KR100300445B1 - 발광미생물을이용한수계의독성물질연속감시방법및이를위한연속감시용키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 독성물질에 의한 연속배양된 발광미생물의 발광도변화를 측정하여 수계의 독성물질 연속감시방법 및 이를 위한 키트에 관한 것으로서, 물고기나 물벼룩을 이용한 종래의 생물학적 방법에 의한 수계 독성물질의 측정 및 감시방법에 비해 본발명은 정확성, 신속성, 신뢰성이 있으며 유지비가 적고 관리가 용이하다는 장점이 있다.

Description

발광미생물을 이용한 수계의 독성물질 연속감시방법 및 이를 위한 연속감시용 키트
본 발명은 발광미생물을 사용한 수계의 독성물질 연속감시방법 및 이를 위한 연속감시용 키트에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 독성물질에 의한 연속배양 발광미생물의 발광도 변화를 측정하여 수계의 독성물질을 연속감시하는 방법 및 이를 위한 연속감시용 키트에 관한 것이다. 이는 원자력 발전소의 방사성물질에 대한 수계영향 및 군사용 생화학적 무기의 수계영향 및 특히, 수질오염 측정 등에 유용하다.
수질오염 감시망은 호수 및 하천 수질의 유지와 회복을 위한 효율적인 수질감시 및 수질관리 체계를 수립하기 위해 구축되며, 크게 자동감시망과 수동감시망으로 나눌 수 있다. 수동 감시망은 대상수역에서 일정한 기간별로 정해진 위치에서 시료를 채취하여 실험실에서 분석하는 방법을 의미하며, 자동감시망은 연속적으로 채취된 시료가 측정기기로 옮겨져 자동적으로 분석된 후 그 측정치가 정보처리장치에 의해 처리되는 방법을 말한다. 수질오염 자동감시망은 다수의 항목에 관해 자동적으로 연속적인 측정치를 얻을수 있기 때문에 대상 수역의 돌발적인 수질오염에 대해 신속하고 합리적인 대응을 하는데 큰 도움이 된다. 수질오염 감시를 위한 수질자동 측정방법은 일관성, 신속성, 연속성 있는 측정으로 수질사고등에 대처할 수 있는 자료를 축적할 수 있게 하고 또한 수자원의 수질관리효과를 높이기 위해 필요한 대안을 도출해내는데 현실적인 기본자료를 제공하게 한다.
수질독성을 모니터링하는 종래의 방법으로는 화학적 수질 독성 모니터링과 생물학적 수질독성 모니터링이 있다. 화학적 수질독성 모니터링은 수계에서 발생가능한 수많은 물질들에 의해 제한을 받으며 몇몇 물질만을 판명할 수 있으며 극히 소수의 물질만이 정량적으로 분석된다. 외와같은 화학적 분석방법에는 상당히 고가의 기자재와 숙련된 관련기술의 습득이 필요하다. 또한 화학적 조건이 지속적으로 변화하는 흐르는 물은 급속한 간섭을 필요로 하는 상황에서 발생할 수 있는 각각의 물 형태의 기능과 사용에 의하므로 만족성이 더욱 떨어지는 문제점이 있다.
화학적 수질독성 모니터링을 보완하는 시스템의 개발을 위해 생물학적 수질독성 모니터링의 개발이 계속되어 왔다. 종래의 대표적인 수질독성 모니터링 방법은 물고기를 이용한 수질독성 모니터링 방법과 물벼룩을 이용한 수질 독성 모니터링 방법이 있다.
물고기를 이용한 생물 모니터링 장치는 물고기의 물의 흐름을 거슬러 올라가는 성질 즉 역유성을 이용하여 측정하는 장치이다. 유해독성물질이 물유입구(31)를 통하여 유입되면 물고기가 피해를 입게되고 유영성이 떨어지게 된다. 이와 같이 유영성이 떨어진 물고기는 유속을 이기지 못하고 뒤로 밀리게 되나 물고기가 가진 본능으로 인하여 다시 앞으로 나아가고자 꼬리 지느러미를 힘차게 움직이게 되는데 이 때 이 꼬리지느러미가 감지센서(33)를 건드리게 되고 이것이 전기적 신호값으로 나타나 기록된다. 물고기가 빠져나가지 못하도록 물고기 이탈방지망(32)을 설치한다. 이러한 전기신화값은 수질측정기(34)에서 측정한다. 또한 순환펌프(35)를 사용하여 물흐름조절기(36)를 통하여 물의 흐름을 조절한다. 이렇게 사용된 물은 물유출구(38)을 통하여 나가게 된고 물은 물분리관(37)을 통하여 조절된다. 제어장치(39)로 알람 및 유속제어에 활용한다. 이러한 정보는 모니터 및 키보드(40)를 통하여 입출력된다. 여기서 사용되는 물고기는 잉어과 황이 속의 물고기인 금빛황어가 주로 사용된다.
그러나 물고기를 이용한 생물독성경보장치의 단점은 독성을 감지하는 개체의 크기가 크므로 폐놀의 경우 10ppm이 유입되었을 때 독성측정 시간이 8시간 걸린다. 이와 같이 물고기를 이용한 생물독성 경보장치의 경우 민감도가 떨어지며 측정시간 및 오차범위가 크다. 또한 물고기의 배양 및 선택이 선결조건이다.
물벼룩를 이용한 생물모니터링 장치는 물벼룩의 활동성을 적외선센서를 통하여 감지한다. 물벼록 독성 경보장치는 물벼룩의 유영성에 기초한 것으로서, 도 2을 참고하여 자세히 설명하면, 유리 또는 아크릴로 만들어진 시험챔버(42)에는 시험하고자 하는 물이 유입, 유출되고 그 속에 20마리의 물벼룰이 있다. 물이 유입구(41)를 통해 유입되면 시험챔버(42)에 있는 물벼룩이 반응하게 되는데 물벼룩은 물이 독성물질에 오염되지 않았을 때는 규칙적인 움직임을 보이나 독성물질에 노출되면 움직임은 불규칙적으로 변하고 급격해진다. 움직임이 급격해질수록 적외선센서(43)를 차단하는 회수가 많아지게 되므로 전기적 신호값은 증가하게 된다. 온도감응장치(45)를 통해서 온도를 항상 측정하여 전자통제장치(46)를 통해 적외선센서를 통제하며 출력장치(47)를 통하여 그 값을 출력하고 측정된 물은 물유출구(44)를 통해 배출된다.
이러한 물벼룩을 이용한 생물독성경보장치의 경우 개체의 크기가 물고기보다 작으므로 민감성은 물고기를 이용한 장치보다 우수하나 관리가 어렵다. 또한 물벼룩을 교환할 때 시험수조와 유입수, 유출수를 위한 각종 튜브 세척 또는 교환이 필요하며, 물벼룩의 배양에 많은 노력이 요구되는데 배양액을 만들어 1주일에 2-3회 배양액을 교체하는 것과 어미와 새끼의 분리에 주력하게 된다. 또한 물벼룩은 별도의 배양실에서 배양되어야 하며 이곳에서는 실내공간의 소독이나 배양에 방해가 될만한 물건이나 장비가 있어서는 안된다. 또한 화학분석실의 공기가 배양실로 옮겨오는 일도 없어야 한다는 문제점이 있다.
상기와 같은 종래기술의 문제점을 보완하면서, 신속 정확한 수질독성물질의 측정과 저가의 유지비용 및 유지관리가 용이한 연속배양한 미생물을 이용한 수계의 독성물질의 연속감시시스템 및 이를 이용한 수계독성물질의 연속감시방법을 제공하는 것이다.
도 1는 본 발명에 의한 통상적인 독성물질 연속감시용 키트의 일실시예를 도시한다.
도 2는 종래의 생물학적 방법을 이용한 물고기 수질독성 자동조기경보장치이다.
도 3는 종래의 생물학적 방법을 이용한 물벼룩 수질독성 자동조기경보장치이다.
＜도면의 주요부호에 대한 부호의 설명＞
1. 미생물 배양용 배지 공급조 2. 정량펌프 1
3. 미생물 배양기 1 4. 정량펌프 2
5. 발광측정용 참조셀 6. 발광 측정용 참조조의 교반기 1
7. 발광측정용 샘플셀 8. 발광측정용 샘플셀의 교반기 2
9. 정량펌프 3 11. 채취된 시료
12. 샘플채취 및 보관장치 13. 정량펌프 4
16. 광측정기:굵은 선으로 표시 17. 컴퓨터
18. 텔레미터링 장치 19. 경보장치
20. 챠트레코더
21. 미생물 배양용 배지 공급조 22. 정량펌프 5
23. 미생물 배양기 2 24. 정량펌프 6
25. 자동밸브 1 26. 자동밸브 2
31. 물유입구 32. 물고기 이탈방지망
33. 감지센서 34. 수질측정기
35. 순환펌프 36. 물흐름 조절기
37. 물분리관 38. 물유출구
39. 제어장치 40. 모니터 및 키보드
41. 물유입구 42. 시험챔버
43. 적외선센서 44. 물유출구
45. 온도감응장치 46. 전자통제장치
47. 출력장치
본 발명은 발광미생물을 사용한 수계 독성물질의 연속감시방법 및 이를 위한 연속감시용 키트에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 독성물질에 의한 연속배양된 발광미생물의 발광도변화를 측정함으로써 수계의 독성물질 연속감시방법 및 이를 위한 연속감시용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 발광미생물을 이용한 독성물질 연속감시방법을 구체적으로 보면, 연속배양하여 발광미생물을 연속적으로 공급하는 단계와, 연속적으로 공급되는 발광미생물의 발광도를 대조구로 측정하는 단계와, 발광도가 측정된 발광미생물에 채취한 시료를 혼합시켜 발광도를 측정하는 단계와, 대조구의 발광도와 시료를 포함한 발광미생물의 발광도의 차이를 분석하는 단계로 이루어진다.
추가로, 상기의 분석단계에서 얻은 독성물질의 측정치가 설정값이상인 경우에 경보를 하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 순차로 배지공급조, 배지공급조로부터 공급받은 배지로 발광미생물을 연속배양하는 배양조, 배양조로부터 공급된 배양액의 발광도를 대조구로서 측정하는 대조구 측정조, 시료채취조에서 공급된 시료와 대조구 측정조로 부터 공급되는 미생물을 혼합하여 발광도를 측정하는 발광도측정조, 미생물 배양조, 대조구 측정조, 발광도측정조의 광량을 측정하는 수단 및 대조구측정조와 발광도측정조에서 얻은 발광도의 차이를 분석하는 수단으로 이루어지는 연속배양된 발광미생물을 이용한 독성물질의 연속감시용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 양상은 미생물 배양조가 오염시 이로부터 배양액의 공급을 중지하고 연속배양된 발광미생물을 공급하기 위한 상기 미생물 배양조와 병렬로 연결된 제2의 미생물 배양조가 구비된 것을 특징으로 하는 연속배양된 발광미생물을 이용한 독성물질의 연속감시용 키트에 관한 것이고, 상기 미생물 배양조의 광량을 측정하여 미생물 배지공급을 제어할 수 있는 개폐수단이 구비된 연속배양된 발광미생물을 이용한 독성물질의 연속감시용 키트이다.
본 발명에 따른 독성물질 연속감시방법 및 이를 위한 연속감시용 키트에서 사용가능한 연속배양 미생물은 포토박테리움 포스포럼(Photobacterium phosphoreum), 비브리오 피쉐리(Vibrio fischeri) 또는 이들의 발광효소를 코딩하는 유전자(lux gene)를 숙주미생물에 도입한 재조합균주 중에서 선택할 수 있으며, 연속배양 발광미생물을 위한 배지는 플래겟-부르만 실험디자인법(Plackett-Burman experimental design) 또는 2인자 중심법(2 factor central composite method)으로 선택된 최적화배지를 사용할 수 있고, 배양기의 광량을 측정하여 배지공급을 제어한다. 이때 플래겟-부르만 실험디자인법은 발광미생물의 주요배지를 선택하는 방법으로 주요기질인 트립톤, 이스트 추출물(yeast extract), 글리세롤, 염화나트륨, 염화칼륨, CaCl2, H2O, MgCl2·6H2O, NaHCO3, MgSO4·7H2O를 각각의 발광미생물의 생체발광량과 성장성에 주는 영향을 계산한다. 이 값을 각각 조사한 결과 이스트 추출물, 염화나트륨이 발광성과 성장성에 가장좋은 영향을 나타냈으며, 이때의 농도는 2인자 중심조성법을 사용하여 찾을 수 있다. 이와 같은 방법을 사용하면 연속배양을 하는데 가장 좋은 성분과 농도를 유도하므로써 최소의성분으로 최적의 농도를 유지하므로써 가장 좋은 발광성과 성장성을 보장할 수 있다.
미생물의 연속배양은 통상의 공지의 연속배양법인 키모스타트(chemostat) 와 터비도스타트(turbidostat)의 원리로 가능하나, 적정온도 및 적정교반속도를 유지하고 일정량의 공기를 주입하여 배양하면서 미생물 배양조의 광량을 측정하여 배지량의 공급을 제어하는 방법으로 연속배양하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 또다른 양상은 제1 미생물 배양조의 오염시에 이로부터 미생물 공급을 중단하고 병렬로 연결된 제2 미생물 배양조로부터 발광미생물을 연속적으로 공급할 수 있다.
본 발명에 따라서 측정된 발광도의 차이를 비속도법, 생체발광량법 또는 감마법을 사용하여 분석할 수 있다.
본 발명에 사용된 발광미생물의 발광현상은 통상 산소의 존재하에서 발광효소인 루시퍼라제, 환원형 플래빈 및 장쇄형 알대히드의 상호작용에 의하여 이루어지는데 이들은 세포의 전자전달계의 일부를 구성한다. 플래빈 모노 뉴클레오다이드(FMN)가 NADH에 의하여 환원되어, 이것이 발광효소등과 반응하면서 빛을 발산하게 된다. 이러한 발광현상은 전자의 흐름에 따라 좌우되므로 빛의 출력은 대사활성과 생체의 건강상태의 변화를 나타낸다.
FMNH2+O2+RCHO→발광+FMN+H2O+RCOOH
발광도는 발광미생물중 일종인 포토박테리움 포스포럼(Photobacterium phosphoreum)의 발광 스펙트럼은 420~630nm이며, 가시광선영역인 490nm에서 최대치를 나타낸다. 실제로 발광되는 색깔은 밝은 파랑색과 초록색의 중간색깔을 나타낸다. 이 같은 발광현상은 이미 언급한 바와 같이, 호기적 조건의호흡대사와 연결되어 일어나는데, 에너지는 빛으로 발산되므로 ATP생산은 일어나지 않는다. 이같은 과정에 어떤 독성물질이 작용하면, 발광량잉 감소된다. 이와 같은 원리를 이용하여 독성물질의 독성도를 측정할 수 있다. 포토박테리윰 포스포럼(Photobacterium phosphoreum)은 저온에서 생장불가능한 다른 발광미생물과는 달리 4℃의 낮은 온도에서도 성장이 가능하다는 장점을 가지고 있어 저온상태에서 장기 저장이 가능하고 또한 비교적 저온의 수질도 모니터링이 가능하다.
여기서, 발광량 변화의 차이는 비속도법(specific rate), 생체발광량도법(bioluminescence intensity), 감마법(gamma value)을 통해 계산되고 여기에서 계산된 값은 직선에 가까운 값을 가진다. 이때 계산하는 방법은 다음과 같다.
a)비속도를 이용한 방법
일정기간동안 발생하는 생체발광량을 측정하는 방법으로,
μ = (lnL2-lnL1)/(t2-t1)
μ: 비속도
t1: 처음측정시간
t2: 두 번째 측정시간
L1: 처음 측정되는 생체발광량도
L2: 두 번째 측정되는 생체발광량도
b)생체발광도를 이용하는 방법
Io/I = I+Ks[Q]
Io:독성물질이 없을때의 생체발광도
I: 독성물질이 없을때의 생체발광도
Ks: 상수(constant)
[Q]: 독성물질의 농도
c)감마값을 이용하는 방법
잔류하는 발광량에 대한 감소한 빛의 양의 비
γ(t,T): T℃에서의 t시간동안의 감마효과
R(t): t시간동안 독성물질이 유입되지 않은 시료(블랭크)의 생체발광량도의 비, t시간 후의 독성물질이 유입되지 않은 시료의 생체발광량을 처음 측정할 때의 값으로 나누어서 구한다.
L(0): 처음 측정할 때의 샘플의 생체발광도
L(t): t시간후의 생체발광도이다.
각 농도에서의 γ값을 구하여 독성물질의 농도와 γ값을 로그-로그 그래프에 나타내념 직선화하여 표현할 수 있다. 이때의 γ=1이 되는 독성물질의 농도가 EC50값이 된다. 이 때의 값을 각각의 독성물질의 종류에 따라 다르게 나타내어진다. 이와 같은 특성을 이용하여 각각의 독성물질의 종류에 따라 다르게 나타내어진다. 이와 같은 특성을 이용하여 그 값을 구하고 그 값이 EC50을 넘어서게 되면 경보를 발령하고 디스플레이 한다.
도 3을 참조하여 구체적으로 본 발명의 실시예를 기술하면 다음과 같다.
미생물 배양용 배지 공급 탱크(1)에서 정량펌프1(2)을 사용하여 미생물 배양기(3)로 배지를 공급한다. 미생물 배양기(3)에는 적정온도와 적정 교반속도를 유지하면서 일정량의 공기를 주입시킨다. 미생물 배양기(3)에서는 연속배양을 유지하기 이해 미생물 배양기의 광량을 측정하여 미량 변화를 점검하여 제어프로그램으로 배지 공급펌프인 정량펌프1(2)을 제어하며 광량의 급격한 변화시 미생물 배양기기가 오염되었을 경우가 많으므로 별도의 경보음 및 신호를 발령한다. 오염이 되었을 경우 자동밸브1(25)이 자동으로 차단되며 별도로 운전중인 미생물 배양기2(21)를 사용하기 위해 자동밸브2(26)를 연다. 미생물 배양기에서 배양된 발광미생물은 정량 펌프2(22)를 연다. 미생물 배양기에서 배양된 발광 미생물은 정량 펌프2(22)를 통해 발광측정용 참조셀(5)에 공급된다. 여기서 측정된 값은 발광량 측정의 참조값으로 입력된다. 발광측정용 참조셀(5)에서 측정된 발광미생물은 정량펌프3(9)에 의해 발광측정용 샘플셀(7)에 공급된다. 또한 정량펌프4(13)에서 채최된 시료가 발광측정셀(7)에 공급된다. 혼합된 시료는 독성물질의 유무에 따라서 발광량의 변화가 생기게 되므로 이 발광량을 측정하여 그 신호를 컴퓨터로 보내게 된다. 컴퓨터는 이 데이터를 보관하며 측정값은 EC50, 비속도법, 생체발광량도법 등으로 분석하며 마이크로프로세서에서 저장기능과 연산기능을 수행하여 이상독성물질유무를 원격송수신장치인 텔리미터링 시스템을 통하여 지역국이나 관제센터로 자료를 보내 준다.
본 발명은 독성물질에 의한 연속배양된 발광미생물의 발광도변화를 측정하여 수계의 독성물질 연속감시방법 및 이를 위한 연속감시용 키트에 관한 것으로서, 물고기나 물벼룩을 이용한 종래의 생물학적 방법에 의한 수계 독성물질의 감시방법 및 장치에 비해 본발명은 정확성, 신속성, 신뢰성이 있으며 유지비가 적고 관리가 용이하다는 장점이 있다.

Claims (10)

  1. 연속배양하여 발광미생물을 연속적으로 공급하는 단계와, 연속적으로 공급되는 발광미생물의 발광도를 대조구로 측정하는 단계와, 발광도가 측정된 발광미생물에 채취한 시료를 혼합시켜 발광도를 측정하는 단계와, 대조구의 발광도와 시료를 포함한 발광미생물의 발광도의 차이를 분석하는 단계로 이루어지는 연속배양 발광미생물을 이용한 독성물질의 연속감시방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 추가로 상기의 분석단계에서 얻은 독성물질의 측정치가 설정값 이상인 경우 경보를 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 연속배양 미생물이 포토박테리움 포스포럼(Photobacterium phosphoreum), 또는 비브리오 피쉐리(Vibrio fischeri)인 것을 특징으로 하는 연속배양 발광미생물을 이용한 독성물질의 연속감시방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 플래겟-부르만 실험디자인법(Plackett-Buruman) 또는 2인자 중심법(2 factor central composite method)으로 선택된 최적화배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 연속배양 발광미생물을 이용한 독성물질의 연속감시방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 배양기의 광량을 측정하여 배지공급을 제어하여 배양하는 연속배양 발광미생물인 것을 특징으로 하는 연속배양 발광미생물을 이용한 독성물질의 연속감시방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 제1 미생물 배양조의 오염시에 이로부터의 미생물 공급을 중단하고 병렬로 연결된 제2 미생물 배양조로부터 발광미생물을 연속적으로 공급하는 것을 특징으로 하는 연속배양 발광미생물을 이용한 독성물질의 연속감시방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 측정된 발광도의 차이를 비속도법, 생체발광량법 또는 감마법을 사용하여 분석하는 것을 특징으로 하는 연속배양 발광미생물을 이용한 독성물질의 연속감시방법.
  8. 순차로 배지공급조, 배지공급조로부터 공급받은 배지로 발광미생물을 연속배양하는 배양조, 배양조로부터 공급된 배양액의 발광도를 대조구로서 측정하는 대조구 측정조, 시료채취조에서 공급된 시료와 대조구 측정조로 부터 공급되는 미생물을 혼합하여 발광도를 측정하는 발광도 측정조, 미생물 배양조, 대조구 측정조, 발광도측정조의 광량을 측정하는 수단 및 대조구측정조와 발광도측정조에서 얻은 발광도의 차이를 분석하는 수단으로 이루어지는 연속배양된 발광미생물을 이용한 독성물질의연속감시용 키트.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 미생물 배양조가 오염시 이로부터 배양액의 공급을 중지하고 연속배양된 발광미생물을 공급하기 위한 상기 미생물 배양조와 병렬로 연결된 제2의 미생물 배양조가 구비된 것을 특징으로 하는 연속배양된 발광미생물을 이용한 독성물질의 연속감시용 키트.
  10. 제 8 항 또는 9항에 있어서, 상기 미생물 배양조의 광량을 측정하여 미생물 배지공급을 제어할 수 있는 개폐수단이 구비된 것이 특징인 연속배양 발광미생물을 이용한 독성물질의 연속감시용 키트.
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