KR20010008186A - 돼지 회장염, 돼지 적리 및 돼지 살모넬라성 장염 원인균동시 감별진단법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지 회장염, 돼지 적리 및 돼지 살모넬라성 장염 등 3종의 원인균인 Lawsonia intracellularis(이하 L. intracellularis), Serpulina hyodysenteriae(이하 S. hyodysenteriae), Salmonellae 동시 감별진단법에 관한 것으로, 중합효소연쇄반응(PCR: Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 진단할 수 있는 방법에 관한 것이다. 이를 위하여 본 발명은 3종 질병 원인균의 유전자 특이단편(primer)을 크기가 다르게 합성하여 검체에서 분리한 DNA, 중합효소 및 반응 완충액을 혼합한 후 유전자 증폭기 [PCR machine (Stratagene, USA)] 로, 수소결합된 두가닥의 핵산을 단일가닥으로 분리시키는 열변성 단계(denaturation), primer가 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 결합단계(annealing), 및 결합된 primer를 중합효소에 의해 확장시키는 확장단계(extension)를 거쳐 특이 유전자를 증폭시킨 후 증폭산물을 자외선 조사로 확인하는 방법으로, 통상 4일에서 7일이 소요되던 질병진단 시간을 하루만에 진단할 수 있으며, 본 진단법을 실제로 양돈농가에 적용함으로써 양축가의 경제적 피해를 줄일 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 또한 일반적인 진단법으로는 사체를 통한 검체에서 원인균을 분리해야 하 나, 본 기술개발로 생체에서 원인균의 생존여부와 관계없이 분변 1g으로 검사를 할 수 있어 보균돈의 색출 및 조기도태 유도로 질병전파를 미연에 방지할 수 있다.
Description
본 발명은 돼지 회장염, 돼지 적리 및 돼지 살모넬라성 장염 등 3종 원인균의 동시 감별진단법에 관한 것으로, 중합효소연쇄반응(PCR: Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 진단할 수 있는 방법에 관한 것이다.
상기 3종 질병은 도축장 출하직전의 육성·비육기간에서 설사 및 사료효율저하 등을 일으켜 양돈농가에 미치는 경제적 피해는 심각하며, 3종 질병의 감염율은 30∼40%, 피해액은 총 매출액의 15∼20%인 실정이다. 또한 상기 질병의 일반적인 세균학적 배양을 통한 진단방법으로는 사체를 통한 검체에서 원인균을 분리해야 하기 때문에 출하직전의 비육돼지를 축주가 부검하기 꺼려하며, 4∼7일의 진단기간이 소요되고 있어 보다 신속하고 정확한 진단기법의 개발이 요구되어 왔다. 현재 3종 질병의 진단방법으로 세균학적 방법, 병리조직학적 방법 및 혈청학적 방법 등이 이용되고 있으나 시간이 걸리고 번거로운 단점이 있으며, 최근 검체로부터 DNA를 분리한 후 중합효소를 이용하여 특정 염기서열을 증폭시켜 원인체를 검색하는 PCR 기법이 보고되었으나 신뢰도 등의 문제점으로 실용화되기에는 많은 문제점이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 사실에 의거하여 안출한 것으로 실용화할 수 있는 3종 질병 원인균의 특이적인 primer를 개발하여 PCR 기법을 이용하여 사체가 아닌 생체에서 분변 1g으로 하루만에 3종 질병 원인균을 동시감별 하는데 그 목적이 있다 또한 본 개발 기술의 야외 실제적용으로 양돈농가의 경제적 손실을 줄이는데 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서 개발한 3종 질병 원인균의 특이 primer가 PCR의 어떤 조건에서 특이 band를 형성하는 지를 조사하였고, 확립한 진단법의 특이성 및 야외적용시험을 실시하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 첨부한 도면과 실시 예에 따라 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 일실시 예인 3종 질병에 단독 또는 혼합감염된 돼지의 분변에서 추출한 DNA와 본 발명에서 개발한 primer를 혼합하여 실시 예2의 조건으로 PCR을 수행한 후, 전기영동하여 찍은 사진,
도 2는 돼지 회장염 및 돼지 살모넬라성 장염 원인균(L. intracellularis, Salmonellae)의 특이성을 나타낸 사진,
도 3은 돼지 적리 원인균(S. hyodysenteriae)의 특이성을 나타낸 사진.
〈도면의 부호설명〉
M:DNA size marker(ΦX174-HinkⅡ)
본 발명의 구체적인 구성과 작용을 첨부한 도면을 참고로 하여 설명한다. 도 1은 3종 질병에 단독 또는 혼합감염된 돼지의 분변에서 추출한 DNA와 본 발명에서 개발한 primer를 혼합하여 PCR을 수행한 후, 전기영동하여 찍은 사진이다. Lane 1은 돼지 회장염 원인균(L. intracellularis)에, Lane 2는 돼지 살모넬라성 장염 원인균(Salmonellae)에, Lane 3은 돼지 적리 원인균(S. hyodysenteriae)에 각각 단독감염된 돼지의 분변에서 추출한 DNA로 PCR을 수행한 것이며, Lane 4는 돼지 회장염 원인균(L. intracellularis)과 돼지 적리 원인균(S. hyodysenteriae)에, Lane 5는 돼지 회장염 원인균(L. intracellularis)과 돼지 살모넬라성 장염 원인균(Salmonellae)에, Lane 6은 돼지 살모넬라성 장염 원인균(Salmonellae)과 돼지 적리 원인균 (S. hyodysenteriae)에, Lane 7은 돼지 회장염 원인균(L. intracellularis), 돼지 살모넬라성 장염 원인균(Salmonellae) 및 돼지 적리원인균(S. hyodysenteriae)에 각각 혼합감염된 돼지의 분변에서 추출한 DNA로 PCR을 수행한 후 찍은 사진이다. 실험결과, 돼지 회장염, 돼지 살모넬라성 장염 및 돼지 적리의 원인균에서 각각 210 bp, 300 bp와 421 bp의 특이 band가 관찰되었다.
본 발명에서 개발한 진단법의 특이성을 조사하고 또한 3종 primer간의 교차반응 여부를 확인하기 위해 3종 질병 원인균 및 유사질병을 일으키는 다른 장내세균 유전자 증폭산물을 비교한 결과는 도 2 내지 도 3과 같다. 도 2에서 Lane 1은 돼지 회장염 원인균(L. intracellularis)에서, Lane 2에서 13은 돼지 살모넬라성 장염 원인균(Salmonellae)속 12종에서, Lane 14와 15는 유사질병을 일으키는 Campylobacter jejuni 및 Escherichia coli 2종에서 특이성 및 교차반응 여부를 확인한 사진이며, 도 3에서 Lane 1에서 9까지는 분리한 9주의 돼지 적리 원인균(S. hyodysenteriae)에서, Lane 10은 비병원성균인 S. innocens에서, Lane 11에서 13은 유사질병을 일으키는 Campylobacter jejuni, Escherichia coli 및 Listeriae monocytogenes 3종에서 특이성 및 교차반응 여부를 확인한 사진이다. 실험결과 3종 원인균에서만 특이 band가 관찰되고 3종 상호간 및 기타 3종의 장내세균에서는 교차반응에 의한 비특이 band가 관찰되지 않았다.
다음에 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시 예를 들어 설명한다.
실시 예1. 3종 질병 원인균에 대한 특이 primer 합성
돼지 회장염, 돼지 살모넬라성 장염 및 돼지 적리의 원인균인 Lawsonia intracellularis, Salmonella typhimurium 및 Serpulina hyodysenteriae의 특이 primer는 Primer3 program(www.genome.wi.mit.edu)을 이용하여 표 1과 같이 합성의뢰 하였으며(Bioneer Co, Korea) primer의 크기는 각각 23 mer, 20 mer, 20 mer로 하였다.
실시 예2. PCR 조건
PCR 수행은 3종 각각의 primer에 대해 20 pmol의 농도로 5㎕의 10×PCR buffer, 3㎕의 25mM MgCl2, 4㎕의 10 mM dNTP 및 1㎕의 templatr DNA를 총 50㎕ 부피로 혼합하여 표 2와 같은 조건으로 유전자 증폭기를 이욜 PCR을 수행하였다.
실험결과, 도 1과 같이 돼지 회장염, 돼지 살모넬라성 장염 및 돼지 적리의 원인균에서 각각 210 bp, 300 bp와 421 bp의 특이 band가 관찰되었다.
실시 예3. PCR 증폭산물의 확인시험
증폭된 PCR 산물이 3종 원인균의 특이 유전자임을 확인하기 위해 GeneCleanⅡ kit(Invitrogen, USA)를 이용 클로닝(cloning) 한 후, Top DNA sequencing kit(Injae, Korea)로 염기서열을 확인하였다.
실험결과, PCR 증폭산물의 염기서열은 첨부된 핵산 염기서열과 같으며 GenBank의 염기서열과 일치함을 확인할 수 있었다.
실시 예4. 야외적용시험
특이성이 확립된 3종의 primer와 PCR 조건을 이용하여 실용성을 확인하기 위해 야외적용시험을 실시하였다. 세균학적 및 병리조직학적 방법으로 3종 질병에 단돋 또는 혼합감염으로 진단된 총 23 건의 돼지 분변에 대해, 본 발명에서 개발된 진단법을 적용하여 비교시험을 한 결과는 표 3과 같다.
비교 실험결과, 100% 일치하여 야외에 적용할 수 있음이 확인되었다.
이상의 실시 예와 실험결과를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 양돈농가의 육성·비육돈에서 큰 피해를 입히는 3종 질병의 원인균을 하루만에 동시 감별진단할 수 있는 진단법을 개발하고 양돈장에 실제 적용함으로써 질병의 조기진단으로 양축농가의 경제적 피해를 줄일 수 있는 효과가 있다. 또한 통상적인 진단방법으로는 사체를 통한 검체에서 원인균을 분리해야 하나, 본 기술개발로 생축에서도 원인균의 생존여부와 상관없이 분변 1g으로 검사를 할 수 있어 보균돈의 색출 및 조기도태 유도로 질병전파를 미연에 방지할 수 있는 효과가 있다.
Claims (1)
- 돼지 회장염, 돼지 살모넬라성 장염 및 돼지 적리 등 3종 질병 원인균의 동시 감별진단법을 위하여 이 primer와 염기서열 그리고 PCR 조건을 이용하는 경우
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| KR1020000067549A KR20010008186A (ko) | 2000-11-14 | 2000-11-14 | 돼지 회장염, 돼지 적리 및 돼지 살모넬라성 장염 원인균동시 감별진단법 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100408784B1 (ko) * | 2001-02-26 | 2003-12-06 | 삼성에버랜드 주식회사 | 다중 중합효소연쇄반응을 이용한 병원성 미생물의검출방법 및 검출키트 |
| KR100492523B1 (ko) * | 2002-12-02 | 2005-06-02 | 제일사료 주식회사 | 돼지 회장염, 돼지 적리 및 돼지 살모넬라성 장염의 동시진단 방법 및 그 진단키트 |
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2000
- 2000-11-14 KR KR1020000067549A patent/KR20010008186A/ko not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| J Clin Microbiol. 1994 Jun;32(6):1497-502 * |
| J Vet Diagn Invest. 1997 Jul;9(3):281-6 * |
| J Vet Diagn Invest. 1999 Jan;11(1):45-9. * |
| J Vet Med Sci. 2000 Jul;62(7):771-3. * |
| Mol Cell Probes. 1995 Apr;9(2):111-9 * |
| Mol Cell Probes. 2000 Apr;14(2):101-8 * |
| Vet Microbiol. 1998 Apr 30;62(1):59-72 * |
| 연구보고서 1999 : 수의과학기술개발사업/ 국립수의과학검역원 pp.29-43, 2000 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100408784B1 (ko) * | 2001-02-26 | 2003-12-06 | 삼성에버랜드 주식회사 | 다중 중합효소연쇄반응을 이용한 병원성 미생물의검출방법 및 검출키트 |
| KR100492523B1 (ko) * | 2002-12-02 | 2005-06-02 | 제일사료 주식회사 | 돼지 회장염, 돼지 적리 및 돼지 살모넬라성 장염의 동시진단 방법 및 그 진단키트 |
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