KR20000065263A - 미생물 단백분해효소의 신속한 분석방법 및 장치 - Google Patents

미생물 단백분해효소의 신속한 분석방법 및 장치 Download PDF

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스테픈 앨든 랠스
로이드 그랜트 사이몬슨
실비아 조투 섀이드
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더 유나이티드 스테이츠 어브 아메리카, 에즈 레프리젠티드 바이 더 세크리터리 어브 더 유.에스. 디파트먼트 어브 더 네이비
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Abstract

임상 및 실험실 샘플에서 미생물 단백분해효소 활성을 검출하는 분석방법이 제공되는데, 본 분석방법은 원하는 단백분해효소 활성을 지닌 어떤 미생물을 함유하고 있다고 추정되는 샘플을 수집하고; 상기 샘플의 미생물을 고상의 기질에 고정하고; 상기 고정화 미생물을 효소기질(enzymatic substrate)과 접촉시켜 효소기질 말단-산물 (enzymatic substrate end-product)을 만들고; 샘플의 단백분해효소 활성 레벨에 따라 강도가 변하는, 검출가능한 발색반응을 일으키는 화학적 증강제와 상기 효소기질 말단-산물을 접촉시키고; 및 샘플내 단백분해효소 활성의 유무가 반정량적(seni-quantitative)으로 결정되는 상기 발색반응을 검출하는 것으로 이루어진다. 이러한 분석을 수행하는 장치로서, 고정화 미생물과 별도로, 숙주 단백분해효소를 함유할 수 있는 다른 물질 또는 용액의 배출를 허용하는 동시에 문제되는 미생물과 결합 가능한 고상의 기질을 보유하는 구조 또는 지지체가 제공된다.

Description

미생물 단백분해효소의 신속한 분석방법 및 장치
치주질환은 인간에게 가장 흔한 고통의 하나이며, 세균성 병인(bacterial etiology)을 갖는 것으로 널리 받아들여지고 있다. 치주질환은 성인에 있어서 치아를 잃게 되는 가장 흔한 원인의 한가지이다. 본 발명에 있어서, 치주질환이라는 단어는 치아의 지지 구조에 영향을 주는 모든 염증성 질환을 포함하고, 세균 병인성인, 예를들어, 이에 제한되지는 않으나, 회사시키는 궤양성 치은염, 성인 치막염, 청소년 치막염, 급속하게 진행되는 치막염, 고질적인 치막염, 사춘기 이전의 치막염을 포함한다. 또한 본발명에 있어서, 플라크(plaque)는 치주질환에 관련된 것으로 여러 시간에 걸쳐 아랫 잇몸과 위 잇몸에 축적된 일차적인 세균군을 의미한다.
또한, 본 발명에 있어서, 활성의(active), 활성(activity)라는 단어는 미생물 단백분해효소를 위한 기질, 예를들어 파라-니트로아닐라이드 펩타이드(para-nitroanilide peptide)기질, 파라-니트로아닐라이드 아미노산 기질 등과 반응성이 있는 단백분해효소와 관련된다. 치주질환은 다음과 같이 하나 또는 그 이상의 특징이 있다. : 피부염, 치막 프로빙(probing)에서의 유혈, 부착상실, 상아질 상실, 화농, 유동, 통증, 그리고, 종국적으로는 치아의 탈락
스피로헤타(spirochetes)를 포함하는 특정 구강세균 종이 치주질환과 관련되어 있다(1). 스피로키테스는 흔히 성인(1-4)과 어린이(5) 모두에 있어서 치주질환 부위에서 가장 많은 숫자로 발견된다. 트레포네마 속(genus Treponema)으로부터의 구강 스피로키테스는 치주질환이 있는 사람의 아랫 잇몸 플라그의 중요한 구성성분을 이루고, 발견되는 미생물 세포의 50%에 이른다(2). 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)는 치주질환 부위와 가장 흔하게 관련되는 스피로키테스 종으로 여겨진다(2,3). 스피로헤타는 치주질환에서 숫자가 증가하고 치료후에 감소함을 보여준다(3). 시몬슨(Simonson) 등은 치아 플라그에서 트리포네마 텐티콜라의 숫자가 치주질환의 심각성 정도에 직접적으로 비례하여 증가함을 보여주었다(6). 스피로키테스 외에 치주질환과 관련된 잘 알려진 세균 종으로는 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 아이케넬라 코로덴스(Eikenella corodens), 카프노시토파가 종(Capnocytophaga spp.), 포르피로모나스 진자이벌러스(Porphyromonas gingivalis), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 캄필로박터 렉터스(Campylobacter rectus) 등이 포함된다.
트립신류 단백분해효소, 키모트립신류 단백분해효소, 콜라겐 등은 치주질환과 관련되는 몇몇 중요한 세균 종과 관계된 단백분해효소이다.(1-3,7-13)
트립신류 단백분해효소는 트레포넬라 덴티콜라와 포르피로모나스 진자이벌리스(1,7-13)와 관계된다. 키모트립신류 단백분해효소는 트레포네마 덴티콜라와 카프노시토파가 종(1-3)과 관계한다. 본 발명에 있어서, 기트립신이라는 단어는 술한 바와 같이 트립신류 단백분해효소를 포함하고, 키모트립신이라는 단어는 키모트립신류 단백분해효소를 포함한다(2,3,7-13). 이러한 분석은 플라크, 타액, 양치액 샘플 등에서 미생물 단백분해효소를 발견하는데 신속한 방법과 수단을 제공하고 이에 따라, 치주질환에 대하여 진단, 위험성 판단, 치료의 계획과 치료효과의 기록 등을 보조한다. 이 분석은 또한 효소 활성을 측정함에 의하여 배양중이거나, 다른 임상, 실험실의 검체, 샘플 등에서의 미생물 동정을 보조한다.
미생물 단백분해효소에 대해 석시닐-알라닐-알라닐-프롤릴-페닐알라닐-파라-니트로아닐라이드(succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-phenylalanyl-para-nitroanilide)(SAAPFPNA)와 다른 파라니트로 아닐라이드 아미노산, 파라니트로아닐라이드 펩타이드 기질들의 개별적 또는 조합한 사용은 여기에 기술된 미생물 단백분해효소에 대한 신속한 분석의 일부로 보고되지는 아니하였다. 비록 여러 유사한, 그러나 본질적으로는 무관한, 발명들이 기술된 바 있으나, 미생물 단백분해효소에 대한 간단하고, 신속한 분석은 보고된 바 없다. 본 발명에 기술된 것과 같이 단백분해효소를 검출하는 것은 어떠한 공지의 기술과 비교하여도 신속하고, 간단하며, 저렴하게 치주질환에 있어서 분석, 위험판단, 치료의 계획 및 기록을 도와준다. 로젠버그(Rosenberg) 등은 미국 특허 제4,976,951호에서 충치진단 및 위치설정기술을 기재하고 있다 ; 그러나, 이 방법은 본 발명과 본질적으로 다르다. 에버솔(Ebersole)은 미국 특허 제4.458,014호에서 구강질환의 확인을 위해 미생물 동정을 위한 혈청학적 방법을 상세히 기술한 바 있다. 첸(Chen)등은 미국 특허 제4,866,167호 핵산 결합에 의한 인간 구강세포의 검출에서 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)를 포함하는 세균 종을 검출하는는 법을 기술하였다. 에버솔과 첸 등의 방법들은 기술적으로 복잡하고, 시간이 오래 걸리며, 신속하지 못하다. 랄스(Ralls)와 시몬손(Simonson)은 1995. 7. 28.일자에 출원된 미국 특허 출원 제08/508,653호에서 카리에스 유발성의 세균에 대한 신속한 면역분석을 기술하였고, 1995. 11.27.일자에 출원된 미국 특허 출원 제08/562,772호는 질환 관련 항원에 대한 구강내 항체를 검출하기 위한 신속한 면역분석을 기술하였다. 이들 발명들은 항원 항체반응에 기초한 면역분석들로, 본 발명과는 그 개념에 있어서 본질적으로 상이하다.
플라크, 타액, 양치액 샘플과 기타 임상, 실험실의 표본이나 샘플로부터 미생물 단백분해효소의 활성을 신속하게 측정할 수 있는 간단한 방법은 보고된 바 없다. 치주질환에 대한 공지의 임상적인 진단과 위험 판단방법은 세균에 기초한 것이 아니며, 주관적인 임상의 자료에 의한다. 그에 따라, 활동이 없는 부위 또는 치료된 부위와 활발하게 파괴되고 있는 치주질환 부위를 구별함에 있어서 종종 임상의 난관이 있다. 공지의 방법들은 결과를 선별함에 있어서 종종 지나치게 늦거나 부정확하고, 해석상의 오류가 따르는 것으로 여겨진다. 이는 치료중인 환자에 대해 즉각적인 답변을 구하고자 하는 치과 의사와 치과 서비스를 받기가 어려운 지역으로 여행하고자 하는 사람들에게 대하여 특히 그러하다. 필요한 것은 플라그, 타액, 양치액에서 진행중인 단백분해효소의 활성을 검출하기 위한 신속하고, 작동이 간단한 분석이며 이는 함유된 특정 치주질환성 세균 종의 평가를 허락한다.
한시간이내에, 바람직하게는 5분 정도, 밝혀지고 이해될 수 있는 저렴한 비용의 실험이 필요하고, 이는 치주질환의 진단을 위해 환자 또는 특정 부위를 선별하는 것을 돕는다. ; 치주질환이 진행될 위험에 대비해 환자 또는 부위를 기록하는 것, ; 치주질환의 치료를 계획하는 것 ; 치료효과를 위해 환자 또는 부위를 기록하는 것
발명의 요지
따라서, 본 발명의 목적은 치아 플라크, 타액, 양치액 샘플 등에 있어서 활성 미생물 단백분해효소의 존재를 신속하게 검출하기 위한 분석 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 구강전체에서 또는 구강내 특정 부위에서 치주질환 진단, 치주질환 활성의 결정(일정 수준 이상의 단백분해효소 활성에 대해 양성)을 신속하게 보조하기 위한 분석 수단 및 방법이다.
본 발명의 다른 목적은 구강전체에서 또는 구강의 특정 부위에서 치주질환 발생의 위험을 판단하는 것을 신속하게 보조하기 위한 분석수단 및 방법이다.
본 발명의 또다른 목적은 치주질환이 있는 환자에 대한 계획적인 치료를 신속하게 보조 하기 위한 분석 수단 및 방법이다.
본 발명의 또다른 목적은 구강전체를 선별 기초로 하여 또는 구강내 특정 부위에서 치주질환 치료 효과의 기록을 신속하게 보조하기 위한 분석 수단 및 방법이다.
본 발명의 또다른 목적은 미생물 동정에 유용한 특정 단백분해효소의 활성을 신속하게 보조하기 위한 분석 수단 및 방법이다.
본 발명의 또 다른 목적은 임상 기타 실험실의 표본과 샘플들 예를들면, 오줌, 땀, 눈물, 혈액, 혈청, 변, 위액, 활액과 점액질 등으로 부터 활성 미생물 단백질 분해 효소의 동정을 신속하게 보조하기 위한 수단 및 방법이다.
본 발명의 또다른 목적은 신속한 분석을 수행하는데 필요한 장치이다.
본 발명의 이들 그리고 다른 목적들은 원하는 단백분해효소를 함유하는 것으로 기대되는 플라그, 타액, 양치액, 또는 기타 임상 또는 실험실의 샘플들을 모은 후, 샘플을 고체상의 기질에 뿌린 다음, 샘플을 인산 완충염으로 세척하고, 샘플을 미생물 단백분해효소 활성을 위한 기질인 SAAPFPNA 또는 파라니트로아닐라이드 펩티드 기질 또는 파라 니트로아닐라이드 아미노산 기질등과 접촉하여 미생물 단백분해효소의 활성 분석에 의해 이루어진다.
염색체 반응은 선택된 파라니트로아닐라이드 기질에 대해 특이적인 단백분해효소에 양성인 샘플들내에 파라디메틸아미노신암알데하이드
(para-dimethylaminocinnamaldehyde) 화학 증강시약(chemical enhancing reagent)의 첨부에 의해 진행된다. 반응은 반정량적(semi-quantitative)이고 반응의 강도는 샘플에서의 미생물 단백분해효소의 활성 수준에 비례한다. 이 분석을 수행하기 위한 장치는 미생물로부터 다른 물질들 또는 용액의 배수가 허용되는 동안 관심 있는 미생물을 고정화 또는 유지할 수 있는 고체상 기질을 지탱하는 틀 또는 지지체이다.
본 발명은 치아 플라크, 타액, 양치액 샘플 등과 기타 임상, 실험실의 검체 및 샘플에서 신속하게 미생물 단백분해효소를 검출하기 위한 분석장치와 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 예를들어 키모트립신류(Chymotrypsin-like)의 단백분해효소, 트립신류(Trypsin-like)의 단백분해효소, 또는 콜라겐(Collagenases) 등 미생물 단백분해효소의 활성을 구강 전체에 기초하여 또는 구강내의 특정 부위에서 측정하므로써 치주질환의 검사를 돕고, 치주질환이 진행될 위험성을 판단하며, 치주질환의 치료를 계획하고, 치주질환 치료의 효과를 모니터링하게 된다.
상술한 바람직한 실시예와 그에 따르는 도면에 의해 본 발명을 보다 완벽하게 이해할 수 있다. 서로 다른 도면에서 사용되는 동일한 숫자는 같은 구조나 구성요소를 나타낸다. 각각의 도면은 개략도로서, 도면에 도시되어 있는 것은 실제의 크기나 정확한 비율을 나타내는 것이 아니다.
도면1a는 본 발명에 따른 방법을 수행하는 장치의 실시형태를 나타낸 것으로, 양성 반응을 도시하고 있으며, 키모트립신류 활성이 있다는 것을 나타내고 있다.
도면1b는 본 발명에 따른 방법을 수행하는 장치의 실시형태를 나타낸 것으로, 음성 반응을 도시하고 있으며, 키모트립신류 활성이 없다는 것을 나타내고 있다.
바람직한 실시형태
본 발명은 플라크(plaque), 타액, 양치액 샘플을 비롯하여 기타 다른 임상, 실험실 검체와 샘플에서 미생물 단백분해효소 활성을 검출하기 위한 신속한 분석방법 및 장치에 관한 것이다. 치주질환 등의 원인이 되는 세균 종과 관련된 미생물 단백분해효소에는, 예를 들어 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola)의 트립신, 키모트립신과 포르피로모나스 징기발리스 (Porphyromonas gingivalis)의 트립신이 있다. 플라크, 타액 또는 양치액 샘플에서의 미생물 단백분해효소의 검출은 단백분해효소를 생산하는 어떤 미생물, 예를 들어 키모트립신을 생산하는 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 트레포네마 소크란스키이 (Treponema socranskii) 및 카프노사이토파자 (Capnocytophaga spp.) 등이 샘플내에 존재한다는 것을 가리킨다. 본 발명은 진단보조, 위험성 평가, 치주질환에 대한 치료계획 및 치료효과의 모니터링을 포함하는 특정분야 및 구강분야 전반에 걸쳐 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 구강 임상 샘플내의 단백분해효소의 존재 유무를 결정하는 신속한 분석방법은 완전히 진행되어 1 시간 이하, 통상 5분이나 그 이하의 시간내에 판독이 가능하다. 본 발명에서, "신속한 분석 (rapid assay)" 이란 용어는 1시간 이내, 바람직하게는 반시간 이내에 진행될 수 있는 분석 또는 테스트를 의미한다. 본 분석은 가장 바람직하게는, 환자의 치아 플라크, 타액 또는 양치액 샘플을 본 발명에 따른 장치에 적용한 때로부터 거의 5분 이내에 또는 그 보다 적은 시간내에 완전히 판독이 가능하다.
상기한 바와 같이, 치주질환은 인류에 나타나는 가장 흔한 질환의 하나이며, 성인이 치아를 잃는 가장 흔한 이유가 된다. 본 발명은 타액, 플라크 군집 또는 양치액을 사용하여, 숙주에 상주하는 세균 플라크 군락의 일반적인 성질을 나타내도록 함으로써 환자에 있어서 특정 세균 종과 관련된 미생물 단백분해효소 레벨를 신속하게 검진할 수 있다. 이러한 정보는, 다른 한편으로 치주질환에 대한 진단, 위험성 평가, 치료계획 및 치료효과의 모니터링을 도와줄 수 있다. 특정부위의 플라크를 사용함으로써 이러한 정보를 부위를 결정하는데 이용할 수 있다. 본 발명은 제도적인 치주질환 진단 및 위험성 평가 프로그램의 기초로서 계획되었다. 위험성 평가 프로그램에 있어서 본 발명의 가치는 치주질환의 진행정도에 따른 위험을 알게 됨으로써 치료수단이 가장 효과적이고 효율적인 방법으로 조정된다는 것이다. 본 발명의 일차적인 유용성으로는 다음과 같은 것들이 있다: 1) 미생물 단백분해효소 활성은 치주질환의 정도와 치주질환에 관계된 세균종 양쪽 모두에 밀접하게 관련되어 있으며; 2) 본 분석은 숙주와 미생물 단백분해효소 사이에 간단하면서도 유일한 차이점을 만들며; 3) 본 발명은 약 5분 이내에 수행·판독될 수 있으며; 4) 본 분석은 저렴하며; 5) 본 분석은 간단하고, 사용이 기술적으로 용이하며, 보조원에 의해서도 쉽게 수행될 수 있다. 본 발명은 환자가 의자에 앉아 있는 채로 바로 명확한 결과가 얻어져 치과 수술에서 이용될 수 있다.
간략하게, 본 발명은 미생물 단백분해효소 활성을 검출하기 위해 간단하고 반정량적인 발색반응을 이용하는 분석방법 및 장치이다. 치주질환에 적용되는 본 방법은, 문제되는 구강세균을 함유하는 것으로 추정되는 샘플을 환자로부터 수집하는 것을 포함한다. 상기 샘플은 치아 플라크, 타액 및 양치액를 수집하는 공지된 모든 기술에 의해 수집될 수 있다. 샘플은 일반적으로 희석되지 않고 적당한 샘플배지에 결합될 수 있다. 샘플 또는 샘플 함유 배지의 부분표본이 고상의 기질(solid phase substrates), 바람직하게는 관류필터(flow-through filter) 타입 장치 (예를 들어, Devaron, Inc., Dayton, NJ 에서 판매하는 장치) 또는 오프란디(Oprandy)의 미국특허 5,039,493 에 기술된 것과 같은 장치에 설정된다. 여기에 있는 미생물은 기계적인 압류에 의해 일차적으로 고상기질의 필터 표면에 고정화되고, 상기 기질은 인산완충식염수로 세척된다. 상기 고상기질로는 니트로셀룰로스 필터 배지와 같은 알려지지 않은 일반적으로 사용되는 어떠한 기질 또는 오프란디가 기술하고 있는 어떠한 물질도 사용될 수 있다. 일단, 알려지지 않은 샘플의 미생물이 고상기질에 고정화되고 세척되면, 필터 표면이 SAAPFpNA 또는 미생물 단백분해효소에 대한 다른 파라-니트로아닐라이드 펩타이드 기질 또는 파라-니트로아닐라이드 아미노산 기질과 접촉되어 효소기질 말단-산물 (enzymatic substrate end-product)을 만든다. 필터상에 효소기질 말단-산물이 만들어진 다음에는, 미생물 단백분해효소 활성에 대해 선택성이 있는 증강된 발색반응(chromogenic reaction)을 일으키는 파라-디메틸아미노신남알데히드(para-dimethylaminocinnamaldehyde) 시약과 접촉하게 된다. 비록 숙주에서 유래하는 키모트립신 같은 몇몇 단백분해효소가 혈중, 혈청 또는 치육구액(gingival crevicula fluid)이나 숙주 단백분해효소-함유용액이 있는 경우 이 용액으로 분포된다 해도, 일반적으로 오직 고정화 단백분해효소 함유 미생물만을 분리하여 반응시키면서 기질필터표면을 통과한다. 일단 표시가 되면, 발색반응의 결과 나타난 색의 상대적 강도를 분석함으로써 샘플내 단백분해효소 활성량이 반정량화될 수 있다.
본 발명은 다른 형태로도 실시될 수 있다. 본 발명은 일차적으로 구강유래 미생물 단백분해효소를 검출하기 위한 것이나, 거의 아무런 변형없이도 본 장치는 다른 임상, 실험실 검체 및 샘플, 예를 들어 소변, 땀, 눈물, 혈액, 혈청, 대변, 위액, 활액, 객담 및 미생물 배양물에서 미생물 단백분해효소 활성을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 변형실시예에서는, 다양한 미생물 단백분해효소 활성을 검출하기 위해 효소기질 조합이 이용될 수 있다. 마찬가지로, 이러한 효소기질 조합과 반응하는 다른 화학적 증강제가 이용될 수 있다. 그 밖의 변형실시예에서는, 장치의 필터표면에 숙주 단백분해효소가 잔류되는 것을 최소화하기 위해 적절한 차단제로 고상기질장치를 미리 차단 (pre-blocked)시킬 수 있다. 또한, 고상기질은 여기에 기술된 형태와 정확하게 일치될 필요는 없다. 동일한 발명사상 내에서, 본 발명은 쉽게 "딥 스틱(dip stick)" 또는 다른 유사한 기술로 변형될 수 있다.
본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 다음의 실시예는 키모트립신을 검출하는 본 발명의 특정한 적용예를 나타내는 것으로서, 본 발명을 수행하기 위해 지금까지 알려진 최적의 실시예 (the best mode)를 포함한다. 또한, 다음의 실시예는 위에서 기술한 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
플라크, 타액 또는 양치액 샘플에서 키모트립신류 활성을 분석하는 법이 4개의 단순하고 신속한 단계로 기술된다.
1. 희석되지 않은 타액 샘플 5㎕가 고상기질 관류 여과장치(Devaron, Inc., Dayton, NJ, 0.45 ㎕)에 스폿(spot)된다. 또는, 동일한 구강내의 특정 부위 또는 수개의 부위로부터 집적된 사람 치아 플라크의 임상 샘플이 정균된 인산-완충 식염수(PBS), pH 7.4 에 수집되고, 현탁액 5㎕가 상기 여과장치에 스폿된다. 용액은 상기 여과장치 표면을 통해 용액이 배수될 수 있다. pH 7.4의 상기 PBS 용액은 다음과 같이 만들어 진다.
PBS, pH 7.4 1L
증류수 1000 ㎖
NaCl 8.0 g
KH2PO40.2 g
Na2HPO4.12H2O 2.9 g
KCl 0.2 g
NaN30.2 g
2. 필터표면에 PBS 1적(滴)을 가함으로써 스폿된 여과장치 표면이 세척되며, 그것은 배출된다.
3. 석시닐-알라닐-알라닐-프롤릴-페닐알라닐-파라-니트로아닐라이드
(succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-phenylalanyl-para-nitroanilide) (SAAPFpNA) (no. L-1400, lot no. 500481, Bachem Bioscience Inc., King of Prussia, PA) 효소기질 용액은, 0.20M 트리스 완충액 (Tris buffer : Trizma Base, no. T-1503, lot no. 97F-5605, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 1㎖ 당 SAAPFpNA 3.0㎎을0.02% 소듐 아자이드(sodium azide), pH 7.6 또는 PBS 로 용해시킴으로써 만들어진다. 실온에서 이 용액 1적(50㎕)을 필터 표면에 가한 다음 배출되도록 한다.
4. 화학적 증강제인 파라-디메틸아미노신남알데히드 (no. D-4506, lot no. 17F-0558, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)는, 파라-디메틸아미노신남알데히드 0.234g을 에탄올 78㎖에 가하고 농염산 10㎖를 가한 후 물을 가해 100㎖로 만들어 줌으로써 얻어진다. SAAPFpNA를 적용시키고 나서 3분 후에 이 화학적 증강제 2적(100㎕)을 필터 표면에 가하고, 배출되도록 한다. 키모트립신류 활성에 대해 양성일 경우에는, 샘플이 스폿된 부분이 적-자주색으로 변하는데 키모트립신류 활성의 정도에 따라 강도가 변한다. 키모트립신류 활성에 대해 양성인 경우의 색상변화는 도 1a에 예시되어 있다. 또한, 키모트립신류 활성에 대해 음성인 경우의 색상 변화는 도 1b에 예시되어 있다. 이러한 분석은 5분 또는 그 이하의 시간내에 완료된다.
본 분석을 수행하는데 있어서 상기에서 특정된 것과 정확하게 일치시킬 필요는 없다. pH, 온도, 임상·실험실 검체 및 샘플, 효소기질, 증강제 또는 다른 시약의 농도 및 반응조건이 변할 수 있다. 바람직한 상업적 실시형태에 있어서, 고상기질 관류여과장치는 본 분석을 수행하는데 필요한 물질, 시약 및 지시사항과 함께 패키지 포장될 수 있다. 필요할 경우, 상기 패키지에서 고상기질여과장치를 제외시킬 수 있으며, 또한 필요할 경우 장치의 필터 표면에 단백분해효소를 함유하고 있다고 생각되는 샘플을 위치시킬 수도 있다. 필터표면이 세척되고, SAAPFpNA 같은 효소기질이 적용된 후, 단시간 내에 파라-디메틸아미노신남알데히드 같은 화학적 증강제가 첨가되어 단백분해효소 활성이 존재할 경우 검출가능한 발색반응을 일으키게 된다. 만일, 어떤 레벨의 단백분해효소 활성, 예를 들어 키모트립신류 단백분해효소 활성이 존재하면, 도 1a에 도시된 것과 같이 색이 변하게 된다.
본 발명은 치주질환 환자를 검사하거나 환자에 있어서 특정 부위의 진단과정을 보조하는 것; 치주질환이 발생할 위험이 있는 환자 또는 부위를 모니터링 하는 것; 치주질환의 치료계획을 세우는 것; 및 환자 또는 일정 부위에 대해 치주질환 치료효과를 모니터링하는 것을 도울 수 있다. 통상적인 임상진단방법 및 위험성 평가방법은 구강내에 존재하는 세균 프로필에 기초하지 않고, 일반적으로 오류가 수반될 수 있는 주관적인 임상증상에만 기초한다. 본 발명은 이러한 주관성을 많이 배제하고 반정량적인 데이터 (semi-quantitative data) 에 의해 치료가 결정될 수 있도록 한다.
본 발명의 최대 특징은 숙주 단백분해효소로부터 미생물 단백분해효소를 신속하고 간단하게 분리할 수 있다는 데 있다. 이것은, 고상기질에 필터표면을 사용하여, 숙주에서 유래되는 물질을 함유하고 숙주 단백분해효소를 함유할 가능성이 있는 다른 용액을 통과시키는 동시에, 미생물 및 그 구성성분을 억류시킴으로써 수행될 수 있다. 이렇게 해서, 필터표면에 잔류하는 단백분해효소는 1차적으로 미생물에서 유래한 것이 된다.
또한, 본 발명은 신속하고, 저렴하며, 사용이 간단하고 보조원에 의해서도 쉽게 수행될 수 있다. 본 방법은 기술적으로 복잡하지 않고 민감하며, 선택성이 있고 반정량적이다. 본 방법은 환자가 의자에 앉은 채로 또는 심지어 대기실에서 명확한 결과가 얻어져 임상에서 이용될 수 있으며, 이로써 보다 신속한 치료결정이 내려질 수 있도록 한다.
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상술한 바와 같이, 본 발명의 범위내에서 많은 변형과 변화가 가능하다는 것은 명백하다. 따라서, 다음에 기술하는 특허청구범위의 범위내에서 본 발명이 특정된 것과 다른 형태로 수행될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 위에서 기술한 기술사상은 쉽게 변형되거나 또는 발명요지를 벗어나지 않는 범위내에서 다양하게 응용될 수 있으므로, 이러한 응용과 변형은 상술한 실시형태와 동일성 범위내에 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 여기서 사용된 용어나 구절은 본 발명을 설명하기 위한 것이지 한정하기 위한 것이 아니라는 점이 이해되어야 한다.

Claims (8)

  1. 임상 및 실험실 샘플에서 미생물 단백분해효소 활성을 신속하게 검출하는 분석장치로서,
    (a) 원하는 단백분해효소 활성을 지닌 미생물을 함유하고 있는 것으로 추정되며, 치아 플라크, 타액, 양치배출액, 소변, 땀, 눈물, 혈액, 혈청, 대변, 위액, 활액, 객담, 배양배지 및 다른 임상, 실험실 검체와 샘플로 구성된 그룹으로부터 선택되는 샘플;
    (b) 상기 샘플내의 원하는 미생물을 고정화하고, 숙주 단백분해효소가 함유될 수 있는 다른 용액과 물질을 배출시킬 수 있는 고상의 기질(solid phase substrates);
    (c) 상기 고상기질에 고정화된 원하는 미생물에 적용되어 효소기질 말단-산물(enzymatic substrate end-product)을 생산하는 효소기질; 및
    (d) 상기 효소기질 말단-산물과 반응하여 검출가능한 발색반응을 일으키는 화학적 증강제로 이루어지는 분석장치.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 효소기질은 미생물 단백분해효소에 대한 파라-니트로아닐라이드 펩타이드 기질 및 파라-니트로아닐라이드 아미노산 기질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석장치.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 미생물 단백분해효소는 파라-니트로아닐라이드 펩타이드 기질 및 파라-니트로아닐라이드 아미노산 기질과 반응하는 미생물 단백분해효소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석장치.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 미생물 단백분해효소는 키모트립신류 단백분해효소(chymotrypsin-like proteases), 트립신류 단백분해효소(trypsin-like proteases) 및 콜라겐아제(collagenases)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석장치.
  5. 임상 및 실험실 샘플에서 미생물 단백분해효소 활성을 신속하게 검출하는 분석방법으로서,
    (a) 원하는 단백분해효소 활성을 지닌 미생물을 함유하고 있는 것으로 추정되며, 치아 플라크, 타액, 양치배출액, 소변, 땀, 눈물, 혈액, 혈청, 대변, 위액, 활액, 객담, 배양배지 및 다른 임상, 실험실 검체와 샘플로 구성된 그룹으로부터 선택되는 샘플을 얻고;
    (b) 숙주 단백분해효소가 함유될 수 있는 다른 용액과 물질은 배출시키면서 원하는 미생물을 고정화할 수 있는 고상의 기질과 상기 샘플을 접촉시키고;
    (c) 상기 고상기질에 고정화된 원하는 미생물과 효소기질을 접촉시켜 효소기질 말단-산물(enzymatic substrate end-product)을 생산하고;
    (d) 상기 효소기질 말단-산물과 화학적 증강제를 접촉시켜 발색반응 또는 신호를 형성하고; 및
    (e) 상기 발색반응 또는 신호를 검출하는 것으로 이루어지는 분석방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 효소기질은 미생물 단백분해효소에 대한 파라-니트로아닐라이드 펩타이드 기질 및 파라-니트로아닐라이드 아미노산 기질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 미생물 단백분해효소는 파라-니트로아닐라이드 펩타이드 기질 및 파라-니트로아닐라이드 아미노산 기질과 반응하는 미생물 단백분해효소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 미생물 단백분해효소는 키모트립신류 단백분해효소, 트립신류 단백분해효소 및 콜라겐아제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
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