KR100392065B1 - 고정화 발광미생물 담체의 제조방법 및 이를 이용한수질검사 방법 - Google Patents

고정화 발광미생물 담체의 제조방법 및 이를 이용한수질검사 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고정화된 발광미생물을 이용하여 수중의 중금속 및 유기용매 등에 의한 수질의 오염도를 검사하는 방법에 관한 것으로 고정화 발광미생물 담체를 생물반응기에 주입하는 단계와; 상기의 생물반응기에 배양액과 산소를 공급하는 단계와; 상기의 생물반응기 내부의 담체를 교반하는 단계와; 상기의 생물반응기로부터 연속배출되는 발광미생물을 포함한 배양액을 수질시료와 혼합한 후 발광량을 측정하는 단계로 구성되는 수질검사방법을 제공함으로써 상수원으로 유입되는 폐수를 조기에 검출하여 수계의 오염을 미연에 방지할 수 있으며 또한 폐수처리장에서 방출수의 처리정도를 검사하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

고정화 발광미생물 담체를 이용한 수질검사방법{Water Toxicity Analysis Method Using Immobilized Bioluminescent Bacteria}
본 발명은 고정화 발광미생물을 이용한 수질검사방법에 관한 것으로써, 특히 고정화된 포토박테리엄 포스포럼(Photobacterium phosphoreum)을 이용하여 수중의 중금속 및 유기용매 등에 의한 수질의 오염도를 검사하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 발광미생물을 이용한 수질중의 독성물질에 의한 오염도 측정은발광미생물의 발광량이 독성물질의 양에 따라 감소하는 것을 이용하여 측정된다. 발광미생물이 빛을 내는 기작은 미생물의 호흡작용에 의해서 발생하기 때문에 독성물질에 매우 민감한 특징을 나타내며 독성물질의 농도가 증가함에 비례하여 빛이 감소하기 때문에 독성물질의 정량도 가능하다.
수계의 독성물질 검사에 사용되는 발광미생물중에서 가장 대표적인 것은 포토박테리엄 포스포럼으로서 이 포토박테리엄 포스포럼을 이용한 종래의 방법은 먼저 동결건조된 미생물을 특정 용액으로 활성화하여 측정하려고 하는 시료용액과 혼합시킨 후 발광량의 감소를 측정하는 방법이다.
구체적인 예로 미국특허 제US5,565,360호에 마이크로톡스 시스템( MicrotoxTMsystem, 미국 Azur Env.사)에 관하여 개시되어 있는 바 이 시스템은 조작이 용이하여 전세계적으로 많이 쓰이고 있다. 그러나 이 시스템의 가장 큰 문제점은 사용되는 장비와 동결건조된 미생물 및 사용되는 시약이 매우 고가라는 점과 숙련된 작업자가 필요하다는 것이다.
또한 종래의 포토박테리엄 포스포럼을 이용한 수계의 독성물질의 검사방법으로 생물반응기를 이용한 방법이 있다. 이 방법은 미생물을 연속 배양하면서 배양기로부터 유출된 미생물을 포함하는 용액을 폐수와 혼합하여 일정시간동안 발광량의 감소를 측정하는 것으로 구체적인 예로 5L와 14L의 혼탁배양기를 이용하여 발광미생물인 포토박테리엄 포스포럼을 배양한 후 발광미생물이 주위 환경요인에 의하여 발광량이 감소하는 것을 측정한다. ( Sameer P. Rupani, M. B. G., Konstantin B.Konstantinov, and Prasad S. Dhurjati (1996). Characterization of the Stress Response of a Bioluminescent Biological Sensor in Batch and Continuous Cultures. Biotech. Prog. 12: 387-392.)
그러나 상기의 방법으로는 생물반응기를 연속적으로 오염없이 장기간 배양하는 것이 매우 어렵다. 발광미생물의 특성상 연속배양의 경우 약 10일 정도 배양하면 빛을 내지 않는 변이주가 발생하는 특징을 가지고 있기 때문에 상기의 방법을 이용하였을 경우 장기간, 무인시스템을 유지하기가 힘들며 측정현장에서 발생하기 쉬운 다른 미생물에 의한 오염때문에 미생물의 연속배양을 수행하기 어려운 문제점이 있다.
본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 제안된 것으로써, 본 발명의 목적은 고정화된 발광미생물 담체를 배양하는 생물 반응기를 이용하여 수중 독성물질을 연속 검사하는 방법중에 변이주의 발생을 억제시키고 미생물의 오염을 방지하여 수질을 연속적으로 장기간 감시할 수 있는 무인시스템의 수질 검사방법을 제공한다.
도 1은 고정화된 알지네이트 담체로부터 외부로 균주가 유출되는 과정의 개략도.
도 2는 고정화된 발광미생물을 이용한 반응기의 개략도.
도 3(A)는 실시예 1의 배양일 1일이 경과한 고정화된 발광미생물 담체 내부를 주사현미경을 이용하여 측정한 사진.
도 3(B)는 실시예 1의 배양일 32일이 경과한 고정화된 발광미생물 담체 내부를 주사현미경을 이용하여 측정한 사진.
상기한 목적을 달성하기 위해 본 발명은 고정화 발광미생물 담체를 생물반응기에 주입하는 단계와; 상기의 생물반응기에 배양액과 산소를 공급하는 단계와; 상기의 생물반응기 내부의 담체를 교반하는 단계와; 상기의 생물반응기로부터 연속배출되는 발광미생물을 포함한 배양액을 수질시료와 혼합한 후 발광량을 측정하는 단계를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 고정화 발광미생물를 이용한 수질검사방법을 제공한다.
상기에서 고정화 발광미생물 담체는, 바람직하게, 미리 배양한 발광미생물 포토박테리엄 포스포럼을 원심분리하여 회수하는 단계와; 상기의 회수된 발광미생물을 알지네이트 용액과 혼합시키는 단계와; 상기의 혼합된 용액을 스트론튬 용액에 적하하여 가교시키는 단계와; 상기의 가교된 용액을 경화시키는 단계를 통하여 제조된 것으로 한다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 고정화 발생미생물을 이용한 수질검사방법에 대해서 살펴보면 다음과 같다.
도 1은 고정화된 알지네이트 담체로부터 외부로 균주가 유출되는 과정의 개략도로서 고정화된 포토박테리움 포스포럼 박테리아를 이용한 경우에 이 박테리아는 고정화 담체내부에서 생장하게 되고, 균체수가 증가하면서 서서히 담체밖으로 유출되게 된다. 고정화된 담체는 외부의 환경으로부터 포토박테리움 포스포럼 박테리아를 보호하는 역할을 하게 되고, 빠른 유속으로 반응기를 운전하더라도 균체는 담체내부에 존재하기 때문에 유실을 방지할 수 있게 한다. 따라서 비록 주위 환경에 개방된 반응기 일지라도 빠른 유속으로 운전을 하게되면 오염된 균주는 바로 유출이 되며, 목적하는 발광미생물은 담체로부터 계속 공급되기 때문에 오염의 문제없이 반응기를 운전할 수 있다.
기존의 교반식 반응기를 이용하여 연속배양을 하는 경우 약 10일 정도 반응기를 운전하게 되면 빛을 내지 않는 변이주가 발생하게 되는데, 이 변이주는 정상균에 비하여 성장속도가 빠른 특징을 가지고 있다. 따라서 일단 교반식 반응기 내부에 빛을 내지 않는 변이주가 발생하게 되면 변이주와 빛을 내는 균주와의 성장속도의 차이에 의하여 반응기 내부의 균총이 금방 변이주로 바뀌게 된다.
그러나 고정화 담체로부터 유출된 발광미생물을 이용하는 경우에 비록 담체 내부에 변이주가 발생하더라도 내부의 공간적인 제약에 의하여 주변의 다른 균주에 큰 영향을 주지 않기 때문에 그 변이주의 증가를 크게 억제시킬 수 있다.
고정화 담체의 제조방법은 다음과 같다.
포토박테리움 포스포럼(photbacterium phosphoreum)KCTC2858는 한국종균협회에서 구입하였으며 미리 18℃에서 16시간 동안 배양한 포토박테리움 포스포럼 박테리아를 원심분리를 통하여 회수를 한다. 이 발광미생물의 고정화를 위한 담체의 제조에 사용된 재료는 알지네이트 용액과 스트론튬 클로라이드 (SrCl2·6H2O)용액이다. 먼저 알지네이트 용액의 제조 방법은 멸균된 증류수 100중량부에 NaCl 2중량부가 포함되어 있는 용액에 쇼듐 알지네이트(sodium alginate) 2.4중량부를 첨가하여 제조하고, 스트론튬 클로라이드 용액은 멸균된 증류수 100 중량부에 NaCl 2중량부가 포함되어 있는 용액에 8.2 중량부의 스트론튬 클로라이드용액을 첨가하여 제조한다. 고정화 담체를 제조하기 위하여 미리 배양하여 회수한 발광미생물을 알지네이트 용액과 섞어주어 알지네이트-세포 용액을 제조하고, 이 용액을 스트론튬 클로라이드 용액에 한방울씩 첨가하여 제조한다. 이 과정은 알지네이트가 2가의 양이온인 스트론튬과 반응하여 가교를 형성함을 이용한 방법으로 알지네이트는 일반적으로 2가의 양이온과 반응하여 굳는 성질을 갖고 있다. 제조된 담체는 내부까지 스트론튬과 알지네이트가 완전히 반응하도록 30분가량 경화과정을 거친다.
도 2는 고정화된 발광미생물을 이용한 반응기의 개략도로서 상기의 완전히 경화된 담체를 도 2와 같이 구성된 생물반응기에 넣어준다. 이 반응기에 물 100 중량부에 2.8중량부의 NaCl, 0.16중량부의 CaCl2·2H2O, 0.48중량부의 MgCl2·6H2O 그리고 0.3중량부의 이스트 추출액(yeast extract)이 포함되어 있는 배양액을 공급하고 산소는 반응기 하단부로부터 공급한다. 반응기 내부의 교반은 반응기 하단부로부터 유입된 공기를 이용하고 반응기의 희석속도는 펌프를 이용하여 1.2/시간로 유지하도록 하여 다른 균으로부터 오염을 방지한다. 그리고 반응기 내부의 담체밖으로 유출된 균체를 이용하여 수질의 독성물질을 검출한다.
펌프를 이용하여 반응기 내부의 발광미생물이 포함된 배양액을 반응기 외부로 배출시키고, 배출된 용액을 소형측정기에 첨가하여 준다. 이 소형측정기는 산소공급 부분과 발광량을 감지할 수 있는 부분으로 구성되어 있으며 광섬유를 통하여 발광량 측정장치와 연결되어 있다. 반응기 내부의 교반은 소형 자석막대를 이용한다. 수질의 독성검사는 이 소형측정기에 중금속등의 독성물질이 포함된 시료용액을 첨가하여 준 후 매 2분 마다 소형측정기 내부의 발광량을 연속 측정하여 수질의 독성을 측정한다.
본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같은 바, 본 발명이실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1 >
고정화 발광미생물 담체 내부에서의 균체의 농도
미리 18℃에서 16시간 동안 배양한 포토박테리움 포스포럼(photbactrium phosphoreum) KCTC2852를 원심분리를 통하여 회수를 한 다음 물 100중량부에 NaCl 2중량부, 알지네이트 2.4중량부로 구성되어 있는 멸균된 용액에 첨가하여 준 후, 이 용액을 물 100중량부에 NaCl 2중량부 그리고 8.2 중량부의 스트론튬 용액에 한방울씩 첨가하여 제조한다. 제조된 담체는 내부까지 완전히 스트론튬과 알지네이트가 반응하도록 30분가량 경화과정을 거친다.
250mL 삼각플라스크에서 발광미생물 생장배지 (NaCl 2.8%, CaCl2·2H2O 0.16%, MgCl2·6H2O 0.48%, yeast extract 0.3% )에서 배양하였다. 배양일수에 따라담체 내부에서 균체의 양이 증가하는 것을 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였으며 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 (A)는 배양일 1일의 경우이고 (B)는 배양일 32일의 경우이다.
고정화 담체 내부에서의 균체의 농도 증가를 알아보기 위하여 헥사소듐메타포스페이트(Na6O18P6)를 이용하여 담체를 녹인 후 분광광도계를 이용하여 파장 600nm에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과를 표 1에 나타내었다.
도 3의 주사현미경사진에서 보는 바와 같이 담체 내부의 공간은 세포의 이동이 자유로울 정도로 매우 넓은 것을 알 수 있으며 표 1의 배양일수에 따라 흡광도가 증가하는 것으로 부터 30일이 경과하는 동안 세포의 농도는 꾸준히 증가함을 알 수 있다.
배양일수 0일 1일 10일 18일 26일 30일 31일
흡광도(600nm) 0.198 0.223 0.298 0.396 0.503 0.651 0.717
< 실시예 2 >
고정화 발광미생물 담체 외부로 유출되는 균체의 농도
상기의 실시예 1에서 제조한 발광미생물 담체의 외부로 유출되는 균체의 양을 조사하기 위하여 시간별로 균체의 농도 및 발광량을 각각 분광광도계와 발광량측정기(RLU, Relative Light Unit)를 이용하여 조사하였다. 담체 외부에 붙어있는 균체를 제거하기 위하여 충분히 세척을 한 후 삼각플라스크에 첨가하였다. 표 2에서 보는 바와 같이 초기에 균체의 농도가 낮을 경우 낮은 수준의 발광량을 보여주다가 균체가 대수증식기에 도달했을 때 발광량이 급격하게 증가하는 것을 알 수 있다.
시간 0시간 1시간 2시간 3시간 4시간 5시간 6시간 7시간 8시간 9시간 10시간 11시간 12시간
흡광도(600nm) 0.008 0.012 0.016 0.027 0.038 0.072 0.141 0.283 0.501 0.918 1.55 1.82 1.92
발광량(RLU) 37.52 28.72 14.74 12.65 16.76 11.17 13.68 25.35 291.6 6015 21000 20110 17120
< 실시예 3 >
고정화된 발광미생물의 연속배양
고정화된 발광미생물을 반응기를 이용하여 연속배양을 하였다. 초기에 발광량과 균체량을 측정하였다. 또한 외부로 부터의 오염의 영향이 없음을 확인하기 위하여 모든 표본의 선택은 개방된 상태에서 수행하였다. 표 3에 배양시간에 따른 발광량 및 균체량을 나타내었으며 균체량을 흡광도로서 표시하였다. 또한 표 4에 배양시간에 따른 변이주의 발생비율을 나타내었다. 변이주의 발생은 연속 배양하면서 반응기로부터 배출된 배지를 발광미생물 생장배지와 같은 조성의 한천배지에 시간대 별로 도말 한 후 18℃에서 3일간 배양한다. 그리고 암실에서 배양한 균주 중 발광하는 균주와 발광하지 않는 균주의 콜로니(colony) 숫자를 확인한다.
배양시간 2일 10일 13일 21일 24일 30일
발광량(RUL) 69650 52220 22980 10670 37350 6876
흡광도(600nm) 0.102 0.527 0.583 0.68 0.573 0.552
배양시간(일) 0 3 5 7 17
변이주 발생 비율(%) 0 0 0 2.63 24.64
< 비교예 1 >
발광 미생물의 현탁배양
발광미생물을 2.5L 반응기에서 연속배양하였다. 배양액은 발광미생물 생장배지 (NaCl 2.8%, CaCl2·2H2O 0.16%, MgCl2·6H2O 0.48%, yeast extract 0.3% )를 이용하였고, 배양 중 희석속도는 0.1/시간을 유지하도록 하였다. 변이주의 발생을 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였으며 그 결과를 표 5에 배양시간에 따른 변이주의 발생비율로 나타내었다.
배양시간(일) 0 3 6 7 8 9
변이주 발생 비율(%) 0 0 0 0.6 38.1 100
표 3-5의 결과로 부터 실시예 3에서 측정한 발광량과 균체량은 비례하여 증감하는 것을 알 수 있으며, 5일에서 27일까지 일정한 수준을 유지하는 것을 관찰할 수 있다. 표 5에 나타난 바와 같이 비교예 1의 현탁배양의 경우 일반적으로 약 8일 경이면 빛을 내지 않는 변이주가 발생하여 발광량이 급격하게 감소하는 것을 관찰 할 수 있는 반면 고정화된 담체로부터 유출된 발광미생물을 이용한 경우 약 30일까지는 수질의 독성을 측정할 수 있는 정도의 발광량을 유지하는 것을 관찰할 수 있고, 30일까지 배양하는 동안 다른 미생물에 의한 오염은 관찰 할 수 없었다.
< 실시예 4>
고정화된 담체로부터 유출된 균체를 이용한 독성검사
유출된 균체를 이용하여 중금속중 독성이 높은 수은에 대하여 독성검사를 수행하였다. 수은은 0.01ppm의 농도로 첨가되었고 담체내에 충분한 세포가 고정화 되어 있는 경우 재현성을 알아보기 위하여 연속배양 중 21일, 22일에 독성검사를 하였으며 그 결과를 표 6에 나타내었다. 표 6의 결과로부터 발광량은 2분 이후부터 거의 유사한 기울기로 감소한다는 것을 알 수 있다. 수은을 1ppm의 농도로 첨가하여 독성검사를 하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었으며 표 7의 결과로 부터 수은이 첨가 된 후 4분이 경과하게 되면 거의 모든 발광미생물이 빛을 잃어버림을 알 수 있다. 카드뮴을 첨가하여 독성검사를 한 결과를 표 8에 나타내었으며 표 8의 결과로부터 카드뮴에 대하여 매우 민감하게 발광량이 감소하는 것을 볼 수 있다. 카드뮴 10ppm의 농도로 첨가된 경우 6분 가량이 경과하였을 경우 초기 발광량의 약 50%가 감소하는 것을 관찰할 수 있다.
배양시간(분) 0 2 4 6 8 10 12
발광량(% RLU) 21일 100 141.5 109.2 87.5 73.7 63.7 55.1
22일 100 103.2 77.5 56.2 43.4 34.6 27.7
배양시간(분) 0 2 4 6 8 10 12
발광량(% RLU) 21일 100 87.5 0.0568 0.0018 0.0013 0.0017 0.0018
22일 100 129.7 0.1145 0.0255 0.0206 0.0205 0.0194
배양시간(분) 0 2 4 6 8 10 12
발광량(% RLU) 100 96 64.2 50.1 40.4 31.5 24.5
상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 고정화 발광미생물를 이용한 수질의 독성물질 검사방법은 상수원으로 유입되는 폐수를 조기에 검출하여 상수원을 보호하는 목적으로 사용할 수 있으며, 또한 폐수처리장에서 방출수의 처리정도를 검사하는데 적용할 수 있다. 예를 들어 상수원에 인접한 공장에서 배출되는 중금속, 유기용매등의 독성물질과 폐광산으로부터 유출되는 중금속, 생활폐수 및 가축폐수로 인한 수질의 오염을 미연에 방지하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (2)

  1. 고정화 발광미생물 담체를 생물반응기에 주입하는 단계와; 상기의 생물반응기에 배양액과 산소를 공급하는 단계와; 상기의 생물반응기 내부의 담체를 교반하는 단계와; 상기의 생물반응기로부터 연속배출되는 발광미생물을 포함한 배양액을 수질시료와 혼합한 후 발광량을 측정하는 단계를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 고정화 발광미생물를 이용한 수질검사방법.
  2. 삭제
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