KR20010020420A - 생물발광 리포터 박테리아 및 생물학적 폐수 처리 시스템에서의 독성 관측 방법 - Google Patents
생물발광 리포터 박테리아 및 생물학적 폐수 처리 시스템에서의 독성 관측 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20010020420A KR20010020420A KR1019997010044A KR19997010044A KR20010020420A KR 20010020420 A KR20010020420 A KR 20010020420A KR 1019997010044 A KR1019997010044 A KR 1019997010044A KR 19997010044 A KR19997010044 A KR 19997010044A KR 20010020420 A KR20010020420 A KR 20010020420A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- reporter
- bacteria
- sludge
- light
- bacterium
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 280
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 108
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 title claims abstract description 44
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title description 2
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims abstract description 164
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 claims abstract description 119
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 95
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 68
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 30
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 39
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 39
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 39
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 18
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 12
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 claims description 9
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 8
- 238000004891 communication Methods 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 5
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 claims description 2
- UGTJLJZQQFGTJD-UHFFFAOYSA-N Carbonylcyanide-3-chlorophenylhydrazone Chemical compound ClC1=CC=CC(NN=C(C#N)C#N)=C1 UGTJLJZQQFGTJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000862974 Hyphomicrobium Species 0.000 claims description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims description 2
- DOBMPNYZJYQDGZ-UHFFFAOYSA-N dicoumarol Chemical compound C1=CC=CC2=C1OC(=O)C(CC=1C(OC3=CC=CC=C3C=1O)=O)=C2O DOBMPNYZJYQDGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960001912 dicoumarol Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 51
- 239000013068 control sample Substances 0.000 abstract 2
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 64
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 45
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 45
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 35
- 101100287724 Caenorhabditis elegans shk-1 gene Proteins 0.000 description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 30
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 26
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 25
- 230000004044 response Effects 0.000 description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 11
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 10
- 231100000650 Toxic shock syndrome Toxicity 0.000 description 10
- 206010044248 Toxic shock syndrome Diseases 0.000 description 10
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 10
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 9
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 7
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 7
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 7
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 7
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 239000010842 industrial wastewater Substances 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 5
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 5
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 4
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011021 bench scale process Methods 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 230000008791 toxic response Effects 0.000 description 3
- 239000010891 toxic waste Substances 0.000 description 3
- 238000013022 venting Methods 0.000 description 3
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 3
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 2
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 241001148192 Pseudomonas flavescens Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000010841 municipal wastewater Substances 0.000 description 2
- 230000001546 nitrifying effect Effects 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 230000027086 plasmid maintenance Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009531 respiratory rate measurement Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- UIFFUZWRFRDZJC-UHFFFAOYSA-N Antimycin A1 Natural products CC1OC(=O)C(CCCCCC)C(OC(=O)CC(C)C)C(C)OC(=O)C1NC(=O)C1=CC=CC(NC=O)=C1O UIFFUZWRFRDZJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQWZLRAORXLWDN-UHFFFAOYSA-N Antimycin-A Natural products CCCCCCC(=O)OC1C(C)OC(=O)C(NC(=O)c2ccc(NC=O)cc2O)C(C)OC(=O)C1CCCC NQWZLRAORXLWDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108010075028 Cytochromes b Proteins 0.000 description 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005081 Overlapping Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607568 Photobacterium Species 0.000 description 1
- 241000607565 Photobacterium phosphoreum Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241001478894 Sphaerotilus Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589153 Zoogloea ramigera Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 101150113943 algD gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- UIFFUZWRFRDZJC-SBOOETFBSA-N antimycin A Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](CCCCCC)[C@@H](OC(=O)CC(C)C)[C@H](C)OC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=CC=CC(NC=O)=C1O UIFFUZWRFRDZJC-SBOOETFBSA-N 0.000 description 1
- PVEVXUMVNWSNIG-UHFFFAOYSA-N antimycin A3 Natural products CC1OC(=O)C(CCCC)C(OC(=O)CC(C)C)C(C)OC(=O)C1NC(=O)C1=CC=CC(NC=O)=C1O PVEVXUMVNWSNIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001055 blue pigment Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000004665 defense response Effects 0.000 description 1
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 231100000584 environmental toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003295 industrial effluent Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000004298 light response Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005121 nitriding Methods 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000005693 optoelectronics Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical group 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960001860 salicylate Drugs 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000006104 solid solution Substances 0.000 description 1
- 238000011064 split stream procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000011071 total organic carbon measurement Methods 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- DNYWZCXLKNTFFI-UHFFFAOYSA-N uranium Chemical compound [U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U] DNYWZCXLKNTFFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
- 235000015041 whisky Nutrition 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/18—Water
- G01N33/186—Water using one or more living organisms, e.g. a fish
- G01N33/1866—Water using one or more living organisms, e.g. a fish using microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Activated Sludge Processes (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
본 발명은 생물학적 슬러지(sludge)에 자연적으로 존재하며, 자연적으로 존재하는 박테리아에는 없는 리포터(reporter) 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 박테리아를 포함하는, 리포터 박테리아에 관한 것이다. 상기 핵산은 생물발광 리포터 단백질을 암호화할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 리포터 박테리아와 유입 스트림을 접촉시키는 단계, 상기 리포터 박테리아에 의한 리포터 단백질의 발현을 관측하는 단계, 및 상기 리포터 단백질의 발현 감소를 독성의 존재와 상관시키는 단계를 포함하는, 폐수 처리 유입 스트림에서 독성의 존재를 검출하는 방법 및 장치를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명은 공지된 첨가량의 산화적 인산화 탈커플링(decoupling)제를 함유한 생물학적 폐수 슬러지의 샘플 및 대조군 샘플을 본 발명의 리포터 박테리아와 접촉시키는 단계, 탈커플링제를 함유한 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 신호 출력을 탈커플링제를 함유하지 않은 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 신호 출력과 비교하는 단계, 및 대조군 샘플에서의 신호 출력과 비교한 탈커플링된 샘플에서의 신호 출력의 감소를 탈커플링제의 작용과 상관시키는 단계를 포함하는, 공지된 첨가량의 탈커플링제의 효과를 결정할 수 있는, 생물학적 폐수 슬러지에 대한 공지된 첨가량의 산화적 인산화 탈커플링제의 효과를 결정하는 방법 및 장치를 제공한다.
Description
폐수 고형물에서 핀플록(pinfloc)이 생성되는 문제점은 독성 쇼크(shock), 먹이 고갈[높은 평균 세포 체류 시간(mean cell residence time; MCRT), 다양한 유기물 부하량 또는 유입수 유동 패턴에 의해 야기됨], 및/또는 펌프 전단에 의해 야기될 수 있다(젠킨스(Jenkins, D.) 등의 하기 문헌[1993] 참조). 독성 쇼크 및 유입수내 유기물 부하량이 일정하지 않으므로, 핀플록의 원인이 되는 인자를 밝혀내기가 종종 어렵다. 폐수 고형물 처리용 미생물 군집에 대한 유입 폐수의 독성으로 인해, 작업비용이 더 많이 들고 배출수의 품질이 감소될 수 있다(젠킨스 등의 하기 문헌[1993] 참조). 독성 쇼크는 미생물을 사멸시키고 플록 구조를 해체시킨다. 생성된 작은 플록(핀 모양의 플록)은 하류 공정의 청정기에서 잘 침전되지 않으므로, 배출수의 품질 표준을 충족시키기 위해 비싼 중합체 첨가 작업이 필요할 수 있다. 특정한 화학 물질 분해 개체군이 사멸되면, 그 결과 독성 물질이 집수(receiving water)로 방출되어 배출수가 오염될 수 있다. 유입되는 폐기물 스트림의 독성을 탐색할 수 있다면, 이러한 현상들을 피할 수 있고 그에 대한 대책도 취해질 수 있다. 예를 들어, 독성 스트림을 임시 저장조로 전향시킨 다음, 폐수 고형물의 품질에 심각한 영향을 미칠 수 있는 높은 독성 물질 농도를 피하기 위해 더 느린 속도로 폐수 처리 시스템으로 복귀시킬 수 있다.
폐수 독성의 이상적인 측정 방법은 비용이 적고, 온-라인(on-line)으로 사용할 수 있으며, 사용하기 쉽고, 민감하고 폐수 고형물인 미생물 군집에 적절하여야 한다. 현재 사용중인 독성 측정 방법은 (1) 화학적 분석법, (2) 현미경적 분석법, (3) 호흡측정식 억제법, 및 (4) 생물발광법(킬로이(Kilroy, A. C.) 및 그레이(Gray, N. F.)의 하기 문헌[1992] 참조)을 포함한다.
유입 폐수내 독성 물질에 대한 화학적 분석법은 존재할 수 있는 독성 물질의 정체를 알고 있어야 하고, 비용이 많이 들며(패톤(Paton, G. I.) 등의 하기 문헌[1995] 참조), 공정 제어 반응이 효과적이도록 충분히 빠르지 않다. 저장조로 독성 유입수를 전향시키는데 소요되는 시간은 종종 수 분 내지 수 초이다. 특히 시 직영 처리 공장의 유입수는 존재할 수 있는 유입 독성 물질이 복잡하고 불확실하기 때문에 화학적 분석법이 적합하지 않다. 독성 결과를 평가하는 현미경적 방법도 플록을 현미경하에서 조사해야 하기 때문에 시간이 소요된다. 또한, 일반적으로 독성 쇼크를 지시하는 핀 모양의 플록은 다른 환경 조건 또는 다른 작업 조건에 의해서 야기될 수 있다(젠킨스 등의 하기 문헌[1993] 참조). 미생물 개체군 또는 형태의 변화를 현미경하에서 조사하여 독성 쇼크를 확인할 수 있지만, 유입되는 독성 폐기물 스트림을 제어하기 위한 예방 방법으로는 사용할 수 없다.
폐수 고형물에 대한 폐수 독성을 측정하는 가장 통상적인 방법은 호흡측정식 억제법이다(콩(Kong, Z.) 등의 하기 문헌[1996] 및 스트로트만(Strotmann, U. J.) 및 에글사에르(Eglsaer, H.)의 하기 문헌[1994] 참조). 폐수 샘플에서의 폐수 고형물의 산소 소비 속도를 비독성 대조군에서의 산소 소비 속도와 비교한다. EC(유효 농도, effective concentration)50독성 수치는 산소 소비 속도를 50% 감소시키는 독성 물질의 유효 농도이다(볼스카이(Volskay, V. T. Jr.) 및 그라디(Grady, C. P. L. Jr.)의 하기 문헌[1988] 참조). 호흡 속도의 감소가 독성을 지시한다. 상기 호흡측정 방법은 전체 미생물 군집의 대사 상태는 측정할 수 있지만, 목표가 될 수 있는 특정한 중요 개체군에 대해서는 쉽게 알아낼 수 없다. 호흡측정 방법을 이용한 독성 결정은 온-라인으로 행해질 수 있지만, 현재 기술로는 비용이 비싸고 시간이 소요되는 경향이 있다. 배치 그랩(batch grab) 샘플에서, 유입되는 폐기물 스트림내 독성 화합물과 그의 독성 지표 사이에는 시간차가 발생한다.
생물발광 미생물을 사용하여 독성을 측정하는 방법은 비교적 간단하고, 빠르며, 독성 제제를 화학적으로 확인할 필요가 없고, 온-라인으로 측정할 수 있다. 생태계 독성(ecotoxicity)을 측정하기 위해 현재 사용중인 생물발광 방법은 자연적으로 발광하는 해양 박테리아, 주로 생물발광 방법의 표준으로 간주되는 마이크로톡스(MICROTOX) 시스템(아주르 인바이론멘탈(AZUR Environmental))을 포함한다(패톤 등의 하기 문헌[1995] 참조). 이 시험 방법은 포토박테리움 포스포레움(Photobacterium phosphoreum) 세포를 해동하는 단계, 이 세포를 식염수 완충된 중성 pH 용액에 첨가하는 단계, 및 폐수 샘플내 상기 박테리아의 생물발광 반응을 광도계로 측정하는 단계로 이루어진다(두트카(Dutka, B. J.) 등의 하기 문헌[1983] 참조). 비교를 위해 사용하는 EC50 수치는 기본 수준의 생물발광을 50% 감소시키는 독성 물질의 농도이다. 마이크로톡스 시스템만의 고유한 문제점은 pH 및 식염수 완충액을 요구하고, 재현성이 없으며(두트카 등의 하기 문헌[1983] 참조), 온-라인 또는 연속식 관측 시스템으로 적용하기에 부적합하고, 사용하는 유기체가 폐수 고형물의 군집을 이루는 종을 대표하지 않는다는 점이다.
폐수 처리의 또다른 문제점은 대량의 슬러지를 처분하는데 고비용이 든다는 점이다. 탈커플링(decoupling)제를 사용하여 슬러지 체적을 줄일 수 있지만, 탈커플링제가 슬러지 동력학에 미치는 효과를 정확하게 측정하기 어려운 문제점이 있다.
본 발명은 폐수 처리 시스템에서 독성을 측정하고 탈커플링제의 효과를 측정하는 빠르고 효과적인 방법을 제공함으로써 상기 요구를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 생물학적 슬러지에 자연적으로 존재하며, 자연적으로 존재하는 박테리아에는 없는 리포터(reporter) 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 박테리아를 포함하는, 리포터 박테리아를 제공한다. 상기 핵산은 생물발광 리포터 단백질을 암호화할 수 있으므로, 생물발광 리포터 박테리아를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 교배가 일어날 수 있는 조건하에서, 생물학적 슬러지의 박테리아에는 자연적으로 존재하지 않는 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한 공여자 박테리아와 생물학적 슬러지의 박테리아-함유 샘플을 접촉시킴을 포함하는 방법에 의해 수득되는 생물발광 리포터 박테리아를 제공한다.
본 발명은 추가로 생물학적 슬러지에 자연적으로 존재하는 분리된 박테리아에, 이 생물학적 슬러지의 박테리아에는 자연적으로 존재하지 않는 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한 핵산 구성물을 전달시킴을 포함하는 방법에 의해 수득되는 생물발광 리포터 박테리아를 제공한다.
또한, 본 발명은 생물발광 리포터 박테리아를 제조하기 위해 생물학적 슬러지 샘플내 박테리아가 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 흡수할 수 있는 조건하에서, 생물발광 리포터 단백질을 암호화하고 생물학적 슬러지에는 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 포함하는 박테리아와 생물학적 슬러지의 박테리아-함유 샘플을 접촉시킴을 포함하는, 생물발광 리포터 박테리아의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 생물발광 리포터 박테리아를 제조하기 위해 생물학적 슬러지에 자연적으로 존재하는 분리된 박테리아가 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 흡수할 수 있는 조건하에서, 상기 분리된 박테리아에는 자연적으로 존재하지 않는 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한 핵산 구성물을 상기 분리된 박테리아에 전달시킴을 포함하는, 생물발광 리포터 박테리아의 제조 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 (a) 본 발명의 리포터 박테리아와 유입 스트림을 접촉시키는 단계, (b) 상기 리포터 박테리아에 의한 리포터 단백질의 발현을 검출하는 단계, 및 (c) 상기 리포터 단백질 발현의 감소를 독성의 존재와 상관시키는 단계를 포함하는, 폐수 처리 유입 스트림에서 독성의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 리포터 단백질을 발현하는 리포터 박테리아와 유입수를 접촉시키는 단계, (b) 상기 리포터 박테리아에 의한 리포터 단백질의 발현을 검출하는 단계, (c) 상기 리포터 단백질의 발현 감소를 독성의 존재와 상관시키는 단계를 포함하는, 폐수 유체의 유입 스트림을 갖는 생물학적 폐수 처리 설비에서 폐수 유체의 독성 상태를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 공지된 첨가량의 산화적 인산화 탈커플링제를 함유한 생물학적 폐수 슬러지 샘플을 본 발명의 생물발광 리포터 박테리아와 접촉시키는 단계, (b) 탈커플링제를 함유하지 않은 슬러지 샘플을 본 발명의 생물발광 리포터 박테리아와 접촉시키는 단계, (c) 상기 탈커플링제를 함유한 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 검출하는 단계, (d) 상기 탈커플링제를 함유하지 않은 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 검출하는 단계, (e) 상기 탈커플링제를 함유한 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 상기 탈커플링제를 함유하지 않은 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 광 출력과 비교하는 단계, 및 (f) (d) 단계의 리포터 박테리아에 의한 광 출력과 비교한 (c) 단계의 리포터 박테리아에 의한 광 출력의 감소를 탈커플링제의 작용과 상관시키는 단계를 포함하는, 공지된 첨가량의 탈커플링제의 효과를 결정할 수 있는, 생물학적 폐수 슬러지에 대한 공지된 첨가량의 산화적 인산화 탈커플링제의 효과를 결정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 본원에 기술된 방법에 따라 폐수 슬러지 샘플에서 공지된 첨가량의 탈커플링제의 효과를 연속적으로 관측하는 단계, 및 (b) 상기 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 선택된 수준으로 지속적으로 유지시키기에 필요한 만큼 탈커플링제의 첨가량을 연속적으로 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함하는, 생물학적 폐수 슬러지에서 에너지 역학을 연속적으로 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명은 생물학적 폐수 처리 설비에서 유입 폐수의 독성 상태를 검출하는 장치를 제공한다. 이 장치는 (a) 본 발명의 리포터 박테리아를 함유하는 제 1 챔버, (b) 유입 폐수의 일부를 상기 제 1 챔버로 전향시키기 위한 상기 제 1 챔버와 유체 연통적인 수단, 및 (c) 상기 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 검출하기 위해 상기 제 1 챔버에 광도계를 근접시키는 수단을 포함할 수 있고, 이 장치에 의해 측정된 광 출력의 감소로 독성 상태를 검출한다.
본 발명은 또한 생물학적 폐수 처리 설비에서 탈커플링제가 슬러지의 에너지 역학에 미치는 효과를 관측하는 장치를 제공한다. 이 장치는 (a) 생물학적 슬러지의 일부를 수용하기 위한, 본 발명의 리포터 박테리아를 함유하는 제 1 챔버, (b) 탈커플링제가 첨가된 생물학적 슬러지의 일부를 상기 제 1 챔버로 전향시키기 위한 상기 제 1 챔버와 유체 연통적인 수단, 및 상기 (c) 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 검출하기 위해 상기 제 1 챔버에 광도계를 근접시키는 수단을 포함할 수 있고, 이 장치에 의해 측정된 광 출력의 감소를 슬러지의 에너지 역학에 대한 탈커플링제의 효과와 상관시킨다.
본 발명은 생물학적 폐수 처리 시스템에서 생물학적 슬러지(sludge)의 독성 상태의 검출에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 생물학적 폐수 처리 시스템에서 독성 상태를 검출하는데 사용하기 위한 생물발광 박테리아를 제공한다.
도 1은 독성 물질에 대한 본 발명의 Shk 1 리포터 박테리아에 의한 생물발광 반응을 측정하는 연속식 샘플링(sampling) 시스템의 도식도이다. 이 시스템은 대조군 및 실험군 샘플링 세포를 포함한다.
도 2는 독성 물질로서 에탄올(▲), 2,4-디니트로페놀(■) 및 카드뮴(●)에 대한 Shk 1 리포터 박테리아의 생물발광 반응을 도시한 것이다.
도 3은 일정 범위의 하이드로퀴논 농도에 대한 Shk 1 리포터 박테리아의 경시적인 생물발광 반응을 도시한 것이다.
도 4는 일정 범위의 하이드로퀴논 농도에 노출될 때, Shk 1 리포터 박테리아의 생물발광 반응 및 산업 폐수 고형물의 산소 소비 속도를 도시한 것이다(■ 생물발광, ● 산소 소비 속도(㎖/ℓ·분)).
도 5는 연속식 샘플링 시스템에서 일정 범위의 하이드로퀴논 농도에 대한 Shk 1 리포터 박테리아의 생물발광 반응을 도시한 것이다. 실험군 샘플링 세포에서 계산된 하이드로퀴논 농도를 나타낸다(■ 정규화된 실험군 생물발광, ― 정규화된 대조군 생물발광, --- 실험군 샘플링 세포에서 계산된 하이드로퀴논 농도(㎖/ℓ)).
도 6은 본 발명의 한 실시태양에서 사용된 유전자 구성물 pSS50과 Tn4431, 및 플라스미드 pSa325를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 한 실시태양에서 사용된 플라스미드 pUTK50을 나타낸다.
본 발명은 생물학적 슬러지에 자연적으로 존재하며, 자연적으로 존재하는 박테리아에는 없는 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 박테리아를 포함하는, 리포터 박테리아를 제공한다. 상기 리포터 단백질은 검출가능한 신호를 생산한다. 본원에 사용된 바와 같이, "생물학적 슬러지"란 폐수 처리 설비(예를 들어, 공장의 폐수 처리 설비, 시 직영 폐수 처리 설비 등)의 슬러지를 포함하고, 또한 일반적으로 생물고형물 및 폐수 고형물로 지칭된다.
본 발명의 리포터 박테리아를 생산할 수 있는 본 발명의 박테리아는 생물발광 리포터 유전자를 자연적으로 함유하지 않은 임의의 박테리아일 수 있고, 바람직한 실시태양에서는 생물학적 슬러지에 자연적으로 존재하는 박테리아이다. 본 발명이 생물학적 슬러지로부터 직접적으로 분리된 박테리아로 제한되지 않지만, 생물학적 슬러지에 존재하고 이미 슬러지에 순응되어 있거나, 또는 적어도 생물학적 슬러지에서 잘 자라지 않을 정도로 슬러지와 다른 환경에서 장기간의 배양에 순응되지는 않은 균주를 사용하는 것이 유리하다. 상기 리포터 박테리아는 생물학적 슬러지 또는 박테리아를 함유하는 슬러지의 샘플로부터 분리된 자연적으로 존재하는 박테리아를 사용하여 제조될 수 있다. 리포터 박테리아의 한 예는 생물학적 폐수 슬러지에 자연적으로 존재하는 박테리아로부터 하기 실시예에 기술된 교배 방법으로 생산된 Shk 1 리포터 박테리아일 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 교배가 일어날 수 있는 조건하에서, 생물학적 슬러지의 박테리아에는 자연적으로 존재하지 않는 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한 공여자 박테리아와 생물학적 슬러지의 박테리아-함유 샘플을 접촉시키는 단계, 및 (b) 원래의 생물학적 슬러지 샘플로부터 생물발광을 발현하는 리포터 박테리아(즉, 생물발광 리포터 박테리아)를 선택하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 생물발광 리포터 박테리아를 제공한다. 이와 같이, 박테리아의 혼합물(분류학에 공지되어 있거나 공지되어 있지 않은 박테리아)을 생물학적 슬러지의 샘플로부터 수득하여 리포터 박테리아를 제조하기 위해 공여자 박테리아와 접촉시킬 수 있다.
생물학적 슬러지 샘플의 박테리아를 발현 구성물내에 리포터 단백질 유전자를 갖는 공여자 균주와 교배시키는 상기 방법은 상당히 유리한 점을 갖는다. 예를 들어, 신호를 암호화하는 유전자를 갖는 공여자 균주를 폐수 고형물 균주와 직접 교배시키는 것은 처리 공장-특이적 독성 바이오센서(biosensor)를 개발하는 빠르고 효과적인 방법이다. 광 출력이 높은, 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 구성물의 수용자(생물발광 리포터 박테리아)는 한천 평판 배지상에 생성된 콜로니(colony)를 육안으로 조사하여 고를 수 있다. 가시광선을 용이하게 생산하는 균주를 사용하여 광 검출 장비를 사용하지 않고도 유입수의 잠재적인 화학 물질 또는 그랩 샘플의 독성을 결정할 수 있지만, 광 출력을 연속적으로 온-라인 방식으로 관측하고 방출된 빛의 변화를 정략적으로 검출하는 광 검출 장치가 바람직하다. 상기 광 검출 장치의 예로는 빛을 측정하는 장치(예를 들어, 광전자 증배관 또는 포토다이오드(photodiode))에 결합된 빛을 이동시키는 장치(예를 들어, 액체 광파이프 또는 광섬유 케이블)를 들 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
상기 슬러지 교배 방법에서, 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한 공여자 박테리아(공여자 균주)는 다른 문헌에서 공여자로서 사용된 박테리아, 예를 들어 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 알칼리제네스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 중에서 선택할 수 있지만, 이론적으로는 거의 모든 공지된 박테리아가 공여자로서 기능할 수 있다. 상기 선택 단계에서 공여자 균주에 반하여 선택될 수 있는 리포터 박테리아를 제조하는 공여자 균주를 고르는 것이 바람직하다. 예를 들어, 공여자 박테리아가 슬러지 박테리아에 필요한 영양소와는 다른 영양소를 요구한다면, 슬러지에서 생존하지 못할 것으로 기대된다. 따라서, 슬러지-계 배지(공여자 균주의 특정 영양소가 보충되지 않은 배지)에서 선택하면, 슬러지-유래된 박테리아가 우선적으로 성장하여 개질된 리포터-발현성 슬러지 박테리아의 선택을 유리하게 할 것이다. 선택 단계의 한 예를 하기 실시예에서 제공하였지만, 다른 공지된 선택 조건(예를 들어, 항생제 저항성)을 사용하거나, 교배되지 않은 신호-발현성 공여자 세포에 대해서 본 발명의 신호-발현성 슬러지 박테리아를 선택하는데 사용하기 위해 다른 공지된 선택 조건을 일반적으로 개질시킬 수 있음은 자명하다.
슬러지 교배 방법의 특성에 기인하여, 리포터 박테리아는 생물학적 슬러지에 함유된 임의의 박테리아의 개질된 형태일 수 있다. 생물학적 슬러지에 존재하는 것으로 알려진 박테리아 중에는 주글레아(Zoogloea) 종, 슈도모나스 종, 하이포마이크로비움(Hyphomicrobium) 종, 알칼리제네스 종, 아시네토박터(Acinetobacter) 종 및 스파에로틸루스(Sphaerotilus) 종이 포함된다. 또한 상기 박테리아의 목록은 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology](하기 참고 문헌 18번) 및 젠킨스 등의 문헌(하기 참고 문헌 19번)을 참조한다. 아직 동정되지 않은 다른 슬러지 박테리아도 본 발명의 교배 절차에 사용할 수 있고, 이러한 방법에서 선택 단계에 의해 동정되고 분리될 수 있다. 중요한 필요 조건은 슬러지 박테리아가 공여자 박테리아와 교배할 수 있고, 안정하게 유지될 수 있으며, 리포터 유전자 구성물을 발현할 수 있어야 한다는 점이다. 교배 방법 및 공여자와 수용자 사이에 교배가 이루어졌는지를 결정하는 방법에 대한 교시는 본원에 개시된 하기 실시예에서 제공하였다. 따라서, 본 발명의 다양한 리포터 박테리아는 본 발명의 방법을 사용하여 계속 개발된다. 실제로, 교배 절차로부터 1종 이상의 리포터 균주를 수득할 것으로 기대하는 것이 비합리적이지는 않다.
리포터 박테리아는 시각적 신호를 생산하는 자연적으로 존재하지 않는 리포터 단백질을 발현할 수 있다. 시각적 신호는, 예를 들어 발광(즉, 생물발광) 형태일 수 있는 빛일 수 있다. 신호가 발광의 형태라면, 리포터 박테리아는 생물발광을 발현한다거나 생물발광적이라고 지칭될 수 있다. 시각적 신호는 또한 리포터 단백질을 암호화하는 핵산의 발현으로 안료가 생성된 결과일 수 있다. 리포터 단백질을 암호화하는 핵산은 1종 이상의 단백질을 암호화할 수 있고, 이들의 발현 결과 검출가능한 신호(예를 들어, 생물발광)가 생산된다. 이들 유전자는 구성물내에서 이들의 발현을 제어하는 프로모터(promoter)에 따라 동시에 발현되거나 연속적으로 발현될 수 있다. 따라서, "리포터 단백질"이란 용어는 신호를 생산하기에 충분한 1종의 단백질, 또는 연속적으로 발현되거나 동시에 발현되거나 일부 임시적으로 중첩된 유전자와 함께 발현될 때 신호를 생산하는 1종 이상의 단백질을 의미할 수 있다.
본 발명의 리포터 박테리아는 단백질을 발현하는 DNA 구성물인 핵산을 함유한다. 본 발명의 리포터 박테리아의 구체적인 예에서, 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산은 lux 구성물이다. lux 구성물은, 예를 들어 플라스미드 pUTK2에서 유지 프로모터의 다운스트림(downstream)에 위치한 Tn4431 lux 트랜스포손(transposon)일 수 있다. 다른 가능한 구성물은 임의의 공지된 광범위한 숙주 플라스미드내 lux 구성물(예를 들어, pRK293) 또는 트랜스포손내 lux 구성물(예를 들어, Tn5luxAB)을 포함한다. 프로모터가 없는 lux 카세트(cassette)는 트랜스포손 돌연변이 유발에 의해 수용자 염색체로 직접 삽입시킬 수 있다. 광 출력을 높게 발현하는 수용자는 육안으로 조사하여 고를 수 있다. 프로모터를 확인하는 것은 일반적으로 중요하지 않다. 이 경우에, Shk 1에서 lux 유전자의 업스트림(upstream)에 위치하는 프로모터는 명확하게 공지되어 있지 않지만, 플라스미드 유지 프로모터로 생각된다. 또한, 본 발명의 리포터 단백질은 항구적으로 발현될 수 있다.
그밖의 다른 리포터 단백질도 또한 본 발명의 리포터 박테리아에 효과적일 것이다. 중요한 것은 정상적으로는 발현되지 않거나 또는 생물학적 슬러지 박테리아에서 상이한 수준으로 발현되는 신호를 생산하는 리포터 단백질을 갖는 것이다. 가장 통상적으로 사용되는 리포터 유전자는 청색 안료 생성물을 발현하는 lacZ(β-갈락토시데이즈), 빛을 방출하는 lux(루시퍼레이즈), 및 녹색형광을 나타내는 GFP(green fluorescence protein, 녹색형광 단백질)이다. lux 유전자는 반응 시간이 빠르고 방출된 빛을 전기 신호로 쉽게 전환시킬 수 있기 때문에, 다수의 환경적 용도에서 리포터 유전자로 선택된다. GFP 및 lacZ는 오랜 기간에 걸쳐 반복되는 장기적인 영향을 관측하는데 더욱 적합하다. 선택되는 리포터 단백질 또는 리포터 복합체는 특정 용도에 따라 다르다. 디자인할 때 적절한 고려사항은 특이성, 민감성, 신뢰성, 반응 시간 및 비용을 포함한다. 또한 리포터 유전자에는 화학 물질-특이적 리포터 구성물(예를 들어, 나프탈렌의 경우 nah/lux 및 톨루엔의 경우 tod/lux), 스트레스 검출용 리포터 구성물(예를 들어, 스트레스 유도된 엑소폴리사카라이드 생산에 대한 alg/lux), 및 신호 정지-특이적 리포터 구성물(예를 들어, 일반적인 세포 손상에 대한 lac/lux 및 kan/lux)이 있다.
독성 관측용 리포터 박테리아에는 몇 가지 바람직한 특성이 있다. Shk 1 생물발광 리포터 박테리아는 새로 제조되는 폐기 화학 물질을 미리 탐색하거나 유입 폐수 및 공장 배출수를 반복적으로 온-라인 방식으로 관측하는 독성 관측 시스템에 바람직한 상기 특성 중 몇 가지를 갖는다. Shk 1 리포터 박테리아는 분산된 세포로서 높은 성장 속도를 갖는데, 이것은 일반적인 독성 측정용 배양 제조물에서 유리하다. Shk 1 박테리아는 지정된 공장에서 처리되는 전형적인 탄소원을 함유하는 완전 합성 폐수에서 성장한다. 메탄올, 이소프로판올 및 에틸렌 글리콜(본원에 제공된 하기 실시예에서 사용됨)은 호흡측정식 억제법에 기초한 EC50수치가 50 내지 200㎖/ℓ인 것으로 보아, 폐수 고형물에 대해 비-억제성인 것으로 밝혀졌다(킬로이 및 그레이의 하기 문헌[1992] 참조). 침전된 폐수 고형물의 상청액이나 정상적인 유입 폐수는 생물발광에 영향을 미치지 않았다. 정상적인 농도의 유입 화학 물질에 대한 생물발광 반응의 감소는 상기 균주가 폐수 고형물의 품질에 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 독성 물질에 매우 민감함을 제시하였다. 또한, 전형적인 유입수의 pH 범위에서 벗어난 pH도 Shk 1 박테리아의 생물발광에 영향을 미치지 않았다. 넓은 pH 범위에 걸쳐 생물발광 반응이 일정하게 나타나므로, 생물발광 리포터 박테리아를 전형적인 페수 pH에 사용할 수 있다. 처리할 폐수의 특성과 일치하지 않은 영양소 요구성 또는 환경 요구성을 갖는 숙주를 사용하는 독성 관측은 더욱 어렵다.
따라서, 본 발명은 추가로 생물학적 슬러지의 박테리아에는 자연적으로 존재하지 않는 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한 박테리아와 생물학적 슬러지의 박테리아-함유 샘플을 접촉시킴을 포함하는, 리포터 박테리아의 제조 방법을 제공한다. 리포터 박테리아가 생물발광 리포터 박테리아인 경우, 상기 핵산은 생물발광 리포터 단백질을 암호화할 수 있다. 또 다르게는, 상기 핵산은 비발광성 신호를 생산하는 단백질을 암호화할 수 있다. 상기 리포터 박테리아는 본원에 제공된 방법 및 그밖의 방법에 따라 선택될 수 있다. 본 발명은 상기 방법에 의해 수득된 리포터 박테리아를 제공한다.
또한, 본 발명은 생물학적 슬러지에 자연적으로 존재하는 분리된 생물학적 슬러지의 박테리아가 생물 발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 흡수할 수 있는 조건하에서, 상기 분리된 슬러지 박테리아에는 자연적으로 존재하지 않는 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한 핵산 구성물을 상기 분리된 슬러지 박테리아에 전달시킴을 포함하는, 생물발광 리포터 박테리아의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은 핵산을 원핵세포로 전달시키는 당해 분야의 표준 방법에 따라 리포터 단백질 암호화 DAN가 전달된 특정 슬러지 박테리아를 먼저 다른 슬러지 구성 요소로부터 분리시킨다는 점에서 상기 슬러지 교배 방법과 다르다. 전술한 바와 같이, 폐수 슬러지에 존재할 수 있는 임의의 속/종을 이 방법에 사용할 수 있다. 생물발광을 발현하는 리포터 박테리아는 육안으로 조사하거나 그밖의 방법에 의해 통상적으로 선택될 수 있다. 본 발명은 또한 전술한 방법에 의해 수득된 생물발광 리포터 박테리아를 제공한다. 또한, 본원에서 기술한 바와 같이, 생물발광 단백질 이외의 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 사용하여 본 발명의 리포터 박테리아를 제조할 수 있다.
전달 단계는 핵산을 박테리아로 도입시키거나 삽입시키는 임의의 공지된 방법에 의해 행해질 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션(electroporation), 형질전환 및 형질도입은 모두 원핵세포에서 행해지는 전형적인 방법이다. DNA를 원핵세포로 전달시키기 위해 사용되는 임의의 다른 전형적인 방법을 본 발명에서 시험할 수 있다. 본 발명의 리포터 박테리아에서, 핵산은 단백질을 발현하는 DNA 구성물이다. 핵산 구성물은 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한 플라스미드, 트랜스포손 또는 파지(phage)일 수 있다. 예를 들어, 종 내에서 플라스미드 복제를 지지하는 복제 기원을 함유한 플라스미드, 또는 박테리아 염색체로 혼입된 벡터, 및 상기 플라스미드 또는 염색체 혼입 벡터내에서 리포터-암호화 DNA에 작용적으로 연결된 프로모터가 모두 본 발명의 범위내에 포함된다. 상기 구성물의 다른 구성 요소에 대한 필요 조건은 샘브루크(Sambrook) 등의 문헌(하기 참고 문헌 17번)과 같은 분자학적 방법 지침서 또는 문헌을 참조하여 통상적으로 결정할 수 있다. 수용자 세포가 DNA 구성물을 흡수할 수 있는 조건은 하기 실시예 1에 기술된 조건이거나, 샘브루크 등의 문헌(하기 참고 문헌 17번)과 같은 분자학적 방법 지침서에 기술된 다른 조건일 수 있다. 리포터 단백질은 전술한 바와 같을 수 있다.
본 발명의 리포터 박테리아에서, 리포터 단백질은 항구적으로 발현될 수 있다. 이것은 Shk 1 리포터 박테리아와 같은 신호 정지-특이적 리포터 박테리아의 경우일 때이지만, 다른 리포터 박테리아를 특정 독성 물질 또는 그밖의 슬러지 구성 요소를 검출하기 위한 탐침으로서 기능을 하도록 제조할 수 있다. 적용 분야에 따라 다양한 유형의 유전자 구성물이 리포터 박테리아에 사용되어 왔다. 독성 쇼크의 문제점에 특히 적절한 박테리아는 화학 물질-특이적, 스트레스-특이적 및 신호 정지-특이적 리포터 박테리아이다. 화학 물질-특이적 리포터 박테리아는 특정한 화학 물질 또는 화학 물질의 그룹을 검출하기 위해 고안된다. 유전자 조절 요소가 미생물의 분해 경로에 기초함에 따라, 화학 물질-특이적 리포터 박테리아는 조건이 목표 화학 물질의 생분해에 바람직한지를 결정하기 위해서도 사용될 수 있다. 이러한 유형의 탐침의 예로는 나프탈렌의 경우 nah/lux 및 톨루엔의 경우 tod/lux를 포함한다. 스트레스-특이적 리포터 박테리아는 미생물이 손상 제어 반응 또는 손상 방어 반응을 활성화시키기에 충분히 불리한 환경 조건을 경험하는지를 결정하기 위해 사용된다. 이러한 스트레스-특이적 탐침의 예는 높은 에탄올 농도, 높은 염도 또는 질소 제한에 대한 반응으로 생산되는 엑소폴리사카라이드가 프로모터를 유도하여 유전자를 발현할 때, 발현되는 alg/lux이다. lux 유전자는 프로모터의 다운스트림에 위치한다.
신호 정지-특이적 리포터 박테리아(세포 손상-검출용 리포터 박테리아)는 연속적으로 검출가능한 신호를 생산한다. 신호 생산에 필요한 일반 대사 활성을 손상시키기에 충분하여, 그 결과 신호가 검출되지 않거나 비독성 조건에서의 신호 검출량에 비해 신호 검출량이 감소되는 세포 손상으로서 독성을 표시한다. 신호 정지-특이적 리포터 박테리아의 예는 생물발광 리포터 박테리아 Shk 1이다.
본 발명은 또한 폐수 처리 유입 스트림에서 독성의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 리포터 단백질을 발현하는 리포터 박테리아와 유입수를 접촉시키는 단계, (b) 상기 리포터 박테리아에 의한 리포터 단백질의 발현을 검출하는 단계, 및 (c) 상기 리포터 단백질의 발현 감소를 독성의 존재와 상관시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 한 실시태양에서, 리포터 박테리아에 의한 리포터 단백질의 발현은 루시퍼레이즈와 같은 생물발광 리포터 단백질로부터의 광 출력을 검출하고 측정함으로써 확인할 수 있다. 더욱 구체적인 실시태양에서, 폐수 유체의 유입 스트림을 함유하는 생물학적 폐수 처리 설비에서 폐수 유체의 독성 상태를 검출하는 본 발명의 방법은 (a) 폐수 유체의 유입 스트림으로부터의 유체 스트림을 접촉용 챔버로 전향시키는 단계, (b) (a) 단계의 유체를 함유한 상기 접촉용 챔버에 본 발명의 생물발광 리포터 박테리아를 첨가하는 단계, 및 (c) 상기 접촉용 챔버로부터의 광 출력을 검출하는 단계를 포함하고, 이때 광 출력의 감소는 독성 상태를 나타낸다.
예를 들어, 광 방출 리포터 단백질을 사용하는 리포터 박테리아에 의해 방출된 빛은 광섬유를 통해 광 증배 장치 및 감지기로 이동된다. 필요한 신호 증폭 정도는 리포터 박테리아 디자인 및 환경 자극의 강도 둘다에 따라 어느 정도 달라진다. 리포터 반응은 컴퓨터 자료 수집 소프트웨어를 사용하여 다른 부호로 번역되어 저장될 수 있다. 공정 제어 반응(예를 들어, 폐수 처리 시스템에서 독성 유입 폐수의 유동을 전향시키거나 감소시키는 반응)은 설정치 경고에 기초하여 자동으로 또는 수동으로 활성화될 수 있다. 공정 제어 반응을 개시하는 광 방출의 정도는 독성 쇼크를 야기할 것으로 기대되는 유입수의 특징에 따라 실험적으로 보정될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 폐수 유체의 유입 스트림을 접촉용 챔버로 전향시키는 단계, (b) 상기 유입 스트림으로부터 전향된 유체를 함유한 상기 접촉용 챔버에 본 발명의 리포터 박테리아를 첨가하는 단계, 및 (c) 이동된 빛을 측정하는 장치(예를 들어, 광전자 증배관 또는 포토다이오드)에 결합된, 광 출력을 검출하는 장치(예를 들어, 빛을 이동시키는 액체 광파이프 또는 광섬유 케이블)를 사용하여 상기 접촉용 챔버로부터의 광 출력을 검출하는 단계를 포함하고, 이때 광 출력의 감소가 독성 상태를 나타내는, 폐수 유체의 유입 스트림을 함유하는 생물학적 폐수 처리 설비에서 폐수 유체의 독성 상태를 검출하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 생물발광 리포터 박테리아의 용도를 제공할 수 있다.
액체 광가이드(guide) 및 광섬유관 또는 광섬유 케이블은 샘플링 위치로부터 빛이 전기 신호로 전환되는 위치까지 빛을 이동시키는 수단을 제공하는 장치이다. 빛은 광섬유관내 섬유를 통해서 또는 액체 광가이드(맑은 액체로 채워진 관)를 통해서 내부 반사에 의해 이동된다. 빛은 검출계(광전자 증배관 또는 포토다이오드)에서 측정가능한 전기 신호(전류)로 전환된다. 전기 신호의 변화는 빛의 양의 변화를 반영한다. 광전자 증배관은 빛의 광자에 의해 충격을 받을 때 전자를 잃어버리는 광전자 방출 검출계로 구성되어 있다. 그다음 증폭된 전기 전류가 생성된다. 포토다이오드는 빛에 대한 반응으로 전기 신호를 생산하는 빛에 민감한 반도체 장치이다.
유입 스트림을 함유하는 생물학적 폐수 처리 설비에서 폐수 유체의 독성 상태를 검출하는 본 발명의 방법은 추가로 (a) 본 발명의 생물발광 리포터 박테리아를 유입 폐수 스트림으로부터 전향된 폐수 유체를 함유하지 않은 챔버에 첨가하는 단계, (b) 빛을 측정하는 장치(예를 들어, 광전자 증배관 또는 포토다이오드)에 결합된, 광 출력을 검출하는 장치(예를 들어, 빛을 이동시키는 액체 광파이프 또는 광섬유선)에 의해 상기 챔버로부터의 광 출력을 검출하는 단계, 및 (c) 상기 유입 스트림으로부터 전향된 유체를 함유한 접촉용 챔버에서 검출되는 광 출력을 유입 폐수 스트림으로부터 전향된 폐수 유체를 함유하지 않은 상기 챔버에서 검출되는 광 출력과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 유입 폐수 스트림으로부터 전향된 폐수 유체를 함유하지 않은 챔버로부터의 광 출력과 비교한 유입 폐수 스트림으로부터 전향된 유체를 함유한 접촉용 챔버로부터의 광 출력의 상대적인 감소는 폐수 유체의 독성 상태를 지시한다. 상기 설비로부터 전향된 폐수 유체를 함유하지 않은 챔버는 합성 폐수를 함유할 수 있다. 당연히 대조군과 비교할 필요 없이 독성 유입수를 검출할 수 있는 방식으로 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 표준화할 수 있음을 기대할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) 공지된 첨가량의 산화적 인산화 탈커플링제를 함유한 생물학적 폐수 슬러지 샘플을 본 발명의 생물발광 리포터 박테리아와 접촉시키는 단계, (b) 탈커플링제를 함유하지 않은 슬러지 샘플을 본 발명의 생물발광 리포터 박테리아와 접촉시키는 단계, (c) 상기 탈커플링제를 함유한 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 검출하는 단계, (d) 상기 탈커플링제를 함유하지 않은 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 검출하는 단계, 및 (e) 상기 탈커플링제를 함유한 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 상기 탈커플링제를 함유하지 않은 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 광 출력과 비교하는 단계를 포함하는, 생물학적 폐수 슬러지에 대한 공지된 첨가량의 산화적 인산화 탈커플링제의 효과를 결정하는 방법을 제공한다. 탈커플링제를 함유하지 않은 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 광 출력과 비교하면, 탈커플링제를 함유한 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 광 출력에서의 감소를 탈커플링제의 작용과 상관시킬 수 있고, 이러한 방법으로 공지된 첨가량의 탈커플링제의 효과를 결정할 수 있다. 당연히 대조군과 비교할 필요 없이 탈커플링제의 효과를 측정할 수 있는 방식으로 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 표준화할 수 있음을 기대할 수 있다. 또한, 생물발광 신호 이외의 신호를 사용하는 본 발명의 리포터 박테리아를 임의의 상기 검출 방법에 사용할 수 있고, 선택된 신호를 검출하는 당해 분야에 공지된 수단을 사용하여 상기 신호를 검출할 수 있다고 생각된다.
전자-전달 인산화의 커플링방지제(uncoupler) 및 억제제는 당해 분야에 공지되어 있다. 커플링방지제로 지칭되는 다양한 화학 제제는 전자-전달 과정 자체를 억제하는 것이 아니라 전자 전달 동안의 ATP의 합성을 억제한다. 이러한 커플링방지 제제의 예로는 디니트로페놀, 디쿠마롤, 카보닐시아나이드-m-클로로페닐하이드라존 및 살리실아닐라이드를 들 수 있다. 이들 제제는 모두 산성인 지용성 물질이고, 수소 원자와 결합할 때 세포막의 지질 매트릭스(matrix)를 통과할 수 있다. 이들 물질은 양자-운동력을 상쇄시키면서 세포막을 통해 H+이온의 통과를 촉진시킨다. 특징적으로, 커플링방지제는 실제로는 호흡을 촉진시키지만, ATP 합성을 완전히 억제하기 때문에 에너지가 낭비되는 결과를 초래한다.
다양한 화학 물질은 전자 전달자의 작용을 방해함으로써 전자 전달을 억제한다. 일산화탄소는 사이토크롬(cytochrome) 말단의 사이토크롬 산화효소에 직접 결합하여 산소의 부착을 차단시킨다. 시아나이드(CN-) 및 아자이드(N3-)는 사이토크롬의 포르피린(porphyrin) 고리의 철과 매우 강하게 결합하여 철의 산화 및 환원을 방지한다. 항생제인 안티마이신 A는 사이토크롬 b 및 c 사이의 전자 전달을 억제한다. 이들 억제제 및 커플링방지제 모두는 세포의 성장과 그밖의 기능을 억제하는 강력한 독소이다(하기 참고 문헌 16번).
폐수 처리 설비내 박테리아는 유입수내 폐기 화학 물질을 CO2및 새로운 세포 질량으로 전환시켜 배출수에 잠재적인 환경 오염 물질이 없게 한다. 세포 질량은 청정기에서 침전되고, 여기에서 일부는 공장의 헤드(head)로 재순환되고 일부는 소각되거나 그밖의 다른 수단에 의해 처리된다. 슬러지(폐기 세포) 처리는 비용이 비싸기 때문에, 세포 수득량을 처리 공장에서 화학 물질 분해에 요구되는 개체군을 유지시키기에 필요한 수준으로만 감소시키는 것이 바람직하다. 탈커플링제를 첨가하면 폐수의 더 많은 부분이 CO2및 세포로 전환되는 결과가 나타난다. 그러나, 독성 물질인 탈커플링제의 첨가량을 제어하는 것이 필요하다. 첨가량이 너무 많으면, 세포가 사멸되고 공장의 기능이 마비될 수 있으며, 첨가량이 너무 적으면, 세포 수득량이 과도하게 많아질 것이다.
본 발명의 리포터 박테리아를 사용하여 유입 폐수(정체불명이거나 또는 예측하지 않은 독성 물질이 첨가될 수 있는 잠재적인 원료 물질) 및 탈커플링제가 첨가될 챔버(예를 들어, 통기조)를 모두 관측할 수 있다. 독성 표시가 유입수에서 나타나면, 미생물이 독성 물질에 의한 손상을 복구하고 다시 세포 성장하여 사멸한 세포를 보충하기 위해 모든 가능한 에너지를 생산할 수 있도록 탈커플링제의 첨가를 중지시키는 것이 바람직할 것이다. 시스템이 예측하지 않은 독성 물질의 첨가로부터 회복된 후에는, 탈커플링제를 다시 첨가할 수 있다. 또한 시스템의 한 곳에서 슬러지의 에너지 역학을 관측하고 또다른 곳에서 잠재적인 독성 물질의 존재를 관측하기 위해 본 발명의 방법 및 리포터 유기체를 사용할 수 있다.
탈커플링제와 접촉시키거나 접촉시키지 않은 생물발광 리포터 박테리아에 의한 광 출력은 생물발광 미생물에 의한 광 출력을 측정하기 위해 본원에 기술된 방법에 따라 결정할 수 있다. 리포터 박테리아는 본 발명의 임의의 리포터 박테리아일 수 있다. 탈커플링제는 전술한 탈커플링제, 및 현재 공지되어 있거나 미래에 확인될 임의의 다른 탈커플링제일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는 1종 이상의 탈커플링제를 연속적으로 또는 함께 조합하여 사용할 수 있다.
탈커플링제는 리포터 박테리아에 의한 신호 출력(예를 들어, 빛/생물발광)을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 탈커플링제와 접촉시키지 않은 리포터 박테리아에 의한 신호 출력과 비교할 때, 탈커플링제와 접촉시킨 리포터 박테리아에 의한 신호 출력에서의 증가는 탈커플링제와 접촉시킨 리포터 박테리아에서 에너지 생산이 증가함을 나타낸다. 탈커플링제와 접촉시키지 않은 리포터 박테리아에 의한 신호 출력과 비교할 때, 탈커플링제와 접촉시킨 리포터 박테리아에 의한 신호 출력에서의 감소는 탈커플링제와 접촉시킨 리포터 박테리아에서 에너지 생산이 감소함을 나타낸다.
슬러지의 에너지 역학에 대한 탈커플링제의 효과를 관측하기 위해, 탈커플링제와 접촉시킨 결과로서 리포터 박테리아에 의해 생산된 에너지의 양을 결정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 슬러지 미생물에 의한 에너지 수율을 감소시켜 슬러지 수득량을 감소시키는 효과를 미치는 탈커플링제를 첨가하여 슬러지의 에너지 역학을 제어하는 것이 바람직하다. 슬러지 수득량에서의 이러한 감소는 폐수 처리 공장에서 슬러지 처리 문제를 최소화하는데 도움이 된다. 다양한 유입 폐수의 조성, 활성화된 슬러지 미생물 활성의 다양성, 및 순응된 미생물에 의한 탈커플링제의 분해에 기인하는 탈커플링제의 효력 감소로 인해, 탈커플링제의 표준 첨가량을 사용하는 것은 실용적이지 않다. 불충분한 첨가량은 산화적 인산화를 충분히 탈커플링시키지 못할 것이고, 과도한 첨가량은 활성화된 미생물을 사멸시켜 슬러지의 품질, 폐수 처리 효력의 불활성화 또는 공장에서의 워시아웃(washout)과 관련된 문제를 일으킬 것이다. 따라서, 폐수 처리 공장의 효율적인 작업을 위해서는, 슬러지 미생물에 의한 에너지 수율을 임계 수치보다 크게 증가시키거나 그 미만으로 떨어뜨리지 않고 일정한 수준으로 제공하는 슬러지내 탈커플링제의 양을 유지시키는 것이 가장 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한 (a) 슬러지의 에너지 역학에 대한 공지된 첨가량의 탈커플링제의 효과를 결정하는 전술한 방법에 따라 폐수 슬러지 샘플에서 공지된 첨가량의 탈커플링제의 효과를 연속적으로 관측하는 단계, 및 (b) 상기 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 선택된 수준으로 유지시키기 위해 탈커플링제의 첨가량을 연속적으로 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함하는, 생물학적 폐수 슬러지에서 에너지 역학을 연속적으로 조절하는 방법을 제공할 것이다. 생물발광 리포터 박테리아의 경우, 선택된 수준의 리포터 박테리아에 의한 광 출력은 활성화된 슬러지 박테리아가 바람직한 수율의 슬러지 질량을 생산하기 위해 이상적인 것으로 결정된 수준의 에너지를 생산할 때 생성되는 광 출력이다. 바람직한 에너지 수준/광 출력은 공장에서 슬러지의 질량을 증가시키거나 감소시키지 않는 탈커플링제의 첨가량에서 나타나는 광 출력 수준으로서 통상 실험적으로 결정될 수 있다. 또한 생물발광 신호 이외의 신호를 사용하는 본 발명의 리포터 박테리아를 전술한 임의의 검출 방법에 사용할 수 있고, 선택한 신호를 검출하는 당해 분야에 기술된 수단을 사용하여 신호를 검출할 수 있다고 생각된다.
전술한 방법을 실행하기 위해, 본 발명은 생물학적 폐수 처리 설비에서 유입 폐수의 독성 상태를 검출하는 장치를 제공한다. 이 장치는 (a) 본 발명의 생물발광 리포터 박테리아를 함유하는 제 1 챔버, (b) 유입 폐수의 일부를 상기 제 1 챔버로 전향시키기 위한 상기 제 1 챔버와 유체 연통적인 수단, 및 (c) 상기 생물발광 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 검출하기 위해 상기 제 1 챔버에 광도계를 근접시키는 수단을 포함할 수 있고, 이 장치에 의해 측정된 광 출력의 감소로 독성 상태를 검출한다. 상기 장치는 추가로 대조군 배지 및 생물발광 리포터 탐침을 포함하는 제 2 챔버를 포함할 수 있다. 대조군 배지는 본 발명의 생물발광 리포터 박테리아가 혼합될 수 있는 합성 폐수의 스트림일 수 있다. 빛 이외의 다른 검출가능한 신호를 생산하는 리포터 박테리아를 사용하는 경우에는, 예를 들어 신호가 색 변화일 때 광 검출용 장비를 색도계 장비로 대체시킴으로써 본 발명의 장치를 통상적으로 채택할 수 있다.
폐수 유체는 폐수 유체의 주 스트림으로부터 전향된 단일 주 스트림으로서 또는 분할된 스트림으로서 제 1 챔버로 전향될 수 있다. 본 발명의 장치에서 제 1 챔버는 통기조 또는 균등화조와 유체 연통적일 수 있다. 독성 물질을 함유한 것으로 밝혀진 유입 균주를 전향시키는 것이 필요한 경우를 위해, 전향조가 처리 시스템에 존재할 수 있다. 예를 들어, 균등화조를 포함하는 폐수 처리 시스템에서는 균등화조로부터 검출 챔버로 전향되는 슬러지에서 독성 반응을 검출할 수 있다. 균등화조 대신 통기조를 포함하는 시스템에서는 통기조로부터 전향된 슬러지 또는 유입 스트림으로부터 전향된 슬러지에서 독성 반응을 검출할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 유체를 수용하거나 수송시키거나 또는 전향시키는 수단은 필요에 따라 유체의 수용 또는 수송을 정지시키거나 개시할 수 있는 밸브 또는 그밖의 다른 장치를 사용하여 유체의 수용 또는 수송을 제어할 수 있는 수단이다. 예를 들어, 정상적인 폐수 처리 작업하에서는, 밸브(들) 또는 다른 유동 조절 장치(들)를 개방시켜 폐수를 통기조 또는 균등화조에 수용시킬 수 있다. 폐수를 전향 챔버에 수용시키고 폐수를 다시 전향 챔버로부터 정상적인 공정 챔버로 수송하는 것은 밸브(들) 또는 다른 조절 장치(들)에 의해 제어된다. 독성 반응이 폐수 유입 스트림에서 검출되면, 유체를 통기조 또는 균등화조로 유입시킬 수 있는 밸브(들) 또는 다른 조절 장치(들)를 잠그고 유체를 전향 챔버로 유입시킬 수 있는 밸브(들) 또는 다른 조절 장치(들)를 개방시켜 독성 유입 스트림을 처리 설비로부터 전향 챔버로 직접 전향시킬 수 있다. 그다음 폐수 처리 시스템에서 활성화된 슬러지에 대한 독성 유입수의 영향을 최소화하기 위해, 전향 챔버와 통기조 또는 균등화조 사이에서 유속을 조절하거나 개방된 밸브 또는 다른 조절 장치의 수를 조절함으로써 전향 챔버로부터 통기조 또는 균등화조로의 독성 유입 스트림의 유동을 조절할 수 있다.
상기 장치에 사용된 리포터 박테리아는 본 발명의 리포터 박테리아일 수 있다. 리포터 박테리아는 박테리아가 연속적으로 생산되는 케모스태트(chemostat) 또는 터비도스태트(turbidostat)(수동 또는 자동일 수 있음)로 생산되거나 일정한 농도로 유지될 수 있으며, 박테리아는 상기 배양기로부터 검출 장치의 제 1 챔버로 공급되고 여기에서 유입 폐수와 혼합된다. 생물발광 리포터 박테리아의 경우, 제 1 챔버에서 유입 폐수와 접촉할 때 생물발광 리포터 박테리아에 의해 생산되는 빛의 양은, 예를 들어 액체 광파이프 또는 광섬유 케이블과 같은 광 검출 장치에 의해 연속적으로 측정될 수 있다. 빛을 검출하는 수단, 즉 광 검출 장치는, 예를 들어 광전자 증배관 또는 포토다이오드일 수 있는 검출된 빛을 측정하는 수단에 결합된다.
리포터 박테리아는 검출 장치의 제 2 챔버로 공급되어 여기에서 합성 폐수와 혼합될 수 있다. 생물발광 박테리아의 경우, 독성을 시험할 유입 폐수와 접촉시킨 생물발광 리포터 박테리아에 의한 광 출력과 비교하기 위해, 합성 폐수에서의 생물발광 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 전술한 바와 같은 광 검출 장치를 사용하여 연속적으로 측정할 수 있다. 제 2 챔버 또는 대조군 챔버에서 검출된 빛의 양을 사용하여 생물발광 리포터 박테리아의 대사 상태에서의 임의의 변화에 대해 보정할 수 있다. 폐수 처리 시스템에서 활성화된 슬러지로의 독성 유입수의 첨가를 전향시키거나 조절하여 그 영향을 관측하고, 따라서 독성 폐기물의 해로운 영향을 최소화하기 위해, 이러한 광 출력 자료를 적절한 연산식에 적용할 수 있다.
적절한 연산식의 예는 하기 1) 및 2)를 포함할 수 있다:
1) 대조군 챔버로부터의 빛과 비교하였을 때 샘플 챔버로부터의 빛의 감소가 검출되면, 유입되는 폐기물 스트림을 임시 저장조로 전향시킨 후, 이후에 슬러지 품질을 악화시키지 않는 속도로 처리 통기조로 복귀시킨다.
2) 샘플 챔버로부터의 빛이 대조군 챔버에서와 동일한 수준의 빛으로 복귀될 때, 유입되는 폐기물 스트림을 정상적인 유동 경로(예를 들어, 통기조)로 복귀시킬 수 있다.
생물발광 리포터 박테리아에 의한 광 출력 및 이 리포터 박테리아의 지속적인 광 출력 유지는 생물학적 폐수 처리 설비에서 슬러지의 에너지 역학에 대한 탈커플링제의 효과를 관측하는 장치를 사용하여 연속적으로 관측할 수 있다. 이 장치는 (a) 생물학적 슬러지의 일부를 수용하기 위한, 하기 특허청구의 범위의 청구항 1 내지 15의 리포터 박테리아를 함유하는 제 1 챔버, (b) 탈커플링제가 첨가된 생물학적 슬러지의 일부를 상기 제 1 챔버로 전향시키기 위한 상기 제 1 챔버와 유체 연통적인 수단, 및 (c) 상기 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 검출하기 위해 상기 제 1 챔버에 광도계를 근접시키는 수단을 포함할 수 있고, 이때 광 출력의 감소를 슬러지의 에너지 역학에 대한 탈커플링제의 효과와 상관시킨다. 유사하게, 리포터 박테리아에 의한 빛 이외의 신호 출력 및 이 리포터 박테리아의 지속적인 빛 이외의 신호 출력 유지도, 빛 이외의 신호 출력에 대한 탈커플링제의 효과를 관측하는 수단을 포함하도록 변형된 전술한 장치를 사용하여 연속적으로 관측할 수 있다.
폐수 처리 시스템의 배치 및 탈커플링제의 작용을 검출하는 장치의 용도는 본질적으로 독성 관측 장치의 용도에 대해 전술한 바와 같다. 폐수 처리 설비 배치의 정확성은 본 발명의 장치 또는 리포터 박테리아의 용도 및 본 발명의 방법에 중요하지 않다. 따라서, 본 발명은 임의의 실제의 폐수 처리 공장에 적용될 수 있다.
생물발광 리포터 박테리아를 사용할 때, 제 1 챔버에서 활성화된 슬러지 및 탈커플링제와 접촉시 생물발광 리포터 박테리아에 의해 생산되는 빛의 양은, 예를 들어 액체 광파이프 또는 광섬유선과 같은 광 검출 장치를 사용하여 연속적으로 측정할 수 있다. 빛을 검출하기 위한 수단, 즉 광 검출 장치는, 예를 들어 광전자 증배관 또는 포토다이오드일 수 있는 검출된 빛을 측정하기 위한 수단에 결합된다. 대조군 챔버는 활성화된 슬러지(탈커플링제가 없는 슬러지)의 스트림을 수용할 수 있고, 여기에서 본 발명의 생물발광 리포터 박테리아는 활성화된 슬러지와 혼합될 수 있다. 활성화된 슬러지 및 탈커플링제와 접촉시켰을 때의 생물발광 리포터 박테리아에 의한 광 출력과 비교하기 위해, 활성화된 슬러지에서 생물발광 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 전술한 광 검출 장치로 연속적으로 측정할 수 있다.
상기 장치를 사용하여, 특정한 첨가량의 탈커플링제의 효과를 결정할 수 있고, 따라서 폐수 처리 시스템에 첨가된 탈커플링제의 첨가량을 조정하여 세포 수득량을 최소로 하면서 슬러지 미생물의 대사 활성 상태를 최적으로 유지시킬 수 있다. 빛 이외의 검출가능한 신호를 생산하는 리포터 박테리아를 사용하는 경우에는, 예를 들어 신호가 색 변화일 때 광 검출 장비를 색도계 장비로 대체시킴으로써 본 발명의 장치를 통상적으로 채택할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위함이지 제한하고자 함이 아니므로, 수많은 변형과 변화가 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 전술한 프로토콜(protocol)을 전형적으로 사용할 수 있지만, 당해 분야의 숙련자에게 공지된 다른 절차로 대체할 수도 있다.
실시예 1
생물발광 리포터 제조
추정 플라스미드 유지 프로모터의 다운스트림에 Tn4431 lux 트랜스포손이 위치하는 플라스미드 pUTK2(벌라쥐(Burlage, R. S.) 등의 하기 문헌[1990] 참조)를 함유하는 에스케리치아 콜라이를 폐수 처리 공장으로부터 수득한 폐수 고형물내 박테리아와 교배시켰다. 폐수 고형물 및 생물발광 플라스미드를 함유한 에스케리치아 콜라이 배양액을 R2A 배지상에 도말하고 32℃에서 48시간 동안 배양하여 교배시켰다. 대조군용 교배에는 단지 에스케리치아 콜라이나 폐수 고형물만을 함유시켰다. 유입 폐수와 유사한 화학 조성을 갖고 20㎖/ℓ의 테트라사이클린 및 2,000㎖/ℓ의 에틸렌 글리콜을 함유하는 최소 염 배지상에서 형질전환체를 선택하였다. 가시광선을 방출하는 1개의 분리체(Shk 1)를 골라 이후의 연구에 사용하였다.
작은 소단위(16S) 리보솜의 DNA 서열을 분석하여 분류학상으로 폐수 고형물 분리체의 특성을 기술하였다. 프라이머(primer) 1114f 및 1492(래인(Lane, D. J.)의 하기 문헌[1991] 참조)를 사용하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 염기쌍 1114 내지 1492 사이의 16S rDNA를 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 제조사의 프로토콜(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로진(InVitrogen))을 사용하여 TA 클로닝(cloning) 벡터(pCRII)로 클로닝시켰다. 1492r 프라이머(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 레트로진(Retrogen))로 단일 프라이머 연장에 의해 DNA 서열을 결정하였다. 생성된 16S rDNA 서열을 시밀래리티 랭크(Similarity Rank) 프로그램(마이다크(Maidak, B. L.) 등의 하기 문헌[1994] 참조)을 사용하여 일리노이 리보소멀 데이타 베이스(Illinois Ribosomal Data Base)에서 탐색하였다.
일리노이 리보소멀 데이타 베이스에서 Shk 1 생물리포터의 16S rDNA를 탐색한 결과, 16S rDNA가 슈도모나스 플라베센스(Pseudomonas flavescens) 균주 B62(힐데브란드(Hildebrand, D. C.) 등의 하기 문헌[1994] 참조)와 0.817의 유사성을 가지면서 슈도모나스 속에 속함을 확인하였다. Shk 1 박테리아는 분산된 세포로서 합성 폐수에서 성장하였고, 세포수가 2배가 되는 시간은 약 2.2시간이었다.
배치 시험에서 독성 물질에 대한 생물발광 반응
일정 범위의 pH 조건, 카드뮴, 에탄올, 하이드로퀴논 및 2,4-디니트로페놀의 농도에서 Shk 1 박테리아의 초기 생물발광 반응을 마이크로베타 리퀴드 신틸레이션 카운터(MICROBETA Liquid Scintillation Counter)(미국 매릴랜드주 가이터스버그 소재의 왈라스 인코포레이티드(Wallace, Inc.))를 사용하여 측정하였다. 하이드로퀴논 농도에 대한 생물발광 반응의 경시적 변화를 기록하였다.
리포터 박테리아를 세포 밀도가 0.5 OD600(600㎚에서의 광학 밀도)이 될 때까지 모의 폐수 배지에서 성장시켰다. 모의 폐수 배지는 염, 금속, 인(K2HPO4) 및 질소[(NH4)2SO4]로 구성되었다. 모의 배지에서 주요 탄소원은 아세테이트(1,000㎖/ℓ), 메탄올(108㎖/ℓ), 이소프로판올(94㎖/ℓ) 및 에틸렌 글리콜(2,000㎖/ℓ)이었다. 농축된 양의 독성 물질 또는 pH 완충액(40㎕)을 마이크로베타 신틸레이션 카운터 평판 웰(well)에 첨가한 다음 리포터 세포(160㎕)를 첨가하였다. 세포를 첨가한 직후에, 신틸레이션 카운터로 웰로부터의 생물발광을 측정하였다.
조사한 pH의 범위는 5.5 내지 7.9이었고, 에탄올, 카드뮴, 하이드로퀴논 및 2,4-디니트로페놀의 농도는 0 내지 10,000㎖/ℓ이었다. 모든 샘플은 3중으로 제조하였다. 증류수, 모의 폐수, 및 실험실 벤치(bench) 규모의 반응기로부터 얻은 폐수 고형물의 하이드로퀴논 독성을 측정하였다.
Shk 1 리포터 균주의 생물발광은 독성 물질인 카드뮴, 2,4-디니트로페놀 및 하이드로퀴논의 반응으로 감소하였다. 대조적으로, 10,000㎖/ℓ 이하의 에탄올 농도는 생물발광에 영향을 미치지 않았다(도 2 참조). Shk 1 생물리포터의 생물발광 반응은 pH 6.1 내지 pH 7.9로 일정하였다. 그러나, 시험한 가장 낮은 pH(pH 5.5)에서는 생물발광이 약간 감소하였다. 생물발광은 카드뮴 농도가 1.0㎖/ℓ보다 더 높게 증가함에 따라 감소하였다(도 2 참조). 1.0 내지 10㎖/ℓ의 카드뮴 농도에서 생물발광의 유의적인 감소가 나타났고, 100, 1,000 및 10,000㎖/ℓ의 카드뮴 농도에서는 생물발광이 완전히 억제되었다. 2,4-디니트로페놀에 대한 생물발광 반응은 이 독성 물질의 농도가 약 1,000㎖/ℓ까지 증가할 때는 일정하게 유지되었고, 그 이상에서는 급격히 감소하였다(도 2 참조).
하이드로퀴논에 대한 반응으로의 Shk 1의 생물발광 및 폐수 고형물의 호흡측정
하이드로퀴논에 노출시 산업 폐수 고형물에 의한 산소 소비 속도를 측정하였다. 폐수 고형물을 산업 폐수 처리 공장으로부터 수득하여 500㎖ 플라스크에 넣었다. 이 플라스크에 50㎖의 모의 폐수 배지를 넣고 하룻밤 동안 항온처리하였다.
3㎖의 폐수 고형물 용액, 1㎖의 적절한 하이드로퀴논 용액, 및 1㎖의 모의 폐수 배지를 호흡측정기의 웰에 첨가하였다. 웰에 헤드-공간이 없도록 하면서 산소 탐침(미국 오하이오주 옐로우 스프링스 소재의 옐로우 스프링스 인스트루먼트 캄파니(Yellow Springs Instrument, Co.))을 즉시 샘플에 넣고, 산소 농도를 시간에 따라 측정하였다.
조사한 각 행렬에서 Shk 1의 초기의 생물발광은 하기 순서로 하이드로퀴논 농도가 증가함에 따라 감소하였다: 증류수에서의 Shk 1, 모의 폐수에서의 Shk 1, 및 모의 폐수와 혼합된 실험실 벤치 규모의 폐수 고형물 반응기로부터 얻은 폐수 고형물에서의 Shk 1. 모의 폐수와 혼합된 폐수 고형물에서 Shk 1 박테리아로부터 수득한 자료를 나타내었다(도 3 참조). 독성 반응은 1.0㎖/ℓ보다 높은 하이드로퀴논 농도에서 나타났다. 그러나, 1.0, 10 및 100㎖/ℓ의 하이드로퀴논을 함유한 샘플에서의 생물발광은 4시간 후에 0㎖/ℓ의 하이드로퀴논 농도에서의 생물발광 수준으로 회복되었다(도 3 참조). 1,000 및 10,000㎖/ℓ의 하이드로퀴논을 함유한 샘플에서의 생물발광은 4시간까지 증가하지 않았다. 이전의 연구에서, 항온처리 시간이 증가함에 따라 생물발광이 회복되는 것으로 보아 페놀의 독성이 감소함을 보고하였다(두트카 등의 하기 문헌[1983] 참조).
산업 폐수 고형물을 사용하여 호흡측정 실험을 행한 결과, 생물리포터에서 관찰된 하이드로퀴논 독성의 결과와 동일한 경향이 나타났다(도 4 참조). 생물발광 및 산소 소비 속도는 둘다 0, 1.0 및 10㎖/ℓ의 하이드로퀴논 농도 사이에서 크게 감소하였지만, 10 내지 1,000㎖/ℓ의 하이드로퀴논 농도에서는 일정하였다.
연속식 시스템에서 하이드로퀴논에 대한 생물발광 반응
연속식 샘플링 시스템을 개발하여 시험 독성 물질로서 하이드로퀴논을 사용하여 독성 물질에 대한 Shk 1 리포터의 생물발광 반응을 측정하였다(도 1 참조). 샘플링 시스템은 5㎖의 액체 체적 및 20㎖의 공기 헤드-공간을 갖는 2개의 빛이 통하지 않는 샘플링 용기로 구성되었다. 액체 광가이드를 각 용기의 상면에 연결시켜 빛을 광전자 증배관(미국 코넥티컷주 스트래트포드 소재의 오리엘 코포레이션(Oriel Corp.))으로 통과시키고, 이 광전자 증배관에서 광 신호를 전기적 전류로 전환시켰다.
리포터 Shk 1 세포의 한 분취량(25㎖)을 50㎖의 용기에 첨가하였다. 일정한 세포 밀도를 유지시키기에 충분한 속도로 배지를 첨가하고, 이들 리포터 세포를 연동식 펌프를 통해 샘플 용기에 공급하였다. 공기도 또한 각 샘플 용기에 취입시켰다. 대조군 용기에 모의 폐수를 수용시키고, 실험군 용기에 10, 100, 1,000 및 10,000㎖/ℓ 농도로 하이드로퀴논이 차례로 간헐적으로 첨가된 모의 폐수를 수용시켰다.
배치 배양액에서 출발하여 Shk 1 세포가 연속적으로 생산되었지만, 대조군에서의 광 신호는 연속식 샘플링 실험에서 계속 증가하였다. 이러한 현상을 설명하기 위해, 대조군에서의 신호 및 실험군에서의 신호를 대조군에서의 신호로 정규화하였다. 정규화된 Shk 1 리포터의 광 반응은 각각 하이드로퀴논에 노출되는 동안 감소하였다. 생물발광의 감소는 샘플 용기에서 계산된 하이드로퀴논 농도에 상응하였다(도 5 참조). 생물발광의 감소 속도는 하이드로퀴논 농도가 증가함에 따라 증가하였는데(하기 표 1 참조), 이것은 하이드로퀴논의 농도가 높을수록 그에 대한 독성 반응이 더욱 심각해짐을 지시하는 것이다.
처리 설비-특이적 생물리포터는 다양한 속의 균주보다는 폐수 고형물의 품질에 미치는 잠재적인 독성 물질의 영향을 더욱 잘 반영할 수 있다. Shk 1 박테리아로부터의 광 방출은 폐수 고형물의 미생물 활성에 영향을 미치는 독성 물질로서 공지되어 있는 카드뮴, 2,4-디니트로페놀 및 하이드로퀴논에 민감하였다(노르베르크(Norberg, A. B.) 및 몰린(Molin, N.)의 하기 문헌[1983]; 바티스토니(Battistoni, P.) 등의 하기 문헌[1993]; 볼스카이 및 그라디의 하기 문헌[1988]; 및 스톰(Stom, D. I.) 등의 하기 문헌[1992] 참조). 유입 폐수의 공통적인 성분인 에탄올은 시험 범위의 농도에서 광 방출에 영향을 미치지 않았다. 이전의 연구에서, 마이크로톡스 시스템도 에탄올에 대한 EC50수치가 31,000 내지 56,706㎖/ℓ로서 에탄올 독성이 낮음을 제시하였다(두트카 등의 하기 문헌[1983] 참조). 그러나, 2,4-디니트로페놀에 대한 EC50수치는 독성 측정 방법의 유형에 따라 상당히 다양하였다. 본 발명의 연구에서는 2,4-디니트로페놀에 대해 340㎖/ℓ의 EC50수치가 수득되었지만, 볼스카이 및 그라디는 호흡측정 방법으로 측정하여 110㎖/ℓ의 EC50수치를 보고하였고(볼스카이 및 그라디의 하기 문헌[1988] 참조), 스트로트만 및 에글사에르(1995)는 포토박테리움 포스포레움에 의한 생물발광 방법을 사용하였을 때는 29㎖/ℓ의 EC50수치를, 질화식 억제 방법을 사용하였을 때는 70㎖/ℓ의 수치를 보고하였다.
연속식 온-라인 독성 관측 시스템은 하이드로퀴논 농도의 증가에 따라서 빠르고 비례적인 반응을 나타내었다. 그러나, 대조군 챔버를 사용하는 광 반응의 정규화가 필요하다. 지속적인 광 출력이 수득되는 Shk 1 배양 조건을 사용하면 대조군 챔버가 필요하지 않다. 대조군 접촉용 용기를 사용하지 않고 실험군 챔버에 Shk 1 배양액을 공급하여 빛을 관측하는 것은 본 발명의 시스템을 더욱 간단하게 할 것이다.
광범위한 미생물에 리포터 서열을 삽입할 수 있기 때문에, 특정한 용도로 개질된 생물리포터를 개발할 수 있다. 3급 질소를 제거하는 시 직영의 폐수 처리 공장에서는 질화 미생물이 가장 민감한 목표 유기체일 수 있다. 단지 2급 아민만을 처리하는 산업 폐수 처리 공장 또는 시 직영 공장에서는, 이들 질화 미생물 개체군은 목표 대상이 아닐 수 있다. 이러한 경우에는, 비반응성 또는 휘발성 유기물에 대한 특정한 분해적 유기체를 보호하는 것이 더 중요할 수 있다. 그밖의 경우에는 독성 물질에 의한 플록 구조물의 손상에 기인한 핀 모양의 플록만이 중요할 수 있다. 독성을 관측하기 위한 효과적인 생물리포터의 디자인은 이러한 고려 사항 및 다른 고려 사항을 포함하여야 할 것이다.
공정 제어 반응
독성 쇼크 제어 전략의 궁극적인 목적은 단순히 독성 쇼크의 발생을 관측하는 것이 아니라 폐수 고형물 군집에 대한 손상을 최소화하는 것이다. 공정 제어 반응은 유입 폐수를 임시 보유조로 전향시킨 후 독성 물질의 과도한 농도를 피하기에 충분한 속도로 통기조에 점증적으로 첨가하는 단계, 독성 영향을 완충시키기 위해 복귀하는 폐수 고형물을 증가시키는 단계, 및 독성 물질의 높은 국소적 농도를 최소화하기 위해 유입수의 유동 패턴을 변화시키는 단계를 포함할 수 있다.
독성 유입물 부하량을 제어하기 위한 전형적인 공정 변형은 1) 유입수를 전향조로 전향시킨 후 통기조에 점증적으로 첨가하는 단계, 2) 통기조에서 혼합액내 현탁된 고형물(mixed liquor suspended solid, MLSS)을 증가시키기 위해 복귀하는 활성화된 슬러지의 유속을 증가시키는 단계, 및 3) 플러그(plug) 유동으로부터 완전히 혼합하기 위해 유동 방식을 변형시켜 유입수 유동 분포를 변화시키는 단계를 포함한다. 이러한 공정 제어 반응은 비독성 물질의 일시적인 높은 부하에 적합한 제어 방식과 동일한 반응이다. 상기 공정 제어 반응에 의해 먹이 대 질량의 비율(Food to Mass, F/M)을 일정하게 유지시켜 독성을 최소화한다. 공정 배치에서의 이러한 변화는 리포터 탐침을 사용하여 활성화될 수 있다.
산업 배출수 조성의 고유한 불확실성에 기인하여, "심층 방어식(defense in depth)" 접근법이 추천된다. 유입 폐수의 독성을 측정하고 전향조로 전향시키는데 소요되는 시간은 유속 및 탐침의 위치에 따라 수 초 내지 수 분이다. 이 경우, 신호 정지-특이적 탐침이 그의 빠른 반응 시간, 비-특이적 반응 특성 및 유입수내 잠재적으로 높은 화학 물질 농도에 기인하여 매우 효과적일 수 있다. 탐침은 유입수의 특성에 따라 유입수에 직접 위치하거나 또는 희석된 분할된 스트림에 위치할 수 있다. 또한 자동화된 인-라인(in-line)식 총 유기 탄소(TOC) 측정도 이 경우에 유용할 수 있다.
잠재적인 독성 유입수를 전향시키는 것은 더욱 정확하게 독성을 평가하여, 통기조내 MLSS를 증가시키거나 유입수 유동 분포를 변화시키기 위한 시간을 허용할 것이다. 더 정확한 독성 평가를 위해 화학 물질-특이적 탐침 또는 스트레스-특이적 탐침을 전향조에서 사용할 수 있다. 가능한 보유 시간에 따라, 배치 유형의 독성 시험 기법(마이크로톡스) 또는 종래의 분석적 기법(TOC, GC(기체 크로마토그래피))도 또한 적용할 수 있다. 전향조로부터 통기조로의 유입수 첨가 속도는 통기조에 위치한 신호 정지-특이적 탐침 또는 스트레스-특이적 탐침을 사용하여 제어될 수 있다.
결론적으로, 독성 반응은 복귀하는 활성화된 슬러지의 유속을 감소시키고, 정상 유입수 유동 방식을 회복시키고, 잠재적인 손상을 확인하기 위해 현미경 또는 분자학적으로 분석하여 활성화된 슬러지의 품질을 관측함으로써 MLSS를 정상적인 수준으로 복귀시킴을 포함할 수 있다.
독성 쇼크를 야기하기에 충분한 독성 수준과 관련하여 리포터 탐침에서 생성되는 반응을 초기에 보정하는 것이 필요하다. 이것은 공지되거나 일정한 화학 조성의 유입수를 사용하는 배치 시험 및 실험실 벤치 규모의 활성화된 슬러지에서 가장 효과적으로 이루어질 수 있다. 실물 규모의 수준에서는 추가의 조정 또는 변형이 필요할 수 있다.
| 하이드로퀴논 농도(㎎/ℓ) | 정규화된 생물발광의 감소 속도(분-1) |
| 10 | 0.011 |
| 100 | 0.013 |
| 1,000 | 0.015 |
| 10,000 | 0.064 |
실시예 2
산업 폐수 처리 공장에서 독성 관측 방법의 적용
I 단계
본 발명에 따른 리포터 구성물이 폐수 처리 공장의 활성화된 슬러지 미생물에 삽입될 것이다. 이들 구성물은 바람직하게는 검출가능한 신호로서 빛을 방출한다. 이것은 공여자 균주를 공장의 혼합액내 박테리아 또는 공장에서 분리된 선택된 박테리아와 직접적으로 교배시키고, 혼합액으로부터 유래하거나 공장 유입수에 기초한 배지상에서 수용자를 선택함으로써 이루어질 것이다. 다르게는, 상기 구성물이 활성화된 슬러지의 "전형적인" 미생물에 삽입될 수 있다. 이 공정은 시간에 따른 유입수 변화량 또는 슬러지 변화량에 따라 반복될 수 있다.
사용할 수 있는 2가지 유형의 리포터 박테리아는 신호 정지-특이적 탐침 및 스트레스-특이적 탐침이다. 신호 정지-특이적 탐침은 연속적으로 빛을 방출하는 미생물로 구성된다. 방출된 빛의 양은 세포의 대사 활성을 손상시키기에 충분한 독성 물질에 의한 손상에 따른 반응으로 감소한다. 이것은 마이크로톡스 분석법과 이론적으로 유사하지만, 공장의 활성화된 슬러지에 적절한 미생물에 기초하는 점이 다르다. 사전에 구성된 트랜스포손-암호화 광 방출 카세트를 함유하는 플라스미드를 사용하여 이러한 균주를 구성할 수 있다.
스트레스-특이적 탐침은 미생물의 스트레스에 대한 반응에 직접적으로 기초한다. 리포터 균주의 스트레스에 대한 반응의 활성화는 빛의 방출과 연관된다. 독성 물질-유도성 스트레스는 결과적으로 광 출력을 증가시킨다. 이들 균주는 실제로 세포가 손상을 입기 전에 빛이 방출되므로, 독성 물질의 영향을 나타내는 민감한 지시제이다. 이들 균주를 구성하기 위해 현재 상용중인 카세트는 algD 조절유전자 프로모터에 기초한다.
I 단계에서 구성된 선택된 리포터 박테리아를 이어서 II 단계에서 평가할 것이다. 선택의 1차 기준은 구성의 용이성, 배양가능성, 안정성 및 방출하는 빛의 강도이다.
II 단계
I 단계에서 구성된 리포터 박테리아는 16S rRNA의 서열을 부분적으로 분석하여 동정될 것이다. 균주 동정은 일리노이 리보소멀 데이타 베이스 및 진뱅크(GenBank)에 존재하는 서열과의 비교에 기초할 것이다. 16S rRNA 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드 탐침이 합성될 것이다. 목표 공장의 혼합액내 세포로부터 RNA를 추출하고, 리포터 균주가 활성화된 슬러지 미생물을 대표하는지를 결정하기 위해 올리고뉴클레오티드 탐침으로 조사할 것이다.
III 단계
목표 공장의 유입수에서 잠재적인 독성 물질에 대한 리포터 박테리아의 반응이 측정될 것이다. 다르게는, 공장으로부터 수득한 유입수 샘플이 사용될 것이다. 상이한 독성 물질 첨가량에 대한 리포터 균주의 반응이 호흡측정 방법으로 결정된 활성화된 슬러지의 활성과 비교될 것이다. 이들 실험은 일회 첨가하여 배치식으로 노출시켜 행해질 수 있다. 방출된 빛은 액체 광파이프 및 광전자 증배관을 사용하여 정량될 것이다. 독성 물질에 노출됨에 따른 반응에 의한 광 방출의 강도, 속도 및 경과 시간이 측정될 것이다. 이러한 실험의 결과는 활성화된 슬러지에서 생물학적 활성을 관측하기 위한 리포터 박테리아 균주의 효과적인 용도를 결정하는 타당한 기초자료를 제공할 수 있다.
온-라인 독성 관측 시스템
온-라인 시스템은 활성화된 슬러지에 대한 유입 폐수의 독성을 관측하기 위해 그리고 잠재적인 독성 폐기물 스트림의 첨가를 제어하기 위해 개발되어 왔다. 이 시스템은 활성화된 슬러지 유입물의 분리된 스트림을 생물발광 리포터 미생물과 접촉시키는 균등화조 또는 통기조를 사용한다. 상기 미생물은 터비도스태트에서 연속적으로 생산되고 접촉용 챔버로 공급되어 폐기물 스트림과 혼합된다. 생물발광 미생물이 합성 폐수와 접촉하는 대조군 챔버는 광 출력 비교를 위해 사용된다. 이것은 생물발광 균주의 대사 상태의 임의의 변화를 보정한다. 광 출력은 광전자 증배관 또는 포토다이오드에 결합된 액체 광파이프 또는 광섬유선에 의해 연속적으로 관측된다. 슬러지 품질에 미치는 악영향을 최소화하기 위해 유입 폐수를 전향시키거나 잠재적인 독성 물질 첨가를 제어하는 것은 광 출력 자료를 포함하는 적절한 제어 연산식을 통해 이루어질 수 있다.
생물발광 리포터 감지기는 본원에서 제공된 프로토콜에 따라 생물발광으로 가공된 "전형적인" 슬러지 미생물(예를 들어, Shk 1) 또는 특정 미생물(예를 들어, 주글레아 종, 섬유상 형태, C1 분해자 등)을 포함할 수 있다. 유입수내 독성 물질이 특정 미생물 개체군을 위하여 또는 특정 미생물 개체군에 반하여 특정 개체군을 선택할 수 있는지를 결정하기 위해, 다중 챔버를 사용하여 독성에 따른 상이한 중요 개체군을 독성과 비교할 수 있다.
활성화된 슬러지의 에너지 역학 제어기
생물발광 미생물의 광 출력은 에너지 의존적이다. 미생물의 에너지 공급물이 고갈되면 광 출력이 감소한다. 제어 전략은 활성화된 슬러지 유기체의 에너지 상태를 관측하고 그에 따라 탈커플링제 첨가량을 조정하기 위해 고안되어 왔다. 이것은 미생물 중에서 본 발명의 Shk 1 리포터 박테리아와 같은 생물발광 균주에 의한 광 출력을 적절한 제어 연산식을 사용하는 비례적분미분(proportional, integral, derivative; PID) 제어기가 결합된 광섬유 및 광전자 증배관을 사용하여 관측함으로써 이루어진다. 이러한 방식으로, 슬러지 미생물은 세포 수득량을 최소로 하면서 대사 활성 상태는 최적으로 유지된다.
PID 제어기는 측정된 신호(이 경우, 생물리포터의 빛 수준)의 변화에 대한 반응으로 신호 출력을 (예를 들어, 펌프의 속도 제어로) 조정하는 장치이다. 신호 출력의 변화를 계산하는 다양한 방식(예를 들어, P만, PI 또는 PID)을 사용할 수 있다. 이 경우에, 조절기는 활성화된 슬러지 통기조로 탈커플링제(예를 들어, 2,4-디니트로페놀)를 첨가하는 펌프의 속도를 조정할 것이다. 탈커플링제 및 활성화된 슬러지 시스템을 사용하는 이후의 통상적인 실험은 슬러지의 생산을 최소화하기 위해 적절한 광 방출 수준 및 적절한 조절기 방식의 선택사항을 결정할 것이다.
본 명세서는 그 전체에서 괄호안의 다양한 공개물을 참고로 하였다. 이들 공개물의 전체 인용문은 하기와 같다. 이들 공개물은 본 발명과 관련된 분야의 상황을 보다 구체적으로 기술하기 위해 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.
참고 문헌
1. 바티스토니, 파바(Fava, G.) 및 루엘로(Ruello, M. L.)의 문헌[Heavy metal shock load in activated sludge uptake and toxic effects, Water Res., 27(5), 821, 1993].
2. 벌라쥐, 베미스(Bemis, L. A.), 레이톤(Layton, A. C.), 세일러(Sayler, G. S.) 및 래리머(Larimer, F.)의 문헌[Comparative genetic organization of incompatibility group P degradative plasmids, J. Bacteriol., 172(12), 6818, 1990].
3. 듀보우(DuBow, M. S.) 및 구조(Guzzo, A.)의 문헌[Luminescent bacterial biosensors to detect toxic agents and elucidate molecular mechanisms of toxicity, Environ Can/et al Proc 15thInt Symp on Wastewater Treatment/4thWorkshop on Drinking Water, Montreal, PQ].
4. 두트카, 니홀름(Nyholm, N.) 및 피터슨(Petersen, J.)의 문헌[Comparison of several microbiological toxicity screening tests, Water Res., 17(10), 1363, 1983].
5. 힐데브란드, 팔레로니(Palleroni, N. J.), 헨더슨(Henderson, M.), 토쓰(Toth, J.) 및 존슨(Johnson, J. L.)의 문헌[Pseudomonas flavescens sp. nov, isolated from walnut blight cankers, Int. J. Syst. Bacteriol., 44, 410, 1994].
6. 젠킨스, 리차드(Richard, M. G.) 및 다이거(Daigger, G. T.)의 문헌[Manual on the Causes and Control of Activated Sludge Bulking and Foaming, Lewis Publshers, Inc., Chelsea, MI, 1993].
7. 킬로이 및 그레이의 문헌[The toxicity of four organic solvents commonly used in the pharmaceutical industry to activated sludge, Water Res., 26(7), 887, 1992].
8. 콩, 판롤레그헴(Vanrolleghem, P.), 빌렘스(Willems, P.) 및 페어스트라에테(Verstraete, W.)의 문헌[Simultaneous determination of inhibition kinetics of carbon oxidation and nitrification with a respirometer, Water Res., 30(4), 825, 1996].
9. 래인의 문헌[16S/23S rRNA sequencing. In E. Stackebrandt and M. Goodfellow(eds.), Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, John Wiley ＆ Sons, New York, NY, 1991].
10. 마이다크, 라센(Larsen, V.), 맥코이(McCaughey, M. J.), 오버벡크(Overbeck, R.), 올센(Olsen, G. J.), 포겔(Fogel, K.), 블란디(Blandy, J.) 및 워에스(Woese, C. R.)의 문헌[The ribosomal database project, Nucleic Acids Research, 22, 3485, 1994].
11. 노르베르크 및 몰린의 문헌[Toxicity of cadmium, cobalt, uranium and zinc to Zoogloea ramigera, Water Res., 17(10), 1333, 1983].
12. 패톤, 팔머(Palmer, G.), 카인드니스(Kindness, A.), 캠프벨(Campbell, C.), 글로버(Glover, L. A.) 및 킬함(Killham, K.)의 문헌[Use of luminescence-marked bacteria to assess copper bioavailability in malt whisky distillery effluent, Chemosphere, 31(5), 3217, 1995].
13. 스톰, 길(Geel, T. A.), 발라얀(Balayan, A. E.), 샤코바(Shachova, G. I.), 쿠즈네쵸브(Kuznetsov, A. M.) 및 메드베데바(Medvedeva, S. E.)의 문헌[Bioluminescent method in studying the complex effect of sewage components, Arch. Environ. Contam. Toxicol., 22, 203, 1992].
14. 스트로트만 및 에글사에르의 문헌[The toxicity of substituted phenols in the nitrification inhibition test and luminescent bacteria test, Ecotoxicol. Environ. Saf., 30, 269, 1995].
15. 볼스카이 및 그라디의 문헌[Toxicity of selected RCRA compounds to activated sludge microorganism, J. Water Pollut. Control Fed., 60(10), 1850, 1988].
16. 브로크(Brock, T. D.), 스미스(D. W. Smith) 및 마디간(M. T. Madigan)의 문헌[Biology of Microorganisms, Fourth Edition, Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, N. J. T-847, 1974].
17. 샘브루크 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989].
18. [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1-III, Eds. N. R. Krieg and J. G. Holt, Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 1984].
19. [Manual on the Causes and Control of Activated Sludge Bulking and Foaming, Lewis Publishers, Inc., Chelsea, MI, 1993].
Claims (38)
- 생물학적 슬러지(sludge)에 자연적으로 존재하며, 자연적으로 존재하는 박테리아에는 없는 리포터(reporter) 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 박테리아를 포함하는, 리포터 박테리아.
- 제 1 항에 있어서,자연적으로 존재하는 박테리아가 생물학적 슬러지로부터 수득되는 리포터 박테리아.
- 제 1 항에 있어서,리포터 박테리아가 시각적 신호를 생산하는 리포터 박테리아.
- 제 3 항에 있어서,시각적 신호가 빛인 리포터 박테리아.
- 제 1 항에 있어서,박테리아가 주글레아(Zoogloea) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 하이포마이크로비움(Hyphomicrobium) 종, 알칼리제네스(Alcaligenes) 종, 아시네토박터(Acinetobacter) 종 및 스파에로틸루스(Sphaerotilus) 종으로 구성된 군에서 선택되는 리포터 박테리아.
- 제 1 항에 있어서,리포터 단백질을 암호화하는 핵산이 lux 구성물인 리포터 박테리아.
- 제 1 항에 있어서,리포터 단백질이 항구적으로 발현되는 리포터 박테리아.
- 교배가 일어날 수 있는 조건하에서, 생물학적 슬러지의 박테리아에는 자연적으로 존재하지 않는 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한 공여자 박테리아와 생물학적 슬러지의 박테리아-함유 샘플을 접촉시킴을 포함하는 방법에 의해 수득되는, 생물발광 리포터 박테리아.
- 제 8 항에 있어서,생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 공여자 박테리아가 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)인 리포터 박테리아.
- 제 8 항에 있어서,생물학적 슬러지에 함유된 박테리아가 주글레아 종, 슈도모나스 종, 하이포마이크로비움 종, 알칼리제네스 종, 아시네토박터 종 및 스파에로틸루스 종으로 구성된 군에서 선택되는 리포터 박테리아.
- 제 8 항에 있어서,생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산이 lux 구성물인 리포터 박테리아.
- 생물학적 슬러지 샘플내 박테리아가 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 흡수할 수 있는 조건하에서, 생물학적 슬러지에 자연적으로 존재하는 분리된 박테리아에 이 박테리아에는 자연적으로 존재하지 않는 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한 핵산 구성물을 전달시킴을 포함하는 방법에 의해 수득되는, 생물발광 리포터 박테리아.
- 제 12 항에 있어서,생물학적 슬러지에 자연적으로 존재하는 박테리아가 주글레아 종, 슈도모나스 종, 하이포마이크로비움 종, 알칼리제네스 종, 아시네토박터 종 및 스파에로틸루스 종으로 구성된 군에서 선택되는 리포터 박테리아.
- 제 12 항에 있어서,생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산이 lux 구성물인 리포터 박테리아.
- 생물학적 슬러지 샘플내 박테리아가 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 흡수할 수 있는 조건하에서, 생물학적 슬러지의 박테리아에는 자연적으로 존재하지 않는 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 박테리아와 생물학적 슬러지의 박테리아-함유 샘플을 접촉시킴을 포함하는, 생물발광 리포터 박테리아의 제조 방법.
- 생물학적 슬러지에 자연적으로 존재하는 분리된 박테리아가 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 흡수할 수 있는 조건하에서, 상기 분리된 박테리아에는 자연적으로 존재하지 않는 생물발광 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한 핵산 구성물을 상기 분리된 박테리아에 전달시킴을 포함하는, 생물발광 리포터 박테리아의 제조 방법.
- (a) 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 리포터 박테리아와 유입 스트림을 접촉시키는 단계,(b) 상기 리포터 박테리아에 의한 리포터 단백질의 발현을 검출하는 단계, 및(c) 상기 리포터 단백질 발현의 감소를 독성의 존재와 상관시키는 단계를 포함하는, 폐수 처리 유입 스트림에서 독성의 존재를 검출하는 방법.
- 제 17 항에 있어서,리포터 단백질의 발현을 광 출력을 측정함으로써 검출하는 방법.
- (a) 유입 스트림으로부터의 유체 스트림을 접촉용 챔버로 전향시키는 단계,(b) (a) 단계의 유체를 함유한 상기 접촉용 챔버에 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 생물발광 리포터 박테리아를 첨가하는 단계, 및(c) 상기 접촉용 챔버로부터의 신호 출력을 검출하는 단계를 포함하고, 이때 신호 출력에서의 감소가 독성 상태를 나타내는, 폐수 유체의 유입 스트림을 갖는 생물학적 폐수 처리 설비에서 폐수 유체의 독성 상태를 검출하는 방법.
- 제 19 항에 있어서,신호가 생물발광 리포터 박테리아로부터의 광 출력이고, 광전자 증배관 및 포토다이오드(photodiode)로 구성된 군에서 선택된 광 측정 수단에 결합된, 액체 광파이프 및 광섬유관으로 구성된 군에서 선택된 광 이동 수단으로 상기 광 출력을 검출하는 방법.
- 제 19 항에 있어서,(d) 상기 유입 폐수 스트림으로부터 전향된 폐수 유체를 함유하지 않은 챔버에 (b) 단계의 리포터 박테리아를 첨가하는 단계,(e) (d) 단계의 챔버로부터의 신호 출력을 검출하는 단계, 및(f) (c) 단계에서 검출된 신호 출력을 (e) 단계에서 검출된 신호 출력과 비교하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 (e) 단계의 신호 출력과 비교한 (c) 단계의 신호 출력에서의 상대적인 감소가 폐수 유체의 독성 상태를 나타내는 방법.
- 제 21 항에 있어서,신호가 생물발광 리포터 박테리아로부터의 광 출력이고, 광전자 증배관 및 포토다이오드로 구성된 군에서 선택된 광 측정 수단에 결합된, 액체 광파이프 및 광섬유 케이블로 구성된 군에서 선택된 광 이동 수단으로 상기 광 출력을 검출하는 방법.
- (a) 공지된 첨가량의 산화적 인산화 탈커플링(decoupling)제를 함유한 생물학적 폐수 슬러지 샘플을 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 리포터 박테리아와 접촉시키는 단계,(b) 탈커플링제를 함유하지 않은 슬러지 샘플을 (a) 단계에서 언급된 리포터 박테리아와 접촉시키는 단계,(c) 상기 탈커플링제를 함유한 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 신호 출력을 검출하는 단계,(d) 상기 탈커플링제를 함유하지 않은 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 신호 출력을 검출하는 단계,(e) 상기 탈커플링제를 함유한 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 신호 출력을 상기 탈커플링제를 함유하지 않은 슬러지 샘플내 리포터 박테리아에 의한 신호 출력과 비교하는 단계, 및(f) (d) 단계의 리포터 박테리아에 의한 신호 출력과 비교한 (c) 단계의 리포터 박테리아에 의한 신호 출력의 감소를 탈커플링제의 작용과 상관시키는 단계를 포함하는, 공지된 첨가량의 탈커플링제의 효과를 결정할 수 있는, 생물학적 폐수 슬러지에 대한 공지된 첨가량의 산화적 인산화 탈커플링제의 효과를 결정하는 방법.
- 제 23 항에 있어서,신호가 생물발광 리포터 박테리아로부터의 광 출력이고, 광전자 증배관 및 포토다이오드로 구성된 군에서 선택된 광 측정 수단에 결합된, 액체 광파이프 및 광섬유관으로 구성된 군에서 선택된 광 이동 수단으로 상기 광 출력을 검출하는 방법.
- 제 23 항에 있어서,탈커플링제가 디니트로페놀, 디쿠마롤 및 카보닐시아나이드-m-클로로페닐하이드라존으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
- (a) 제 23 항에 따른 방법에 따라 폐수 슬러지 샘플에서 공지된 첨가량의 탈커플링제의 효과를 연속적으로 관측하는 단계, 및(b) 상기 리포터 박테리아에 의한 신호 출력을 선택된 수준으로 유지시키기 위해 탈커플링제의 첨가량을 연속적으로 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함하는, 생물학적 폐수 슬러지에서 에너지 역학을 연속적으로 조절하는 방법.
- (a) 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 생물발광 리포터 박테리아를 함유하는 제 1 챔버,(b) 유입 폐수의 일부를 상기 제 1 챔버로 전향시키기 위한 상기 제 1 챔버와 유체 연통적인 수단, 및(c) 상기 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 검출하기 위해 상기 제 1 챔버에 광도계를 근접시키는 수단을 포함하고, 이때 광 출력의 감소로 독성 상태를 검출하는, 생물학적 폐수 처리 설비에서 유입 폐수의 독성 상태를 검출하는 장치.
- 제 27 항에 있어서,광 출력을 검출하는 수단이 광 이동 수단 및 광 측정 수단을 포함하는 장치.
- 제 28 항에 있어서,광 이동 수단이 액체 광파이프 및 광섬유 케이블로 구성된 군에서 선택되는 장치.
- 제 28 항에 있어서,광 측정 수단이 광전자 증배관 및 포토다이오드로 구성된 군에서 선택되는 장치.
- 제 27 항에 있어서,배지내에 a)에서 언급된 생물발광 리포터 박테리아를 함유하는 제 2 챔버, 및 상기 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 검출하기 위해 상기 제 2 챔버에 광도계를 근접시키는 수단을 추가로 포함하는 장치.
- 제 31 항에 있어서,배지가 합성 폐수인 장치.
- (a) 생물학적 슬러지의 일부를 수용하기 위한, 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 생물발광 리포터 박테리아를 함유하는 제 1 챔버,(b) 탈커플링제가 첨가된 생물학적 슬러지의 일부를 상기 제 1 챔버로 전향시키기 위한 상기 제 1 챔버와 유체 연통적인 수단, 및(c) 상기 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 검출하기 위해 상기 제 1 챔버에 광도계를 근접시키는 수단을 포함하고, 이때 광 출력의 감소가 슬러지의 에너지 역학에 대한 탈커플링제의 효과와 상관되는, 생물학적 폐수 처리 설비에서 슬러지의 에너지 역학에 대한 탈커플링제의 효과를 관측하는 장치.
- 제 33 항에 있어서,광 출력을 검출하는 수단이 광 이동 수단 및 광 측정 수단을 포함하는 장치.
- 제 34 항에 있어서,광 이동 수단이 액체 광파이프 및 광섬유 케이블로 구성된 군에서 선택되는 장치.
- 제 34 항에 있어서,광 측정 수단이 광전자 증배관 및 포토다이오드로 구성된 군에서 선택되는 장치.
- 제 33 항에 있어서,(d) 배지내에 (a)에서 언급된 리포터 박테리아를 함유하는 제 2 챔버, 및(e) 상기 제 2 챔버에서 리포터 박테리아에 의한 광 출력을 검출하기 위해 상기 제 2 챔버에 광도계를 근접시키는 수단을 추가로 포함하는 장치.
- 제 37 항에 있어서,배지가 탈커플링제를 함유하지 않은 생물학적 슬러지인 장치.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4524897P | 1997-05-01 | 1997-05-01 | |
| US60/045,248 | 1997-05-01 | ||
| US8/944,934 | 1997-10-02 | ||
| US08/944,934 US6110661A (en) | 1997-05-01 | 1997-10-02 | Bioluminescent reporter bacterium |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20010020420A true KR20010020420A (ko) | 2001-03-15 |
Family
ID=26722545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019997010044A KR20010020420A (ko) | 1997-05-01 | 1998-04-29 | 생물발광 리포터 박테리아 및 생물학적 폐수 처리 시스템에서의 독성 관측 방법 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6110661A (ko) |
| EP (1) | EP0979299A1 (ko) |
| JP (1) | JP2002500510A (ko) |
| KR (1) | KR20010020420A (ko) |
| CN (1) | CN1254382A (ko) |
| AU (1) | AU7264698A (ko) |
| BR (1) | BR9809325A (ko) |
| CA (1) | CA2287940A1 (ko) |
| ID (1) | ID22801A (ko) |
| WO (1) | WO1998049337A1 (ko) |
| ZA (1) | ZA983668B (ko) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100353617B1 (ko) * | 1999-06-21 | 2002-09-26 | 광주과학기술원 | 발광성 미생물을 이용한 독성물질의 분해도 및 처리공정효율평가 방법 |
| KR100392065B1 (ko) * | 2000-06-21 | 2003-08-19 | 자연엔지니어링 주식회사 | 고정화 발광미생물 담체의 제조방법 및 이를 이용한수질검사 방법 |
| US7056728B2 (en) * | 2000-07-06 | 2006-06-06 | Xenogen Corporation | Compositions and methods for use thereof in modifying the genomes of microorganisms |
| WO2002085791A2 (en) | 2001-04-23 | 2002-10-31 | Monsanto Technology Llc | Pcr-based monitoring in wastewater biotreatment systems |
| EP1399581B1 (en) * | 2001-06-29 | 2007-07-11 | Vivactiss BVBA | Detection of microbiological contaminants in samples of non-living material |
| US7186565B2 (en) | 2001-07-20 | 2007-03-06 | Kristin Schirmer | Sampling and toxicity monitoring device and method |
| KR100464068B1 (ko) * | 2002-05-16 | 2005-01-03 | 학교법인 동서학원 | 페놀계 화합물 검출용 바이오센서 및 그 제조방법 |
| KR100464067B1 (ko) * | 2002-05-16 | 2005-01-03 | 학교법인 동서학원 | 살리실산 검출용 바이오센서 및 그 제조방법 |
| US20050074784A1 (en) * | 2003-10-07 | 2005-04-07 | Tuan Vo-Dinh | Integrated biochip with continuous sampling and processing (CSP) system |
| JP4626286B2 (ja) * | 2004-12-09 | 2011-02-02 | 国立大学法人豊橋技術科学大学 | 余剰汚泥の発生抑制方法 |
| EG26405A (en) * | 2005-04-03 | 2013-10-21 | ReQ®R«RfQzRdRdQxQyQÝQxQ¿QxRdQ¾RdReR«QzRhQxRdQ¡Q¼QyR«RbQxQ¡QxRdQ¡RcRfRhRdRhQÐR«Qz | Genetically engineered biochemical reagent to monitor toxicity of chemical contaminants in liquids |
| CN101113985B (zh) * | 2006-07-27 | 2010-12-15 | 中国科学院电子学研究所 | 一种卫生状况现场快速检测装置及检测方法 |
| GB2429283B8 (en) * | 2006-08-01 | 2013-04-10 | Univ Hertfordshire Higher Education Corp | Preservative efficacy testing |
| US7798090B2 (en) * | 2007-01-05 | 2010-09-21 | Thomas Angell Hatfield | Rescue and locational determination equipment |
| WO2008089278A2 (en) * | 2007-01-17 | 2008-07-24 | The Regents Of The University Of California | Biologically derived robots and their use |
| WO2009036070A1 (en) * | 2007-09-10 | 2009-03-19 | University Of Kentucky Research Foundation | Spores for the stabilization and on-site application of bacterial whole-cell biosensing systems |
| US8227186B1 (en) | 2008-07-25 | 2012-07-24 | The Ohio State University Research Foundation | Methods and compositions relating to bioluminescent microorganisms |
| CN102109512A (zh) * | 2011-01-29 | 2011-06-29 | 佛山分析仪有限公司 | 一种检测水质毒性的装置及方法 |
| CN103760315A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-04-30 | 广州市污水治理有限责任公司 | 一种城镇生活污水处理厂来水毒性物质的鉴别方法 |
| CN104820082A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-08-05 | 中国神华能源股份有限公司 | 废水毒性检测系统及废水毒性检测方法 |
| US20220155228A1 (en) * | 2020-11-17 | 2022-05-19 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Multi compartment sensing unit comprising biosensors |
| KR102653250B1 (ko) * | 2023-10-13 | 2024-04-01 | 동문이엔티(주) | 발광박테리아를 이용한 생태독성감시장치 및 그를 이용한 생태독성감시방법 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4563331A (en) * | 1983-11-21 | 1986-01-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | System for measuring bioluminescence flash kinetics |
| DE3833628A1 (de) * | 1988-10-03 | 1990-04-12 | Genlux Forschungsgesellschaft | Verfahren zum nachweis und zur identifikation toxischer substanzen mit hilfe klonierter mikroorganismen |
| GB9119382D0 (en) * | 1991-09-11 | 1991-10-23 | Knight Scient Ltd | Apparatus for monitoring liquids |
| DE4333971A1 (de) * | 1993-10-05 | 1995-04-06 | Steffen Dipl Ing Rothe | Verfahren und Vorrichtung zur Optimierung von technischen und stofflichen Parametern zur Leistungsbeeinflussung des Stoffwechsels von Mikroorganismen oder mikrobiellen Mischpopulationen |
| DE4431964A1 (de) * | 1994-09-08 | 1996-03-14 | Bayer Ag | Lumineszente nitrifizierende Mikroorganismen |
| EP0817965A1 (en) * | 1995-03-31 | 1998-01-14 | Novo Nordisk A/S | Method for identifying biologically active substances by their effect on living cells |
-
1997
- 1997-10-02 US US08/944,934 patent/US6110661A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-04-29 CN CN98804721A patent/CN1254382A/zh active Pending
- 1998-04-29 AU AU72646/98A patent/AU7264698A/en not_active Abandoned
- 1998-04-29 EP EP98919974A patent/EP0979299A1/en not_active Withdrawn
- 1998-04-29 KR KR1019997010044A patent/KR20010020420A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-04-29 JP JP54731698A patent/JP2002500510A/ja active Pending
- 1998-04-29 BR BR9809325-8A patent/BR9809325A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-04-29 WO PCT/US1998/008598 patent/WO1998049337A1/en not_active Application Discontinuation
- 1998-04-29 CA CA002287940A patent/CA2287940A1/en not_active Abandoned
- 1998-04-30 ZA ZA983668A patent/ZA983668B/xx unknown
-
1999
- 1999-04-29 ID IDW991229A patent/ID22801A/id unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA983668B (en) | 1999-01-08 |
| JP2002500510A (ja) | 2002-01-08 |
| US6110661A (en) | 2000-08-29 |
| WO1998049337A1 (en) | 1998-11-05 |
| BR9809325A (pt) | 2000-07-04 |
| AU7264698A (en) | 1998-11-24 |
| CN1254382A (zh) | 2000-05-24 |
| CA2287940A1 (en) | 1998-11-05 |
| ID22801A (id) | 1999-12-09 |
| EP0979299A1 (en) | 2000-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6110661A (en) | Bioluminescent reporter bacterium | |
| Cho et al. | A novel continuous toxicity test system using a luminously modified freshwater bacterium | |
| McCLURE et al. | Survival and catabolic activity of natural and genetically engineered bacteria in a laboratory-scale activated-sludge unit | |
| Kelly et al. | Bioluminescent reporter bacterium for toxicity monitoring in biological wastewater treatment systems | |
| Xiao et al. | Toxicity measurement in biological wastewater treatment processes: a review | |
| Boon et al. | Bioaugmentation as a tool to protect the structure and function of an activated-sludge microbial community against a 3-chloroaniline shock load | |
| Brinch et al. | Method for spiking soil samples with organic compounds | |
| Prosser | Molecular marker systems for detection of genetically engineered micro-organisms in the environment | |
| Girotti et al. | Monitoring of environmental pollutants by bioluminescent bacteria | |
| Jansson | Tracking genetically engineered microorganisms in nature | |
| Ripp et al. | Bioluminescent most-probable-number monitoring of a genetically engineered bacterium during a long-term contained field release | |
| Lajoie et al. | A toxicity testing protocol using a bioluminescent reporter bacterium from activated sludge | |
| Hurtado-Gallego et al. | Two novel cyanobacterial bioluminescent whole-cell bioreporters based on superoxide dismutases MnSod and FeSod to detect superoxide anion | |
| Wiles et al. | Development of bespoke bioluminescent reporters with the potential for in situ deployment within a phenolic-remediating wastewater treatment system | |
| Yoshino et al. | Identifying prokaryotes and eukaryotes disintegrated by a high-pressure jet device for excess activated sludge reduction | |
| CN101605888A (zh) | 使用转化的贝利不动杆菌adp1作为生物传感器检测甲苯和二甲苯的方法 | |
| Errampalli et al. | Bioremediation: a perspective | |
| Morkus et al. | A rapid assay to assess nitrification inhibition using a panel of bacterial strains and partial least squares modeling | |
| Leta et al. | Enhancing biological nitrogen removal from tannery effluent by using the efficient Brachymonas denitrificans in pilot plant operations | |
| Kilroy et al. | Treatability, toxicity and biodegradability test methods | |
| US8048644B1 (en) | Biological indicator for monitoring the transport of micro-organisms in the environment | |
| Diels et al. | Use of DNA probes and plasmid capture in a search for new interesting environmental genes | |
| Sanseverino et al. | Applications of Environmental Biotechnology to Bioremediation | |
| Philp et al. | Wastewater toxicity assessment by whole cell biosensor | |
| Sørensen et al. | Reporter genes in bacterial inoculants can monitor life conditions and functions in soil |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |