１１７−１２７，１９８８年）は、活性化Ｎ−ｒａｓ癌遺伝子に特異
的にハイブリダイズするメチルホスホネートアンチセンスオリゴヌクレオチドを
検討し、これが生化学的分解に耐性であり、培養ヒトＨＴ２９細胞に毒性を示さ
ないが、これはＮ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害せず、この細胞に影響を与えない
ことを見いだした。Ｃｈａｎｇらは、マウスＢａｌｂ−ｒａｓ遺伝子のｍＲＮＡ
転写物に特異的にハイブリダイズする、メチルホスホネートおよびホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドの両方が、インビトロにおいてこの遺伝子の蛋白質産
物の翻訳を阻害しうることを示した。Ｃｈａｎｇら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ
Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，４，２２１−２３２，１９８９年；Ｂｒｏｗｎら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４，２４３−２５２，１９８９年。Ｔmは ｒａｓ ｐ２１蛋白質産物のインビトロ翻訳に対するこれらのオリゴヌクレオチ
ドのアンチセンス活性とはよく相関しなかったことが指摘されている。Ｃｈａｎ
ｇらが使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｒａｓ遺伝子の翻訳開始領
域に特異的にハイブリダイズするため、活性化ｒａｓに選択性を示すことが期待
されず、これらのオリゴヌクレオチドのｒａｓ遺伝子の正常型（野生型）と変異
型（活性化型）に対する結合能力は比較されなかった。
【０００７】 Ｈｅｌｅｎｅおよび共同研究者はアクリジンインターカレート剤および／また
は疎水性の尾に連結された９−ｍｅｒホスホジエステルを用いて活性化（第１２
コドン Ｇ→Ｔ転位）Ｈ−ｒａｓ ｍＲＮＡ発現の選択的阻害を示した。この化
合物は低マイクロモル濃度でＲＮａｓｅＨおよび細胞増殖アッセイの両方におい
て変異型ｒａｓのメッセージを選択的に標的とすることを示した。Ｓａｉｓｏｎ
−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ，Ｔ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０，１１１１−１１１８、１
９９１年。 Ｃｈａｎｇおよび共同研究者は変異型Ｈ−ｒａｓのメッセージの選択的標的化に
ついて開示している；この時標的はＡ→Ｔトランスバージョンを含むＨ−ｒａｓ
コドン６１であり、用いられたオリゴヌクレオチドは１１−ｍｅｒメチルホスホ
ネートまたはそのソラーレン誘導体であった。活性に７．５−１５０μＭの濃度
を必要とするこれらの化合物は、免疫沈降により、正常ｐ２１と比較して変異型
Ｈ−ｒａｓ ｐ２１発現を選択的に阻害することが示された。Ｃｈａｎｇら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，８２８３−８２８６、１９９１年。 発明の概要 本発明は、ヒトｒａｓを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、および
これらを用いる方法に関する。より詳細には、本発明はヒトＨ−ｒａｓ，Ｋｉ−
ｒａｓおよびＮ−ｒａｓをコードするｍＲＮＡを標的とし、ｒａｓ発現を阻害し
うるオリゴヌクレオチドを提供する。ヒトＮ−ｒａｓの５’非翻訳領域，翻訳開
始部位，コーディング領域または３’非翻訳領域を標的とするオリゴヌクレオチ
ドが提供される。ｒａｓ発現を調節する方法、癌細胞の増殖を阻害する方法、お
よびｒａｓに関連する状態を治療する方法が提供される。これらの方法は、本発
明のオリゴヌクレオチドを用いる。 発明の詳細な説明 悪性腫瘍は、癌細胞に特徴的な制御された増殖の喪失、すなわち連続的な制御
不能の増殖、周辺組織への侵入能力、および他の臓器への転移能力を誘導する、
一連の段階的で進行性の変化を通して発達する。厳密に制御されたインビトロの
研究によって、正常細胞と癌細胞の増殖を性格付ける因子が定義され、細胞増殖
と分化を制御する特定の蛋白質が同定されてきた。さらに、厳密に制御された定
量的なインビトロアッセイで細胞の形質転換を研究することが可能であることに
よって、形質転換した細胞の表現型を誘導しうる特定の遺伝子が同定されてきた
。そのような癌の原因遺伝子または癌遺伝子は、それらが産生する蛋白質の発現
調節の変化を誘導する突然変異によって形質転換誘導能を獲得すると信じられて
いる。ある場合には、そのような変化はプロモーターやエンハンサーといった非
コードＤＮＡ調節領域中において起こり、癌遺伝子の転写活性の変化を誘導し、
その遺伝子産物の過剰または過小産生を引き起こす。他の場合には、遺伝子変異
は癌遺伝子のコード領域内において起こり、非活性、過剰な活性または正常型（
野生型）の遺伝子産物とは異なった活性を示す遺伝子産物の産生を誘導する。
【０００８】 今日までに３０以上の細胞性癌遺伝子ファミリーが同定されている。これらの
遺伝子は、それらの細胞内局在とそれらの蛋白質産物の推定上の作用機構によっ
て分類することができる。ｒａｓ癌遺伝子は、原形質膜の内面に存在する類縁蛋
白質をコードする遺伝子ファミリーのメンバーである。ｒａｓ蛋白質群はアミノ
酸レベルで高度に保存され、ＧＴＰに対して高親和性かつ特異的に結合し、そし
てＧＴＰａｓｅ活性を有している。細胞内におけるｒａｓ遺伝子産物の機能は明
らかでないが、ＧＴＰ結合蛋白質、またはＧ蛋白質として知られている信号伝達
蛋白質群とかなりの配列ホモロジーを有するという生化学的性質は、ｒａｓ遺伝
子産物が原形質膜を介しての細胞外信号の伝達に関係して、基本的な細胞調節機
能において基礎的な役割を果たしていることを示唆する。
【０００９】 Ｈ−ｒａｓ，Ｋｉ−ｒａｓ，およびＮ−ｒａｓと呼ばれる３つのｒａｓ遺伝子
は、哺乳類のゲノム中で同定されている。哺乳類ｒａｓ遺伝子は、それらのコー
ド配列内の単一の点突然変異により形質転換を誘導する性質を獲得する。自然に
発生するｒａｓ癌遺伝子中の突然変異は、第１２番、第１３番、第６１番のコド
ンに存在する。Ｈ−ｒａｓ，Ｋｉ−ｒａｓ，およびＮ−ｒａｓの配列は既知であ
る。Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３０２，３３−３７，１９８３年；Ｋａｈｎ
ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７，６３９−６５２，１９８７年；Ｈａｌ
ｌおよびＢｒｏｗｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，
５２５５−５２６８，１９８５年。ヒト腫瘍中で見つかる活性型ｒａｓ変異で最
もよく検出されるのは、Ｈ−ｒａｓ遺伝子の第１２コドン中の変異であり、これ
はＧＧＣからＧＴＣへの塩基の変化によりｒａｓ蛋白質産物のＧＴＰａｓｅ調節
領域中のグリシンからバリンへの置換をもたらす。Ｔａｂｉｎ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３００，１４３−１４９，１９８２年；Ｒｅｄｄｙ，Ｐ．Ｅ．ら、
Ｎａｔｕｒｅ ３００，１４９−１５２，１９８２年；Ｔａｐａｒｏｗｓｋｙ，
Ｅ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３００，７６２−７６５，１９８２年。この単一アミノ
酸の変化はｒａｓ蛋白質機能の正常な調節を喪失させると考えられ、それにより
正常に制御された細胞蛋白質を常に活性な蛋白質に変換する。そのような正常ｒ
ａｓ蛋白質機能の脱制御が、正常から悪性の増殖への形質転換の原因であると信
じられている。したがって、ｒａｓ発現の阻害は、悪性の状態、すなわち癌およ び他の過増殖性状態の治療および／または予防において有用であると考えられる
。
【００１０】 最近、Ｈ−ｒａｓ遺伝子は、即座に治療が施されない場合には突然の死をしば
しば引き起こす遺伝病であるｌｏｎｇ Ｑ−Ｔ症候群と呼ばれる重篤な心不整脈
との関係が示唆されている。不規則な鼓動の始まりには前兆がないことがしばし
ばである。Ｈ−ｒａｓ遺伝子が正確にｌｏｎｇ Ｑ−Ｔ症候群の原因であるか否
かは不明である。しかし、この症候群の遺伝と第１１染色体上のＨ−ｒａｓ遺伝
子周辺領域の特定の変異の存在との間には、非常に高い相関がある。このため、
Ｈ−ｒａｓ遺伝子は、ｌｏｎｇ Ｑ−Ｔ症候群による心臓突然死の高リスクの優
れた指標となる。
【００１１】 Ｎ−ｒａｓは、最初に、遺伝子転移実験において癌遺伝子として同定された（
Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９８３，３０３：３９６−４００）。
その活性化は、Ｔａｐａｒｏｗｓｋｙらにより特徴決定された（Ｃｅｌｌ １９
８３，３４：５８１−６）。活性化Ｎ−ｒａｓは、多くの血液新生物および固体
腫瘍において見いだされており、過増殖性状態の発達および維持におけるＮ−ｒ
ａｓの役割が示唆される。
【００１２】 本発明は、ヒトｒａｓ癌遺伝子発現の阻害のためのオリゴヌクレオチドを提供
する。そのようなオリゴヌクレオチドはヒトｒａｓ遺伝子に由来する選択された
ＤＮＡまたはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズする。本発明はまた、ｒａｓの
変異型の発現を選択的に阻害するためのオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴ
ヌクレオチドとそれがハイブリダイズする相補的核酸標的との間のこの関係は、
一般的に、”アンチセンス”と称される。本発明の文脈においては、選択された
核酸標的へのオリゴヌクレオチドの”標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）”は、多段
階のプロセスである。このプロセスは、通常、その機能を調節すべき核酸配列の
同定で始まる。この核酸配列は、例としては、その発現が特定の疾病状態と関係
する細胞性遺伝子（あるいはその遺伝子から作られたｍＲＮＡ）、または感染作
因からの外来核酸でありうる。本発明においては、標的はｒａｓをコードする核
酸、すなわち、ｒａｓ遺伝子またはｒａｓ遺伝子から発現されるｍＲＮＡである
。標的化プロセスには、結果として所望の効果、即ち遺伝子発現の調節、を生じ
るように、オリゴヌクレオチドの相互作用を起こす核酸配列内の一つまたは複数
の部位の決定もまた含まれる。いったん一つまたは複数の標的部位が同定された
ならば、所望の調節が得られるように、標的に充分に相補的である、即ち充分に
良く且つ充分な特異性をもってハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを選択す
る。
【００１３】 本発明の文脈においては、”調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）”は、阻害または
刺激のいずれかを意味する。ｒａｓ遺伝子発現の阻害は、現在のところ、調節の
望ましい型である。この調節は、当該技術分野で日常的に行われている方法、例
えば、本明細書の実施例に教示されているような、ｍＲＮＡ発現のノーザンブロ
ットアッセイ、または蛋白質発現のウエスタンブロットアッセイにより測定する
ことができる。細胞増殖または腫瘍細胞成長に及ぼす影響も、本明細書の実施例
に教示されているように、測定することができる。本発明の文脈においては、”
ハイブリダイゼーション”とは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対合としても
知られる、相補塩基間、通常は向かい合う核酸鎖または核酸鎖の２つの領域間の
水素結合を意味する。グアニンとシトシンは、それらの間で３つの水素結合を形
成することが知られている相補塩基の例である。アデニンとチミンは、それらの
間で２つの水素結合を形成する相補塩基の例である。”特異的にハイブリダイズ
しうる”および”相補的”は、安定且つ特異的な結合がＤＮＡまたはＲＮＡ標的
とオリゴヌクレオチドの間で起こるような充分な相補性の程度を示すために用い
られる用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズしうるため
にはその標的核酸配列と１００％相補的である必要はないことが分かる。オリゴ
ヌクレオチドは、標的へのオリゴヌクレオチドの結合が標的分子の正常な機能を
妨害して有効性の損失を引き起こし、かつ、特異的結合が所望される条件下、即
ちインビボアッセイあるいは治療処置の場合には生理条件下、またはインビトロ
アッセイの場合にはアッセイを行う条件下で、オリゴヌクレオチドの非標的配列
への非特異的結合を排除するのに充分な程度の相補性がある場合、特異的にハイ
ブリダイズしうる。
【００１４】 本発明の好ましい態様においては、Ｈ−ｒａｓ，Ｋｉ−ｒａｓまたはＮ−ｒａ
ｓをコードするｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドが提供される。当業者
は、本発明に従って、ｍＲＮＡには、翻訳開始コドンおよび停止コドンを含む、
３文字遺伝子コードを用いて蛋白質をコードする情報を運ぶコーディング領域の
みならず、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、５’キャップ領域、イントロ
ン領域およびイントロン／エクソンもしくはスプライシングジャンクションのリ
ボヌクレオチドとして当業者に知られる領域を形成する付随するリボヌクレオチ
ドも含まれることを理解するであろう。すなわち、本発明にしたがって、これら
の付随リボヌクレオチドならびにコーディングリボヌクレオチドを完全にまたは
部分的に標的とするオリゴヌクレオチドを作成することができる。好ましい態様
においては、オリゴヌクレオチドは、ｒａｓ ｍＲＮＡの翻訳開始部位（ＡＵＧ
コドン）またはコーディング領域，５’非翻訳領域または３’−非翻訳領域の配
列を標的とする。妨害すべきメッセンジャーＲＮＡの機能には、すべての生存機
能、例えばＲＮＡの蛋白質翻訳のための部位への移動、ＲＮＡからの蛋白質の実
際の翻訳、ＲＮＡのスプライシングまたは成熟化、ならびにおそらくはＲＮＡが
従事する独立した触媒活性が含まれる。そのようなＲＮＡ機能の妨害の総合的な
効果は、ｒａｓ蛋白質発現の妨害をもたらすことである。
【００１５】 本発明は、ｒａｓ遺伝子発現を調節するためのオリゴヌクレオチドを提供する
。そのようなオリゴヌクレオチドは、ｒａｓをコードする核酸を標的とする。本
明細書において定義されるように、”調節”とは、阻害または促進のいずれかを
意味する。ｒａｓ遺伝子発現の阻害は、現在のところ、調節の好ましい形態であ
る。
【００１６】 本発明の文脈においては、”オリゴヌクレオチド”との用語は、天然に存在す
る塩基、糖および糖間（主鎖）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモ
ノマーのオリゴマーまたはポリマーを意味している。”オリゴヌクレオチド”と
の用語はまた、同様に機能するが天然には存在しないモノマーまたはその部分を
含むオリゴマーを含む。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例え
ば促進された細胞への取り込みおよびヌクレアーゼ存在下での増強された安定性
のような性質のため、天然型よりしばしば好適である。
【００１７】 本発明のある種の好適なオリゴヌクレオチドはキメラオリゴヌクレオチドであ
る。本発明の文脈において”キメラオリゴヌクレオチド”または”キメラ”とは
、各々少なくとも一つのヌクレオチドから作り上げられた二つまたはそれ以上の
化学的に異なった領域を含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレ
オチドは典型的には一つまたはそれ以上の有利な性質（例えば、ヌクレアーゼ耐
性の増加、細胞内への取り込みの増加、ＲＮＡ標的に対する結合親和性の増加）
を与える少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド領域、およびＲＮＡ：ＤＮＡ
またはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断しうる酵素のための基質である領域を
含む。一例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡデュープレックスのＲＮＡ
鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅＨの活
性化により、ＲＮＡ標的が切断され、このことにより遺伝子発現のアンチセンス
阻害の有効性が非常に増強される。したがって、キメラオリゴを用いた場合、同
じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチ
ドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドでしばしば同等の結果を得ることが
できる。ＲＮＡ標的の切断はゲル電気泳動により、必要ならば、当該技術分野に
おいて知られる核酸ハイブリダイゼーション技術と組み合わせて、ルーチン的に
検出することができる。１つの好ましい態様においては、キメラオリゴヌクレオ
チドは、標的結合親和性を高めるように修飾された少なくとも１つの領域、およ
び通常はＲＮＡｓｅＨの基質として作用する領域を含む。その標的（この場合、
ｒａｓをコードする核酸）に対するオリゴヌクレオチドの親和性は、オリゴヌク
レオチドと標的が解離する温度であるオリゴヌクレオチド／標的対のＴｍを測定
することによりルーチン的に決定される；解離は分光学的に検出される。Ｔｍが
高いほど標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性は強い。より好適な態様にお
いては、ｒａｓ ｍＲＮＡ結合親和性を増加させるために修飾されたオリゴヌク
レオチドの領域は、糖の２’位が修飾された少なくとも一つのヌクレオチド、最
も好ましくは２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルまたは２
’−フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。そのような修飾はオリゴヌクレオチド内
へルーチン的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは所定の標的に対し、
２’−デオキシオリゴヌクレオチドより高いＴｍ（即ちより強い標的結合親和性
）を有することが示されている。そのような強められた親和性の効果はｒａｓ遺
伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を非常に高めることである。Ｒ
ＮＡｓｅＨはＲＮＡ：ＤＮＡデュープレックスのＲＮＡ鎖を切断する細胞性エン
ドヌクレアーゼである；従ってこの酵素の活性化はＲＮＡ標的の切断を生じ、ア
ンチセンス阻害の効率を非常に促進しうる。ＲＮＡ標的の切断はゲル電気泳動に
よりルーチン的に示すことができる。別の好適な態様において、ヌクレアーゼ耐
性を増強させるためにキメラオリゴヌクレオチドも修飾される。細胞は核酸を分
解しうる種々のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼを含む。多数のヌ
クレオチドおよびヌクレオシド修飾が、それらを取り込んだオリゴヌクレオチド
を天然のオリゴヌクレオチドよりヌクレアーゼ消化に対する耐性を高くすること
が示されている。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを細胞抽出液または
単離ヌクレアーゼ溶液とインキュベートし、通常は、ゲル電気泳動により、残存
する無傷のオリゴヌクレオチドの程度を時間に関して測定することによりルーチ
ン的に測定される。ヌクレアーゼ耐性を促進するように修飾されているオリゴヌ
クレオチドは非修飾オリゴヌクレオチドより長く無傷のままで残存している。種
々のオリゴヌクレオチド修飾がヌクレアーゼ耐性を促進または与えることが示さ
れている。少なくとも一つのホスホロチオエート修飾を含むオリゴヌクレオチド
が現在の所より好適である。いくつかの場合、標的結合親和性を促進させるオリ
ゴヌクレオチド修飾はまた、独立してヌクレアーゼ耐性を促進しうる。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドおよびいくつかの望ましい修飾についての議論は、Ｄｅ
Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５，２８：３６６−
３７４）に見いだされる。
【００１８】 本発明において企図されるいくつかの好適なオリゴヌクレオチドの特定の例に
は、修飾された主鎖、例えばホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチル
ホスホネート、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原
子またはヘテロ環式糖間結合を含むものがある。最も好ましいものは、ホスホロ
チオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子主鎖、特にＣＨ2 −ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2、ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＨ2（メチレン（メチルイミノ
）またはＭＭＩ主鎖として知られている）、ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2、 ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2およびＯ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ 2 主鎖（ここで天然のホスホジエステル主鎖はＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2と表される）を
有するオリゴヌクレオチドである。 ＤｅＭｅｓｍａｅｋｅｒら（Ａｃｃ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５，２８：３６６−３７４）に開示されるアミド主鎖もま
た好ましい。モルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好適である
（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．およびＷｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｄ．，米国特許第５
，０３４，５０６号）。別の好適な態様においては、ペプチドー核酸（ＰＮＡ）
主鎖のようにオリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖がポリアミド主鎖に置
き換えられてもよく、核酸塩基はポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接または間
接的に結合される（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１
，２５４，１４９７）。オリゴヌクレオチドはまた、１つまたはそれ以上の置換
糖部分をを含んでいてもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは下記の基の一つを
２’位に含む：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ3、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ3ＯＣＨ3、ＯＣＨ3Ｏ
（ＣＨ2）nＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2またはＯ（ＣＨ2）nＣＨ3（式中ｎは１か ら約１０である）；ＣlからＣ10低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低 級アルキル、アルカリールまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ3；ＯＣ Ｆ3；Ｏ−，Ｓ−，またはＮ−アルキル；Ｏ−，Ｓ−，またはＮ−アルケニル； ＳＯＣＨ3；ＳＯ2ＣＨ3；ＯＮＯ2；ＮＯ2；Ｎ3；ＮＨ2；ヘテロシクロアルキル ；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置
換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオ
チドの薬動力学的特性を改良する基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性
を改良する基、および同様な特性を有する他の基。好ましい修飾には、２’−メ
トキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3，２’−Ｏ−（２−メトキシエ チル）としても知られる］（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ
．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）が含まれる。他の好ましい修飾としては
、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ3），２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ2ＣＨ 2 ＣＨ3）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾をオリゴ
ヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチドの糖の３’位および５’
末端のヌクレオチドの５’位に作成してもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペ
ントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣体を有していてもよい。
【００１９】 オリゴヌクレオチドはまた、追加的にまたは代わりに、核酸塩基（当該技術分
野においては、しばしば単に”塩基”と称される）修飾または置換を含んでいて
もよい。本明細書において用いる場合、”非修飾”または”天然”核酸塩基には
、アデニン（Ａ），グアニン（Ｇ），チミン（Ｔ），シトシン（Ｃ）およびウラ
シル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、まれにまたは一時的に天然の核酸中
に見いだされる核酸塩基、例えばヒポキサンチン，６−メチルアデニン，５−ｍ
ｅピリミジン，特に５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンと
も称され、当該技術分野においてはしばしば５−ｍｅ−Ｃと称される），５−ヒ
ドロキシルメチルシトシン（ＨＭＣ），グリコシルＨＭＣおよびゲントビオシル
ＨＭＣ、ならびに合成核酸塩基、例えば２−アミノアデニン，２−（メチルアミ
ノ）アデニン，２−（イミダゾリルアルキル）アデニン，２−（アミノアルキル
アミノ）アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン，２−チオウラシル，
２−チオチミン，５−ブロモウラシル，５−ヒドロキシメチルウラシル，８−ア
ザグアニン，７−デアザグアニン，Ｎ6（６−アミノヘキシル）アデニンおよび ２，６−ジアミノプリンが含まれる（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ Ｒｅｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓ
ｃｏ，１９８０，ｐｐ７５−７７；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８７，１５：４５１３）。当該技術分野におい
て知られる”万能”塩基、例えばイノシンも含まれうる。５−ｍｅ−Ｃ置換は、
核酸デュープレックス安定性を０．６−１．２℃高めることが見いだされており
（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，
Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ
．２７６−２７８）、現在好ましい塩基置換である。
【００２０】 本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性また
は細胞取り込みを増強する１つまたはそれ以上の成分またはコンジュゲートをオ
リゴヌクレオチドに化学的に連結することが含まれる。そのような成分としては
、脂質成分、例えばコレステロール部分、コレステリル部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８９
，８６，６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒ
ｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．１９９４，４，１０５３）、チオエーテル，例
えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎｅｔａｌ．Ａｎｎ．
Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９２，６６０，３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ
ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．１９９３，３，２７６
５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９２，２０，５３３）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオ
ールまたはウンデシル残渣（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．
ＥＭＢＯ Ｊ．１９９１，１０，１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔ．１９９０，２５９，３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ
．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ １９９３，７５，４９）、リン脂質、例えばジ−ヘキサ
デシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム、１，２−ジ−Ｏ
−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａ
ｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９５，３６，３６５
１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８，
３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ
ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９５，
１４，９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９５，３６，３６５１）が挙げられる
が、これらに限定されない。親油性部分を含むオリゴヌクレオチド、およびその
ようなオリゴヌクレオチドを製造する方法は、当該技術分野において知られてお
り、例えば、米国特許５，１３８，０４５、５，２１８，１０５および５，４５
９，２５５に記載されている。
【００２１】 本発明のオリゴヌクレオチドは、一般に体内で切断除去されて活性なオリゴヌ
クレオチドを与える１つまたはそれ以上の部分を含むプロドラッグとして提供し
てもよい。プロドラッグアプローチの１例は、Ｉｍｂａｃｈら（ＷＯ９４／２６
７６４）に開示されている。
【００２２】 所定のオリゴヌクレオチド中の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく
、実際、上述の修飾の２つ以上を１つのオリゴヌクレオチド中に取り込んでもよ
く、あるオリゴヌクレオチドの１つのヌクレオシド中に取り込んでもよい。本発
明はまた、上で定義したキメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを
含む。
【００２３】 本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、よく知られた固相合成技術
により都合よくルーチン的に作製することができる。そのような合成の装置はＡ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつかの会社から市販されている
。そのような合成のために他の手段を用いてもよい；オリゴヌクレオチドの実際
の合成はルーチン的に仕事をする人の手腕である。ホスホロチオエートおよびア
ルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを製造するために同様の技術を
使用することもよく知られている。また、蛍光標識、ビオチニル化またはコレス
テロール修飾オリゴヌクレオチドのような他の修飾オリゴヌクレオチドを合成す
るために、同様の技術およびビオチン、フルオレセイン、アクリジンまたはソラ
ーレン修飾アミダイトおよび／または制御細孔ガラス（ＣＰＧ）（Ｇｌｅｎ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ）のような市販品として入手可能な修
飾アミダイトおよびＣＰＧ産物の使用もよく知られている。
【００２４】 本発明に従ったオリゴヌクレオチドは好適には約８から約５０の核酸塩基単位
を含む。本発明の文脈においては８から５０モノマーを有する上述の天然に存在
しないオリゴマーを含むことが理解されるであろう。
【００２５】 本発明のオリゴヌクレオチドは、診断、治療および研究試薬およびキットとし
て用いることができる。本発明のオリゴヌクレオチドはｒａｓ遺伝子にハイブリ
ダイズするため、これを利用してサンドイッチおよび他のアッセイを容易に構築
することができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドはｒａｓ癌遺伝子の変
異（活性化）型に優先的にハイブリダイズするため、ｒａｓの野生型から活性化
型への転換について細胞および組織をスクリーニングするためのそのようなアッ
セイを考案することができる。そのようなアッセイは、形態学的に類似する腫瘍
の差異診断に、およびｒａｓ遺伝子活性化に由来する癌の増加したリスクの検出
に利用することができる。オリゴヌクレオチドとｒａｓ遺伝子とのハイブリダイ
ゼーションを検出する手段を用意することは、ルーティンに達成することができ
る。そのような用意は、酵素コンジュゲーション、放射性標識または任意の他の
適当な検出系を含むであろう。ｒａｓまたは活性化ｒａｓをコードする核酸の存
在または不在を検出するキットを製造することもできる。
【００２６】 以下の特定の記述は、本発明を例示するためであり、本発明の範囲を限定する
ことを意図するものではない。 ｒａｓ−ルシフェラーゼ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害：Ｈ
−ｒａｓ翻訳開始コドンまたは活性化Ｈ−ｒａｓの第１２コドン点突然変異を標
的とした一連のアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを実施例２
−５に記載したｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子システムを用いてスク
リーニングした。この最初のシリーズのうち、６つのオリゴヌクレオチドがｒａ
ｓ−ルシフェラーゼ活性の有意かつ再現性のある阻害を与えることが同定された
。これらのオリゴヌクレオチド（すべてホスホロチオエートである）の塩基配列
、配列参照番号および配列番号が表１に示されている。
【００２７】
【表１】
【００２８】 正常ｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子または変異型ｒａｓ−ルシフェ
ラーゼレポーター遺伝子を発現する細胞を、ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チド２５０３（配列番号２）の濃度を増加させて処理した用量−応答実験を行っ
た。この化合物はＨ−ｒａｓ ＲＮＡ転写体の翻訳開始コドンを標的としている
。このオリゴヌクレオチドにより細胞を処理するとｒａｓ−ルシフェラーゼ活性
の用量依存性阻害が生じ、正常および変異型ｒａｓ標的の両方に対して約５０ｎ
ＭのＩＣ５０値を示した。ｒａｓ翻訳開始コドンを標的とするオリゴヌクレオチ
ドが、変異型および正常ｒａｓ発現の両方を減少させるのに等しく有効であると
いう観察結果は、２つの標的がＡＵＧ翻訳開始部位周辺の領域に同一の配列組成
を有するため予期されるものである。
【００２９】 変異型（活性型）Ｈ−ｒａｓ ＲＮＡの第１２コドン点突然変異を標的とする
化合物であるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド２５７０（配列番号３）で
細胞を処理した別の用量−応答実験を行った。このオリゴヌクレオチドの濃度を
増加させて細胞を処理すると、ｒａｓ−ルシフェラーゼの変異型または正常型を
発現している細胞中のｒａｓ−ルシフェラーゼ活性が用量依存的に阻害された。
しかしながら、オリゴヌクレオチド２５７０は正常型に比較してｒａｓ−ルシフ
ェラーゼの変異型に対し約３倍の選択性を示した。実際、２５７０はｒａｓ−ル
シフェラーゼの変異型に対し約１００ｎＭのＩＣ５０値を示し、一方、同じ化合
物が非変異型に対して約２５０ｎＭのＩＣ５０値を示した。
【００３０】 Ｈ−ｒａｓの翻訳開始コドンまたは第１２コドン点突然変異を標的とするオリ
ゴヌクレオチドの単一用量（０．５μＭ）で、ｒａｓ−ルシフェラーゼの正常型
または変異型を発現している細胞を処理した。試験したアンチセンスホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドは表１に示されている。ｒａｓ翻訳開始コドンを標
的とする化合物２５０３（配列番号２）がｒａｓ−ルシフェラーゼ活性の阻害に
最も有効であり、正常型および変異型標的の両方を約８０％阻害した。ＩＳＩＳ
２５０２は両方の標的を３０−３５％阻害した。活性化Ｈ−ｒａｓの第１２コド
ン点突然変異を標的とする３つの化合物の内、１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチド
２５７０（配列番号３）のみが正常型に比較してｒａｓ−ルシフェラーゼの変異
型に対する選択性を示し、正常型標的を約２２％阻害し、変異型標的を約６８％
阻害した。ＩＳＩＳ２５７１は、両方の標的を約６０％阻害し、ＩＳＩＳ２５６
６は両方の標的を６５−７０％阻害した。表２は、活性化Ｈ−ｒａｓ遺伝子を標
的とする１３すべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドについて得られたデータ
をまとめたものである。スクランブル対照オリゴヌクレオチドは、変異型または
正常型ｒａｓを阻害せず、正常型ｒａｓの第１２コドン領域に相補的な対照オリ
ゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ２９０７，配列番号１９）は、正常型標的を７０％阻
害したが、変異型ｒａｓには影響を及ぼさなかった。各々のオリゴヌクレオチド
について示されているのはその配列、それが相補的である領域およびｒａｓ−ル
シフェラーゼ融合蛋白質の発現を阻害するその活性である（ｒａｓ−ルシフェラ
ーゼ発現を５０％阻害するのに必要な濃度をｎＭで表したＩＣ５０として示され
る）。第１２コドン点突然変異を標的とするより長いホスホロチオエートはｒａ
ｓ−ルシフェラーゼ発現に対して実質的なアンチセンス活性を示すが、ｒａｓ−
ルシフェラーゼの変異型の発現の選択的阻害を示さなかった。第１２コドン点突
然変異を標的とする１７ヌクレオチドの長さ未満のホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドは、ｒａｓ−ルシフェラーゼの両方の型に活性を示さなかった。これ
らの結果はｒａｓ配列を標的とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効
果的なアンチセンス活性を示している。
【００３１】 Ｈ−ｒａｓ ＡＵＧと特異的にハイブリダイズしうるアンチセンスオリゴヌク
レオチド：Ｈ−ｒａｓ ＡＵＧコドンを標的とする３つの２０−塩基ホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドがｒａｓ−ルシフェラーゼ発現を阻害する能力を、
実施例２−５に記載されたような過渡的トランスフェクションアッセイにより比
較した。表２に示されているこれらのオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ２５０２（
配列番号１）、２５０３（配列番号２）および６１８６（配列番号７）を、Ｈｅ
ｌａ細胞において単一量での（１００ｎＭ）ｒａｓ−ルシフェラーゼ発現の阻害
について試験した。３つすべてのＡＵＧ−標的化オリゴヌクレオチドがｒａｓ−
ルシフェラーゼ発現の阻害に有効であった。これらの３つのホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドはまた各々の糖上に２’−Ｏ−メチル修飾を有するよう製造
された。ＩＳＩＳ２５０３（配列番号２）の２’−Ｏ−メチル体もまた２００−
５００ｎＭのＩＣ５０でｒａｓ−ルシフェラーゼ発現を阻害した。２’−Ｏ−メ
チル体の配列番号７は、最も高い用量（５００ｎＭ）で約４０％の阻害を与えた
。
【００３２】
【表２】
【００３３】 オリゴヌクレオチドの長さはアンチセンス活性および特異性に影響する：Ｈ−
ｒａｓ第１２コドン点突然変異を標的とするオリゴヌクレオチドもまたｒａｓ−
ルシフェラーゼ発現の阻害に有効であった。５から２５塩基の長さの一連の１１
個のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを作製し、実施例２−５に記載され
ている過渡的トランスフェクションアッセイで変異型および野生型ｒａｓ−ルシ
フェラーゼを阻害する能力について試験した。オリゴヌクレオチドは表２に示さ
れる。１００ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度では、１５塩基またはそれより長い
オリゴヌクレオチドが変異型Ｈ−ｒａｓ標的の発現を阻害することが観察された
。１５および１９塩基の長さの間のオリゴヌクレオチドに野生型ｒａｓ−ルシフ
ェラーゼ発現に対する変異型の選択的阻害が観察された。野生型に比較して変異
型のｒａｓ−ルシフェラーゼ阻害に対して観察された最大の選択性は１７−ｍｅ
ｒの２５７０（配列番号３）であり、約４倍であった。２５７０が配列特異的様
式で作用していることを示すために、この化合物の変種（２９０７；配列番号１
９）を試験した。これは中心のアデノシン残基がシトシンに置き換えられており
、そのことはこのオリゴヌクレオチドを野生型Ｈ−ｒａｓ標的に完全に相補的な
ものにしている。それゆえ、このオリゴヌクレオチドは変異型Ｈ−ｒａｓ配列に
完全にハイブリダイズした場合、オリゴヌクレオチド／ＲＮＡデュープレックス
の中心に一つのミスマッチを含むであろう。オリゴヌクレオチド２９０７は変異
型ｒａｓ−ルシフェラーゼ（５％の阻害）に対して野生型ｒａｓ−ルシフェラー
ゼの発現を選択的に阻害した（８８％の阻害）。
【００３４】 変異型第１２コドン領域に相補的な２つの１６−ｍｅｒおよび２つの１８−ｍ
ｅｒを実施例２−５に記載したように試験した（表２）。図１は、用量依存性様
式でオリゴヌクレオチドの長さ１３、１５、１６、１７、１８および１９塩基に
対して測定されたアンチセンス活性および変異型選択性の実験の結果を示してい
る。これらのオリゴヌクレオチドで得られた結果は、変異型Ｈ−ｒａｓ配列に対
して活性であった化合物はまた選択性も発揮したことを示している；長さ１６の
オリゴヌクレオチド（配列番号１４および配列番号１５）および１７塩基（配列
番号３）は最も高い選択性を示した（各々４−および５−倍）。１３塩基化合物
である２５６８（配列番号１２）は試験された濃度でアンチセンス活性を示さな
かった。
【００３５】 デオキシギャップを有するキメラ２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド：変異
型選択的１７−ｍｅｒ（２５７０）の配列に基づいて、末端領域が２’−Ｏ−メ
チルヌクレオシドから成り、中心の残基が”デオキシギャップ”を形成する一連
のキメラホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドを合成した。
デオキシ残基の数はゼロから（全部２’−Ｏ−メチル）から１７（全部デオキシ
）の範囲である。これらのオリゴヌクレオチドは表３に示されている。
【００３６】
【表３】
【００３７】 これらのオリゴヌクレオチドを、実施例６に記載したようなハイブリダイゼー
ション効率、実施例８に記載したような哺乳類ＲＮａｓｅＨを用いるインビトロ
でのＲＮａｓｅＨ切断を指示する能力、およびアンチセンス活性について特徴付
けた。完全長Ｈ−ｒａｓ ｍＲＮＡに対するアンチセンス活性は、実施例９に記
載されているように、レポーター遺伝子ルシフェラーゼに連結されているｒａｓ
−応答性エンハンサー要素を用いてＨ−ｒａｓ遺伝子発現をモニターする過渡的
同時トランスフェクションレポーター遺伝子システムを用いて決定された。
【００３８】 完全長ｒａｓ ｍＲＮＡに対するデオキシギャップオリゴヌクレオチドのアン
チセンス活性：２’−Ｏ−メチル修飾により与えられた標識親和性の増強の有益
な性質は、もしこれらの化合物が適当な長さのＲＮａｓｅＨ感受性デオキシギャ
ップを備えていればアンチセンス阻害に利用することができる。２’−Ｏ−メチ
ルデオキシギャップオリゴヌクレオチドは、実施例９に記載したＨ−ｒａｓトラ
ンス活性化レポーター遺伝子システムを用いて完全長Ｈ−ｒａｓ ｍＲＮＡに対
するアンチセンス活性について試験した。アンチセンス実験は最初に単一オリゴ
ヌクレオチド濃度（１００ｎＭ）で実施した。５またはそれ以上のデオキシギャ
ップを含むキメラ２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドはＨ−ｒａｓ遺伝子発現
を阻害した。全デオキシ化合物は約５０％の阻害を与えた。全２’−Ｏ−メチル
、１−デオキシ、および３−デオキシは阻害を与えなかった。５−デオキシ、７
−デオキシおよび９−デオキシ化合物は、それぞれ約８５％、９５％および９０
％の阻害を与えた。これらの化合物は全デオキシの親化合物よりも強い活性を示
した。
【００３９】 これらの活性な化合物を用いて、４つのデオキシ残基を含む２’−Ｏ−メチル
キメラとともに、用量応答試験を実施した。これらのオリゴヌクレオチドによる
完全長Ｈ−ｒａｓのオリゴヌクレオチド媒介性阻害は用量依存性であった。最も
活性な化合物は７残基デオキシキメラであり、それは全デオキシオリゴヌクレオ
チドの活性よりも約５倍強い活性を示した。
【００４０】 短いキメラオリゴヌクレオチド：２’−Ｏ−メチル修飾により与えられる標的
親和性の増強は短いキメラオリゴヌクレオチドに活性を与えることが観察された
。一連の短い２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドを実施例９に記載され
ているように、完全長ｒａｓに対してのＴmおよびアンチセンス活性について試 験した。表４は５塩基長または７塩基長のデオキシギャップを有する１１、１３
、１５および１７ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのＴmを示している。全 デオキシ１３−ｍｅｒとはっきり対照的に、２’−Ｏ−メチルキメラ１３−ｍｅ
ｒの両方ともｒａｓ発現を阻害し、１１−ｍｅｒの一つもまた活性であった。こ
のことは図２に示されている。
【００４１】
【表４】
【００４２】 キメラ２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドによる相対的アンチセンス活性お
よびインビトロでＲＮａｓｅＨ切断を活性化する能力はデオキシ長とよく相関し
ている（図３）。
【００４３】 非対称デオキシギャップ：デオキシギャップはキメラ分子の中心にある必要は
ない。結合を促進させるため２’位で修飾された１つの末端、および残りの分子
は修飾されていない（２’デオキシ）領域のヌクレオチドを有するキメラ分子が
やはりｒａｓ発現を阻害しうることが観察された。１７−ｍｅｒの５’または３
’側に、または分子の中の異なった部位に７−デオキシギャップが位置している
配列番号３（変異型第１２コドンに相補的である１７−ｍｅｒ）のオリゴヌクレ
オチドは全て、ＲＮａｓｅＨ活性化およびアンチセンス活性を示した。しかしな
がら、５−塩基ギャップが配置により敏感であることが観察され、いくつかのギ
ャップ位置ではデュープレックスはＲＮａｓｅＨを弱く活性化し、アンチセンス
阻害剤としての働きが弱まった。従って、７−塩基デオキシギャップが好ましい
。
【００４４】 その他の糖修飾：キメラオリゴヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−メチル以外の
２’糖修飾のアンチセンス活性に対する影響を試験した。これらの修飾、ならび
に実施例６に記載されているように、７−塩基デオキシギャップに隣接する ２
’−修飾ヌクレオチドを有する１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを２５−ｍｅｒ
オリゴリボヌクレオチド相補物とハイブリダイズさせた場合に得られたＴm値が 表５に掲げられている。これらのオリゴヌクレオチドにおいて２’位のアルキル
の長さとＴm間に相関が観察された。アルキルの長さが増加するにつれＴmは減少
した。２’−フルオロキメラオリゴヌクレオチドはこの系列の中で最も高いＴm を示した。
【００４５】
【表５】
【００４６】 これらの２’修飾オリゴヌクレオチドを、実施例９に記載したトランス活性化
レポーター遺伝子アッセイを用いてＨ−ｒａｓに対するアンチセンス活性につい
て試験した。表５に示したように、これら全ての２’修飾キメラ化合物がｒａｓ
発現を阻害し、２’−フルオロ ７−デオキシ−ギャップ化合物が最も活性が高
かった。中心に５−デオキシギャップを有する２’−フルオロキメラオリゴヌク
レオチドもまた活性であった。
【００４７】 ５−塩基または７−塩基デオキシギャップ周辺の領域に２’−Ｏ−プロピルを
有する配列番号３のキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを２’−Ｏ−
メチルキメラオリゴヌクレオチドと比較した。Ｔ２４細胞におけるｒａｓ発現は
７−デオキシギャップおよび均一なホスホロチオエート主鎖を有する２’−Ｏ−
メチルおよび２’−Ｏ−プロピルキメラオリゴヌクレオチドの両方により阻害さ
れた。デオキシギャップが５つのヌクレオチドに減少した場合、２’−Ｏ−メチ
ルオリゴヌクレオチドのみがｒａｓ発現を阻害した。
【００４８】 癌細胞におけるＨ−ｒａｓ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害
：ｒａｓ ＡＵＧ領域に相補的な２つのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
（２５０２、２５０３）を、同一の配列および２’−Ｏ−メチル領域が隣接する
７−塩基デオキシギャップを有するキメラオリゴヌクレオチド（４９９８、５１
２２）とともに、実施例１０に記載されたように試験した。これらのキメラオリ
ゴヌクレオチドは表６に示されている。
【００４９】
【表６】
【００５０】 化合物２５０３はＴ２４細胞におけるｒａｓ発現を７１％阻害し、キメラ化合
物（４９９８）はｒａｓ ｍＲＮＡをさらに阻害した（８４％阻害）。またＡＵ
Ｇ領域に相補的である化合物２５０２はｒａｓ ＲＮＡレベルを２６％減少させ
、このオリゴヌクレオチドのキメラ体（５１２２）は１５％の阻害を示した。ま
た、変異型第１２コドンを標的とする２つのオリゴヌクレオチドについてもこの
アッセイを行った。化合物２５７０（配列番号３）はｒａｓ ＲＮＡを８２％減
少させ、７−デオキシギャップを有するこのオリゴヌクレオチドの２’−Ｏ−メ
チルキメラ体（３９８５）はｒａｓ ＲＮＡを９５％減少させた。
【００５１】 オリゴヌクレオチド２５７０および２５０３はまた野生型（活性型ではない）
Ｈ−ｒａｓ第１２コドンを有するＨｅＬａ細胞におけるｒａｓ発現に対するそれ
らの効果を決定するために試験した。これらのオリゴヌクレオチドの両方がＴ２
４細胞（活性型第１２コドンを有する）ではｒａｓ発現を阻害するが、ｒａｓ
ＡＵＧと特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド（２５０３）のみが
ＨｅＬａ細胞においてｒａｓ発現を阻害した。活性型第１２コドンと特異的にハ
イブリダイズしうるオリゴヌクレオチド２５７０（配列番号３）はＨｅＬａ細胞
におけるｒａｓ発現を阻害せず、これはこれらの細胞が活性型第１２コドン標的
を有しないからである。
【００５２】 活性型Ｈ−ｒａｓの第１２コドン領域に相補的な１７−ｍｅｒホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド２５７０を、２５７０と同一
の配列を有し、それぞれ５、７および９塩基のデオキシギャップを有するキメラ
ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド３９８０、３９８５お
よび３９８４（表３に示されている）とともに、Ｔ２４細胞におけるｒａｓ発現
の阻害を試験した（実施例１０に記載しているように）。完全２’−デオキシオ
リゴヌクレオチド２５７０および３つのキメラオリゴヌクレオチドがＴ２４細胞
におけるｒａｓ ｍＲＮＡレベルを減少させた。化合物３９８５（７−デオキシ
ギャップ）および３９８４（９−デオキシギャップ）はｒａｓ ｍＲＮＡを８１
％減少させた；化合物３９８０（５−デオキシギャップ）はｒａｓ ｍＲＮＡを
６１％減少させた。この配列を有し、５−デオキシ（４６８９）または７−デオ
キシ（４６９０）ギャップが隣接する２’−フルオロ修飾ヌクレオチドを有する
キメラオリゴヌクレオチドはＴ２４細胞においてｒａｓ ｍＲＮＡ発現を阻害し
、７−デオキシギャップが好適であった（８２％阻害、５−デオキシギャップを
有する２’−フルオロキメラでは６３％阻害）。
【００５３】 癌細胞増殖のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害：活性型ｒａｓの第１２コ
ドン領域に相補的な同一の配列を有する３つの１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチド
を実施例１１に記載したようにＴ２４癌細胞増殖に対する効果について試験した
。３９８５は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが隣接している７−デオキシギャッ
プを有し、４６９０は２’−Ｆ ヌクレオチドが隣接している７−デオキシギャ
ップを有する（全てホスホロチオエートである）。これらのオリゴヌクレオチド
の癌細胞増殖に対する効果は、ノーザンブロット分析により示されたそれらのｒ
ａｓ ｍＲＮＡ発現に対する効果とよく相関していた：オリゴヌクレオチド２５
７０は細胞増殖を６１％阻害し、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチド３
９８５は細胞増殖を８２％阻害し、および２’−フルオロキメラ類似体は細胞増
殖を９３％阻害した。
【００５４】 細胞増殖に対するこれらのオリゴヌクレオチドの用量応答研究では、阻害は２
５ｎＭ−１００ｎＭの範囲で用量依存性であることが示された。４４ｎＭ，６１
ｎＭおよび９８ｎＭのＩＣ５０値が各々オリゴヌクレオチド４６９０、３９８５
および２５７０に対して決められた。ランダムオリゴヌクレオチド対照は試験さ
れた用量では何の効果も示さなかった。
【００５５】 細胞増殖に対するＩＳＩＳ２５７０の効果は細胞型特異的であった。このオリ
ゴヌクレオチドによるＴ２４細胞増殖の阻害は、同じオリゴヌクレオチドによる
ＨｅＬａ細胞の阻害より４倍の効果を示した（１００ｎＭオリゴヌクレオチド濃
度）。ＩＳＩＳ２５７０は活性型（変異型）ｒａｓ第１２コドンを標的としてお
り、それはＴ２４には存在するが、野生型第１２コドンを有するＨｅＬａ細胞に
は存在しない。
【００５６】 キメラ主鎖修飾オリゴヌクレオチド：前の実施例で議論されてきたオリゴヌク
レオチドは均一なホスホロチオエート主鎖を有していた。これまで議論した２’
修飾キメラオリゴヌクレオチドは均一ホスホジエステル主鎖では活性ではない。 ５−ヌクレオチドデオキシギャップが隣接する２’−Ｏ−メチル領域を有し、Ｐ
＝Ｓ主鎖のギャップ領域およびＰ＝Ｏ主鎖の隣接領域を有するキメラオリゴヌク
レオチドを合成した（ＩＳＩＳ４２２６）。ギャップにＰ＝Ｏ主鎖および隣接領
域にＰ＝Ｓを有する別のキメラオリゴヌクレオチドも合成した（ＩＳＩＳ４２２
３）。これらのオリゴヌクレオチドは表７に示されている。
【００５７】 完全に２’デオキシであり、および１つのホスホジエステル（ＩＳＩＳ４２４
８）、２つのホスホジエステル（ＩＳＩＳ４５４６）、３つのホスホジエステル
（ＩＳＩＳ４５５１）、４つのホスホジエステル（ＩＳＩＳ４５９３）、５つの
ホスホジエステル（ＩＳＩＳ４６０６）または１０のホスホジエステル結合（Ｉ
ＳＩＳ４２４１）を分子の中央に含むホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌ
クレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドもまた表７に示されている
。
【００５８】
【表７】
【００５９】 Ｄｉｇｎａｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１，１４７５−１
４８９、１９８３年に記載されているように、ヌクレアーゼ分解に対する感受性
を決定するために、オリゴヌクレオチドを粗ＨｅＬａ細胞抽出物と３７℃でイン
キュベートした。ホスホロチオエート／２’−Ｏ−メチルウイング間に５つのジ
エステルギャップを有するオリゴヌクレオチド（４２３３）は７時間のＴ1/2を 有していた。ホスホロチオエート／２’−Ｏ−メチル分子中に５つのホスホロチ
オエートギャップを有するオリゴヌクレオチドは３０時間のＴ1/2を有していた 。１から１０のジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドの組において、一つ
のホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（４２４８）は全ホスホロ
チオエート分子（ＩＳＩＳ２５７０）と同様にヌクレアーゼに対して安定であり
、ＨｅＬａ細胞抽出物で５時間後でも分解を起こさなかった。２、３および４の
ジエステルギャップを有するオリゴヌクレオチドは各々約５．５時間、３．７５
時間および３．２時間のＴ1/2を有しており、５または１０のデオキシ結合を有 するオリゴヌクレオチドは各々１．７５時間および０．９時間のＴ1/2を有して いた。
【００６０】 キメラ主鎖修飾オリゴヌクレオチドのアンチセンス活性：均一ホスホロチオエ
ート主鎖はアンチセンス活性には必要とされない。ＩＳＩＳ４２２６およびＩＳ
ＩＳ４２３３を、ＩＳＩＳ２５７０（完全ホスホロチオエート／全デオキシ）、
ＩＳＩＳ３９８０（完全ホスホロチオエート、デオキシギャップを有する２’−
Ｏ−メチルウイング）およびＩＳＩＳ３９６１（完全ホスホジエステル、デオキ
シギャップを有する２’−Ｏ−メチルウイング）とともに、実施例２−５に記載
されたように、ｒａｓ発現に対する効果をｒａｓ−ルシフェラーゼレポーターシ
ステムで試験した。Ｐ＝Ｓ（すなわち、ヌクレアーゼ耐性）ギャップ領域を有す
る全てのオリゴヌクレオチドがｒａｓ発現を阻害した。１つのホスホジエステル
（ＩＳＩＳ４２４８）または１０のホスホジエステル結合（ＩＳＩＳ４２４１）
を分子の中央に含むホスホロチオエート主鎖を有する２つの完全２’デオキシオ
リゴヌクレオチドについても活性をアッセイした。単一のＰ＝Ｏを含む化合物は
完全Ｐ＝Ｓ分子と同じ活性であったが、一方、１０のＰ＝Ｏを含む同じ化合物は
完全に不活性であった。
【００６１】 ７−塩基デオキシギャップ領域のみにホスホロチオエート主鎖を有し、隣接領
域にホスホジエステル（２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−プロピル）を有する
配列番号３のキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを作製した。２’−
Ｏ−プロピルジエステル隣接領域を有するオリゴヌクレオチドはｒａｓ発現を阻
害することができた。
【００６２】 修飾塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドによるｒａｓ−ルシフェラー
ゼ遺伝子発現の阻害：変異第１２コドンのウラシルに相補的な位置に２−（アミ
ノ）アデニンを有し、活性型ｒａｓの第１２コドン点突然変異に相補的な一連の
アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを前に記載したように合成
した。アデニンの２−位のアミノ基はウラシルの２−位の酸素と水素結合しうる
ため、通常の２つに代わって３つの水素結合が形成される。このことは活性型ｒ
ａｓ遺伝子に対する２−（アミノ）アデニン修飾アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドのハイブリダイゼーションを非常に安定化させるが、一方、この位置での修飾
Ａ−Ｇミスマッチのため、野生型第１２コドンへのこのオリゴヌクレオチドの安
定性を不安定化するかまたは正味の影響を与えない。このことは所望の標的に対
する修飾オリゴヌクレオチドの特異性を増加させる。
【００６３】 この位置に一つの２，６−（ジアミノ）アデノシンを有し、他は修飾されてい
ない均一ホスホロチオエート１７−ｍｅｒ（２５７０、配列番号３と同一の配列
）がＲＮａｓｅＨ基質として少なくとも２５７０配列と同様に有効であることが
観察された。従って、それは有効なアンチセンス分子であることが期待される。
同一の配列のデオキシギャップを有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
中のこの位置に一つの２，６−（ジアミノ）アデノシンを有するオリゴヌクレオ
チドもまたＲＮａｓｅＨ活性化を示した。
【００６４】 インビボ抗腫瘍データ：実施例１３および１４に記載されているように、ＩＳ
ＩＳ２５０３（配列番号２）を、インビボでのヒト腫瘍に対する活性について評
価した。これらの研究ではヌードマウス内へ皮下に移植され、移植部位で腫瘍増
殖したヒト肺癌腫細胞株（Ａ５４９）を用いた。これらの細胞はＨａ−ｒａｓ遺
伝子中に突然変異を含んでいず、正常Ｈａ−ｒａｓを発現しているため、ＡＵＧ
−配向オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ２５０３のみの抗腫瘍活性を評価した。
【００６５】 第一の研究では、食塩水に溶解したホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを
２０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射により投与した。薬剤処置は腫瘍が最初に見
えるようになった時点で開始し（腫瘍細胞接種から２８日後）、処置は１日おき
に実施した。図４に示すように、関係のない対照ホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドＩＳＩＳ１０８２（配列番号５５）で処置した後には腫瘍増殖には何の
効果も観察されなかった。しかしながら、Ｈ−ｒａｓ−特異的オリゴヌクレオチ
ドＩＳＩＳ２５０３（配列番号２）では有意な腫瘍増殖の阻害が観察された。Ｈ
−ｒａｓ化合物の抗腫瘍効果は、薬剤処置を開始して２０日後に最初に観察され
、研究を継続している間を通して維持された。
【００６６】 第二の研究では、カチオン性脂質処方（ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥ）中にホスホロ
チオエートオリゴヌクレオチドを調製し、実施例１５に記載したように皮下注射
により投与した。薬剤処置は腫瘍細胞を接種して１週間後に開始し、４週間の間
のみ１週間に３回実施した。第一の研究で観察されたように、Ｈ−ｒａｓ−特異
的化合物ＩＳＩＳ２５０３（配列番号２）の投与により著しい腫瘍増殖の減少が
起こったが、関係のない対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１０８２）では有意
な効果は観察されなかった（図５）。腫瘍容量の減少は、目に見える腫瘍が現れ
てから２０日後に最初に観察され研究の残りの期間を通して維持された。
【００６７】 細胞内での２’−修飾ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの安定性：細胞内
でのアンチセンス活性にはヌクレアーゼ安定性を与えるオリゴヌクレオチドの修
飾が必要とされる。糖の２’位でのある種の修飾が、主鎖修飾することなく細胞
内でアンチセンス効果を引き出すのに十分なヌクレアーゼ耐性を与えることが見
いだされている。均一に２’−プロポキシ修飾したホスホジエステルオリゴヌク
レオチド（配列番号３）が同じ配列を有するホスホロチオエート２’−デオキシ
オリゴヌクレオチドと等しいレベルで、投与２４時間後、Ｔ２４細胞でのＨ−ｒ
ａｓ発現を阻害することが観察された。均一な２’−メトキシホスホジエステル
オリゴヌクレオチドもまたいくらかの活性を示した。２’−ペントキシ修飾は少
なくとも２’−プロポキシと同様に活性であることが観察された。
【００６８】 Ｋｉ−ｒａｓに対して活性なアンチセンスオリゴヌクレオチド：ヒトＫｉ−ｒ
ａｓ癌遺伝子の５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域およびコード領域に相補的
であるようにオリゴヌクレオチドを設計した。ＭｃＧｒａｔｈ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３０４，５０１−５０６，１９８３年。オリゴヌクレオチドはコー
ド領域のうちＫｉ−ｒａｓ−媒介形質転換を誘導する突然変異の部位であること
が知られている第１２および６１コドン、および形質転換に関与することは知ら
れていない第３８コドンを標的としている。オリゴヌクレオチドは表８に示され
ている。
【００６９】
【表８】
【００７０】 １２個のＫｉ−ｒａｓ特異的オリゴヌクレオチドを、Ｋｉ−ｒａｓ癌遺伝子内
の第１２コドンに突然変異を含む３つの結腸癌細胞株に対するアンチセンス活性
についてスクリーニングし、Ｋｉ−ｒａｓ ｍＲＮＡレベルの測定により評価し
た。図６に示したように、試験化合物の半数がＫｉ−ｒａｓ転写体に対して有意
な活性を示し（少なくとも４０％の阻害）、最も活性な化合物は５’−および３
’−非翻訳領域を標的とするものであった。しかしながら、Ｋｉ−ｒａｓ発現の
有意な阻害は野生型第１２および６１コドンに対する化合物でも観察された。有
意な活性を示した化合物は試験された３つの癌細胞株全部に有効であった。
【００７１】 ３つの化合物の用量応答分析は、ＩＳＩＳ６９５８およびＩＳＩＳ６９５７（
両方とも５’−ＵＴＲを標的とする）がこの一連のオリゴヌクレオチドにおいて
最も強力なＫｉ−ｒａｓの阻害剤であることを示した。これらのオリゴヌクレオ
チドをＫｉ−ｒａｓ形質転換細胞株の増殖を阻害する能力について試験した。結
腸癌細胞株ＳＷ４８０をオリゴヌクレオチドの単一用量で（２００ｎＭ）処置し
、５日間に渡って細胞数を決定した。図７に示したように、Ｋｉ−ｒａｓ特異的
オリゴヌクレオチドの両方がＳＷ４８０細胞増殖の有効な阻害剤であり、ＩＳＩ
Ｓ６９５７（配列番号２１）はＩＳＩＳ６９５８（配列番号２０）より強い活性
を示した。この活性の相違は、Ｋｉ−ｒａｓ ｍＲＮＡ発現の阻害とよく相関し
ている（図６）。
【００７２】 正常Ｋｉ−ｒａｓと比較した変異型Ｋｉ−ｒａｓの阻害の選択性：Ｋｉ−ｒａ
ｓを標的とするオリゴヌクレオチドを正常型Ｋｉ−ｒａｓと比較して変異型Ｋｉ
−ｒａｓを選択的に阻害する能力について試験した。２つの細胞株を使用した：
変異型Ｋｉ−ｒａｓ（第１２コドン、ＧからＴへのトランスバージョン）を発現
するＳＷ４８０細胞株および正常Ｋｉ−ｒａｓを発現する細胞株（ＨｅＬａ）。
２つのオリゴヌクレオチドを試験した：ＩＳＩＳ６９５７（配列番号２１）、Ｋ
ｉ−ｒａｓの５’−非翻訳領域を標的とする２０−ｍｅｒホスホロチオエート、
およびＩＳＩＳ７４５３（配列番号３２）、Ｋｉ−ｒａｓの第１２コドン領域を
標的とする１５−ｍｅｒホスホロチオエート。処置２４時間後にＫｉ−ｒａｓ
ｍＲＮＡレベルを測定した。第１２コドンを標的とする化合物は変異型Ｋｉ−ｒ
ａｓを発現する細胞株において有効であった（８７％阻害、ＨｅＬａ細胞におい
ては１８％阻害）。しかしながら、５’−非翻訳領域を標的とするＫｉ−ｒａｓ
オリゴヌクレオチドは両方の細胞株においてＫｉ−ｒａｓ発現の強力な阻害剤で
あった（９５％阻害）。変異型Ｋｉ−ｒａｓに対する選択性はオリゴヌクレオチ
ド濃度およびＲＮＡ標的に対する親和性に依存していることが観察された。
【００７３】 デオキシギャップを有するＫｉ−ｒａｓオリゴヌクレオチド：６または８のヌ
クレオチド長の中央２’−デオキシギャップ領域と隣接する２’−Ｏ−メチル修
飾を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（配列番号２１、Ｋｉ−ｒａ
ｓの５’−非翻訳領域を標的とする）を合成した。ギャップを有するオリゴヌク
レオチドの両方ともＫｉ−ｒａｓ発現に活性であることがノーザンブロット分析
により決定された。均一に２’−Ｏ−メチル化された化合物（デオキシギャップ
なし）は不活性であった。６−または８−ヌクレオチドデオキシギャップを有す
るように合成された別のオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ７６７９（配列番号３３
、Ｋｉ−ｒａｓの５’非翻訳／ＡＵＧ領域に相補的）もまた活性であることが観
察された。
【００７４】 ＩＳＩＳ２５０３（Ｈ−ｒａｓ）の２’−メトキシエトキシ類似体：ＩＳＩＳ
２５０３の配列（配列番号２）を有し、２’−メトキシエトキシ（２’−ＭＯＥ
）修飾の種々の組み合わせを有する一連のキメラオリゴヌクレオチドを合成した
。これらは表９に示される。すべての主鎖結合はホスホロチオエートである。
【００７５】
【表９】
【００７６】 これらのオリゴヌクレオチド（ただし、１３９１９および１３９２７は試験し
ていない）を、実施例１０に記載されるように、Ｔ２４細胞においてＨ−ｒａｓ
ｍＲＮＡレベルを低下させる能力について試験した。ただし、オリゴヌクレオ
チドおよびリポフェクチンはＯｐｔｉＭＥＭ中で混合し、２．５μｇ／ｍｌリポ
フェクチン／１００ｎＭオリゴヌクレオチドの比率が一定となるよう維持した。
試験した化合物はすべて親化合物であるＩＳＩＳ２５０３に匹敵する活性を有し
ており、ＩＣ５０は５０ｎＭ以下であった。このため、１つまたはそれ以上の２
’−ＭＯＥ修飾を含むオリゴヌクレオチドは、ｒａｓ発現の低下に好ましい。こ
れらの化合物についての用量応答は、図８に示される。ＩＳＩＳ１３１７７（Ｔ
ＣＡＧＴＡＡＴＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＧＧ；配列番号３４）は、配列番号２のホ
スホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドスクランブル対照である。
【００７７】 ＩＳＩＳ２５０３（Ｈ−ｒａｓ）のＭＭＩ類似体：ＩＳＩＳ２５０３の配列（
配列番号２）および種々の位置にメチレン（メチルイミノ）主鎖結合を有する一
連のキメラオリゴヌクレオチドを合成した。これらは表１０に示される。合成を
容易にするため、これらのオリゴヌクレオチドの作成においては、ＭＭＩ結合を
取り込んだ二量体を用いた。ＭＭＩ主鎖結合を含有する二量体は、太字で示され
ている。”ｏ”は、ＭＭＩ二量体の間のホスホジエステル結合を示す。”ｓ”は
、ＭＭＩ二量体間のホスホロチオエート結合を示す。注のない結合はホスホロチ
オエートである。
【００７８】
【表１０】
【００７９】 これらの化合物を、実施例１０に記載されるように、Ｔ２４細胞においてＨ−
ｒａｓ ｍＲＮＡレベルを低下させる能力について試験した。ただし、オリゴヌ
クレオチドおよびリポフェクチンは、ＯｐｔｉＭＥＭ中で混合し、２．５μｇ／
ｍｌリポフェクチン／１００ｎＭオリゴヌクレオチドの比率が一定となるよう維
持した。図９に示されるように、これらの化合物はすべて、５００ｎＭ以下の用
量でｍＲＮＡレベルを８０％以上低下させることができた。ＩＳＩＳ１３１７７
（配列番号３４）は、配列番号２のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオ
チドスクランブル対照である。ＩＳＩＳ１４８９９を除き、すべてのＭＭＩ化合
物は親デオキシホスホロチオエート化合物であるＩＳＩＳ２５０３より活性が高
かった。いくつかの化合物（ＩＳＩＳ１４８９６，１４８９７，１４８９８）は
、ｒａｓ ｍＲＮＡのほとんど完全な除去を達成した。したがって、１つまたは
それ以上のＭＭＩ修飾を含むオリゴヌクレオチドは、ｒａｓ発現を低下させるの
に非常に好ましい。
【００８０】 Ｎ−ｒａｓに対して活性なアンチセンスオリゴヌクレオチド：公表された配列
（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＨＳＮＲＡＳＲ，ｘ０２７５１）を用いて、ヒトＮ−
ｒａｓを標的とするように一連のホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチ
ドを設計した。これらの化合物を、実施例１０に記載されるように、Ｔ２４細胞
においてＮ−ｒａｓレベルを低下させる能力について試験した。ただし、プロー
ブはＮ−ｒａｓ ｃＤＮＡプローブ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡから購入；カタログ番号ＨＰ１２９）であり、およびオリ
ゴヌクレオチドおよびリポフェクチンはＯｐｔｉＭＥＭ中で混合し、２．５μｇ
／ｍｌリポフェクチン／１００ｎＭオリゴヌクレオチドの比率が一定となるよう
維持した。
【００８１】 これらのオリゴヌクレオチド、および各オリゴヌクレオチドの示すＮ−ｒａｓ
ｍＲＮＡの低下のパーセンテージは、表１１に示される。太字で示されるオリ
ゴヌクレオチド（配列番号４４，４５，４６，４７，４９および５２）は、３０
０ｎＭの用量でスクリーニングしたとき、ｒａｓ ｍＲＮＡの３０％を越える低
下を示し、このアッセイにおいて活性であると考えられる。したがってこれらの
配列が好ましい。これらのオリゴヌクレオチドのうち、１４６８６，１４６８７
，１４６８８，１４６９１および１４６９４（配列番号４４，４５，４６，４９
および５２）は、５０％を越える阻害を示した。オリゴヌクレオチド１４６７７
，１４６７８，１４６８６，１４６８７，１４６８８，１４６８９，１４６９０
，１４８９１，１４６９２，１４６９３，および１４６９４について用量応答曲
線を得た。これらは図１０に示される。図からわかるように、ＩＳＩＳ１４６８
６およびＩＳＩＳ１４６９１（それぞれ配列番号４４および４９）は、４００ｎ
Ｍの用量でＮ−ｒａｓ ｍＲＮＡをほとんど完全に除去した。
【００８２】
【表１１】
【００８３】 以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定することを意図す
るものではない。 実施例 実施例１：オリゴヌクレオチドの合成および特性決定 非修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、自動化ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ｂ）で、標準的ホスホルアミダイト化学お
よびヨウ素酸化を用いて合成した。β−シアノエチルジイソプロピル−ホスホル
アミダイトは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔ
ｙ，ＣＡ）から購入した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについては、
ホスファイト結合の段階的チオ化のために、標準的酸化ボトルをアセトニトリル
中の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドの０．２Ｍ
溶液で置き換えた。チオ化サイクルの待機時間を６８秒間に増加し、続いてキャ
ッピング工程を行った。
【００８４】 ２’−メトキシオリゴヌクレオチドは、２’−メトキシ−β−シアノエチルジ
イソプロピル−ホスホルアミダイト（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍ
Ａ）を用い、テトラゾールおよび塩基のパルス輸送の後の待機時間を３６０秒間
に増加することを除いて、非修飾オリゴヌクレオチドについての標準的なサイク
ルを用いて合成した。他の２’−アルコキシオリゴヌクレオチドは、適当な２’
−修飾アミダイト、例えばＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｔｅｒｌ
ｉｎｇ，ＶＡ）から入手可能なものを用いて、この方法を改変して合成した。
【００８５】 ２’−フルオロオリゴヌクレオチドは、Ｋａｗａｓａｋｉら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．１９９３，３６，８３１−８４１）に記載されるようにして合成した。
簡単には、市販の９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを出発物質として用
い、文献の方法を改変して２’−β−Ｏ−トリフリル基のＳN２−置換により２ ’−α−フルオロ原子を導入することにより、保護されたヌクレオシドＮ6−ベ ンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンを合成した。すなわち、
Ｎ6−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンは、３’，５’− ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として、中程度の収率で選択的に保護
された。ＴＨＰおよびＮ6−ベンゾイル基の脱保護は、標準的方法を用いて行い 、５’−ジメトキシトリチル−（ＤＭＴ）および５’−ＤＭＴ−３’−ホスホル
アミダイト中間体は、標準的方法を用いて得た。
【００８６】 ２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成は、テトライソプロピルジ
シロキサニル（ＴＰＤＳ）保護９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発
物質として用い、中間体であるジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンに
変換することにより実施した。ＴＰＤＳ基の脱保護、およびＴＨＰによるヒドロ
キシル基の保護により、ジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護アラビノフラノシルグア
ニンを得た。選択的Ｏ−デアシル化およびトリフレート化（ｔｒｉｆｌａｔｉｏ
ｎ）の後、粗生成物をフッ素で処理し、次にＴＨＰ基を脱保護した。標準的方法
を用いて、５’−ＤＭＴ−および５’−ＤＭＴ−３’−ホスホルアミダイトを得
た。
【００８７】 ２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの合成は、２，２’−アンヒドロ−
１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを７０％フッ化水素ピリジンで処理す
る既知の方法を改変することにより実施した。標準的方法を用いて、５’−ＤＭ
Ｔおよび５’−ＤＭＴ−３’ホスホルアミダイトを得た。
【００８８】 ２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンは、２’−デオキシ−２’−フルオ
ロウリジンのアミノ化、および続く選択的保護により、Ｎ4−ベンゾイル−２’ −デオキシ−２’−フルオロシチジンを得ることにより、合成した。標準的方法
を用いて、５’−ＤＭＴおよび５’−ＤＭＴ−３’ホスホルアミダイトを得た。
【００８９】 ２’−（２−メトキシエチル）修飾アミダイトは、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅ
ｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１９９５，７８，４８６−５０４にしたがって合成し
た。合成を容易にするために、最後のヌクレオチドはデオキシヌクレオチドであ
った。２’−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3−シトシンは５−メチルシトシンでありう
る。 ５−メチルシトシンモノマーの合成：２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−ア
ラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］： ５−メチルウリジン（リボシルチミン；Ｙａｍａｓａ，Ｃｈｏｓｈｉ，Ｊａｐ
ａｎから市販）（７２．０ｇ，０．２７９Ｍ），ジフェニルカーボネート（９０
．０ｇ，０．４２０Ｍ）および炭酸水素ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４Ｍ）
をＤＭＦ（３００ｍＬ）に加えた。混合物を撹拌しながら加熱還流し、発生した
二酸化炭素ガスを制御された様式で放出させた。１時間後、わずかに暗色の溶液
を減圧下で濃縮した。得られたシロップをジエチルエーテル（２．５Ｌ）中に撹
拌しながら注加した。生成物はガムを形成した。エーテルをデカントし、残渣を
最小量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶解した。溶液を新たなエーテル（２．
５Ｌ）中に注加して堅いガムを得た。エーテルをデカントし、ガムを真空オーブ
ン中で乾燥して（６０℃、１ｍｍＨｇ、２４時間）、固体を得て、これを砕いて
薄褐色粉末を得た（５７ｇ，８５％粗収率）。この物質は、そのまま次の反応に
用いた。 ２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン： ２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ，０．８１Ｍ），トリ
ス（２−メトキシエチル）ボレート（２３１ｇ，０．９８Ｍ）および２−メトキ
シエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌステンレス圧力容器に入れ、１６０℃に予熱し
た湯浴中に置いた。１５５−１６０℃で４８時間加熱した後、容器を開封し、溶
液を蒸発乾固させ、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）中で破砕した。残渣を熱アセトン（
１Ｌ）中に懸濁した。不溶性塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄し、濾
液を蒸発させた。残渣（２８０ｇ）をＣＨ3ＣＮ（６００ｍＬ）に溶解し、蒸発
させた。シリカゲルカラム（３ｋｇ）を０．５％Ｅｔ3ＮＨを含有するＣＨ2Ｃｌ
2／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）中で充填した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2（２
５０ｍＬ）に溶解し、シリカ（１５０ｇ）に吸着させ、次にカラムに負荷した。
生成物を充填溶媒で溶出して、１６０ｇ（６３％）の生成物を得た。 ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジ
ン： ２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，０．５０６Ｍ）
をピリジン（２５０ｍＬ）とともに蒸発させ、乾燥した残渣をピリジン（１．３
Ｌ）に溶解した。塩化ジメトキシトリチルの第１のアリコート（９４．３ｇ，０
．２７８Ｍ）を加え、混合物を室温で１時間撹拌した。塩化ジメトキシトリチル
の第２のアリコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、反応液をさらに１時
間撹拌した。次にメタノール（１７０ｍＬ）を加えて反応を停止させた。ＨＰＬ
Ｃは約７０％の生成物の存在を示した。溶媒を蒸発させ、ＣＨ3ＣＮ（２００ｍ Ｌ）中で破砕した。残渣をＣＨＣｌ3（１．５Ｌ）に溶解し、２ｘ５００ｍＬの 飽和ＮａＨＣＯ3および２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相をＮ ａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。２７５ｇの残渣を得た。残渣を３．５
ｋｇのシリカゲルカラムで、０．５％Ｅｔ3ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサ ン／アセトン（５：５：１）で充填し溶出することにより、精製した。純粋な画
分を蒸発させて、１６４ｇの生成物を得た。不純画分から追加の約２０ｇを得て
、全収率１８３ｇ（５７％）であった。 ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチル−ウリジン： ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリ
ジン（１０６ｇ，０．１６７Ｍ），ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦおよ
び１８８ｍＬのピリジンから調製した３：１混合物の７５０ｍＬ）および無水酢
酸（２４．３８ｍＬ，０．２５８Ｍ）を合わせ、室温で２４時間撹拌した。反応
は、最初にｔｌｃ試料にＭｅＯＨを加えて停止させることにより、ｔｌｃにより
モニターした。ｔｌｃで判定して反応が完了した際、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加
え、混合物を３５℃で蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ3（８００ｍＬ）に溶解し、 ２ｘ２００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムおよび２ｘ２００ｍＬの飽和ＮａＣｌ
で抽出した。水層を２００ｍＬのＣＨＣｌ3で逆抽出した。合わせた有機相を硫 酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて、１２２ｇの残渣（約９０％生成物）を得た
。残渣を３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：
１）を用いて溶出した。純粋な生成物画分を蒸発させて、９６ｇ（８４％）を得
た。 ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン： ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣＨ3ＣＮ（７００ｍＬ ）中に溶解することにより第１の溶液を調製し、取り置いた。トリエチルアミン
（１８９ｍＬ，１．４４Ｍ）をトリアゾール（９０ｇ，１．３Ｍ）のＣＨ3ＣＮ （１Ｌ）中の溶液に加え、−５℃に冷却し、オーバーヘッドスターラーを用いて
０．５時間撹拌した。０−１０℃に維持した撹拌溶液に、ＰＯＣｌ3を３０分間 かけて滴加し、得られた混合物をさらに２時間撹拌した。第１の溶液を後者の溶
液に４５分間かけて滴加した。得られた反応混合物を冷室で一夜放置した。反応
混合物から塩を濾過し、溶液を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し
、不溶性固体を濾過により除去した。濾液を１ｘ３００ｍＬのＮａＨＣＯ3およ び２ｘ３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ
た。残渣をＥｔＯＡｃ中で砕いて、表題化合物を得た。 ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジ
ン： ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）の、
ジオキサン（５００ｍＬ）およびＮＨ4ＯＨ（３０ｍＬ）中の溶液を室温で２時 間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍＬ）と
ともに共沸させた。残渣をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し、２リットルのスチ
ール圧力容器に移した。ＮＨ3ガスで飽和したＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を加え、 容器を１００℃で２時間加熱した（ｔｌｃは完全な変換を示した）。容器内容物
を蒸発乾固させ、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２
００ｍＬ）で１回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させ
て、８５ｇ（９５％）の表題化合物を得た。 Ｎ4−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル −５−メチルシチジン： ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチ
ジン（８５ｇ，０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解し、無水安息香酸
（３７．２ｇ，０．１６５Ｍ）を撹拌しながら加えた。３時間撹拌した後、ｔｌ
ｃは反応が約９５％完了したことを示した。溶媒を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（
２００ｍＬ）とともに共沸させた。残渣をＣＨＣｌ3（７００ｍＬ）に溶解し、 飽和ＮａＨＣＯ3（２ｘ３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で 抽出し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、蒸発させて、残渣（９６ｇ）を得た。残渣を、０ ．５％Ｅｔ3ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を溶出溶媒として用い て、１．５ｋｇのシリカカラム上でクロマトグラフィーに供した。純粋な生成物
画分を蒸発させて、９０ｇ（９０％）の表題化合物を得た。 Ｎ4−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル −５−メチルシチジン−３’−アミダイト： Ｎ4−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチ ル−５−メチルシチジン（７４ｇ，０．１０Ｍ）をＣＨ2Ｃｌ2（１Ｌ）に溶解し
た。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）および２−シアノエトキシ
−テトラ（イソプロピル）ホスファイト（４０．５ｍＬ，０．１２３Ｍ）を窒素
雰囲気下で撹拌しながら加えた。得られた混合物を室温で２０時間撹拌した（ｔ
ｌｃは反応が９５％完了したことを示した）。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ3（ １ｘ３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（３ｘ３００ｍＬ）で抽出した。水性洗浄
液をＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍＬ）で逆抽出し、抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ4で乾燥 し、濃縮した。得られた残渣を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を溶出溶媒と
して用いて、１．５ｋｇのシリカカラム上でクロマトグラフィーに供した。純粋
な画分を合わせ、９０．６ｇ（８７％）の表題化合物を得た。
【００９０】 ５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−ｍｅ−Ｃ）を含有するオリゴヌク
レオチドは、市販のホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅ
ｒｌｉｎｇ ＶＡまたはＣｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ ＭＡ）を用い
て、公表されている方法（Ｓａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１９９３，２１，３１９７−３２０３）に従って合成した。
【００９１】 メチレン（メチルイミノ）（ＭＭＩ）主鎖を有するオリゴヌクレオチドは、米
国特許５，３７８，８２５（本出願の出願人と同一の出願人に譲渡されており、
その全内容を本明細書の一部としてここに引用する）に従って合成した。合成を
容易にするため、ＭＭＩ結合を含有する種々のヌクレオシド二量体を合成し、オ
リゴヌクレオチド中に取り込ませた。他の窒素含有主鎖は、ＷＯ９２／２０８２
３（本出願の出願人と同一の出願人に譲渡されており、その全内容を本明細書の
一部としてここに引用する）に従って合成した。
【００９２】 アミド主鎖を有するオリゴヌクレオチドは、ＤｅＭｅｓｍａｅｋｅｒら（Ａｃ
ｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５，２８，３６６−３７４）に従って合成した。
アミド部分は、簡単なよく知られた合成方法により容易にアクセスすることがで
き、オリゴヌクレオチドの固相合成に必要な条件と適合する。
【００９３】 モルホリノ主鎖を有するオリゴヌクレオチドは、米国特許５，０３４，５０６
（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ）に従って合成した。 ペプチド−核酸（ＰＮＡ）オリゴマーは、Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎら（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ １９９１，２５４，１４９７）に従って合成した。
【００９４】 オリゴヌクレオチドは、制御孔ガラスカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ）から切断し、濃水酸化アンモニウムで５５℃で１８時間脱ブロッキン
グした後、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２．５倍容量のエタノールから２回沈殿さ
せることにより精製した。合成したオリゴヌクレオチドは、変性ゲルでのポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分析し、少なくとも８５％が全長物質であるこ
とを確認した。合成において得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステ
ル結合の相対的量は、31Ｐ核磁気共鳴スペクトルにより定期的に確認し、いくつ
かの研究については、Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１
９９１，２６６：１８１６２−１８１７１に記載されるように、オリゴヌクレオ
チドをＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣで精製した物質から得られた結果は、
ＨＰＬＣ以外で精製した物質から得られた結果と同様であった。 実施例２ 実施例２ ｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築 この研究において記述されるｒａｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、Ｐ
ＣＲ技術を用いて構築した。変異型（第１２コドン）および非変異型（野生型）
ヒトＨ−ｒａｓ遺伝子両方のエクソン１の５’−領域のＰＣＲクローニングのプ
ライマーとして使用するためにオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ｃ−
Ｈ−ｒａｓｌ活性化癌遺伝子（第１２コドン、ＧＧＣ→ＧＴＣ）を含むプラスミ
ドｐＴ２４−Ｃ３、およびｃ−Ｈ−ｒａｓ原癌遺伝子を含むｐｂｃ−ＮはＡｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ，ＭＤ）から得た。１．９ｋｂホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミ
ドｐＴ３／Ｔ７ ｌｕｃはＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から得た。オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーは、変
異型および非変異型Ｈ−ｒａｓ遺伝子を鋳型として用いる標準ＰＣＲ反応に用い
た。これらのプライマーはＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に挟まれ
た正常および変異型Ｈ−ｒａｓの配列−５３から＋６５（翻訳開始部位に関して
）に対応する１４５塩基対のＤＮＡ産物を産生する。ＰＣＲ生成物は標準的な方
法によりゲルで精製し、沈澱させ、洗浄して水に再懸濁した。
【００９５】 Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）のルシフェラーゼ遺伝子のクローニングのため
のＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物がアミノ末端のメチオニン残基を除いて完全
長のルシフェラーゼ蛋白質をコードするように設計した。このメチオニン残基は
アミノ末端がリジン残基、続いてロイシン残基という２つのアミノ酸で置き変わ
られるようにした。ルシフェラーゼ遺伝子のクローニングのために使用されたオ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて、鋳型としてルシフェラーゼレポーター遺
伝子を含む商業的に入手可能なプラスミド（ｐＴ３／Ｔ７−Ｌｕｃ）（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）を用いる標準的なＰＣＲ反応を行った。これらのプライマーは、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩとＢｓｓＨＩＩ制限酵素部位に挟まれたルシフェラーゼ遺伝子に相当
する約１．９ｋｂの産物を与えた。この断片は、標準的な方法によりゲル精製し
、沈殿し、洗浄し、そして水に再懸濁した。
【００９６】 ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合レポーター遺伝子の構築を行うために、ｒａｓお
よびルシフェラーゼのＰＣＲ産物を適当な制限酵素により切断し、制限酵素Ｎｈ
ｅＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＢｓｓＨＩＩを用いて、３部分のライゲーション
によって、ステロイドで誘導されるマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）のプロモー
ターを含む発現ベクター中にクローン化した。この結果、ホタルのルシフェラー
ゼ遺伝子にインフレームで融合されたＨ−ｒａｓの５’配列（−５３から＋６５
）の挿入を含むクローンが得られた。このようにして得られた発現ベクターは、
ステロイド誘導性のＭＭＴＶプロモーターによって発現が調節されるｒａｓ−ル
シフェラーゼ融合産物をコードする。これらのプラスミド構築物はホタルルシフ
ェラーゼをコードする配列とインフレームで融合された活性化（ＲＡ２）または
正常（ＲＡ４）Ｈ−ｒａｓ蛋白質の１−２２のアミノ酸をコードする配列を含む
。ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合ｍＲＮＡの翻訳開始は天然のＨ−ｒａｓ ＡＵＧ
コドンに依存している。変異型および正常Ｈ−ｒａｓルシフェラーゼ融合構築物
は標準的な方法を用いるＤＮＡ配列分析により確認した。 実施例３ プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション トランスフェクションは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，
Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ、Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ
．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｋ．Ｓｔｒａｈｌ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏ
ｎｓ，ＮＹ）中のＭ．Ｅ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇによる記載を以下のように変更し
て行った。Ｈｅｌａ細胞を、５×１０5細胞／ディッシュになるように６０ｍｍ のディッシュに播種した。全部で１０μｇまたは１２μｇのＤＮＡを各ディッシ
ュに添加したが、このうち１μｇは、恒常的に発現するラウス肉腫ウイルス（Ｒ
ＳＶ）プロモーターにより調節されるラットグルココルチコイド受容体を発現す
るベクターであり、残りはｒａｓ−ルシフェラーゼレポータープラスミドであっ
た。１６から２０時間後に、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈物を、３ｍＭ ＥＧ
ＴＡを含むトリス緩衝生理食塩液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５
０ｍＭ塩化ナトリウム）で洗浄して除去した。次に、１０％牛胎児血清を含む新
鮮な培地を細胞に添加した。この時点において、レポーター遺伝子発現をデキサ
メタゾンで活性化する前に、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで前処理し
た。 実施例４ 細胞のオリゴヌクレオチドによる処理 プラスミドトランスフェクションに続いて、前もって３７℃に暖められたリン
酸緩衝生理食塩液で細胞を洗浄し、５μｇ／ｍｌのＮ−［１−（２，３−ジオレ
イルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（Ｄ
ＯＴＭＡ）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭを、各プレートに添加した（ウェル当たり１
．０ｍｌ）。オリゴヌクレオチドは５０μＭ保存液から各プレートに添加して、
３７℃で４時間インキュベートした。培地を除き、１０％ウシ胎児血清および指
示された濃度の適当なオリゴヌクレオチドを含むＤＭＥＭで置き換え、さらに３
７℃で４時間細胞をインキュベートした後、最終濃度０．２μＭのデキサメタゾ
ンで細胞を処理することにより、レポーター遺伝子の発現を活性化させた。デキ
サメタゾンで刺激して１５時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセ
イした。 実施例５ ルシフェラーゼのアッセイ ルシフェラーゼは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ
．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ、Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅ
ｉｄｍａｎ，Ｋ．Ｓｔｒａｈｌ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，
ＮＹ）中のＭ．Ｅ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇによる記載にしたがって、界面活性剤Ｔ
ｒｉｔｏｎ−Ｘ１００により溶解することにより細胞から抽出した。Ｄｙｎａｔ
ｅｃｈ ＭＬ１０００ルミノメーターを用いて、６２５μＭのルシフェリン（Ｓ
ｉｇｍａ）の添加により発生する蛍光のピークを測定した。アッセイの直線域に
データが確かに集まるように、各抽出物毎に抽出物の量を変えて、ルシフェラー
ゼアッセイを複数回行った。 実施例６ 融解曲線 ＩＢＭ ＰＣコンピューターおよびＧｉｌｆｏｒｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＩＩ
分光光度計を接続したＧｉｌｆｏｒｄ ２６０分光光度計を用いて２６０ｎｍで
温度に対する吸光度曲線を測定した。緩衝液は１００ｍＭ Ｎａ+、１０ｍＭリ ン酸および０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７、を含んでいた。オリゴヌクレオチド
濃度は４μＭであり、各々の鎖は８５℃の吸光度から決定し、吸光係数はＰｕｇ
ｌｉｓｉおよびＴｉｎｏｃｏ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０
，３０４−３２５、１９８９年、に従って計算した。Ｔm、デュープレックス形 成の自由エネルギーおよび会合係数は二重勾配ベースラインによる二状態モデル
へのデータの適合により得られた。Ｐｅｔｅｒｓｈｅｉｍ，Ｍ．およびＴｕｒｎ
ｅｒ，Ｄ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２，２５６−２６３、１９８３
年。報告されたパラメーターは少なくとも３回の実験の平均である。いくつかの
オリゴヌクレオチドに対し、Ｔm -1 対 ｌｏｇ10（濃度）のプロットからデュ ープレックス形成の自由エネルギーも得られた。Ｂｏｒｅｒ，Ｐ．Ｎ．，Ｄｅｎ
ｇｌｅｒ，Ｂ．，Ｔｉｎｏｃｏ，Ｉ．，Ｊｒ．，およびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ
．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８６，８４３−８５３、１９７４年）。 実施例７ ゲルシフトアッセイ 変異第１２コドンを含む４７−ヌクレオチドヘアピンである構造を有するｒａ
ｓ標的転写体はＬｉｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，１２０５５−１
２０６１、１９９１年、により記載されているように製造され地図が作製された
。ハイブリダイゼーション反応は１００ｍＭナトリウム、１０ｍＭリン酸、０．
１ＥＤＴＡ、１００ｃｐｍのＴ７−発生ＲＮＡ（約１０ｐＭ）および１ｐＭから
１０ｐＭの濃度範囲のアンチセンスオリゴヌクレオチド中で行った。反応液は３
７℃で２４時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、負荷用緩衝液
を反応液に加え、反応生成物を４５ｍＭトリス−ホウ酸および１ｍＭ ＭｇＣｌ 2 （ＴＢＴ）を用いて調製した２０％天然ポリアクリルアミドゲルで分離した。 電気泳動は１０℃にて実施し、ゲルはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ
Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｉｍａｇｅｒを用いて定量した。 実施例８ ＲＮａｓｅＨ分析 ＲＮａｓｅＨアッセイは活性型（第１２コドン、Ｇ→Ｕ）Ｈ−ｒａｓ ｍＲＮ
Ａの＋２３から＋４７に対応する化学合成２５−塩基オリゴリボヌクレオチドを
用いて実施した。５’−末端標識ＲＮＡを２０ｎＭの濃度で使用し、２０ｍＭト
リスーＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ジチオスレイトール、１０μｇ ｔＲＮＡおよび４Ｕ ＲＮａｓｉｎを含む最終
用量０μlの反応液で１０倍モル過剰のアンチセンスオリゴヌクレオチドとイン キュベートした。反応組成物は３７℃で１５分前もってアニールし、放置して徐
々に室温まで冷却した。ＨｅＬａ細胞核抽出物を哺乳類ＲＮａｓｅＨ源として使
用した。２μｇの核抽出物（５μｌ）の添加により反応を開始し３７℃で１０分
間進行させた。反応はフェノール／クロロホルム抽出により停止し、ＲＮＡ成分
をエタノールで沈澱させた。等しいＣＰＭを７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリル
アミドゲルに負荷して、ＲＮＡ切断生成物を分離し、電気泳動後のオートラジオ
グラフィーにより可視化した。切断生成物の定量はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎ
ａｍｉｃｓデンシトメーターを用いて実施した。 実施例９ ｒａｓトランス活性化レポーター遺伝子システム 構成的ＳＶ４０プロモーターの制御下の活性型（第１２コドン、ＧＧＣ→ＧＴ
Ｃ）Ｈ−ｒａｓ ｃＤＮＡ挿入物を含む発現プラスミドｐＳＶ２−ｏｌｉはＢｒ
ｕｎｏＴｏｃｑｕｅ博士（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｓａｎｔｅ，Ｖｉｔｒ
ｙ，Ｆｒａｎｃｅ）から贈与された。このプラスミドはステロイド−誘導可能マ
ウス哺乳動物腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターの制御下のＨ−ｒａｓ発現
プラスミドのＰＣＲによる構築に鋳型として使用した。Ｈ−ｒａｓをコードする
配列を得るため、Ｈ−ｒａｓ遺伝子の５７０ｂｐのコード領域をＰＣＲにより増
幅した。ＰＣＲプライマーは、クローニングを容易にするためその５’−領域に
ユニークな制限酵素部位を有するように設計した。Ｈ−ｒａｓ第１２コドン変異
型癌遺伝子のコード領域を含むＰＣＲ生成物をゲルで精製し、消化し、クローニ
ングに先だってもう一度ゲルで精製した。この挿入物を発現プラスミドｐＭＡＭ
ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ）内にクローニン
グすることにより構築が完成した。
【００９７】 ｒａｓ−応答性レポーター遺伝子ｐＲＤ５３を用いてｒａｓ発現を検出した。
Ｏｗｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，３８
６６ー３８７０、１９９０年。 実施例１０ インビボにおけるｒａｓ発現のノーザンブロット分析 ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）から入手した。細胞は、１０
％熱不活性化ウシ胎児血清および各々５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプ
トマイシンを補充したＬ−グルタミンを含むＭａＣｏｙ ５Ａ 培地（Ｇｉｂｃ
ｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）中で増殖させた。細胞は１００
ｍｍプレートに播種した。それらがコンフルエントの７０％に達したとき、オリ
ゴヌクレオチドで処理した。プレートを１０ｍｌの前もって暖めたＰＢＳおよび
２．５μlＤＯＴＭＡを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ低減血清培地で洗浄した。次にオ リゴヌクレオチドを所望の濃度まで添加した。４時間処理後、培地をＭａＣｏｙ
培地に置換した。オリゴヌクレオチド処理４８時間後に細胞を回収し、標準Ｃｓ
Ｃｌ精製法を用いてＲＮＡを単離した。Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．Ｃｕｒｒｅ
ｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ
．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏ
ｏｒｅ、Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｋ．Ｓｔｒａｈｌ編、
ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）。
【００９８】 ヒト上皮癌細胞株Ｈｅｌａ２２９はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）から入手した。Ｈｅ
ｌａ細胞は６ーウェルプレートで１０％ウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍｌのペ
ニシリンを補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に単層で維持し
た。オリゴヌクレオチド処理およびＲＮＡの単離は上にＴ２４細胞に対して記載
した方法と実質的に同じである。
【００９９】 ノーザンブロットハイブリダイゼーション：各々のＲＮＡ１０μｇを１．２％
アガロース／ホルムアミドゲルで電気泳動し、標準法を用いてＧｅｎｅＢｉｎｄ
４５ ナイロン膜（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ
）に一晩移した。Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，
Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ、Ｊ．Ａ．Ｓ
ｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｋ．Ｓｔｒａｈｌ編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ
ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）。ＲＮＡは膜にＵＶ−架橋された。二本鎖32Ｐ標識
プローブはＰｒｉｍｅ ａ Ｇｅｎｅ標識キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓ
ｏｎＷＩ）を使用して合成した。ｒａｓプローブは第１２コドンにＧＧＣからＧ
ＴＣへの突然変異を有する活性型（変異型）Ｈ−ｒａｓ ｍＲＮＡのｃＤＮＡク
ローンのＳａｌＩ−ＮｈｅＩ断片であった。対照プローブはＧ３ＰＤＨであった
。ブロットはＱｕｉｃｋＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）により６８℃で１５分間プリハイブリダイゼー
ションを行った。１００μlの１０ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡと混合した熱変性 放射活性プローブ（２．５ｘ１０6カウント／２ｍｌハイブリダイゼーション溶 液）を加え、６８℃で１時間膜をハイブリダイズした。ブロットは２ｘＳＳＣ／
０．１％ＳＤＳ中室温で１５分間２回、および０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ
中６０℃で３０分間１回洗浄した。ブロットのオートラジオグラフィーを行い、
信号の強度はＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて定量した
。ノーザンブロットは最初にｒａｓプローブにハイブリダイズさせ、次に０．１
ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１５分間煮沸して剥し、試料が正しく装填された
かを検査するために対照プローブと再ハイブリダイゼーションさせた。 実施例１１ 癌細胞増殖のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害 実施例１０に本質的に記載したように、細胞を培養しオリゴヌクレオチドで処
理した。細胞は６０ｍｍプレートに播種し、７０％コンフルエントに達したとき
ＤＯＴＭＡ存在下オリゴヌクレオチドで処理した。 時間経過実験：１日目、細胞を１００ｎＭの最終濃度で単一用量のオリゴヌクレ
オチドで処理した。３日目に一度増殖培地を交換し、計数チャンバーを用いて５
日間毎日細胞を計数した。用量応答実験：種々の濃度のオリゴヌクレオチド（１
０、２５、５０、１００または２５０ｎＭ）を細胞に加え、３日後に細胞を回収
して計数した。オリゴヌクレオチド２５７０、３９８５および４６９０をＴ２４
癌細胞の増殖への影響について試験した。 実施例１２ ２−（アミノ）アデニン−置換オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドは以下の例外を除いて実施例１に従って合成する：２−（
アミノ）アデニンが好ましい部位においては、標準ホスホルアミダイトを商業的
に入手可能な２−アミノデオキシアデノシン ホスホルアミダイト（ＣｈｅｍＧ
ｅｎｅｓ）で置き換える。 実施例１３ Ａ５４９細胞の培養 Ａ５４９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手）は６−ウェルプレート（Ｆａｌｃ
ｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）を用い、１ｇグルコ
ース／リットルおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）を含むダルベッコ改良イーグル培地（
ＤＭＥ）中でコンフルエントになるまで増殖させた。 実施例１４ ヌードマウスにおけるヒト腫瘍細胞のオリゴヌクレオチド処理−腹
腔注射 ヒト肺癌腫Ａ５４９細胞を採取し、５ｘ１０6細胞（２００μl）をヌードマウ
スの内部腿内へ皮下注射した。触診できる腫瘍に約１ヶ月で発育した。ホスホロ
チオエートオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ２５０３および１０８２（無関係の対照
）を、２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で１日おきに約１０週間マウスに投与した。こ
の期間マウスの腫瘍増殖をモニターした。 実施例１５ ヌードマウスにおけるヒト腫瘍細胞のオリゴヌクレオチド処理−カ
チオン性脂質との皮下注射 ヒト肺癌腫Ａ５４９細胞を採取し、５ｘ１０6細胞（２００μl）をヌードマウ
スの内部腿内へ皮下注射した。触診できる腫瘍に約１ヶ月で発育した。カチオン
性脂質処方（ＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥ、６０ｍｇ／ｋｇ）で調製したホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ２５０３および無関係対照オリゴヌクレオチ
ド１０８２（用量５ｍｇ／ｋｇ）を腫瘍部位のマウスの皮下に投与した。薬剤処
置は腫瘍細胞接種１週間後に開始し、４週間だけ週に２回行った。マウスの腫瘍
増殖を総計で９週間モニターした。 実施例１６ Ｔ２４細胞における２’修飾オリゴヌクレオチドの安定性 Ｔ２４膀胱癌細胞を実施例１０に記載したように増殖させた。細胞はオリゴヌ
クレオチドの単一用量（１μＭ）で処理し、２４時間後ノーザンブロット分析に
よりＨ−ｒａｓ ｍＲＮＡ発現についてアッセイした。試験したオリゴヌクレオ
チドはＩＳＩＳ２５７０（配列番号３）の類似体（Ｈ−ｒａｓを標的とする１７
ｍｅｒ）であった。 実施例１７ ３つの結腸癌腫細胞株に対するＫｉ−ｒａｓオリゴヌクレオチドの
活性 ヒト結腸癌腫細胞株Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０およびＳＷ６２０はＡｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手
し、実施例１０のＨｅＬａ細胞で記載したように培養および維持した。細胞をオ
リゴヌクレオチドの単一用量（２００ｍＭ）で処理し、２４時間後にノーザンブ
ロット分析によりＫｉ−ｒａｓ ｍＲＮＡ発現を測定した。増殖研究においては
、０日目に細胞をオリゴヌクレオチドの単一用量（２００ｎＭ）で処理し、５日
間にわたって細胞数をモニターした。 実施例１８ 変異型対野生型Ｋｉ−ｒａｓのオリゴヌクレオチド阻害 ＳＷ４８０細胞は前の実施例のごとく培養した。ＨｅＬａ細胞は実施例１０の
ごとく培養した。細胞をオリゴヌクレオチドの単一用量（１００ｎＭ）で処理し
、２４時間後にノーザンブロット分析によりｍＲＮＡレベルを決定した。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、用量依存的様式でｒａｓの阻害を示す一連の８個のパネルである。実
線は野生型（正常）ｒａｓに対する活性を示し、破線は活性化（変異体）ｒａｓ
に対する活性を示す。 図２は、ｒａｓ−ルシフェラーゼに対する、均一デオキシホスホロチオエート
および短いキメラオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を示す棒グラフである
。 図３は、ｒａｓを標的とするホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルオリゴヌク
レオチドを用いたときの、アンチセンス活性とＲＮＡｓｅＨを活性化する能力と
の間の関係を、デオキシギャップ長さの関数として示す折れ線グラフである。 図４は、ＩＳＩＳ２５０３の、ヌードマウス中のＡ５４９ヒト細胞腫瘍に対す
る抗腫瘍活性を示す折れ線グラフである。 図５は、カチオン性脂質とともに投与されたｒａｓオリゴＩＳＩＳ２５０３の
、ヌードマウス中のＡ５４９ヒト細胞腫瘍に対する抗腫瘍活性を示す折れ線グラ
フである。 図６は、３つのヒト結腸癌腫細胞株であるＣａｌｕ１，ＳＷ４８０およびＳＷ
６２０におけるＫｉ−ｒａｓ ｍＲＮＡ発現のアンチセンス阻害を示す棒グラフ
である。 図７は、Ｋｉ−ｒａｓ特異的オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ６９５７およびＩＳ
ＩＳ６９５８によるＳＷ４８０ヒト癌腫細胞株の増殖の阻害を示す棒グラフであ
る。 図８は、ＩＳＩＳ２５０３（配列番号２）の２’−ＭＯＥ類似体によるＨ−ｒ
ａｓ ｍＲＮＡレベルの低下を示す棒グラフである。黒棒：１５０ｎＭオリゴヌ
クレオチド用量；斜線棒：５０ｎＭ用量；横線棒：１５ｎＭ用量。 図９は、ＩＳＩＳ２５０３（配列番号２）のＭＭＩ類似体によるＨ−ｒａｓ
ｍＲＮＡレベルの低下を示す棒グラフである。黒棒：５００ｎＭオリゴヌクレオ
チド用量；斜線棒：１００ｎＭ用量；横線棒：５０ｎＭ用量。 図１０は、オリゴヌクレオチド１４６８６−１４６９４，１４６７７および１
４６７８によるＮ−ｒａｓ ｍＲＮＡレベルの低下を示す棒グラフである。黒棒
：４００ｎＭオリゴヌクレオチド用量；斜線棒：２００ｎＭ用量；横線棒：１０
０ｎＭ用量。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１月２５日（２０００．１．２５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項８】 請求項１−５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含む
、ヒトＮ−ｒａｓ癌遺伝子の活性化に起因する状態を予防または治療するための
組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１０月２６日（２０００．１０．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【図１ｇ】
【図１ｈ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 カウサート，レックス・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州92008, カールズバッド，ニューシャイア・ストリ ート 3008 (72)発明者 マノハラン，ムシアー アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，レポサド・ドライブ 7634 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 AA20 BA80 CA20 DA03 GA11 HA17 4C084 AA13 ZB262 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 ZB26

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトＮ−ｒａｓをコードする核酸を標的とし、ヒトＮ−ｒａ
    ｓ発現を阻害しうる、８−３０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ヒトＮ−ｒａｓをコードするｍＲＮＡの５’非翻訳領域，翻
    訳開始部位，コーディング領域または３’非翻訳領域を標的とする、請求項１記
    載のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 配列番号４４，４５，４６，４７，４９または５２を有する
    、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 少なくとも１つの主鎖修飾を含む、請求項１記載のオリゴヌ
    クレオチド。
  5. 【請求項５】 オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド単位が
    糖の２’位で修飾されている、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 薬学的に許容しうる担体中の請求項１記載のオリゴヌクレオ
    チド。
  7. 【請求項７】 ヒトＮ−ｒａｓの発現を調節する方法であって、ヒトＮ−ｒ
    ａｓ遺伝子を含有する組織または細胞を有効量の請求項１記載のオリゴヌクレオ
    チドと接触させ、このことによりヒトＮ−ｒａｓの発現を調節することを含む方
    法。
  8. 【請求項８】 癌細胞の増殖を阻害する方法であって、癌細胞を有効量の請
    求項１記載のオリゴヌクレオチドと接触させ、このことにより癌細胞の増殖を阻
    害することを含む方法。
  9. 【請求項９】 ヒトＮ−ｒａｓ癌遺伝子の活性化に起因する状態を予防また
    は治療する方法であって、ヒトＮ−ｒａｓ癌遺伝子の活性化に起因する状態を有
    すると疑われる動物を有効量の請求項１記載のオリゴヌクレオチドと接触させ、
    このことにより前記状態を予防または治療することを含む方法。
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