KR20000052802A

KR20000052802A - 생물학적 샘플내의 상승 조절 및 하강 조절된 단백질의 특성화를위한 프로테옴 분석

Info

Publication number: KR20000052802A
Application number: KR1019990703621A
Authority: KR
Inventors: 모세라르센페터; 페이스테판제이
Original assignee: 모세 라르센 페터; 페이 스테판 제이
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2000-08-25
Also published as: JP2007248476A; JP4376925B2; US6611766B1

Abstract

약품 선별 및 테스트를 포함하여 비정상적인 또는 복합 치료 조건과 같은 상이한 조건하에서 상승 조절 또는 하강 조절된 단백질을 특성 분석하기 위하여 세포 프로테옴을 분석하는 방법 및 컴퓨터 시스템을 제공한다. 또한, 상기 방법 및 컴퓨터 시스템을 사용하여 특성 규명되는 단백질 및 엔코딩 또는 보충 핵산을 제공한다.

Description

생물학적 샘플내의 상승 조절 및 하강 조절된 단백질의 특성화를 위한 프로테옴 분석{PROTEOME ANALYSIS FOR CHARACTERIZATION OF UP- AND DOWN-REGULATED PROTEINS IN BIOLOGICAL SAMPLES}

단백질 및 2차원 겔 전기영동. 2차원 겔 전기영동(2-DGE)은 단백질의 혼합물을 분리하기 위해 특히 유효한 도구이다. 세포 단백질 추출물은 겔 위에 놓여지고, 개개의 단백질은 먼저 전하에 따라, 그 다음에 크기에 따라 분리된다. 그 결과는 1000 내지 5000 스폿 정도의 특성도로 되고 그 각각은 일반적으로 단일 단백질로 된다. 분해능은 겔 크기를 증가시킴으로써, 그리고 방사성 동위원소법은 염색(silver staining)을 사용하고 겔의 두께를 1.5 mm 이하로 감소시켜 감응도를 향상시킴으로써 개선될 수 있다. Jungblut 등에 의한 Journal of Biotechnology 41:111-120(1995)에는 최대 5000까지의 단백질 스폿이 23 × 30 cm의 겔 상에서 쥐의 뇌세포 추출물로부터 얻을 수 있다고 보고되어 있다.

염기성 단백질 및 산성 단백질을 분석하는 데는 고분해능의 2-DGE가 사용되어 왔다. 1차원에서의 등전(isoelectric) 포커싱(SDS)은 2차원에서의 나트륨 도데실설페이트 (SDS) 겔 전기영동(IEF-SDS)과 혼합될 수 있다. 이와는 달리, 1차원에서의 비평형 pH 구배 전기영동(NEPHGE)은 2차원에서의 SDS 겔 전기영동(NEPHGE-SDS)과 혼합될 수 있다. 이러한 절차는 O'Farrell, J. Biol, Chem. 250:4007-4021 (1975) 및 O'Farrell et al., Cell, 12:1133-1142 (1977)에 개시되어 있고, 이 문헌들은 여기에 인용함으로써 이 명세서에 포함된 것으로 한다. NEPHGE 겔들은 단백질의 등전점(isoelectric point)을 결정하기 위해 사용될 수 없다. 단백질의 등전점은 일반적으로 공지의 단백질에 대하여 안정한 pH 구배에서 결정된다. O'Farrell(1977)에서 설명되어 있는 바와 같이, 산성 단백질의 양호한 분해능은 평형 IEF로 얻어진다. 염기성 단백질의 양호한 분해능은 pH 7-10 NEPHGE 겔로 얻어질 수 있다. 단백질의 전체 범위의 최고 분해능을 위하여 2개의 겔, 즉 산성 단백질에 대한 IEF 겔과 염기성 단백질에 대한 NEPHGE 겔이 사용된다. pI에 따라 단백질을 분리하는 다른 방법은 공지의 방법에 따라 고정화된 pH 구배 겔 전기영동(IPG)을 사용할 것이다.

일단 2-DGE 겔이 얻어지면, 단백질은 염색(코오마시에 블루, 은 또는 금), 형광(샘플이 예컨대 모노브로모바이메인으로 적절히 준비되어 있는 경우), 또는 X 레이 또는 인(phosphor) 촬상판 상에 포착된 이미지(샘플이 예컨대 [35S]-메티오닌, [14C]-아미노산, 또는 [32P]-인산염으로 방사능적으로 라벨붙여진 경우)를 포함하는 여러가지 방법으로 가시화될 수 있다. 염색된 형광 이미지는 예를들면 카메라를 사용하여 전자식으로 포착되어지고, X 레이 필름 및 인 촬상판은 전자 이미지를 생성하도록 적절한 장치에 의해 주사(scan)된다. 예를 들어 전기영동 후에, 2-DGE 겔은 AMPLIFY(Amersham)으로 처리되고 건조되어진 메타놀 및 아세트산으로 고정될 수 있다. 겔은 X 레이 필름의 동적 범위의 부족을 보상하기 위하여 많은 시간동안 노출될 수 있다. 각각의 필름 이미지는 상이한 위치, 크기, 형상 및 광학 밀도를 갖는 많은 스폿(spot)을 포함한다. 이미지 상의 스폿들은 그 스폿들과 단백질 사이의 대응성을 판단하기 위해 분석된다. 인 촬상 기술을 이용하면 인 촬상판의 응답이 선형이고 다중 노출에 대한 필요성을 제거하고 필름의 비선형 응답을 피하는 1:100,000의 범위를 커버하기 때문에 바람직하다.

2DGE 겔의 분석. 겔 이미지의 시각 검사(visual inspection) 및 분석은 분해가능한 스폿의 수 이내로 제한된다(Jungblut et al., In; Neuhoff, V. (ed.) Electrophoresis, Verlag Chemie GmbH, Weinheim, p.301-303;(1984); Andersen et al., Diabetes, Vol. 44:400-407(April, 1995)). 또한, 겔의 크기를 증가시키면 시각 분석이 어려워지고 시간이 많이 소모된다. 하나의 필름을 분석하는 데는 경험있는 전문가 수준의 사람에 의해 실시되더라도 적어도 8-20 시간이 소요된다. 더 나아가서, 시각 분석에 의한 정량화는 제한된다. 일반적으로, 시각 분석은 2 이상의 인수의 단백질 양에서의 변화만을 검출할 뿐인다.

정량화를 증대시키고 개개의 겔 필름의 평가를 돕기 위하여, 예컨대, PDQUEST(Protein Database Inc., New York), BioImage(Ann Arbor, MA, USA), Phoretix(Phoretix International, Newcastle, UK), 및 Kepler(Large Scale Biology Cerporation, Rockville, MD) 등과 같은 각종의 컴퓨터 프로그램 및 컴퓨터 평가 시스템이 개발되어 있다. BioImage와 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하기 위하여, 겔 필름 상의 이미지는 일반적으로 디지탈 카메라를 이용하여 주사 또는 포착되고, 디지탈 이미지는 컴퓨터의 메모리 또는 기억 장치에 저장된다. 디지탈화된 겔 이미지는 컴퓨터 프로그램에 의해 분석된다. 각각의 스폿은 집적 광학 밀도 퍼센트(IOD%)와 같은 농도값 및 "X, Y" 테카르트형 좌표와 같은 겔 상의 위치가 할당된다. BioImage와 같은 컴퓨터 프로그램은 분해능에 있어서의 최고 품질 및 스폿 위치의 최고 재현성을 필요로 한다. 겔 배지는 탄성이 있기 때문에 겔 패턴들은 동일하지 않다. 즉, 본질적으로 동일한 조건에서 얻어진 2개의 겔이라도 정확히 동일 위치에 위치된 단백질 스폿을 갖지 않을 것이다. 만일 2개의 겔이 본질적으로 동일하지 않은 조건에서 얻어진 것이면 대응하는 단백질 스폿의 위치의 변화가 더 커질 것이다.

상기 설명한 것과 같은 컴퓨터 평가 시스템들은 겔 이미지에 대한 "스폿 목록"의 발생을 위해 스폿 농도 및 IOD%의 정량화를 개선시켜 왔다. 그러나, 그러한 컴퓨터 평가 시스템들은 편집을 위해 아직까지 상당한 오퍼레이터의 노력을 필요로 한다. 평가 대상의 겔 이미지는 예를 들면 스캐닝에 의해 컴퓨터에 입력된다. 디지탈 이미지는 감응도 임계치 이상의 농도 또는 광학 밀도를 갖는 스폿들을 배치하기 위해 조사된다. 그 다음에 오퍼레이터는 겔 이미지를 편집한다. 예를 들어 2개의 매우 큰 스폿들이 인접해 있으면, 컴퓨터는 이 2개의 스폿을 하나의 긴 스폿으로 인식할 수 있다. 컴퓨터는 실제로 2개의 스폿이 있다는 것을 해석하지 못할 수 있다. 이 때는 오펴레이터가 그 스폿을 2개의 스폿으로 분리하기 위하여 수동적으로 편집하여야 한다. 다른 또 하나의 예로서, 컴퓨터는 고농도 선과 같은 겔 이미지 상의 비단백질 스폿을 단백질 스폿으로 잘못 인식할 수도 있다. 이 때, 오퍼레이터는 비단백질 스폿을 삭제하기 위해 이미지를 수동으로 편집해야 한다. 숙련된 오퍼레이터가 통상의 컴퓨터 평가 시스템을 이용하여 평가된 겔 이미지를 편집하는 데는 6-8 시간이 걸릴 수 있다. 이러한 수동 편집은 분석에 상당한 정도의 주관(subjectivity)이 들어가게 되고, 이것은 2D 겔 이미지의 분석에 있어서의 주요 단점으로 된다. 전체의 분석을 동일한 오퍼레이터가 수행하도록 함으로써 상기한 단점을 줄이려고 하는 시도가 있기는 하지만, 여기에는 오퍼레이터가 스폿들을 어떻게 정의하고 또 컴퓨터가 어떻게 정의하는지에 대한 차이 때문에 한계가 있게 된다. 이 때문에 분석에 상당한 정도의 오류가 발생하게 된다.

1995년에 Jungblut 등에 보고되어 있는 바와 같이, 많은 연구자들은 각종 조직 또는 세포 형태에 대한 2-DGE 데이터 베이스를 생성하기 위하여 통상의 평가 시스템을 사용하여 왔다. 그러나, 이 시스템들은 새로운 겔 이미지에 대한 정확한 스폿 목록을 생성하기 위하여 오퍼레이터가 상당한 노력을 행하여야만 한다. 더 중요한 것은 통상의 컴퓨터 평가 시스템들이 오퍼레이터가 새로운 겔 이미지를 신속히 그리고 효율적으로 분석하고 해석할 수 있게 하는 동일 세포 형태의 다른 겔 이미지로부터의 정보를 이용하는 분석 및 해석 도구를 제공하지 못한다는 것이다. 통상의 컴퓨터 평가 시스템들은 단지 소량으로만 존재하는 단백질을 신뢰성있게 검출하는 데에 사용될 수 없다. 따라서, 새로운 겔 이미지를 분석하고 해석함에 있어서 오퍼레이터의 노력을 저감시키고 속도를 증대시키는 컴퓨터 분석 시스템이 필요하게 되었다. 또한, 동일 세포 형태의 다른 겔 이미지로부터의 정보를 이용하는 새로운 겔 이미지 분석 및 해석 용 컴퓨터 분석 시스템이 필요하게 되었다.

종래의 대부분의 컴퓨터 평가 시스템들은 또한 겔 이미지 그룹들 사이의 통계적 비교를 위한 분석 도구를 제공하지 못한다. 따라서, 새로운 겔 이미지를 분석 및 해석할 수 있을 뿐만 아니라 각종의 겔 이미지 그룹들 사이의 통계적 비교를 실행할 수 있는 컴퓨터 분석 시스템이 또한 필요하게 된다.

그러므로, 질병에 있어서 어떤 단백질 또는 핵산이 상승 조절 또는 하강 조절되어야 하는지를 결정하기 위한 방법 및 분석 시스템과 단백질 진단용 또는 치료용 조성물을 시험하기 위한 방법 및 시스템, 그리고 그러한 질병을 진단하거나 치료하기 위한 방법을 제공할 필요가 있다.

본 발명은, 분자 생물학 및 컴퓨터 이미지 분석 분야에 있어서, 진단 또는 치료 응용을 위해 변형 상태 또는 비변형 상태에서 상승 조절 또는 하강 조절된 세포질 또는 숨겨진 단백질 및/또는 핵산을 특성화하기 위하여 생물, 기관, 조직, 생검(biopsies), 1차, 2차 또는 확립된 세포주 및 체액(혈청, 혈장, 뇌척수액, 소변 등, 또는 배지)(이하, '세포'라 한다)의 프로테옴을 분석하기 위한 방법 및 컴퓨터 시스템에 관한 것이다. 상기의 방법 및 컴퓨터 시스템을 사용하여 특성화된 단백질은 또한 진단 응용에서 사용하기 위해 펩티드 단편 및 단백질 또는 단편을 엔코딩하는 핵산과 함께 제공된다.

도 1은 본 발명의 방법의 일실시예를 도시하는 블록도이다.

도 2는 본 발명에 사용하기에 적합한 일례의 컴퓨터 시스템에 대한 블록도이다.

도 3은 데이타베이스, 내부 검정(intraassay) 분석 및 상호 검정(interassay) 분석 방법을 도시하는 도면이며, 여기서 데이타베이스 분석은 10% IEF, 15% IEF, 10% NEPHGE 및 15% NEPHGE의 4개의 하위군(subgroup)의 각각에 대해 시행되는 한편, 상호 검정 분석은 15% IEF와 15% NEPHGE에 대해서만 시행된다. 각 데이타베이스는 한 세트의 겔내에서 분석된 5개의 상이한 섬 분리물로 구성된다. 내부 검정 분석은 한 세트의 겔내에서 분석된 동일 샘플의 5개의 겔로 구성되는 반면, 상호 검정 분석은 다른 날에 연속 세트의 겔내에서 분석된 동일 샘플의 5개의 겔로 구성된다. 데이타베이스, 내부 검정 분석 및 상호 검정 분석을 위해 상이한 분리물이 사용된다. 컴퓨터 분석 전에, 각 하위군내의 한 겔이 "주 겔(master gel)"로서 임의적으로 선택되어 다른 4개의 데이타베이스 겔, 5개의 내부 검정 겔 및 5개의 상호 검정 겔과의 비교에 이용된다. "주 겔" 데이타베이스는 소정 스폿이 3개의 일련의 분석에서 동일 대조 번호를 갖고 있다는 것을 확증하기 위해 내부 검정 분석 및 상호 검정 분석을 위한 주로서 이용된다. "주 겔"에서 얻은 데이타는 데이타베이스 분석에 포함된다. "주 겔"은 4개의 하위군 모두에서의 동일한 분리물로부터 얻어지는 반면, 4개의 다른 데이타베이스 겔을 생성하는 분리물의 동일성은 하위군마다에 대해 다소 변화한다(표 3).

도 4는 본 발명에 따른 방법에 의해 질병 관련 단백질(즉, 치료, 질병 또는 면연학적인 상태와 관련된 변경된 발현을 나타내는 단백질)을 선택 또는 식별하는 통계적인 접근 방식을 도시하는 흐름도이다. "정상 1", "정상 2" 및 "정상 3"으로 표시된 겔 이미지는 정상 제어 세포로부터의 프로테옴의 겔로부터 얻어진다. "질병 1", 질병 2" 및 "질병 3"으로 표시된 겔 이미지는 질병 세포와 같은 변형된 세포로부터의 겔에서 얻어진다. 겔 이미지 주 복합체 스폿 데이타 목록("정상 복합체"로 표지됨)는 각각의 정상 또는 제어 단백질의 가변성의 통계값을 포함하는 제어 이미지의 복합체이다. 겔 이미지 주 복합체 스폿 데이타 목록("질병 복합체"로 표지됨)는 각각의 질병 또는 변형된 단백질의 가변성의 통계값을 포함하는 질병 또는 변형된 이미지의 복합체이다. "데이타베이스"로 표시된 하단 겔 이미지는 질병, 치료 또는 면연학적으로 변형된 상태에 의해 변형된 단백질을 식별하기 위해 정상 복합체와 질병 복합체간의 통계적인 비교를 포함한다.

도 5A 및 도 5B는 RPMI 1640 + 0.5% 표준 인간 혈청내에서 24시간 동안 배양되고 (³⁵S)-메티오닌으로 4시간 동안 표지한 신생 쥐 랑겔한스섬의 10% 2차원 데이타베이스의 "주 겔"의 형광사진이다. 우측은 등전 집중 처리(IEF: pH 3.5∼7)를 시행한 겔이고, 좌측은 비평형 pH-구배 전기영동(NEPHGE; pH 6.5∼10.5) 겔이다. 화살표는 IL-1β에 의한 발현에서 변경된 105개의 스폿을 가리킨다. 번호는 10% IEF 및 NEPHGE DB의 대조 번호에 대응한다.

도 6A 내지 도 6E는 신생 쥐 섬 단백질(neonatal rat islet protein)의 10% IEF DB의 2차원 겔의 확대 영역을 도시하고, 도 6F 내지 도 6H는 IL-1β노출된 섬의 겔의 대응 영역을 도시하며, 구체적으로는 도 6A는 겔 DB3를, 도 6B는 겔 DB6를, 도 6C는 겔 DB8을, 도 6D는 겔 DB9를, 도 6E는 겔 DB10("주 겔")를, 도 6F는 겔 IL1A를, 도 6G는 겔 IL1B를, 도 6H는 IL1C를 도시한다. 스폿 번호는 데이타베이스의 번호에 대응한다. 10% IEF DB에서, 스폿의 %IOD의 CV%는 다음과 같다. 382:16.7%; 387:17.6%; 471:60.2%; 480:13.9%; 483:14.6%; 484:14.6%; 484:15.4%; 561:18.9% 및 563:47.1%.

도 7A 내지 도 7D는 각각의 DB 하위군의 분석(도 7A: NEPHGE 15%; 도 7B: NEPHGE 10%; 도 7C: IEF 15%; 도 7D: IEF 10%)에 대해서 □, *, + 및 ■ 로 표시된 5개의 겔의 스폿의 공간적인 위치를 도시한다. 스폿이 2개 이상의 겔에서 나타날 때에는 주 이미지의 좌표가 사용된다. 스폿이 오직 하나의 겔에서만 나타날 때에는 소정 겔의 좌표가 사용된다.

도 8A 내지 도 8D는 각 하위군의 분석에 대한 그래픽 데이타를 도시하며(도 8A: NEPHGE 15%, 도 8B: NEPHGE 10%, 도 8C: IEF 15%, 도 8D: IEF 10%), 여기서 5개의 겔의 5에 나타나는 스폿은 총 적분된 광학 밀도의 평균 백분율(%IOD)의 변동 계수(CV%)를 증가시킨 후에 배열되었다. "0" 및 "100"에 대한 그래프 상의 기호는 각각 각 하위군의 %IOD의 최저 및 최고 CV%를 갖는 스폿의 CV% 이다. 소정 백분율의 CV%는 5%, 10%, 20% 등의 최저 CV%를 갖는 실제 스폿의 CV%이다.

도 9A 내지 도 9D는 10%와 15%의 IEF 및 NEPHGE DB내의 5개의 겔의 5에 나타나는 각각의 스폿에 대한 그래픽 데이타를 도시하며(도 9A: NEPHGE 15%, 도 9B: NEPHGE 10%, 도 9C: IEF 15%, 도 9D: IEF 10%), 총 통합된 광학 밀도의 평균 백분율(%IOD)이 계산되어 있다. 각각의 하위군 분석에 대해, 스폿은 평균 %IOD를 증가시킨 후에 배열되었다. 도면에는 모든 스폿(삽입 도면) 및 %IOD≤1 인 스폿(메인 도면)에 대한 회귀 라인과 95% 신뢰 구간이 도시되어 있다. 메인 도면에는 다음의 총스폿수의 비율이 포함된다: IEF 15% DB: 1224/1235(99.1%); NEPHGE 15% DB: 547/557(98.2%); IEF 10% DB: 981/995(98.6%); NEPHGE 10% DB: 366/378(96.8%). 회귀 분석의 결과는 다음과 같다: IEF 15% DB: y=46.1-0.093x, R²=0.0160, p=0.00282; NEPHGE 15% DB: y=44.7-0.028x, R²=0.0160; IEF 10% DB: Y=47.3-0.165x, R²=0.0317, p=0.00(t=-5.69); NEPHGE 10% DB: y=43.9-O.O6Ox, R²=0.0273, p=0.00127.

본 발명은 생물, 기관, 조직, 생검, 1차, 2차 또는 확립된 세포줄 및 체액(혈청, 혈장, 뇌척수액, 오줌 등, 또는 배지)(이하 '세포'라 한다)의 특정 세포 형태의 프로테옴들의 이미지를 분석하기 위한 방법과 컴퓨터 시스템에 관한 것이다. 프로테옴들은 치료된, 병든, 또는 면역학적으로 변형된 조건에서 상승 조절 및 하강 조절된 단백질들이나 핵산들의 특성화를 위해 분석된다. 따라서, 본 발명은 그러한 단백질들이나 핵산들을 단편화, 프로브 그리고 관련된 진단 및 치료의 합성들과 방법들 뿐만 아니라 정제된 또는 분리된 형태로 제공한다.

하나의 측면에서, 본 발명은 변형된 단백질들과 변형되지 않은 단백질들을 확인하거나 특성화하기 위한 방법 및 컴퓨터 시스템을 제공하기 위한 것인데, 이는 정상 세포와 치료된, 병든, 면역학적으로 변형된 세포―시험관내 또는 생체내에서, 그 세포들은 특이 세포형으로부터 얻어지고, 세포주들은 그것으로부터 얻어진다―를 구분한다. 그 샘플은 기록된 이미지들 뿐만 아니라 변형 또는 비변형 단백질들을 구성하는 2DGE 겔을 제공하기 위해 2DGE로 적용될 수 있다.

이 이미지들은 다색상이나 흑백일 수 있다[다색상 이미지는 세 개의 그레이 스케일(grey scale) 범위를 가질 수 있고, 따라서 아래에 설명된 것과 같은 방법으로 분석될 수 있다]. 비록 당업계에서는 그 이미지의 묘사를 위해 세 가지 주된 색상이나 그것들의 조합까지 연장하는데 어려움이 없으나, 단지 이 명세서에서의 설명을 위해, 하나의 그레이 스케일만이 고려된다.

생물 공학에 있어서, 장치들은 노던(Northern), 서던(Southern) 또는 웨스턴(western) 블롯(blots), 1 차원 겔 전기영동(1DGE) 겔들 및/또는 2DGE 겔들을 포함하나, 그것들에 한정되지 않는다. 본 발명은 아래에 단백질을 확인하기 위해 겔 전기영동 이미지를 분석하는 것과, 핵산을 엔코딩하는 것과, 단백질이나 핵산 발현의 변화를 확인하기 위해 겔 이미지들을 비교하는 것에 관하여 기재되었다.

본 발명의 한가지 측면에서는, 이미지를 분석하는 방법이 제공된다. 그 방법은 다음의 단계들 중 적어도 하나의 단계를 포함한다. 그 단계들은 다음과 같이, 그러나 (1) 내지 (3)에 한정되는 것이 아니라, (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11) 또는 (12)를 포함한다.

(1) 새로운 이미지를 포착하는 단계. 여기에서 새로운 이미지는 전기영동 겔 내의 하나 또는 그 이상의 단백질들의 복수 개의 새로운 이미지 스폿들을 포함하고, 각각의 새로운 이미지 스폿들은 스폿 번호, 집적된 광학 밀도 퍼센트(IOD%) 및 위치를 가진다.

(2) 새로운 이미지를 분석하는데 사용되는 주 합성 이미지를 만드는 단계. 상기 주 합성 이미지는 복수 개의 주 합성 스폿 데이터 목록, 스폿 번호를 가지는 각각의 주 합성 스폿 데이터 목록, IOD% 및 위치를 포함한다.

(3) 주 합성 스폿 데이터 목록을 만드는 단계. 상기 주 합성 스폿 데이터 목록은 스폿 번호, IOD%, 위치, 위치와 IOD%를 위한 스폿의 가변성(예컨대, 퍼센트로 나타나는 표준 편차), 포화값[각각의 복수 개의 주 합성 스폿 데이터 목록을 위해 임의의 스폿(요구되는 스폿을 유도하기 위해 사용되는 원래의 이미지로부터 얻어짐)(이 값은 흰색(0)부터 검은색(1)까지의 스케일의 비율로 표현됨)에서 찾아진 최대 화소 농도의 값에 해당함]를 포함한다.

(4) 겔 이미지를 의미있는 것으로 번역하기 위해 필요한 정보를 포함하는 데이터 베이스를 만드는 단계. 이 정보는 이에 제한된 것은 아니지만, 분석된 샘플의 형태를 포함한다. 상기 분석된 샘플의 형태는 그것이 생물, 기관, 조직 샘플, 생체 검사, 체액, 분리된 세포들, 1차, 2차, 또는 확립된 세포 배양이든지, 그것이 전체 세포 추출물, 세포로부터 만들어진 상청액이나 배지를 포함하는 단백질이든지, 세포들의 형태(기원, 종, 연령을 포함함)와, 그 샘플이 병든 생물의 것이든지 병을 위한 대조군 샘플이든지, 개별적인 생물 또는 샘플이, 임의의 형태의 미생물, 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 프리온, 또는 다른 감염원과 같은 다른 생물에 의해 감염되든지(그리고 만약 그렇다면 무엇이, 어떻게, 어느 정도까지 감염이 진행되었는지), 그 개별적인 생물이나 샘플이 임의의 형태의 약이나 화학적 화합물에 의해 치료되었든지(그리고 만약 그렇다면 무엇이, 어떻게, 얼마만큼이나), 그 개별적인 생물이나 샘플이 임의의 형태의 압력이나 그 반응에 영향을 미칠것으로 기대되는 환경 인자에 의해 치료되었든지(그리고 만약 그렇다면 무엇이 어떻게 그리고 얼마만큼이나), 그 샘플이 수집되고 치료된 방법과, 그 실험을 실행하는데 관련된 정보와, 수작업으로 입력되거나 인터넷을 포함하는 다양한 소스로부터 유입된 그 단백질의 특질(즉, 단백질 동일성, 세포의 위치결정 등)과, 또는 몇몇 또는 모든 기타 겔 이미지들을 분석하여 산출된 기타 데이타를 포함한다.

(5) 새로운 이미지를 주 합성 이미지로 정렬시키는 단계.

(6) 주 합성 스폿 데이터 목록으로부터 한 세트의 고정점들을 선택하는 단계.

(7) 새로운 이미지 스폿들―이 스폿들은 해당 고정점의 위치의 위치 공차(公差) 내에 있는 점과, 해당 고정점의 IOD%의 IOD% 공차 내에 있는 IOD%를 가지는 하나의 위치를 가진다―을 검출하고, 한 세트의 일치된 새로운 이미지 스폿들을 형성하기 위해 검출된 새로운 이미지 스폿들을 해당 고정점에 맞추어 일치시키는 단계.

(8) 주 합성 이미지와 새로운 겔 이미지 사이의 같은 번호의 스폿들을 연결하는 한 세트의 벡터를 계산하고, 각 벡터의 크기와 각도를 결정하는 단계.

(9) 당해 벡터와 어떠한 숫자[예컨대, 당해 스폿에 대해 가장 가까운 2 내지 500 개의 스폿들―이것은, 한 세트의 일치된 새로운 이미지 스폿들로부터 벡터 차이들이 미리 결정된 가장 좋은(가장 짧은 길이와 수학적으로 작은 각도) 벡터 차이의 퍼센트보다 큰 이 일치를 제거하며, 각각의 새로운 일치된 새로운 이미지 스폿들과 다음 단계에 대한 벡터 차이를 발생할 것이다― 이 벡터 차이들이 질적 점검 및 이미지들의 정렬에 사용되어질 수 있고 최적의 일치가 얻어질 때까지 반복해서 불일치의 정정을 유도하는 수단들]로부터 나온 벡터들 사이의 차이에 해당하는 각각의 한 세트의 일치된 새로운 이미지 스폿들 벡터의 차이를 계산하는 단계.

(10) 주 합성 스폿 데이터 목록으로부터 잘 명시된 점들을 선택하고, 잘 명시된 스폿들에 대응하는 위치의 위치 공차 내인 위치를 갖는 새로운 이미지 스폿들을 검출하고, 검출된 새로운 이미지 스폿들을 해당하는 잘 명시된 스폿들과 일치시키고, 일치된 새로운 이미지 스폿들을 한 세트의 일치된 새로운 이미지 스폿들에 더하는 단계.

(11) 주 합성 스폿 데이터 목록으로부터 한 세트의 포화된 스폿들을 선택하고, 포화된 스폿들에 대응하는 위치의 위치 공차 내인 위치를 갖는 새로운 이미지 스폿들을 검출하고, 검출된 새로운 이미지 스폿들을 해당 포화된 스폿들과 일치시키고, 일치된 새로운 이미지 스폿들을 한 세트의 일치된 새로운 이미지 스폿들에 더하는 단계.

(12) 주 합성 스폿 데이터 목록으로부터 한 세트의 약한 스폿들을 선택하고, 약한 스폿들에 대응하는 위치의 위치 공차 내인 위치를 갖는 새로운 이미지 스폿들을 검출하고, 검출된 새로운 이미지 스폿들을 해당 약한 스폿들과 일치시키고, 일치된 새로운 이미지 스폿들을 한 세트의 일치된 새로운 이미지 스폿들에 더하는 단계.

(13) [선택적으로 상기 제5 단계를 대체함] 확인되지 않은 새로운 이미지 스폿들을 위치시키기 위해 한 세트의 일치된 새로운 스폿들 외부의 새로운 이미지를 찾는 단계.

본 발명의 또 다른 측면에서는, 주 합성 스폿 데이터 목록이나 주 합성 이미지는 선택적으로 상기 단백질들 중 적어도 하나의 최소한 하나의 특성을 더 포함하는데, 상기 특성은 pI, 분자 질량, 아미노산 서열, 질량 스펙트럼 및 해독후 변형을 포함하는 집단으로부터 선택된 것이다.

본 발명의 다른 특징에서, 신규 이미지는 공통 정착 지점의 사용을 통해 주 복합체 이미지와 정렬된다. 공통 정착 지점은 신규 이미지 및 주 복합체 이미지 모두에 제공된 스폿에 대응한다. 주 복합체 스폿 데이타 목록으로부터 선택된 정착 지점은 1차 정착 지점 및 2차 정착 지점을 포함한다. 1차 및 2차 정착 지점은 사용될 주 복합체 스폿 데이타 목록 단백질을 선택하기 위해 상이한 선택 범주를 사용하는 이미지 처리에서의 상이한 단계에서 획득된다.

본 발명의 다른 특징에서, 뚜렷한 윤곽의 스폿은 0.2＜S＜0.8 범위의 포화값 S를 갖는다. 포화된 스폿은 S≥0.8의 포화값을 갖는다. 약한 스폿은 S≤0.2의 포화값을 갖는다.

다른 특징에서, 본 발명의 방법은,

(a) 단백질 이미지내의 스폿으로서 분리가능한 비변형 또는 변형 단백질을 포함하는 2DGE 겔의 적어도 일부분의 적어도 하나의 기록된 이미지를 제공하는 단계와;

(b) (ⅰ)적어도 하나의 비변형된 단백질 또는 변형된 단백질, (ⅱ)적어도 하나의 변형된 단백질 내에서의 정성적 또는 정량적 변화, (ⅲ)적어도 하나의 변형된 단백질의 적어도 하나의 식별 특징, 또는 (ⅳ)정상 세포, 치료된 세포, 질병 세포 또는 면역학적으로 변형된 세포로부터의 각각의 2DGE 겔내에 제공된 적어도 하나의 마커 단백질을 식별하기 위해 이미지를 분석하는 단계를 포함한다.

본 방법에서, 비변형 단백질, 변형 단백질 또는 마커 단백질로 구성된 군에서 적어도 하나의 단백질이 선택될 수 있다.

본 발명은 또다른 특징으로 시험관내 또는 생체내에서 정상 세포를 치료된 세포, 질병 세포 또는 면연학적으로 변형된 세포와 구별하는 비변형된 단백질 및 변형된 단백질을 식별 또는 특징화하기 위한 방법 및 컴퓨터 시스템을 제공한다. 샘플은 비변형된 단백질 또는 변형된 단백질을 포함하는 2DGE 겔을 제공하기 위해 2차원(2D) 겔 전기영동에 놓이게 될 수 있다.

다른 특징에서, 컴퓨터를 기반으로 하는 시스템은,

(a) 단백질을 단백질 이미지내의 스폿 또는 단백질 복합체 이미지내의 스폿으로서 분리가능한 비변형된 또는 변형된 단백질을 포함하는 2DGE 겔의 적어도 일부분의 적어도 하나의 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지가 저장되는 컴퓨터 판독가능한 매체와;

(b) 컴퓨터를 통해 실행될 때 컴퓨터로 하여금 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지를 분석하여, 적어도 하나의 비변형된 또는 변형된 단백질을 표현하고 옵션으로 변형된 세포 및 비변형된 세포로부터의 각각의 2DGE 겔내에 제공된 적어도 하나의 마커 단백질을 표현하는 적어도 하나의 마커 이미지 또는 마커 복합체 이미지를 추가로 포함하는 출력 데이타를 제공하도록 하는 적어도 하나의 컴퓨터 서브루틴을 포함하며, 상기 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지는 비변형된 단백질 및 변형된 단백질의 이미지 또는 복합체 이미지를 비교하기 위해 사용될 때 (ⅰ)적어도 하나의 변형된 단백질 내에서의 정성적 또는 정량적 변화, 또는 (ⅱ)적어도 하나의 변형된 단백질의 적어도 하나의 식별 특징을 식별하며,

(c) 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지를 포함하고, 옵션으로 (1)마커 이미지 또는 마커 복합체 이미지에 대한 데이타, (2)정량적 또는 정성적 변화에 대한 데이타, 또는 (3)상기 적어도 하나의 특징에 대한 데이타를 추가로 포함하는 출력 데이타를 기록하기 위한 복원 수단을 포함한다.

다른 특징에서, 본 발명은,

(a) 단백질 이미지내의 스폿 또는 단백질 복합체 이미지내의 스폿으로서 분리가능한 비변형된 또는 변형된 단백질을 포함하는 2DGE 겔의 적어도 일부분의 적어도 하나의 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지가 저장되는 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공하는 단계와;

(b) 상기 컴퓨터에서 실행되는 하나 이상의 계산용 서브루틴을 사용하여 컴퓨터상에서 상기 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지를 선택적으로는 데이타베이스와 관련하여 분석하여 상기 하나 이상의 비변형 단백질 또는 변형 단백질을 나타내는 출력 데이타를 제공하는 단계로서, 이 때, 상기 출력 데이타는 선택적으로는 또한 상기 정상 세포, 처리된 세포 또는 병리학적으로 변형된 세포로부터 각각의 2DGE 겔에 존재하는 하나 이상의 마커 단백질을 나타내는 하나 이상의 마커 이미지 또는 마커 복합체 이미지를 포함할 수도 있고, 상기 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지는 상기 비변형 단백질 및 변형 단백질의 이미지 또는 복합체 이미지를 비교하는 데 사용할 때 (i) 상기 하나 이상의 변형 단백질에서의 정성적 또는 정량적 변화 또는 (ii) 상기 하나 이상의 변형 단백질의 하나 이상의 식별 특성을 식별하는 단계와;

(c) 상기 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지를 포함하고, 선택적으로는 또한 (1) 상기 마커 이미지 또는 마커 복합체 이미지에 대한 데이타, (2) 상기 정성적 또는 정량적 변화에 대한 데이타, 또는 (3) 상기 하나 이상의 특성에 대한 데이타를 포함할 수도 있는 상기 출력 데이타를 얻는 단계를 포함하는 컴퓨팅 방법을 제공한다.

상기의 컴퓨터 시스템 또는 방법에 있어서, 적어도 하나의 상기 단백질의 적어도 하나의 특징은 단백질 동일성, pI, 분자량, 아미노산 서열, IOD%, 질량 스텍트럼 또는 단백질 변형을 포함한 다수의 방식으로 특징화될 수 있다.

본 발명은 상기 방법의 컴퓨터 시스템에 의해 제공된 출력 데이타를 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 제공한다.

바람직한 실시예에서, 본 발명의 컴퓨터 시스템 또는 방법은 처리된 세포가 세포 샘플을 제공하기 전에 적어도 하나의 화합물로 처리되는 곳에서 제공된다. 화학적 또는 생물학적 분자와 같은 화합물은 단백질 분석 또는 치료 화합물이 될 것이다.

본 발명의 방법, 컴퓨터 시스템 또는 겔에 있어서, 정성적 변화는 상기 2DGE 겔내의 상기 적어도 하나의 단백질의 구조에서의 변화가 될 것이고, 정량적 변화는 상기 2DGE 겔내의 상기 적어도 하나의 단백질의 양에서의 변화가 될 것이다.

본 발명의 방법, 컴퓨터 시스템 또는 겔에 있어서, 적어도 하나의 특징은 pI, 분자량, %IOD, 아미노산 서열, 질량 스펙트럼 및 단백질 변형으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 방법, 컴퓨터 시스템 또는 겔에 있어서, 세포 유형 또는 세포주는 원핵 세포 또는 진핵 세포로부터 구해질 수 있으며, 진핵 세포는 포유동물 세포 또는 조류 세포인 것이 바람직하다.

본 발명의 방법, 컴퓨터 시스템 또는 겔에 있어서, 처리된 세포는 세포 샘플을 제공하기 전에 적어도 하나의 화합물로 처리될 수 있으며, 바람직한 화합물은 단백질, 핵산 및 화학적 화합물로 이루어진 군에서 선택되고, 더욱 바람직한 화합물은 단백질 약제가 될 것이다.

본 발명에 따르면, 적어도 하나의 순수 단백질이 본 발명에 의해 제공되며, 이 단백질은 본 발명의 방법, 컴퓨터 시스템 또는 겔에 의해 식별 또는 특징화된 단백질에 대응한다.

본 발명의 특징은 새로운 겔 이미지를 분석 및 해석하고 겔 이미지군간의 통계적인 비교를 시행할 수 있다는 점이다.

본 발명의 다른 특징은 신규 겔 이미지의 분석 및 해석을 안내하기 위해 단일 겔(디폴트 허용값을 사용) 또는 주 복합체 이미지로부터의 정보를 사용한다는 점이다.

본 발명의 다른 특징은 신규 겔 이미지내의 스폿들의 위치를 확인함에 있어서 위치뿐만 아니라 통합된 광학 밀도 백분율을 사용한다는 점이다.

본 발명의 장점은 겔 이미지가 조작자로부터의 최소 입력으로 분석 및 해석될 수 있다는 점이다.

본 발명의 다른 장점은 새로운 겔 이미지가 신속하고 효율적으로 분석 및 해석될 수 있다는 점이다.

본 발명의 다른 장점은 소량으로 제공된 단백질을 용이하게 검출할 수 있다는 점이다.

본 발명의 다른 장점은 2차원 겔 전기영동 이미지의 분석 및 해석으로 제한되지 않고, 흑백 이미지 또는 컬러 이미지를 모두 비교할 수도 있고 이미지 해석 및 인식이 수반되는 임의의 상황에 있는 2개의 유사한 이미지를 비교할 수도 있다는 점이다. 이 공정은 이미지 포착 장치로부터의 "새로이 구해진 이미지"와 컴퓨터 기억 장치로부터 복원된 이미지를 비교하는 과정을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명과 관련한 다음의 상세한 설명과 실시예로부터 더욱 명백해질 것이다.

본 발명은 진단 또는 치료 응용을 위해 비변형된(예를 들어, 정상적인) 또는 변형된(예를 들어, 치료, 질병감염 및/또는 면역학적으로 변형된) 상태의 상승 조절(up-regulated) 또는 하강 조절(down-regulated)되는 세포질, 분비 단백질 및 핵산을 특징화하기 위해 조직, 생검, 세포주 및 체액(혈청, 혈장, 뇌척수액, 소변 등)을 분석하기 위한 방법 및 컴퓨터 시스템에 관한 것이다. 이러한 방법 또는 컴퓨터 시스템을 이용하여 특징화된 단백질은 정제되거나 분리된 형태로 제공된다.

본 명세서에서 "단백질" 이라는 용어는 아미노산의 체인이고 모든 변형체(예를 들어, 가공 및 트렁케이션, 글리코스화, 포스포러스화 또는 기타 다른 변형체)를 포함하는 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 포함한다. 이 용어는 또는 합성 또는 재결합 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드뿐만 아니라 천연 단백질도 포함한다.

"변형된 단백질" 이라는 용어는 발현으로 변형되거나 구조적으로 변형된 단백질을 의미한다. 변형된 단백질은 발현이 하나 이상의 화합물을 이용한 치료, 질병에 걸린 또는 병리학적인 상태 및/또는 단백질이 얻어지는 세포 내부 또는 외부의 면역학적인 변화로 인해 변형되는 단백질이다. 변형된 단백질은 상승 조절 또는 하강 조절될 때 변경된 발현을 나타내거나 또는 치료, 질병 또는 면역학적인 변화가 없는 동일 단백질(즉, "비변형된 단백질")의 발현과 비교했을 때 그 발현이 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 구조 변형되는 단백질을 의미할 수도 있다.

"단백질 변형" 이라는 용어는 단백질의 구조의 변화(즉, 정성적인 변화)를 포함한다. 이러한 변형은 본 분야에 널리 공지된 바와 같이 아미노산 서열의 변화, 전사적인 또는 병진적인 스플라이스 변이, DNA 또는 RNA 서열에 대한 선병진적인 또는 후병진적인 변형, 펩타이드, 이온, 비타민, 원자, 당함유 분자, 지질 함유 분자, 소분자 등과 같은 DNA, RNA 또는 단백질에 대한 거대 분자 또는 소분자의 추가를 포함하며, 이러한 것으로만 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 한가지 유형의 단백질 변형은 아미노산 서열의 하나 이상의 변화(대체, 삭제 또는 삽입)에 의해 이루어진다. 이러한 변화는 하나 이상의 아미노산에 있어서 하전 아미노산에서 비하전 아미노산으로의 변화, 비하전 아미노산에서 하전 아미노산으로의 변화, 하전 아미노산에서의 비하전 아미노산(예를 들어, pI 또는 분자량에서의 가능한 차이를 상승시킴)으로의 변화를 포함한다. 아미노산 서열에서의 어떠한 다른 변화도 본 발명에 포함된다. 변화된 아미노산 서열을 갖는 변형된 단백질의 겔 내에서의 전체적인 위치 변화는 본 기술분야에 공지된 바와 같이 단백질내에 얼마나 많은 전체적인 변화가 존재하는지의 여부에 좌우된다.

겔의 분해능에서의 변화(예컨대, pH 또는 기타의 구배 성분을 변화시킴에 의한 변화)는 작거나 큰 아미노산 서열의 변화를 검출할 수 있게 한다. 또, 예컨대 시퀀싱, 질량 스펙트럼계, 표지 항체 결합을 사용하는 등의 분석의 형태는 변화의 검출 방법에 영향을 끼칠 수 있다.

DNA 또는 RNA 단백질 엔코딩에서 길이, 입체 배좌, 접목 또는 배향을 변화시키는 것 등과 같은 다른 형태의 변형은 세포에서 오픈 독출 프레임이 독출되는 방법에 영향을 끼칠 수 있으며, 그것은 겔 상의 스폿의 위치를 크게 변화시킬 수 있고, 그리고 겔 내의 단백질 형태 및 위치의 분석에도 영향을 끼칠 수 있다.

다른 형태의 단백질 변형은 세포에서의 단백질 처리의 변화에 의한 것이다.일부 단백질이 세포 내에서(또는 세포 밖에서) 단백질들이 사용되어야 하는 장소를 지정하는 "주소 표지"를 갖는 경우가 있다. 그러한 표지 또는 태그는 펩티드(peptide), 슈거(sugar) 또는 리피드(lipide)의 형태가 될 수 있으며, 그들이 단백질로부터 부가 또는 제거될 때 단백질이 세포의 어느 위치에 있는 지가 결정된다.

또 다른 형태의 단백질의 변형은 단백질에 대한 다른 거대 분자의 부착에 기인한다. 그러한 그룹은 반드시 이에 한정하는 것은 아니지만, 그러한 거대 분자의 부가/제거를 포함할 수 있다. 그러한 분자는 여러가지의 형태로 이루어질 수 있으며, 영구적이거나 일시적일 수도 있다. 그 분자의 예로써, (ⅰ) 폴리리보실화 (ⅱ) DNA/RNA(단일 또는 이중 스트랜드) (ⅲ) 리피드 및 포스필리피드(예컨대, 막 부착용) (ⅳ) 사카리드/폴리사카리드 및, (ⅴ) 글리코실화(변화의 가능성이 크도록 여러가지의 단일 및 분기된 구조에 다른 형태의 슈거 및 시알릭산의 다중 부가)를 포함한다.

다른 형태의 단백질 변형은 단백질에 대한 작은 정량의 분자의 부착에 기인한다. 그 예들은 반드시 이에 한정하는 것은 아니지만, (ⅰ) 포스포릴화 (ⅱ) 아세틸화 (ⅲ) 우리딜화 (ⅳ) 아데닐화 (ⅴ) 메틸화 및, (ⅵ) 캡핑(단백질의 N 터미널의 여러가지의 복잡한 변형)을 포함한다. 그러한 단백질 변화는 잘 알려진 바와 같이, 표지, pI 변화, 항체 또는 분자에 관련한 다른 방법에 의한 2D에 의해 검출될 수 있다. 분자 중량의 변화는 2DGE에 의해 검출될 수도 있고, 그렇지 않을 수도 있다. MALDI(matrix assisted laser desorption/ionisation time of flight mass spectrometry)는 그러한 변형을 검출하고 특성을 분석하는데 좋다.

"발현"이란 단백질의 물리적 발현 뿐만 아니라, 발현된 단백질의 활성의 측정을 의미한다. 예를들면, 단백질은 비활성 형태로 발현될 수 있으며, 포스포릴화에 의해 활성화된다. 단백질은 유효한 발현(활성)이 변경된 반면에 실제의 발현은 변화하지 않는다. 겔에서, 활성의 변화는 단백질의 변형된 형태의 발현의 변화로서 측정될 수 있다.

폴리펩티드를 언급할 때, "실제의 순도"란 적어도 60 중량%의 단백질이 제거된 유기성 분자가 자연적으로 결합되는 폴리펩티드를 말한다. 실제 순도의 단백질은 적어도 75중량%, 바람직하게는 적어도 90중량%, 더 바람직하게는 적어도 99%중량%의 단백질이다. 실제 순도의 단백질은 자연물로부터의 추출, 단백질을 엔코딩하는 재결합 핵산의 발현 또는 단백질의 화학적 합성에 의해 얻어질 수 있다. 순도는 적절한 방법 예컨대, 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 HPLC 분석에 의해 측정될 수 있다.

이하에서 사용하고 있는 "폴리누클레오티드(polynucleotide)"란 큰 구성의 분리된 단편 또는 성분 형태의 데옥시리보누클레오티드 또는 리보누클레오티드의 핵산 서열을 말한다. 본 발명의 DNA 엔코딩 부분 또는 모든 폴리펩티드는 재결합 전사 유닛으로 발현될 수 있는 합성 유전 인자를 제공하는 cDNA 단편 또는 올리고누클레오티드로부터 분류될 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드 서열은 DNA, RNA 및 변형된 누클레오티드를 사용한 유도체를 포함할 수 있으며, 이들은 이 기술 분야에서 잘 알려진 방법에 의해, 자연물 또는 합성 서열로부터 취출될 수 있다.

이하에 사용하고 있는 "격리" 폴리누클레오티드란 폴리누클레오티드가 취출되는 유기성의 자연 발생적 게놈에 직접 접종(즉, 5' 단부에 하나, 3' 단부에 하나)된 코딩 서열에, 직접 접종(즉, 공유 결합)하지 않는 폴리누클레오티드이다. 따라서, 그 용어는 예컨대, 벡터, 자발 복제 플라스미드나 비러스, 또는 다른 서열에 독립한 격리 분자로서 나타나는 원핵 생물이나 진핵 생물의 게놈 DNA로 결합되는 재결합 폴리누클레오티드를 포함한다. 또, 부가의 폴리펩티드 서열을 엔코딩하는 교잡 유전자의 일부인 재결합 DNA를 포함한다.

본 발명의 격리 및 정제된 폴리누클레오티드 서열은 엄격한 조건하에서 이하에 설명한 폴리누클레오티드 서열에 교잡되는 폴리누클레오티드 서열을 포함한다. "엄격한 조건"이란 교잡 폴리누클레오티드 서열 사이의 특성을 보장하는 교잡 조건을 말한다. 이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 높은 보상 서열을 확인하기 위해 여러가지의 비특성 교잡을 저하시키는 온도와 염의 농도를 포함하는 교잡후 와싱 조건을 선택할 수 있다(이하에서는 Sambrook et al, in Molecular Cloning, 2d ea.;Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)를 참조하고 있다). 예를들어, 그러한 조건은 5xSSC에서 선담금(presoaking) 처리되고, 20% 폼아미드, 5xDenhardt 용액, 50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8과 50㎍의 변성 초음파 처리된 송아지 흉선 DNA의 용액속에서 약 40℃로 1시간 동안 선교잡되며, 이어서 100μM ATP가 보충된 용액에 약 40℃에서 18시간 동안 상기와 동일한 방법으로 교잡시키는 특정한 방법을 포함한다(Sambrook et al. upra(1989)). 또, 본 발명의 격리 및 정제된 폴리누클레오티드 서열은 디아베테스메디에이트 단백질(안티센스 서열) 및 리보짐을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 대한 서열 보상을 포함한다.

"변경된 단백질" 또는 "변경된 단백질 발현"이란 치료, 질병 및/또는 면역학적 변화에 응답하여 증가(상향 조정), 감소(하향 조정), 금지(즉, 턴 오프) 또는 유도(즉, 턴 온)될 때에 발현이 정량적으로 변화하는 단백질을 의미한다.

겔 이미지를 분석하기 위한 컴퓨터 사용 방법 및 시스템

본 발명의 기술적 사상 중 하나는 컴퓨터를 사용한 이미지 분석 과정에 관한 것이다. 본 발명에는 2차원 겔 일렉트로포레시스(2DGE) 이미지를 분석하는 내용에 관하여 개시되어 있다. 하지만, 본 발명은 2DGE 이미지의 분석에 국한되는 것이 아니며, 이미지 보간과 인식이 관련되는 임의의 위치에서 흑백색인지 또는 어떤 색상인지를 비교하는데 어떤 2개의 유사한 이미지가 사용될 수 있다. 이러한 방법은 컴퓨터 기억 장치로부터 복구된 이미지와, 임의의 이미지 캡쳐 장치로부터의 "새롭게 취출된 이미지"를 비교하는 과정을 포함할 수 있다. 그러한 이미지의 예는 반드시 이에 한정하는 것은 아니지만, 조직 절개, 겔 또는 단백질, RNA 또는 DNA의 얼룩 이미지를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 최소한의 조작자의 입력으로 겔 이미지를 빠르고 효율적으로 분석 및 해석하는 분석툴이 제공된다. 겔 이미지는 새로운 단백질을 확인할 수 있도록 컴퓨터 분석에 의해 분석 및 해석된다. 또, 본 발명의 방법은 변형된 단백질 또는 변형되지 않은 단백질에 대하여, 단백질의 변화 즉, 상승 및 하강 조정을 확인하기 위하여 겔 이미지를 비교하는 비교툴이 제공된다.

본 발명의 발명은 신규 겔 이미지의 분석을 안내하는 주 콤포지트 이미지로부터의 정보를 사용한다. 이러한 방법에서, 동일한 세포 형태의 다른 겔 이미지로부터의 정보는 신규 겔 이미지의 분석 및 해석을 안내하는데 사용될 수 있다. 그러한 기술은 신규 겔 이미지를 분석하는데 필요한 시간을 상당히 감소시킨다. 또, 그러한 기술은 신규 겔 이미지를 분석하는데 필요한 조작자의 노력을 상당히 감소시킨다.

본 발명의 방법을 달성하기 위하여, 주 콤포지트 이미지는 조작자 또는 사용자에 의해 선택된 이미지로부터 발생된다. 주 콤포지트 이미지를 발생시킬 때 조작자에 의해 선택된 이미지는 통상적으로 동일한 세포의 형태이며, 프로젝트 또는 실험이 행해진 형태와 관련된 것이어야 한다. 이하에서 사용되고 있는 "이미지"는 픽셀로 구성된 표시를 말하는데, 각 픽셀은 그에 할당되는 적은 값의 그레이 레벨을 갖는다. 예를들면, 8비트 이미지에서 각 픽셀은 0(백색) 내지 255(흑색) 범위로 할당된 그레이 레벨, 포화값((8 비트 이미지에 대하여) 255개로 분할된 각 스폿의 가장 어두운 픽셀의 값에 대응하는 0 내지 1로 변화하는 값) 및 X, Y(위치) 및 Z(스폿이 한개 이상의 겔에 일치되었을 때의 각 스폿에 대한 정량 값)의 표준 편차를 가질 수 있다. 높은 수의 비트를 갖는 이미지는 섬세한 단계에 의해 큰 범위의 그레이 레벨을 가질 수 있다.

주 콤포지트 스폿 데이터 목록은 주 콤포지트 이미지에 대응하도록 발생된다. 이하에 보다 상세히 설명하는 바와 같이, 주 콤포지트 스폿 데이터 목록은 주 콤포지트 이미지 상의 각 스폿의 특성, 예컨대 스폿 위치, 적분된 광밀도 백분율(IOD%), 스폿수 및 포화값과 같은 스폿의 특성을 표시하는 데이터를 포함한다. 주 콤포지트 스폿 데이터 목록은 쉽게 탐색되어 신규 이미지의 분석과 해석을 보조할 수 있는 데이터의 편찬(compilation)을 제공한다. 신규 이미지에서의 스폿이 주 콤포지트 스폿 데이터 목록의 스폿에 대응하도록 위치되어 있을 때, 위치된 신규의 이미지는 주 콤포지트 스폿 데이터 목록의 스폿에 "일치"된다. 주 콤포지트 스폿 데이터 목록이 신규 이미지 스폿과 일치되면, 주 콤포지트 스폿 데이터 목록의 이용가능한 풀(pool)로부터 제거된다. 본 발명의 방법은 모든 주 콤포지트 스폿 데이터 목록을 신규의 이미지 스폿에 일치시키기 위한 일련의 탐색이 반복된다. 모든 주 콤포지트 스폿 데이터 목록이 일치된 후, 신규 이미지에서 일치되어 있지 않은 스폿은 비확인된 신규 이미지 스폿을 나타나게 한다. 그러한 비확인된 신규 이미지 스폿은 그 이전에 비확인된 단백질을 나타나게 한다.

본 발명의 다른 응용에 있어서, 동일한 샘플의 다른 겔 중 동일한 이미지의 다른 노출은 함께 일치되어 독출되는 이미지로부터 매체의 "다이나믹 범위를 확장"시키는 것이 가능하게 할 수 있다. 통상적으로, 그러한 매체는 반드시 이에 한정하는 것은 아니지만, X 선 필름, 포토그래프, 비디오 레코드, 디지털 레코드, 또는 화학적으로 얼룩진 겔, 얼룩진 또는 흠있는 면역 겔의 기타의 기록 장치 및 그들의 조합이나 변형이 있다. 그러한 절차는 세포 내의 단백질의 발현 비가 100,000 이상(예컨대, 약 100 내지 1,000인 X선 필름 또는 약 10 내지 100의 다이나믹한 범위를 갖는 얼룩진 겔의 다이나믹한 범위를 초과한다)이기 때문이며, 또는 상기 매체의 응답이 선형이 아니기 때문에(단백질 스폿의 정량이 정확하지가 않게 된다) 유용하게 사용된다.

주 콤포지트 이미지가 발생되면, 신규 이미지가 상기 이미지에 할당될 수 있다. 본 발명의 방법은 고정점의 사용을 통해 신규 이미지를 주 콤포지트 이미지에 할당한다. 고정점은 신규 이미지와 주 콤포지트 이미지 모두에 존재하는 스폿에 대응하는 공통의 고정점과, 설정된 기준에 기초한 주 콤포지트 스폿 데이터로부터 선택되는 제1 및 제2 고정점을 포함한다. 질적 제어 분석을 구별하는 벡터가 수행되어 고정점이 적절하게 신규 이미지 스폿에 일치되는 것을 보장한다.

본 발명의 방법은 일치되어 있지 않은 주 콤포지트 스폿 데이터에 존재하는 3개의 다른 형태의 스폿에 대하여 신규 이미지에서의 탐색이 수행된다. 제1 형태의 스폿은 "좋게 설정된" 스폿이다. 이하에 보다 상세히 설명하는 바와 같이, 좋게 설정된 스폿은 약 0.2와 약 0.8 사이의 포화값 "S"를 갖는다. 좋게 설정된 스폿은 흐릿하지 않거나 포화되지 않는 스폿들이다. 제2 형태의 스폿은 "포화된"된 스폿이다. 포화된 스폿은 0.8 이상의 포화값 S를 갖는다. 제3 형태의 스폿은 "흐릿한" 스폿이다. 흐릿한 스폿은 0.2 이하의 포화값을 갖는다. 좋게 설정된, 포화된 그리고 흐릿한 스폿에 대응하는 신규 이미지에 위치되어 있는 스폿이 일치되고, 대응하는 주 콤포지트 스폿 데이터 목록과 같은 스폿수가 주어진다.

좋게 설정된, 포화된 그리고 흐릿한 스폿이 완전하게 되면, 일치된 신규 이미지 스폿 이외의 신규 이미지가 비확인된 스폿을 위치시키기 위해 탐색된다. 비확인된 스폿은 2개의 다른 감도 레벨을 사용하여 탐색이 행해진다. 위치된 비확인된 스폿은 추가의 분석과 평가를 위해 조작자에게 표시된다.

본 발명의 또 다른 응용에 있어서, 동일한 이미지 중 상이한 노출은, 동일한 겔 또는 동일한 샘플 중에서 MCI가 있을 때, 사용자가 선택된 신규 겔과 이미지를 지정한다면, 전술한 바 있고 이하에 상세히 설명되는 방법을 사용하여 함께 일치시킬 수가 있다. 그러한 카테고리로 2개 이상의 이미지를 결합하고, 이어서 %IOD가 재산출되며, 이들 값들은 추가의 분석을 위해 사용된다.

전술한 바 있는 본 발명의 방법은, 신규 이미지를 분석하고 해석하기 위한 유효한 분석툴을 제공한다. 본 발명의 방법은 사전에 해석되었던 여러가지의 이미지를 비교할 수 있는 추가의 능력을 제공한다. 예를들면, 조작자는 특별한 방법으로 처리된 한 그룹의 세포와, 비처리된 한 그룹의 세포와 같이 비교될 한개 이상의 그룹의 세포를 확인할 수 있다. 겔 이미지의 처리된 세포 그룹 중 각각의 스폿은 통계상 중요한 차이가 있는지를 확인하기 위해 비처리된 세포 그룹의 겔 이미지에서 대응하는 스폿과 비교된다. 이것은 조작자가 선택된 이미지 사이에서 통계적 비교를 행할 수 있게 하는 편리한 방법이다.

다시, 도 1을 참조하면, 블록도(100)는 본 발명의 방법의 일실시예를 도시하고 있다. 이하에서 자세히 설명하는 바와 같이, 본 발명은 하드웨어, 소프트웨어 및 그들의 조합에 의해 구현될 수 있으며, 컴퓨터 시스템 또는 기타의 처리 시스템으로도 구현될 수 있다. 단계(110)에 있어서, 신규 이미지가 캡쳐된다. 본 발명은 신규 이미지가 2DGE 겔 이미지인 것에 국한되지 않는다는 것에 유의하여야 하며, 즉 본 발명은 임의의 적절한 형태의 이미지가 사용될 수 있다. 이미지는 당업자에게 잘 알려진 방법으로 컴퓨터에 스캔닝됨으로써 캡쳐될 수 있다. 또, 이미지는 랜덤 액세스 메모리(RAM), 리드 온리 메모리(ROM), 하드 디스크 드라이브, 플래쉬 메모리, 광디스크, 플로피 디스크 등의 기억 장치로부터 복구됨으로써 캡쳐될 수 있다. 또, 이미지는 다른 컴퓨터를 통해, 카메라로부터의 통신 인터페이스를 통해, 인터넷을 통한 사이트를 통해 또는 기타의 다른 소스를 통해서 다운로드됨으로써 캡쳐될 수 있다.

단계(120)에서, 주 콤포지트 이미지와 주 콤포지트 스폿 데이터 목록이 발생되고, 분석 형태가 선택된다(주 콤포지트 스폿 데이터 리스트에 대한 신규 겔의 일치, 동일한 겔의 2개의 노출 또는 동일한 샘플의 2개의 겔). 단계(130)에서, 신규 이미지는 주 콤포지트 이미지에 할당된다.

단계(140)에서, 고정점은 주 콤포지트 스폿 데이터 목록으로부터 선택된다. 신규 이미지는 고정점에 대응하는 신규 이미지 스폿에서의 위치가 탐색된다. 스폿이 고정점에 대응하는 신규 이미지에서 위치되어 있다면, 신규 이미지 스폿은 대응하는 고정점하게 된다.

단계(150)에서, 각각 일치된 신규 이미지 스폿에 대하여 벡터차가 산출된다. 가장 큰 벡터차를 갖는 일치된 신규 이미지 스폿은 일치되지 않는다.

단계(160)에서, 신규 이미지는 좋게 설정된 스폿을 검출하고 일치시키기 위해 탐색된다. 단계(170)에서, 신규 이미지는 포화된 스폿을 검출하고 일치시키기 위해 탐색된다. 단계(180)에서, 신규 이미지는 흐릿한 스폿을 검출하고 일치시키기 위해 탐색된다.

단계(190)에서, 신규 이미지는 비확인된 신규 이미지 스폿의 위치를 탐색한다. 신규 이미지는 미리 일치되었던 스폿의 밖에서 탐색된다.

만일, 단계의 처음에서(단계 120), 사용자가 동일한 샘플 중 2개의 겔 또는 동일한 겔에서 2개의 노출 중 하나인 일치된 겔을 선택했다면, 컴퓨터는 모든 단백질에 대한 %IOD를 산출한다.

마지막으로, 단계(195)에서, 여러가지의 이미지 세트가 비교될 수 있다. 조작자는 비교될 그룹의 이미지 뿐만 아니라, 처리될 통계적 비교의 형태를 선택할 수 있다.

여기에 포함된 플로우챠트와 관련한 본 발명의 동작의 설명으로부터, 이 기술 분야의 숙련된 프로그래머 또는 분자 생물학자는 컴퓨터 시스템이나 또는 프로세서의 동작을 제어하는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 본 발명을 용이하게 구현할 수 있을 것이다. 예컨대, 이 기술 분야의 숙련된 프로그래머는 반드시 이에 한정하는 것은 아니지만, C++ 프로그래밍 언어, 또는 이 기술 분야에서 잘 알려진 컴퓨터 시스템을 사용하여 본 발명의 발명을 구현할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 제공할 수 있을 것이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 컴퓨터 시스템 또는 방법은조직, 생체 검사, 격리 세포 또는 세포 배양으로부터 취출되거나 또는 분석될 단백질이 세포적인 것과는 상관없이, 세포 샘플을 제공하기 이전에 적어도 하나의 합성물로 처리되었던 처리 세포가 제공된다. 화학적 또는 생물학적 분자와 같은 합성물은 단백질 진단용 또는 치료용의 합성물일 수 있다.

본 발명의 실시

전술된 바와 같이, 본 발명은 하드웨어, 소프트웨어 또는 이들의 결합을 사용하여 실행될 수 있고, 컴퓨터 시스템 또는 다른 처리 시스템에서 실행될 수 있다. 제1 실시예에서, 본 발명은 전술된 기능을 실행할 수 있는 컴퓨터 시스템에 관한 것이다. 일례의 컴퓨터 시스템(1102)은 도 2에 도시되어 있다. 컴퓨터 시스템(1102)은 프로세서(1104)와 같은 하나 이상의 프로세서를 포함한다. 프로세서(1104)는 통신 버스(1106)에 접속된다. 구체적으로 다양한 소프트웨어 이러한 일례의 컴퓨터 시스템을 통해서 기술된다. 이와 같은 기술을 판독한 후, 당업자라면 다른 컴퓨터 시스템 및/또는 컴퓨터 아키텍쳐를 사용하여 본 발명을 실행하는 방법을 이해할 수 있을 것이다.

컴퓨터 시스템(1102)은 메인 메모리(1108), 바람직하게는 랜덤 액세스 메모리(RAM)를 포함하고, 또 2차 메모리(1110)를 포함하기도 한다. 2차 메모리(1110)의 예로는 하드 디스크 드라이브(1112) 및/또는 플로피 디스크 드라이브를 대표하는 착탈 가능 저장 드라이브(1114), 자기 테이프 드라이브, 광 디스크 드라이브 등이 있다. 착탈 가능 기억 드라이브(1114)는 공지된 방법으로 착탈 가능 기억 유닛(1118)으로 판독 및/또는 기록한다. 착탈 가능 기억 유닛(1118)은 플로피 디스크, 자기 테이프, 광 디스크 등을 대표하며, 착탈 가능 기억 드라이브(1114)를 통해 판독 및 기록된다. 인지하는 바와 같이, 착탈 가능 기억 유닛(1118)은 내부에 컴퓨터 소프트웨어 및/또는 데이터가 저장되어 있는 컴퓨터에 사용 가능한 기억 매체를 포함한다.

다른 실시예에서, 2차 메모리(1110)는 컴퓨터 프로그램 또는 다른 구조 프로그램을 컴퓨터 시스템(1112)에 로딩할 수 있게 하는 다른 유사 수단 또는 메모리 장치를 포함한다. 이러한 메모리 장치는, 예를 들면 착탈 가능 기억 유닛(1122) 및 인터페이스(1120)를 포함할 수 있다. 이러한 예로는 예를 들면, 비디오 게임 장치에서 사용되는 프로그램 카트리지 및 카트리지 인터페이스, 착탈 가능 메모리 칩(예를 들면, EPROM 또는 PROM) 및 그에 관련된 소켓 및 착탈 가능 기억 유닛(1122)으로부터 컴퓨터 시스템(1102)으로 소프트웨어 및 데이터를 전달할 수 있게 하는 다른 착탈 가능 기억 유닛(1122) 및 인터페이스(1120)를 들 수 있다.

또한, 컴퓨터 시스템(1102)은 통신 인터페이스(1124)도 포함할 수 있다. 통신 인터페이스(1124)는 컴퓨터 시스템(1124)과 외부 장치(도시되지 않음), 예를 들면 컴퓨터 시스템(1102)에 겔 이미지를 입력하는 스캐닝 장치간에 소프트웨어 및 데이터가 전달될 수 있게 한다. 통신 인터페이스(1124)의 일례로는, 모뎀, 네트워크 인터페이스(예를 들면, 이더네트 카드), 인터넷과 인터페이스하기에 적절한 네트워크 인터페이스, 커뮤니케이션 포트, PCMCIA 슬롯 및 카드 등이 있다. 커뮤니케이션 인터페이스(1124)를 통하여 전달되는 소프트웨어 및 데이터는 커뮤니케이션 인터페이스(1124)에 의해 수신 가능한 전자, 전자기, 광학 등의 신호일 수 있는 신호(1126)의 형태이다. 신호(1126)는 채널(1128)을 통하여 커뮤니케이션 인터페이스에 제공된다. 채널(1128)은 신호(1126)를 운반하며 이러한 운반은 와이어 또는 케이블, 광섬유, 전화선, 셀룰러 전화 링크, RF 링크 및 다른 커뮤니케이션 채널을 사용하여 실행될 수 있다.

여기서, 용어 "컴퓨터 프로그램 매체", "컴퓨터 프로그램 제품", "프로그램 기억 장치" 및 "컴퓨터 사용 가능 매체"는 착탈 가능 기억 장치(1118), 하드 디스크 드라이브(1112)에 설치된 하드 디스크와 같은 매개로 통상 사용된다. 이러한 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨터 시스템(1102)에 소프트웨어를 제공한다.

컴퓨터 프로그램(또한 컴퓨터 제어 로직으로도 칭함)은 메인 메모리 및/또는 2차 메모리(1110)에 저장된다. 또한, 컴퓨터 프로그램은 통신 인터페이스(1124)를 통하여 수신될 수 있다. 실행시 이러한 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터 시스템(1102)이 전술된 본 발명의 특징을 실행하도록 인에이블한다. 사실상, 컴퓨터 프로그램은 실행시에 본 발명의 특징을 실행하도록 프로세서(1104)를 인에이블한다. 따라서, 이러한 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터 시스템(1102)의 콘트롤러를 나타낸다.

본 발명이 소프트웨어를 사용하여 실행되는 실시예에서, 소프트웨어는 컴퓨터 프로그램 제품에 기억되고 착탈 가능 기억 드라이브(1114), 하드 드라이브, 또는 통신 인터페이스(1124)를 사용하여 컴퓨터 시스템(1102)에 로딩될 수 있다. 프로세서(1104)에 의해 실행될 때 제어 로직(소프트웨어)은 프로세서(1104)로 하여금 전술된 본 발명의 기능을 수행하게 한다.

다른 실시예에서, 본 발명은 예를 들면, 응용 주문형 집적 회로(ASIC)와 같은 하드웨어 성분을 사용하여 하드웨어에서 일차적으로 실행된다. 전술된 기능을 수행하기 위해서 하드웨어 상태 머신의 실행은 당업자라면 이해할 수 있을 것이다.

다른 실시예에서, 본 발명은 하드웨어 및 소프트웨어의 결합을 사용함으로써 실행된다.

본 발명에 의해 제공되는 변형 및 비변형 단백질 및 암호화 핵산

변형되고, 질병에 걸리고, 처리되거나 또는 면역학적으로 변형된 본 발명의 펩티드에 대응하는 일정량 상승 및/또는 하강 조절된 단백질은 본 발명의 방법을 사용하여 발견된다. 그래서, 본 발명은 변이되고, 질병에 걸리거나 또는 비변형된 펩티드 및/또는 암호화 또는 상보성 핵산을 제공하고, 재조합 발현, 정제 및 약제 선별을 포함하고 적어도 하나의 변형 또는 비변형 펩티드 아미노산 서열 또는 암호화 또는 상보성 핵산을 사용하는 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다.

변형 또는 비변형 펩티드 또는 단백질

변형 또는 비변형 펩티드는 단편, 교감 서열 또는 그 서열의 반복 유닛으로서 변형 또는 비변형된 펩티드의 임의의 서브세트, 탄백질 또는 변질된 펩티드 또는 단백질로 칭한다. 본 발명의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드는 다음과 같은 방법에 의해서 제공될 수 있다:

(a) 재조합 DNA 방법;

(b) 손상되지 않은 분자 또는 그 분자의 단편의 단백질 가수 분해 증해법;

(C) 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드를 생성할 수 있는 어떤 다른 방법에 의해서 제공될 수 있다. 변형 또는 비변형 펩티드는 공지된 선별 검정에 의해 선별될 수 있는 생물학적 활성도를 가질 수 있다. 활성도를 갖는 최소의 펩티드 서열은 적어도 하나의 변형 또는 비변형된 펩티드의 특정 영역, 도메인, 교감 서열 또는 그것의 반복 유닛을 포함하거나 또는 구성되는 최소 유닛에 기초한다.

본 발명에 따르면, 변형 또는 비변형 펩티드는 1~40 도메인 또는 어떤 범위 또는 그내의 값과 같은 변형 또는 비변형 펩티드에 대응하는, 경막, 세포질, 소수성, 친수성, 리간드 바인딩과 같은 2개 이상의 폴리펩티드 도메인, 또는 포어 내측 도메인(pore lining domains), 또는 그것의 단편을 포함한다. 펩티드는 본원에서 정의되는 바와 같이 또는 공지된 방법과 같이 약간의 변이가 가능하다. 당업자라면 이해할 수 있듯이, 도메인의 상기 구성은 본 발명의 변형 또는 비변형 펩티드의 일부로서 제공되어, 기능성 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드는 적절할 셀로 발현될 때 변형된 셀 형태에서 발견된 관련 생물학적 활성도에 견딜수 있다. 적절한 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 활성도 검정에 의해 측정되는 이러한 활성도는 본 발명의 하나 이상의 변형 또는 비변형된 단백질 또는 펩티드를 설정한다.

이러한 점에서, 이러한 변형 또는 비변형 펩티드는 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 생물학적 활성도를 유지할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 변형 또는 비변형 펩티드가 자연적으로 발생하지 않거나, 자연적으로 발생하지 않고 자연적으로 발행하지 않은 것으로부터 정제되거나 분리된다.

그래서, 본 발명에서 나타나는 소정의 교시 및 지시는 당업자라면 공지된 방법으로 대체되고, 삭제되거나 또는 부가되는 변종을 얻기 위해서 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드의 다른 위치의 다른 아미노산 찌거기를 부가, 삭제 또는 대체하는 방법을 알 수 있을 것이다.

또한, 본 발명의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드는 변종을 포함하며, 이 변종에서 펩티드에 있는 적어도 하나의 아미노산은 적어도 하나의 다른 아미노산으로 보존적으로 대체, 부가 또는 삭제되어 왔다. 단백질 화학 및 구조에 대한 상세한 설명에 대해서는 예를 들면 스컬츠 등의 1978년 뉴욕시의 스프링어-버래그의 단백질 구조의 원리 및 크레이튼 티.이, 단백질: 1983년 샌프란시스코에 소재한 더블유. 에이치. 프리맨 & 코오포레이티드의 구조 및 분자 특성이 본원에 참조로 통합되어 있다. 콘돈 프리퍼런스와 같은 누클레오티드 서열 치환의 표시에 대해서는, NY(1987, 1992, 1994, 1995), 뉴욕의 그린 퍼블리싱 어소시에티디의 오우서벨 등의 분자 생물학의 커런트 프로토콜의 A.1.1~A.1.24, 어펜딕스 C, D의 NY(1989), 콜드 스프링 하버, 콜드 스핑 하버 프레스, 제2판 래버터리 매뉴얼을 참조하시오.

따라서, 대안적인 치환은 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 활성도를 제공하는 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 단편의 하나 이상의 보존 치환을 함으로써 본 발명의 대안의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드를 제공하기 위해서 루틴 실험에 의해 행해질 수 있다. 그러나, 치환, 삭제 또는 추가의 정확한 효과가 일치될 때, 당업자는 적어도 하나의 치환, 추가 또는 삭제의 효과가 생물학적 활성도를 일치하도록 예를 들면 면역 검정 또는 바이오 검정에 한정되지 않지만 적어도 하나의 활성도 선별 검정에 의해 평가될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 시료로는 셀, 단백질 추출물 또는 셀막의 추출물, 생물학적 액체를 들 수 있다. 그 시료들은 검정 포맷, 검출 방법 및 조직, 시료로 사용되는 셀 또는 추출물의 특성에 따라 변화한다.

셀 및/또는 조직은 셀 및/또는 조직이 배양되고, 통과되고, 통과되지 않고, 변형되고, 재조합되고, 또는 격리될 때 생체내, 현장내 또는 시험관 내에 제공되는 경우 예를 들면, 정상 또는 병리학적 동물 셀 또는 그것의 조직 및 추출물 또는 셀 배양을 포함할 수 있다.

공지된 다양한 계통적 분류법은 본 발명의 분리된 변형 또는 비변형 펩티드를 얻기 위해서 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 펩티드는 자연적으로 펩티드를 생성하는 조직 또는 셀로부터 정제된다. 대안적으로, 상술된 분리 핵산 단편은 어떤 조직에서 변형 또는 비변형 펩티드 단백질을 나타내는데 사용될 수 있다.

보다 더 많은 성숙핵 생물은 소스 생물이 상기의 펩티드를 자연적으로 내포하는 한 본 발명의 적어도 하나의 변형 또는 비변형 펩티드의 소스로서 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "소스 생물"은 펩티드의 아미노산 서열이 유도되는 기원 생물로 칭하며, 생물에 상관없이 펩티드는 내부에 나타나고 최종적으로 분리된다. 적어도 하나의 변형 또는 비변형 펩티드 또는 암호화 핵산의 소스로서 양호한 생물은 포유 동물 또는 새와 같은 어떤 척추 동물일 수 있다. 포유 동물중에서, 양호한 수용체는 목 영장류(인간, 원숭이 등을 포함), 아르테리오닥틸라(arteriodactyla)(말, 염소, 소, 양, 돼지 등을 포함), 설치류 동물(쥐, 토끼, 및 햄스터 등을 포함), 및 캠비보러(고양이, 개 등을 포함)의 포유 동물이다. 가장 바람직한 생물은 인간이다.

당업자라면 자연 오염이 없는 펩티드를 얻기 위해 단백질을 분리하는 공지된 방법을 따를 것이다. 이러한 것들은 면역크로마토그라피, 사이즈 배제 크로마토그라미, HPLC, 이온 교환 크포마토그라피, 및 면역성 크로마토그라피를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 예를 들면, 오우서벌, 인프라; 샘브룩, 인프라; 콜리건 인프라를 참조하시오,

변형 또는 비변형 펩티드에 대해 분리된 핵산 분자 암호화

일 실시예에서, 본 발명은 새로운 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 대해 분리된 핵산 분자 암호화에 관한 것이다. 다른 양호한 실시예에서, 분리된 핵산 분자는 본 발명에 따라 변형 또는 비변형 펩티드 누클레어티드 서열 암호화한 하나 이상의 단백질을 포함한다.

핵산 분리

본 발명의 또다른 양상에서, 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 대한 분리 핵산 분자 암호화가 제공된다.

핵산 분자는 예를 들면 시동물질(primer) 증폭 또는 cDNA 클로닝에 한정되지는 않는 공지된 기술을 사용하여 핵산을 내포한 생물학적 시료로부터 분리될 수 있다.

핵산 분자는 세포의 DNA를 포함한 생물학적 시료로부터 또는 세포의 바이브러리로부터 분리될 수 있다. 적절한 생물학적 시료는, 셀 및/또는 조직이 배양되고, 통과되고, 통과되지 않고, 변형되고, 재조합되고, 또는 분리될 때, 생체내, 현장내 또는 시험관 내에 제공되는 경우, 정상 또는 병리학상의 동물 셀 또는 조직, 예를 들면 췌장, 간장, 폐, 비장, 골수, 혈액 또는 혈액 성분, 중앙 신경계(CNS), 선(腺), 스킨, 헤어, 테스트, 난소, 신장, 갑상선, 뇌척수액(CSF), 주변 신경계(뉴런, 신경절) 및 부분, 심장의 셀, 평활근, 골격근 또는 심근, 자율 신경계, 및 그것의 추출물 또는 셀 배양을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 생물학적 시료를 얻기 위한 방법은 시료의 특성에 따라 변화한다.

당업자라면 대립 유전들 사이에서의 변이를 무시하게 쉬우며 이러한 변동으로 단백질 서열에서의 차를 유발하는 경우 일시적 분석(2D 겔 전기 연동 및/또는 질량 스펙트로메트리)에 의해 검출될 수 있다. 그러므로, 분리된 핵산 분자는 또한 서열이 변형 또는 비변형 펩티드를 암호화하는 한 대립 유전자 변동을 포함하는 경향이 있다. 변형 또는 비변형 펩티드 대립 유전자가 본 발명의 하나 이상의 단백질, 또는 그것의 적어도 하나의 도메인에서 발견되는 것과 동일한 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우, 본원에서 사용되는 동일 기술, 및 본원에 기재된 서열에 기초하여 시동물질로 적절한 유전자를 증폭하는 특히 핵산 증폭 기술을 사용하여 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드로서 분리 및 식별될 수 있다. 이러한 변이는 표 1 및 표 2에 나타나 있다.

큰 cDNA의 클로닝은 동일하지만 작은 cDNA 보다 더 많은 루틴 실험을 한다. 유용한 방법은 cDNA 박테리아파아지 라이브러리 선별에 의존한다(예를 들면 샘브룩, 인프라, 또는 오우서벌, 인프라 참조). 선별용 프로브는 예를 들면 랜덤 헥사머 및 클레노우 효소(파마시아 키트)로 표식된다. 5개의 cDNA가 이러한 방법으로 얻어지지 않는 경우, 서브 cDNA 라이브러리는 특정 단백질 암호화 시동물질이 올리고 dT 또는 랜덤 시동물질 대신에 반대의 복사 반응을 촉진시키게 하는데 사용된다. cDNA 서브라이브러리는 램브다 zap와 같은 표준 벡터에서 클로닝되고 종래의 기술을 사용하여 선별된다. 전(全)길이 cDNA의 구성은 발현 벡터(원시핵 또는 성숙행 중 하나)로 오버랩핑 단편을 서브클로닝함으로써 실행된다. 이러한 실행은 소수의 고유 제한 사이트 때문에 큰 cDNA에 있어서 더 어렵지만, 루틴 제한, 클로닝 또는 PCR은 단편을 결합하는데 사용된다.

생물학적 시료에 변형 또는 비변형된 펩티드 암호화 핵산이 있는지의 여부를 검출하는 방법

다른 실시예에서, 본 발명은 시료에 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 암호화 핵산이 있는지의 여부를 검출하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은, (a) 교배가 발생하는 조건 하에서 전술된 핵산 프로브와 시료를 접촉시키는 단계와, (b) 상기 핵산 프로브에 결합된 표식 프로브의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 당업자는 전술된 바와 같이 공지된 기술에 따라 적절한 표식 핵산 프로브를 선택할 수 있다. 테스트에 사용되는 시료는 포유 동물 조직의 RNA 시료를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

특정 병리학에 관련된 임의의 특정 셀 타입에 나타나는 변형 펩티드 또는 단백질이 발견된다. 따라서, 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 프로브는 생물학적 시료에서 셀로부터 RNA의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 또한, 정상 레벨과 비교했을 때 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 RNA의 변경된 발현 레벨은 질병에 걸린 것으로 나타난다. 또한, 변형 또는 단백질 또는 펩티드 프로브는 통상적으로 특히 변형 조직에서 셀룰러 활성도를 검정하는데 사용될 수 있다. 변형 단백질 또는 전체 단백질의 단편은 또한 체액(혈액, 뇌척수액 및 소변을 포함)에서 검출될 수도 있다.

변형 또는 비변형 펩티드 핵산 분자를 암호화하는 DNA 구성 및 이러한 구성을 포함하는 호스트

본 발명의 변형 또는 비변형 펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 적절한 말단을 제공하기 위해 평활 말단, 결찰용 점착 말단, 제한 효소 동화를 포함하고, 적절한 리가아제와 부적절한 결합, 결착을 피하기 위해 적절한, 알칼라인 포스포타아제 처리로 접착제 단부에 충전하는, 종래의 기술에 따라 벡터 DNA로 재결합될 수 있다. 이러한 처리을 위한 기술은 예를 들면 오우서벨 등의 "인프라"에 기재되어 있으며, 이미 공지된 기술이다.

따라서, 본 발명은 비록 성숙핵 발현이 바람직하더라도 원시액 또는 성숙핵 셀중에서 하나의 변형 또는 비변형 펩티드의 발현을 포함한다.

양호한 호스트는 생체내 또는 현장내에서의 박테리아, 효모, 곤충, 균질, 새 및 포유 동물 셀을 포함한 세균성 또는 성숙핵 호스트, 또는 포유 동물, 곤충, 새 또는 효모 기원의 호스트 셀이다.

포유류의 세포 또는 조직은 사람, 영장류, 햄스터, 토끼, 설치류, 암소, 돼지, 양, 말, 염소, 개 또는 고양이에서 얻어지는 것이 바람직하지만, 그 외 다른 포유류 세포가 사용될 수 있다.

진핵 숙주는 효모, 곤충, 균류 및 생체 내, 조직내, 생체 검사 포유류 세포 또는 조직 배양된 포유류 세포를 포함할 수 있다. 또한, 바람직한 진핵 숙주는 생체 내, 또는 조직 배양 곤충 세포, 포유류 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직한 포유류 세포는 크세노푸스(Xenopus) 난모 세포, 헤라(HeLa) 세포, VERO 또는 CHO-K1 등의 섬유아 세포 기원의 세포 또는 임파성 기원의 세포 및 그 유도체를 포함한다.

포유류 세포는 정확한 폴딩 또는 정확한 위치에서의 글리코실화을 포함하는, 단백질 분자에 대한 해독후 변형을 제공한다. 숙주로서 사용될 수 있는 포유류 세포는 NIH 3T3, VERO 또는 CHO(이에 한정되지 않음)와 같은 섬유아 세포 기원의 세포 또는, 하이브리도마 SP2/O-Ag14 또는 마우스과의 골수종 P3-X63Ag8, 햄스터 세포주(예컨대, CHO-K1 및 프로제니터, 예컨대 CHO-DUXB11) 및 그의 유도체(이에 한정되지 않음)과 같은 임파성 기원의 세포를 포함한다. 포유류 세포중 바람직한 하나의 타입은 유전적으로 불완전한 세포의 기능을 생체 내에서 대체하도록 의도된 세포이다.

포유류 세포 숙주의 경우, 다수의 가능한 벡터 시스템이 적어도 하나의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드의 발현을 위해 이용 가능하다. 매우 다양한 전사 및 해독 조절 서열이 숙주의 성질에 따라 채용될 수 있다. 전사 및 해독 조절 시그널은 아데노바이러스, 소과 유두종 바이러스, 유인원 바이러스 등과 같은 바이러스원으로부터 유도될 수 있으며, 여기에서 조절 시그널은 고도의 발현율을 갖는 특정 유전자와 관련된다. 선택적으로, 액틴, 콜라겐, 미오신, 단백질 생산물을 포함하며 이에 한정되지 않는 포유류 발현 생성물로부터의 프로모터가 이용될 수 있다. [Ausubel, 하기 문헌 설명 참조; Sambrook, 하기 문헌 설명 참조]

살아 있는 곤충이 사용될 때, 명주 나방 모충 및 바큘로바이러스 벡터가 본 발명에 따른 대형의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 생성에 대해 현재 바람직한 숙주이다. 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드는 예컨대, 적어도 하나의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드를 발현하도록 처리된 바큘로바이러스를 당업자에게 공지된 방법에 의해 곤충 숙주에 감염시킴으로써 곤충에서 생성될 수 있다. [Ausubel et al, eds, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, §§16.8-16.11(1987-1996) 참조]

바람직한 실시예에서, 도입될 뉴클레오티드 서열은 수용 숙주에서 자율 증식할 수 있는 플라스미드 또는 바이러스 벡터내로 통합된다. 매우 다양한 벡터를 이러한 목적을 위해 사용할 수 있다. Ausubel et al, eds, 상기 문헌 §§1.5, 1.10, 7.1, 7.3, 8.1, 9.6, 9.7, 13.4, 16.2, 16.6, 16.8-16.11(1987-1996)를 참조한다. 특정 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 선택하는데 있어서 중요 인자는: 벡터를 포함하는 수용 세포가 벡터를 포함하지 않는 수용 세포로부터 식별되고 선택될 수 있는 용이함; 특정 숙주에 요구되는 벡터의 카피수; 및 상이한 종의 숙주 세포 사이에서 벡터를 "함께 사용(shuttle)"할 수 있는 것이 바람직한지를 포함한다.

상이한 숙주 세포는 단백질의 전사 및 해독후 처리(processing)와 변형(예컨대, 글리코실화, 절단)을 위한 특성 및 특정 메카니즘을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현될 외래 단백질의 바람직한 변형 및 처리를 보장하기 위해 선택될 수 있다. 예컨대, 박테리아 시스템에서의 발현은 비글리코실화된 핵 단백질 생성물을 생산하는데 사용될 수 있다. 효모에서의 발현은 글리코실화된 생성물을 생산한다. 포유류 세포에서의 발현은 이종성의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 단백질의 "천연(native)" 글리코실화를 보장하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 상이한 벡터/숙주 발현 시스템은 단백질 가수 분해 절단과 같은 처리 반응을 상이한 정도로 일으킬 수 있다.

전술한 바와 같이, 진핵 숙주에서 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드의 발현은 진핵 조절 영역의 사용을 필요로 한다. 이러한 영역은 일반적으로 RNA 합성의 개시를 명령하기에 충분한 프로모터 영역을 포함한다. [Ausubel, 하기 문헌 설명 참조; Sambrook, 상기 문헌 설명 참조]

변형 또는 비변형 펩티드의 분리 본 발명의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 단백질이나 단편은 전술한 바와 같은 재조합 DNA로부터의 발현에 의해 얻을 수 있다. 별법으로, 변형 또는 비변형 펩티드는 생물 제제로부터 정제될 수 있다. 원한다면, 발현된 적어도 하나의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드가 종래의 방법에 따른 단계, 예컨대 추출, 침강 반응, 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동에 따라 분리되고 정제될 수 있다. 예컨대, 적어도 하나의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드를 적절한 농도로 발현하는 세포는 원심 분리법에 의해 수집되거나, 또는 적절한 버퍼를 사용하여 분해될 수 있으며, 단백질은 예컨대, DEAE-셀룰로오스, 포스포셀룰로오스, 폴리리보시티딜산-아가로스, 히드록시아파티테 상에서의 컬럼 크로마토그래피에 의해, 또는 전기영동이나 면역 침강법에 의해 분리될 수 있다. 별법으로, 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드는 특정 항체, 예컨대 변형 또는 비변형 펩티드 또는 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 항체(이에 한정되지 않음) 같은 특이적 항체를 사용하여 분리될 수 있다. 그러한 항체는 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다(Colligan, 하기 문헌 설명 참조; Ausubel 하기 문헌 설명 참조).

그러나, 당업자에게 공지된 다른 방법으로, 사이즈에 기초하여 분자를 효율적으로 분리하는 방법이 사용될 수 있다. 변형 또는 비변형 펩티드에 대한 정제 프로토콜에서 4번째 단계는 추가 겔 크로마토그래피 정제 단계인 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 실버 스테이닝과 같은 염색법에 의해 면역 반응성 피크를 분석하는 것을 포함한다. 정제 방법에서의 5번째 단계는 SDS-PAGE 이후에 획득된 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드를 친화성 크로마토그래피 처리하거나 또는, 분리되는 물질과 그 물질이 특이적으로 결합할 수 있는 분자 사이의 친화성에 기초한 임의의 다른 과정을 행하는 것을 포함한다. 변형 또는 비변형 펩티드의 추가 정제를 위해서, 변형 펩티드에 대한 단일 클론 항체(mAbs)(실질적으로 순수한 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드에 대해 생성된 특이적 단일 클론 항체)에 결합된 SEPHAROSE 상에서의 친화성 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 역상(reverse-phase) HPLC 등의 다른 방법 또는 우수한 피크 분해능을 가지며 신속한 분리의 특징을 갖는 임의의 다른 방법이 사용될 수 있다.

당업자는 다른 정제 단계가 전술한 바람직한 방법 대신 사용될 수 있음을 이해하며, 부당한 실험 없이 다른 정제 방법을 생각해 낼 수 있다.

변형 또는 비변형 펩티드에 대해 결합 친화력을 갖는 항체 및 항체를 갖는 하이브리도마(hybridoma)

본 발명의 다른 실시예는 전술한 바와 같은 변형 또는 비변형 펩티드 또는 그 단편에 대해 특이적으로 결합 친화력을 갖는 항체에 관한 것이다. 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드에 선택적으로 결합하는 이들 항체는 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드를 포함하는 조직에서 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 발현의 변화의 분석을 포함하지만 이에 한정되지 않는 방법을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드는 항체의 생성, 약학 조성물의 식별 및 DNA/단백질 상호 작용의 연구와 같은 다양한 절차 및 방법에서 사용될 수 있다.

본 발명의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드는 항체 또는 하이브리도마를 생성하는데 사용될 수 있다. 당업자는 항체가 필요하다면, 이러한 펩티드가 본 명세서에 기술된 바와 같이 생성되고, 면역원으로서 사용됨을 이해한다.

본 발명의 항체는 이들 항체의 단편뿐 아니라 단일클론 및 다클론 항체를 포함한다. 본 발명은 단일쇄의 항체도 포함한다. 분자의 유전형을 포함하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "항체"는 공지된 기술 예컨대, 효소 절단, 펩티드 합성 또는 재조합 기술(이에 한정되지 않음)에 의해 제공되는 항체의 단편뿐 아니라, 다클론 항체, 단일 클론 항체(mAbs), 키메라 항체, 가용성 또는 결합형으로 표시될 수 있는 항체에 대한 항유전형(anti-Id) 항체를 포함하도록 의도된다. 다클론 항체는 항원으로 면역된 동물의 혈청으로부터 얻어진 항체 분자의 이질성 집합체이다. 단일클론 항체는 항원에 대해 특유한 항체의 실질적으로 동형 집합체를 포함하여, 이 집합체는 실질적으로 유사한 에피토프 결합 영역을 포함한다. MAbs는 당업자에게 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다. 예컨대, Kohler 및 Milstein, Nature 256:495-497(1975); 미국 특허 제4,367,110호; Ausubel et al, eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Assoc. 및 Wiley lnterscience,N.Y.,(1987-1996); 및 Harlow 및 Lane ANTIBODIES; ALABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory(1988); Colligan et al.,eds.,Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. 및 Wiley Intersience,N.Y., (1992-1996)를 참조하며, 상기 참조 문헌의 내용은 본 명세서에서 참조로 모두 통합되어 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgA, GILD를 포함하는 모든 면역 글로불린 및 그들의 하위종일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생성하는 하이브리도마는 시험관 내에서, 원래의 위치 내에서 또는 생체 내에서 배양될 수 있다. 생체 내에서 또는 원래의 위치 내에서의 mAbs의 높은 역가의 생성은 이 현재 바람직한 생성 방법을 형성한다.

키메라 항체는 예컨대 마우스와 mAb 및 사람의 면역 글로불린이 일정한 영역으로부터 유도된 다양한 영역을 갖는 상이한 동물종으로부터 유도된 영역이 상이한 분자로서, 응용 분야에서 면역원성을 감소시키고, 예컨대, 마우스와 mAbs가 하이브리도마로부터 높은 수율을 갖지만 사람에서의 면역원성보다 높아서 사람/마우스 키메라 mAbs가 사용되는 경우 생성 수율을 증가시키기 위해 사용된다. 키메라 항체 및 그 생성 방법은 당업계[ Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly et al., 유럽 특허 출원 제125023호; Neuberger et al., Nature 314-268-270 (1985); Taniguchi et al., 유럽 특허 출원 제171 496호; Morrison et al., 유럽 특허 출원 제173 494호; Neuberger et al., PCT 출원 제WO86/01533호; Kudo et al., 유럽 특허 출원 제184 187호; Morrison et al., 유럽 특허 출원 제173 494호; Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson et al., 국제 특허 공개 제PCT/US86/02269호; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240:1041-1043 (1988); 및 Harlow, 하기 문헌 설명 참조]에 공지되어 있다. 이들 참조 문헌은 본 발명에서 참조로 통합되어 있다.

항유전형(anti-Id) 항체는 항체의 항원 결합 영역과 일반적으로 관련된 유일한 결정자를 인식하는 항체이다. Id 항체는 항 Id가 마련되는 mAb를 갖는 mAb원으로서 동일한 종 및 유전형(마우스 계통)의 동물을 면역시킴으로써 마련될 수 있다. 면역된 동물은 이들 유전자형 결정자(항 Id 항체)로 항체를 생성함으로써 면역 항체의 유전자형 결정자를 인식하고 응답한다. 미국 특허 제4,699,880호를 참조하는데, 이는 참조로 본 명세서에 통합된다.

항 Id 항체는 다른 동물에서 면역 응답을 유도하도록 "면역원(immunogen)"으로서 사용되어 소위 항항 Id 항체를 생성한다. 항항 Id는 항 Id를 유도한 오리지날 mAb에 대해 에피토프적으로 동일해질 수 있다. 따라서, mAb의 유전자형 결정장에 대해 항체를 사용함으로써, 동일한 특이성의 항체를 발현하는 다른 클론을 식별할 수 있다.

따라서, 본 발명의 변형 또는 비변형 펩티드에 대해 생성된 mAbs는 BALB/c 마우스와 같은 적당한 동물에서 항 Id 항체를 유도하는데 사용될 수 있다. 이러한 면역된 마우스로부터의 비장 세포는 항 Id mAbs는 키홀 임펙트 헤모시아닌(KLH)과 같은 캐리어로 결합될 수 있고, 추가 BALB/c 마우스를 면역시키는데 사용된다. 이들 마우스로부터의 혈청은, 변형 또는 비변형 펩티드에 특이적인 에피토프에 대해 특이적인 원래 mAb의 결합 특성을 갖는 항항 Id 항체를 포함한다. 따라서, 항 Id mAbs는 그 자체의 유전자형 에피토프, 또는 평가된 에피토프와 구조적으로 유사한 "이디오토프"를 갖는다.

본 명세서 사용되는 "항체"는 항원을 결합할 수 있는 예컨대, Fab 및 F(ab')2와 같은 항체의 단편뿐 아니라, 원래 분자를 포함하도록 의도된다. Fab 및 F(ab')2 단편은 원래 항체의 Fc 단편이 없고, 순환으로부터 더 신속하게 제거되고 원래 항체보다 적은 비특이적인 조직 결합을 가질 수 있다(Wahl et al., J.Nucl.Med.24:316-325(1983)). 본 발명에 유용한 항체의 Fab 및 F(ab')2와 다른 단편은, 원래 항체 분자에 대해 본 명세서에 개시된 방법에 따라 변형 또는 비변형 펩티드의 검출 및/또는 정량화에 사용될 수 있다. 이러한 단편은 통상적으로 파파인(Fab 단편을 생성하는) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생성하는)과 같은 효소를 이용하여 단백질 가수 분해 절단에 의해 생성될 수 있다. 항체는 분자를 "결합할 수 있는" 것을 말하며, 분자에서 특이적으로 반응할 수 있다면, 분자를 항체에 결합한다. 본 명세서에 사용되는 용어인 "에피토프"는 항체에 의해 인식될 수 있는 항체에 의해 결합할 수 있는 모든 분자부를 말하도록 의도된 것이다. 에피토프 또는 "항원 결정자"는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 반응성 표면 분류로 구성되어 있으며, 특이적 전하 특성뿐 아니라 특이적 3차원 구조적 특성을 갖는다.

"항원"은 항원에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자부이며, 이는 추가적으로 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성하도록 동물을 유도할 수 있다. 항원은 하나 또는 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 상기 언급된 특이적 반응은 항원이 매우 선택적인 방식으로, 다른 항원에 의해 나타날 수 있는 다수의 다른 항체에 의하지 않고 그 대응하는 항체와 반응하는 것을 나타내도록 의도된 것이다.

면역 검정

변형 또는 비변형 펩티드에 반하여 지시된 본 발명의 항체는 변형 또는 비변형 펩티드 또는 병리학에 관련된 변형 또는 비변형 펩티드를 검출하거나 진단하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 선별 방법은 예컨대, 변형 또는 비변형 펩티드에 대해 특이적 항체(단일클론 또는 다클론)의 생성에 기초한, 방사선 면역 검정(RIA) 또는 효소 연결형 면역 흡착 검정(ELISA) 방법을 포함할 수 있다. 이러한 검정의 경우, 생물 샘플은 생체 검사 또는 다른 조직 샘플링에 의해 얻어진다. 예컨대, RIA의 일형태에서 시험중의 물질은 방사선 표지된 항원의 면전에서 희석된 항혈청과 혼합된다. 이 방법에서, 시험 물질의 농도는 특히 항체에 결합되는 표지된 항원의 양에 역으로 비례하고, 자유 표지된 항원의 양에 직접 관련된다. 다른 적당한 선별 방법이 당업자는 용이하게 나타날 수 있다.

더욱이 당업자는 합리적으로 설계된 항펩티드성 펩티드를 발생시키기 위해, 특이적 펩티드 서열에 결합할 수 있는 펩티드를 발생시키도록, 항체와 관련하여 전술한 기술, 방법 및 키트뿐 아니라 현재 이용가능한 과정도 용이하게 적용할 수 있으며, 이는 Hurby et al., "Application of Synthetic Peptides; Antisense Petides", In: Synthetic Peptides, A User's Guide, W.H.Freeman, NY, pp. 289-307(1992), and Kaspczak et al.,Biochemistry 28:9230-8(1989)를 참조한다.

변형 또는 비변형 펩티드를 포함하는 생물학적 샘플에 대해 본 발명의 진단 검정을 실행하는 바람직한 실시예는,

(a) 상기 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 특이적 항체 또는 그 단편을 고정하기 위해 표지된 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 특이적 항체를 고체 지지체와 검출 가능하게 접촉시키는 단계와;

(b) 상기 변형 또는 비변형 펩티드를 상기 고체 지지체를 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 상기 고체 지지체와 접촉시키는 단계와;

(c) 상기 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드에 결합하기 위해 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 특이적 항체를 고정하기에 충분한 시간 동안 상기 검출 가능하게 표지된 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 특이적 항체를 상기 고체 지지체에서 항온 처리하는 단계와;

(d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 항온 처리 혼합물로부터 고체상 지지체를 분리하는 단계와;

(e) 상기 혼합물 표지를 검출하여 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드를 검출하고 정량화하는 단계를 포함한다.

다른 검정 조건뿐 아니라 검출 가능하게 표지된 항체 및 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드의 특이적 농도, 항온 처리 온도 및 시간은, 샘플에서의 변형 또는 비변형 펩티드의 농도, 샘플의 성질 등에 따라 변경될 수 있다. 소정량의 항변형 펩티드 항체의 결합 작용은 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 당업자는, 루틴 실험을 채용함으로써 각 결정에 대한 효과적인 최적의 검정 조건을 결정할 수 있다. 세척, 교반, 진탕, 여과 등과 같은 다른 이러한 단계는 특정 상황에 통례적으로 또는 필수적인 검정에 부가될 수 있다.

검출은 다수의 검정법중 하나를 이용하여 달성될 수 있다. 예컨대, 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 특이적 항체 또는 항체 단편을 방사능 표지함으로써 방사능 면역 검정의 사용을 통해 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드를 검출할 수 있다. 방사면역 측정의 상세한 설명은 전체가 여기에 참조로 통합되어 있는, Colligan, infra 및 Ausubel, infra에 나타나 있다. 바람직하게는, 변형 펩티드 또는 비변형 펩티드를 보유한 세포의 검출은 라벨된 항체(또는 그 단편)가 대상자에게 제공되고, 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드가 어떤 조직 샘플의 우선적인 제거없이 검출되는, 생체내 이미징 기술에 의하여 성취될 수 있다. 이러한 생체내 검출 방법은 다른 검출 방법보다 덜 침습적이라는 이점이 있으며, 더우기 뇌 조직과 같은, 환자로부터 쉽게 얻어낼 수 없는 조직에서 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드의 존재를 검출할 수 있다.

많은 다른 생체내 라벨과 라벨링 방법들이 본 기술분야의 당업자들에게 알려져 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표지 형태의 예들은 방사성 동위원소와 정자기 동위원소를 포함한다. 본 기술분야의 당업자들은 본 발명에서 사용된 항체와 결합하기 위한 다른 적당한 라벨을 알고 있거나, 루틴 실험을 사용하여 확인할 수 있다. 또한, 이러한 라벨을 항체와 결합시키는 것은 본 기술분야의 당업자들에게 통용되는 표준 기술을 사용하여 행해질 수 있다.

생체내 진단 이미징을 위하여, 사용되는 검출 장치의 형태는 주어진 방사성 핵종을 선택할때 주요한 요소이다. 선택된 방사성 핵종은 주어진 형태의 장치에 의해 검출될 수 있는 부식(decay)의 형태이어야 한다. 일반적으로, 진단 이미징을 가시화하는 편리한 방법이 본 발명에 의하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 양전자 방출 단층촬영(PET), 감마, 베타 및, 자기 공명 이미징(MRI) 검출기가 진단 이미징을 가시화하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체는 또한 생체내 진단을 위하여 정자기 동위원소와 함께 라벨링될 수 있다. 자기 공명 이미징(MRI)으로서, 특별히 사용되는 성분은 157Gd, 55Mn, 162Dy 및, 56Fe 를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 항체(또는 그 단편)는 또한 체조직, 체액(CSF등) 또는 세포성 추출물에서 변형 또는 비변형 펩티드의 존재를 생체내 면역측정에서 사용하는 것에 특히 적합하다. 이러한 면역측정에서, 항체(또는 항체 단편)는 전술된 바와 같이, 바람직하게는 고형 운반자에 결합된 액체 상태로 사용될 수 있다.

원위치에서의 검출은 환자로부터 조직 표본을 제거하고, 이 표본에 본 발명의 라벨링된 항체를 결합시킴으로써 성취될 수 있다. 이 항체(또는 그 단편)는 바람직하게는 생물학적 샘플에 라벨링된 항체(또는 그 단편)를 놓거나 씌워서 제공된다. 이러한 방법을 사용하여, 변형 또는 비변형 펩티드의 존재는 물론, 검사된 조직 위의 변형 또는 비변형 펩티드의 분포도 알아낼 수 있다. 본 발명을 사용하여, 본 기술분야의 당업자들은 광범위한 조직적 방법(착색 방법 등)들은 상기 원위치 검출을 성취하기 위하여 변경될 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있을 것이다. 여기에서 사용된 바와 같이, 진단 시약(항체 또는 항체 단편 등)의 효과적인 양은 소망의 진단 식별을 성취할 수 있는 양이며, 연령, 상태, 성별, 대상자의 질병 범위, 반대 표시(만일 존재한다면) 및, 의사에 의해 조정되는 다른 변수와 같은 요소들에 따라서 달라질 것이다. 진단 테스트에서 일반적으로 사용되는 이러한 물질의 양은 일반적으로 0.01에서 5mg 사이이며, 바람직하게는 0.1에서 0.5mg 사이이다. 본 발명의 분석은 이상적으로 키트의 준비에 적합하다. 이 키트는 유리병, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기 수단을 그들 사이에 밀접하게 수용하기 위해 구분되는 캐리어 수단을 포함하고, 상기 용기 수단은 면역 측정의 별도 요소를 포함한다.

예를 들면, 고형 지지대위에 고정화된 제 1 항체를 포함하는 용기와, 용액내에 제 2 검출가능하게 라벨링된 항체를 포함하는 다른 용기가 있을 수 있다. 다른 용기는 검출되는 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드의 연속적인 희석물을 포함하는 표준 용액을 포함할 수 있다. 변형 또는 비변형 펩티드의 표준 용액은 가로좌표 위에 나타난 변형 또는 비변형 단백직 또는 펩티드의 농도와 세로좌표 위에 검출 신호를 가진 표준 곡선을 준비하기 위하여 사용될 수 있다. 변형 또는 비변형 펩티드를 포함하는 샘플로부터 얻어진 결과는 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드의 농도를 나타내는 이러한 도면으로부터 알 수 있다.

본 발명의 분석은 이상적으로는 키트의 준비에 또한 적합하다. 이러한 키트는 상기 용기 각각이 면역측정의 별도의 성분들을 포함할 때, 유리병, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기 내에 밀폐되어 수용하기 위하여 구획으로 나뉘어지는 캐리어 수단을 포함한다.

예를 들면, 고형 지지대위에 고정된 제1 항체를 포함하는 용기와 용액 내에 검출가능하게 라벨링된 제2 항체를 포함하는 용기가 있을 수 있다. 다른 용기는 검출되는 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드의 연속적인 희석물을 포함하는 표준 용액을 포함할 수 있다. 변형 또는 비변형 펩티드의 표준 용액은 세로좌표 위의 검출 신호와 가로좌표 위에 나타난 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드의 농도를 가진 표준 곡선을 준비하기 위하여 사용된다. 변형 또는 비변형 펩티드를 포함하는 샘플로부터 얻어진 결과는 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드의 농도를 나타내는 이러한 도면으로부터 알 수 있다.

진단 선별. 하기의 설명이 특히 사람 환자에 대하여 중점을 두고 있지만, 본 기술은 적어도 하나의 변형 또는 비변형 펩티드를 보유한 어떤 동물에게도 적용될 수 있는 것으로 이해해야 한다. 본 발명의 진단 방법과 선별 방법은 가계를 바탕으로 한 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드의 변형된 보유 레벨과 관련된 질병이 발생할 위험이 있는 환자, 또는 변형 또는 비변형 펩티드 관련 질병을 진단하고자 하는 환자에게 특히 유용하다.

본 발명에 따라서, 이러한 선별이 필요할 때 개체의 선증상 선별은 현재 본 발명의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 DNA 를 사용하여 가능하다. 본 발명의 선별 방법은 개체 내에서 분실되거나 이상형의 변형 또는 비변형 유전자의 존재의 출생전의 진단을 포함하여, 선증상 진단을 가능하게 하며, 그럼으로써 이러한 개체가 변형 또는 비변형 펩티드 관련 질병을 발생시키거나 발생시켰을 가능성에 관한 의견을 제시할 수 있다. 이것은 예를 들면 변형 또는 비변형 펩티드-관련 병리학의 가계를 가진 개체로부터, 변형되거나 분실된 변형 또는 비변형 펩티드 유전자의 운반자를 인식하는 것에 특히 중요하다. 적당한 시간적 조정을 최대화하기 위하여 빠른 진단이 또한 필요하다.

선별 방법의 바람직한 실시예에서, 조직 샘플은 이러한 개체로부터 선택되어, (1) "정상적인" 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 유전자의 존재; (2) 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 mRNA 의 존재 및/또는; (3) 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 단백질의 존재에 대하여 선별된다. 정상 인류 유전자는 예를 들면, 본 발명에서 설명된 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 서열(또는 그 기능적 단편)에 대항하여 준비된 DNA 프로브를 사용하여, RFLP 분석을 포함하여, "정상" 대 환자의 DNA에 대한 제한 소화(restriction digestion) 패턴에 바탕을 둔 것을 특징으로 한다. 유사하게, 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 mRNA 는 정상적인 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 mRNA와 비교하여, 유사한 프로브를 사용하여 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드-관련 질병을 발생시킬 위험이 없는 인구중에서 발견되는 (a) 레벨 및/또는 (b) 크기를 특징으로 한다. 마지막으로, 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 단백질은 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 활성을 위한 생물학적 분석을 사용하거나 면역학적 측정과 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 항체를 사용하여 (a) 검출되거나 (b) 측정될 수 있다. 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 단백질을 분석할때, 면역학적 분석이 그 속도면에서 바람직하다. (1) 이상형의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 DNA 크기 패턴 및/또는 (2) 이상형의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 mRNA 크기 또는 레벨 및/또는, (3) 이상형의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 단백질 레벨은 환자가 변형 또는 비변형 펩티드-관련 질병을 발생시킬 위험이 있다는 것을 나타낸다.

본 발명의 선별 방법과 진단 방법에서는 전체 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 DNA 코딩 서열이 프로브에 대하여 사용될 필요가 없다. 오히려, 정상 개체 또는 변형 개체로부터의 DNA 제조에서 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드의 존재 또는 그러한 유전자의 부재 또는 (전기영동 패턴에서의 변화와 같은) 그러한 유전자의 변형된 물리적 특성을 검출하기에 충분한 핵산의 단편 또는 길이를 사용하는 것만이 필요하다.

출생전의 진단은 필요하면 양수천자, 난각 융모 샘플링(CVS) 및, 태아경(fetoscopy)을 포함하여, 태아 조직을 얻기 위한 임의의 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 출생전의 염색체 분석은 정상적인 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드 유전자를 보유한 염색체의 비율이 헤테로 접합 상태에 있는지를 결정하기 위하여 사용될 수 있다.

확인된 단백질을 사용하는 약제 선별과 진단 및/또는 치료제와의 관계. 본 발명의 진단 또는 치료용의 단백질 또는 펩티드 조절제 또는 리간드(ligand)는 전술된 바와 같은 표지 항체에 대하여 검출가능하게 표지될 수 있는, 핵산, 화합물, 단백질, 성분, 지질, 항체, 당류, 핵종, 탄수화물, 이미징제, 리포단백질, 글리코단백질, 효소, 검출가능한 프로브와, 그 항체 또는 단편, 또는 그 결합물 중에서 선택된 적어도 하나일 수 있지만, 그것으로 제한되는 것은 아니다. 이러한 라벨은 효소 라벨, 방사성 핵종 또는 방사성 화합물 또는 성분, 형광성 화합물 또는 금속, 화학 발광 화합물 및 생물 발광 화합물을 포함하지만 이것으로 제한되는 것은 아니다. 대체적으로, 임의의 다른 공지된 진단 또는 치료제가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 치료제는 특정 세포 형태의 세포들의 그룹(인접해 있을 필요는 없음) 또는 순환 단백질 복합물로서 목표 세포에 대한 치료 효과를 가질 수 있으며; 상기 치료 효과는 결손 유전자 또는 단백질, 약제 활성, 중독 효과, 성장 촉진 효과, 성장 억제 효과, 대사 효과, 이화 효과, 세포 차별 억제 효과, 신경조절 효과, 다효능 줄기 세포 촉진 효과 및 특정 세포 형태의 세포 내에서 적어도 하나의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드를 조절하는 다른 공지된 치료 효과들중에서 선택되지만 그것들로서 제한되지는 않으며, 상기 효과들은 조제학 투약을 통해 또는 본 발명에 따른 전달 매개자를 통해 목표 세포에 전달된 치료제에 의하여 제공될 수 있다.

치료제로서 치료 핵산은 목표 세포에 대해 하기의 치료 효과들중의 적어도 하나의 효과를 가질 수 있지만, 그것으로 제한되는 것은 아니다. 상기 치료 효과들에는 DNA 서열의 전사를 억제하는 효과; RNA 또는 DNA 서열의 역전사를 억제하는 효과; 단백질의 변환후 완화를 억제하는 효과; DNA 서열의 전사를 유도하는 효과; RNA 서열의 변환을 유도하는 효과; RNA 또는 DNA 서열의 역전사를 유도하는 효과; 단백질의 변환후 완화를 유도하는 효과; RNA로서 핵산의 전사 효과; 단백질 또는 효소로서 핵산의 변환 효과 및; 핵산을 치료 핵산의 구성성 또는 통과성 발현을 위한 목표 세포의 염색체로 통합시키는 효과가 있다.

치료 핵산의 치료 효과들은 안티센스 RNA 또는 DNA와 같은, 결손 유전자를 차단하거나 그 발현을 처리하는 효과; 바이러스성 복제 또는 합성을 억제하는 효과; 치료 단백질을 암호화하거나 결손 단백질을 교정하는 열성 핵산을 발현시키는 유전자 치료; hnRNA, mRNA, tRNA, 또는 rRNA와 같은 RNA 의 결손 또는 발현부족을 완화시키는 효과; 변형 단백질 또는 펩티드를 발현시키는 비정상 또는 정상 세포에서 화합물을 약제 또는 프로드러그로서 생성시키는 약제, 또는 프로드러그 또는 효소를 암호화하는 효과가 있다.

병원성 세포에 전사되는 어떤 공지의 독소, 프로드러그 또는 유전자 드러그의 암호화 또는 치료 효과를 제공하는 본 발명의 치료 핵산은 세포를 포함하는 병원성의 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드에 대하여 지정된 조직 지정 전사 조절 서열(TRS)의 제어하의 유전자를 또한 포함할 수 있다. 이러한 TRS 는 또한 공지된 방법에 따라서 목표 세포에 치료제를 보내는 것으로 한정된다.

본 발명의 약제 또는 리간드와 본 발명의 방법을 조정하는 상기 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드의 무제한적인 예는 상기 변형 또는 비변형 단백질 또는 펩티드, 센스 또는 안티센스 핵산 등을 포함한다.

변형 펩티드 길항약(antagonist)는 변형 또는 비변형 펩티드를 자연적으로 발생하는 적어도 하나의 변형된 또는 비변형된 펩티드를 나타내는 비정상적인 높은 레벨과 관련된 특정 세포형 또는 병원균을 포함하는 병리학을 다루기 위하여 사용되며, 여기서, 변형 또는 비변형 펩티드 길항약은 또한 적어도 하나의 변형 또는 비변형 펩티드를 억제하거나, 변형 또는 비변형 펩티드에 의해 어떤 범위까지 병리학이 조정된다. 이러한 병리학은 전술되거나 기술적으로 알려진 다른 질병들은 물론, 염증성 질병, 신경퇴행성 질병 및 질병들과 관련된 면역 체계로 제한되는 것은 아니다.

염증성 질병은 만성 염증성 병원균과 혈관 염증성 병원균을 포함하지만, 그것으로 제한되는 것은 아니다. 만성 염증성 병리학은 유사 육종증, 만성 염증성 내장 질병, 궤양성 대장염 및 크론(Crohn) 병리학과, 유포된 내부 혈관 응고, 동맥 경화증 및 가와사키 병리학과 같은 혈관 염증성 병리학을 포함하지만, 그것에 제한되는 것은 아니다.

신경 퇴행성 질병은 다발셩 경화증 및 급성 횡단 척수염 등의 수초 제거 질병; 헌팅턴 무도병 및 노인성 무도병 등의 과운동성 질병; 파킨스 병 등의 저운동성 질병; 진행성 핵상 마비; 척추 운동 실조증, 프레드리히 운동실조증 등의 척수소뇌 변성; 다발성 계통 변성(Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager, 및 Machado-Joseph); 및 계통 질환(렙섬 질환, 무베타지단백 혈증, 운동실조증, 모세혈관 확장증, 및 미토콘드리아 멀티 시스템 질환); 다발성 경화증, 급성 횡단 척수염 등의 수초 제거 코어 질환; 신경유전 근위축증 등의 운동 단위 질환(근위축성 측삭 경화증, 영아성 척추 근위축증 및 연소성 긍위축증 등의 전각 세포 변성); 또는 그 하부 질환을 포함할 수 있지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다.

변형 단백질 또는 펩티드 작용약 또는 길항약은 적어도 하나의 변형 펩티드의 비정상적으로 낮거나 높은 발현 레벨에 관계된 병리학을 치료하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 상기 변형 펩티드 작용약 또는 길항약은 각각 적어도 하나의 변형 펩티드를 증대시키거나 억제시키는데에도 사용될 수 있다. 이러한 병리학은 신경변성 질환, 장신경계의 기능부전에 기인하는 위장관(gastrointestinal tract) 질환(예를 들면, 대장염, 회장염, 염증성 장증후군); 심장질환계 질환(예를 들면, 고혈압 및 울혈성 심부전); 교감신경 및 부교감신경 지배를 포함하는 비뇨생식기관 질환(예를 들면, 양성의 전립선 증식, 임포텐스); 신경근육계 질환(예를 들면, 근 디스트로피, 다발성 경화증, 간질) 및 내분비계 질환(예를 들면, 당뇨병)을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

지금까지 본 발명을 개략적으로 설명하였지만, 본 발명은 하기의 실시예를 통하여 더 쉽게 이해될 수 있을 것이다. 이 실시예들은 단순히 설명을 위한 것이고, 특정되어 있지 않는 한 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 겔 이미지 분석

실시예 1A. 예로서, 3개의 다른 동물, 예를 들면 3마리의 쥐가 왜 3가지의 다른 혈압을 갖는지를 확인하는 것이 요망될 수 있다. 3개의 다른 동물로부터의 동맥 세포에 대한 2-DGE 겔을 비교한다. 겔들은 그들의 발현에서 변화되는 단백질을 검사하기 위해 비교되고, 이것은 통계적으로 동물의 혈압과 상관된다. 통계적 분석의 형태는 선형으로 퇴화할 것이다. 동물의 혈압과 비교된 각 스폿의 발현의 선형 퇴화가 실행되었다.

실시예 1B. 다른 실시예로서, 제1군의 겔 이미지는 섬(islet)과 같은 정상적인 즉 치료되지 않은 세포에 관계될 수 있다. 제2군의 겔 이미지는 인터레우킨(IL-1β)으로 치료된 것과 같은, 치료된 세포에 관계될 수 있다. 각각의 겔 이미지 세트에서의 각 스폿의 통계적 평균을 계산한다. 첫번째 겔 이미지 세트에서의 각 스폿의 통계적 평균은 두번째 겔 이미지 세트에서의 각 스폿의 통계적 평균과 비교하여 이들이 통계적으로 다른지를 검사한다. 이러한 방법으로 오퍼레이터는 어떤 단백질이 IL-1β 처리에 의해 변화(상승 조절 또는 하강 조절)되었는지를 신속히 그리고 쉽게 검사할 수 있게 된다.

실시예 1C. 또 다른 예로써, 어느 한 그룹의 이미지들은 정상인 쥐와, 다른 그룹의 이미지들은 당뇨병에 걸린 쥐와 관련이 된다. 상기 목적은 두 그룹 사이의 차이점을 밝혀내는 것이다. 상기 겔 이미지들은 2개의 세트로 나뉘어 진다. 정상 쥐에 대한 제1 세트의 겔 이미지와 당뇨병에 걸린 쥐에 대한 제2 세트의 겔 이미지. 상기 분석은 정상 쥐와 당뇨병에 걸린 쥐 사이의 단백질 발현에 있어서 나타나는 차이점들을 판단하기 위해서 처리된 섬과 처리되지 않은 섬에 대하여 전술한 것과 유사한 방식으로 이루어질 것이다.

제2 실시예: 쥐 섬 단백질의 발현에 있어서 변화하는 유도 인터루킨-1DF : 전산화된 데이타베이스

요약

췌장 섬(islet) 단백질의 평면(2-D) 겔 전기영동 법은 인슐린 의존 당뇨병의 분자적인 병인 연구를 용이하게 하는 중요한 수단이 될 수 있다. 인슐린 의존 당뇨병은 랑게르한스 섬 내에 있는 β세포의 자가 면역 파괴로 인하여 일어난다. 시토키닌 인터루킨 1β는 인슐린의 방출을 억제하고 분리된 췌장의 쥐 섬 내에 있는 β세포에 대해서 선택적으로 독성을 갖는다. 인터루킨 1β가 개재된 β세포 독성 작용의 세포 내 기전뿐만 아니라 면역 반응을 일으키는 항원은 알려져 있지 않다. 그러나 예전의 연구에 의하면 단백질 합성에 있어서의 변경과 관련이 있다는 사실이 밝혀졌다. 따라서, 섬 단백질의 2-D 겔 전기 이동은 1) β세포의 자가 면역 파괴를 개시시키는 주요 항원의 정체를 확인하는 것과, 2) 시토키닌에 의해 유도되는 특정 섬 단백질에 있어서의 질적 및 양적 변화를 결정하는 것과, 3) 시토키닌 작용을 조정하는 인자의 영향을 결정하게 할 수 있다. 따라서 본 연구의 목적은 표준 배양 조건이라 명명된 신생 쥐 섬의 10％ 및 15％ 아크릴아미드 2-D 겔(10％ & 15％ DB) 상에서 재생 가능한 식으로 감지할 수 있는 모든 단백질 스폿들에 대한 데이타베이스를 만드는 것이다. 1373 스폿들이 10％ DB에서 5겔의 5에 존재하는 반면, 1792 스폿들은 75.2％와 91.7％ 사이의 양적인 재생 가능성을 가져오면서 15％ DB에서 5겔의 5에 존재하였다. 양자의 DB에 있어서, 모든 겔 내에 존재하는 스폿들에 대한 총 흡광도(％IOD의 CV％) 퍼센트 변화량의 평균 계수는 42.4％와 45.7％ 사이에 있다. 다른 날에, 동일한 샘플을 연속적인 세트의 겔에서 분석〔상호 검증 분석(interassay analysis)〕하면, ％IOD의 평균 CV％는 35.5％ 내지 36.1％이다. 동일한 샘플을 한 세트의 겔에서 반복적으로 분석〔내부 검증 분석(intraassay analysis)〕하면, IEF 겔에서는 ％IOD의 평균 CV％가 30.2％이고, 반면에 NEPHGE 겔에서는 ％IOD의 평균 CV％가 변화되지 않는다(45.7％). IL-1β로 발현이 변경된 단백질들을 구별하는 데에 10％ DB를 적용하면, 현재 확인되지 않은 105 단백질 스폿들은 IL-1β에 의해 상승 조절 및 하강 조절된, 또는 합성된 디 노보(de novo)임을 발견한다. 결국, 랑게르한스의 신생 쥐 섬에 대한 제1의 10％와 15％ 아크릴아미드 겔단백질 데이타베이스를 제공하고 있으며, IL-1β에 의해 발현이 변경된 단백질을 확인하기 위한 그 데이타베이스의 용법을 설명하고 있다.

서문

시토키닌 인터루킨 1β는 인슐린의 방출을 억제시키고, 분리된 췌장 쥐 섬 내의 β세포에 선택적으로 독성을 갖는다(1996년에 발행된 Mandrup-Poulsen, T, Diabetologia). 활성 단백질의 합성은 시토키닌과 같은 손상 이후 β세포의 파괴, 보호 및 복구에 있어서 중요한 부분을 차지한다. 자유 래디칼 산화 질소는 섬 α세포에 대한 시토키닌의 유해한 영향을 조절하는 중요한 물질로 증명되어져 왔다〔Southern, et al, FEBS. Lett. 276:42-44(1990); Welsh, et al, Endocrinol. 129:3167-3173(1991); Corbett, et al, J. Biol. Chem. 266:21351-21354(1991)〕. 따라서, L-아르기닌의 유사 물질, 즉 NO 생성에 있어서의 기질이 인터루킨 1β(IL-1β)의 유해한 영향을 억제하고〔Southern, et al, FEBS. Lett. 276:42-44(1990); Welsh, et al, Endocrinol. 129:3167-3173(1991); Corbett, et al, J. Biol. Chem. 266:21351-21354(1991)〕, 시토키닌을 유도할 수 있는 NO 신타아제(iNOS)의 등가 형태에 대한 mRNA는 α세포 내가 아니라 β세포 내의IL-1β에 의해 유도된다〔Corbett, et al, J. Clin. Invest. 90:2384-2391(1992)〕. 최근에 신생 쥐 섬으로부터 iNOS를 복제했으며, 가인산 등가 형태와 같이 131kDa의 분자량과 6.8 내지 7.0 범위의 pI 값을 가지고 재 조합 iNOS를 평면(2-D) 겔 이미지에 일련의 스폿들로 표현하는 것을 증명하였다〔Karlsen, et al, Diabetes 44:753-758(1995)〕.

또한, 단백질 합성 억제제가 섬 기능상 IL-1β의 억제 효과를 방해하고〔Hughes, et al, J. Clin. Invest. 86:856-863(1990)〕, 디 노보(de novo) 단백질 합성이 IL-1β의 유해한 영향에 필수적이라는 것을 지적한다. IL-1β는 또한, 세포 스트레스를 저지하는 단백질과 세포 복구의 역할을 한다고 알려진 열처리 단백질(HSP) HSP32〔헴 옥시게나아제(heme oxygenase)〕와 HSP70〔Helqvist, et al, Acta Endocrinol(Copenh) 121:136-140(1989); Helqvist, et al, Diabetologia 34:150-156(1991)l Welsh, et al, Autoimmunity 9:33-40(1991)〕의 합성을 유도한다. 또한, IL-1β는 섬(islet)에서 분자량 45, 50〔Hughes, et al. J Coin. Invest. 86L856-863(1990)〕, 75, 85 및 120 kDa〔Welsh, et al. Autoimmynity 9:33-40(1991)〕의 알려지지 않은 수 많은 단백질의 합성을 억제한다. 2-D 겔 전기영동 법을 사용하여 IL-1β가 신생 쥐 섬에서 29 및 3 단백질 각각을 상승 조절(upregulate) 및 하강 조절(downregulate) 시킨다.

내분비 섬 세포는 β세포의 파괴 또는 생존에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 섬 세포의 분산과 분류는 단백질 합성 패턴에 영향을 미칠 수 있는 해로운 과정일 가능성이 있다. 선택된 섬 세포 물질의 나쁜 점은 임의의 세포 유형 내에서 단백질 발현 상의 변화가 다른 세로로부터의 합성으로 인하여 경감되기 때문에 더 작게 보인다는 것이다.

따라서 본 연구의 목적은 스폿 감지 재생 가능성을 결정하고, (³⁵S)-메티오닌이라 명명된 모든 섬 단백질 데이타베이스 스폿들에 대한 총 흡광율(％IOD의 CV％) 변화 계수를 계산하는 것이다. 또한, 겔 제조의 내부 검ㅇ(intraassay) 및 상호 검정 분석(interassay) 변화가 상기 스폿들의 총 ％IOD의 CV％에 대하여 가지는 기여도를 조사하고자 한다. 마지막으로, 컴퓨터 분석에 의해 섬 단백질 패턴 내에서 변화하는 유도 IL-1β의 수를 한정하고자 한다.

물질과 방법

반응물질 DMEM, RPM1 1640과 Hanks의 평형 염분 용액(HBSS)은 Gibco, Paisley, Scotland로부터 구입된다. 20 mM의 HEPES 완충제, 100,000 IU/I의 페니실린과 100㎎/L의 스트렙토마이신(streptomycin)에 RPM1 1640을 첨가한다. Novo Nordisk Ltd.(Bagsvaerd, Denmark)는 인간의 정격 재 조합 IL-1β를 제공하였다. 특정의 활성도는 400 U/ng〔(Moelvig, et al, Scand. J. Immunol 31:225-235(1990)〕이다. 다음과 같이 다른 반응 물질 들이 사용된다. 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol), 소 혈청 알부민(BSA), 3 HCL, 3 염기, 글리신, (Sigma, St Louis, USA); 삼염화아세트 산(TCA), 인산, NaOH, 글리세롤, n-부탄올, 브로모페놀 블루(bromophenol blue)(Merck, Darmstadt, Germany);(³⁵S)-메티오닌〔SJ 204, 특정 활성도: ＞1.000 Ci/m mol, 0.1％ 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 함유〕, 앰플리파이^??(Amplify^??) (Amersham International, Amersham, UK); 필터(HAWP 0.25㎛ 공극 크기)(Millipore, Boston, USA); RNA'se A, DNA'se I(Worthington, Freehold, NJ, USA); 요소(최고 순도)(Schwarz/Mann, Cambridge, MA, USA); 아크릴아미드, 비스아크릴아미드, TEMED, 과황산암모늄(BioRad, Richmond, CA, USA); 양쪽성 물질: pH 5 내지 7, pH 3.5 내지 10, pH 8 내지 9.5, pH 8 내지 9.5(Pharmacia, Uppsala, Sweden); 넌아이데트(Nonidet) P-40(BDH, Poole, UK); 양쪽성 물질: pH 5 내지 7과 도데실 황산 나트륨(Serva, Heidelberg, Germany); 아가로우즈(agarose)(Litex, Copenhagen, Denmark); 에탄올(무수 96％)(Danish Distillers, Aalborg, Denmark); 메탄올(Prolabo, Brione Le Blanc, France); 아세트산(공업용 품질, 99％ 빙초산)(Bie & Berntsen, Arhus, Denmark) 및 X-ray 필름(Curix RP-2)(AGFA).

섬 분리와 배양. 데이타베이스와 정량 분석 변화 실험에 있어서, 12개의 서로 다른 섬 분리가 실행되는데, 10개는 데이타베이스로, 1개는 내부 검정 분석(intraassay)으로, 1개는 상호 검정 분석(interassay)으로 쓰인다. IL-1β와 관련된 연구에 있어서, 3개의 추가적인 섬 분리가 수행된다.

콜라게나제(collagenase) 소화 후 번식된 지 4일 된 위스터 훠스 쥐(Wista Furth rat)의 췌장으로부터 섬(islet)들이 분리된다〔Brunstedt, In. Lamer, J, Polh, S. L. (Eds.), Methods In Diabetes Research, Vol.1(Laboratory methods, Part c). Wiley & Sons, New York, pp. 254-288(1984)〕. RPMI 1640 ＋ 10 ％의 새끼 송아지 혈청에서 4일간의 배양 전 기간이 지난 후, 150개의 섬들은 300㎖의 RPMI 1640＋0.5％의 정상 인간 혈청(NHS)에서 24시간 동안 배양된다. 이와 다른 일련의 실험들에 있어서는 150개의 섬(islet)들이 150pg/㎖의 IL-1β를 추가하거나 또는, 추가함이 없이 300㎖의 RPMI 1640＋0.5％의 NHS에서 24시간 동안 배양된다.

섬(islet) 표지하기. 24시간의 배양이 끝난 후, 상기 150개의 섬들이 HBBS 내에서 2번 세척되고, 아미노산에 대해 투석된 10％의 NHS와 200μCi의 (³⁵S)-메티오닌으로 메티오닌 없는 둘베코(Dulbecco)의 수정된 이글스(Eagle's) 매질(DMEM) 200㎖에서 4시간 동안 표지되어 얻어진다. 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)을 제거하기 위해서, (³⁵S)-메티오닌은 표지하기 이전에 적어도 4시간 동안 냉동 건조된다. 표지한 이후 섬들은 HBBS 내에서 3번 세척되고 덩어리로 되어 －80℃로 냉동된다.

샘플 준비. 상기 냉동된 섬들은 100㎕의 DNAase I/RNAase A 용액에서 재차 뜨게 되고 2회의 해동에 의해 용해된다. 제2의 해동 후 상기 섬들은 핵산의 소화를 위해서 30분 동안 얼음 상태로 남게 된다. 그에 이어 상기 용해된 샘플은 밤새 냉동 건조된다. 최소 4시간 동안 120㎕의 용해 완충제〔8.5M의 요소, 2％의 넌아이데트(Nonidet) P-40, 5％의 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)과 pH가 7 내지 9의 범위에 있는 2％의 양쪽성 물질〕내에서 상기 샘플들을 흔들어서 용해시킨다.

(³⁵S)-메티오닌 합성의 결정. 각 샘플을 1:10으로 희석한 것 5㎖에 10μg의 BSA(0.2μg/㎖의 H₂O)를 매개체로 첨가하고, 그에 이어 10％의 TCA 0.5㎖에 의해 (³⁵S)-메티오닌의 합성 량이 2배로 측정된다. 이것은 0.25㎛ 필터를 통해 여과되기 이전에 40℃에서 30분 동안 침전된다. 상기 HAWP 필터는 건조되고 계수하기 위해 신틸레이션(scintillation)액 속에 놓여진다.

2-D 겔 전기영동 법. 이 방법은 O'Farrell et al, Cell 12:1133-1142(1997)과 Fey, S.J. et al., 기저 세포에 있어서의 단백질 변이와 이로운 질병 및 해로운 질병에 관련된 임의의 기저 세포에 있어서의 단백질 변이, Faculty of Natural Science, University of Aarhus, Denmark(1984)에 의하여 설명된 것과 같이 필수적이다. 간단히 말해서, 4％의 아크릴아미드, 0.25％의 비스아크릴아미드와 양쪽성 물질을 함유한 1차원적인 겔은 175㎜의 길이와 1.55㎜의 지름을 갖는다. 각 샘플의 카운트(10⁶cpm)와 동일한 숫자가 상기 겔에 부여된다. 방사능 량이 적을 경우에는 그에 필적하는 총 흡광도를 얻기 위해서 상기 겔의 노출 시간을 조절할 필요가 있다. 상기 샘플들은 등전 포커싱(IEF; pH 3.5 내지 7) 겔과 비평형 pH 경도 전기영동(NEPHGE; pH 6.5 내지 10.5) 겔 상에서 분석된다. IEF 겔은 약 4시간 동안 140㎂/gel(전류 제한)에서 미리 촛점이 맞춰지고, 상기 샘플이 1200 V(전압 제한)에서 18시간 동안 작동되고 촛점이 맞춰진다. NEPHGE 겔은 제한 변수로서 약 6.5시간 동안 140㎂/gel과 1200V를 사용해서 촛점이 맞춰진다.

15％의 아크릴아미드와 0.075％의 비스아크릴아미드를 함유하고 있거나, 아니면 10％의 아크릴아미드와 0.05％의 비스아크릴아미드를 함유한 두께 1㎜, 길이 200㎜, 너비 185㎜의 2차원적 겔이 밤새 작동된다. 전기영동 시킨 이후 상기 겔은 45％의 메탄올과 7.5％의 아세트산에서 45분 동안 고정되고 형광 사진을 위하여 건조되기 이전에 45분 동안 앰플리파이^??(Amplify^??) 로 처리된다. 상기 겔은 X-ray 필름과 접촉되도록 놓여지고 1 내지 40일 동안 －70℃에 노출된다. 각각의 겔은 X-ray 필름의 다이나믹 영역이 부족한 것을 보충하기 위해서 적어도 3시간 동안 노출된다.

MW 및 pI의 결정. 상기 단백질의 분자량은 표준 겔과 비교하여 결정된다〔Fey, S.J. et al., The protein variation in basal cells and certain basal cell related benign and malignant diseases, Faculty of Natural Science, University of Aarhus, Denmark(1984)〕. 겔 상의 각 단백질에 대한 pI는 pI 캘리브레이션 키트를 사용해서 결정된다. 랜드마크 단백질은 다음 어느 하나의 기술이나 몇 개의 기술에 의해 겔 상에서 확인된다. 이뮤노블라팅(immunoblotting), 이뮤노프리시퍼테이션(immunoprecipitation), 마이크로시퀀싱(microsequencing) 또는 펩티드 매핑(peptide mapping).

실험의 디자인. 본 연구는 3개의 서로 다른 일련의 분석을 포함한다. 데이타베이스, 내부 검정 분석(intraassay analysis)과 상호 검정 분석(interassay analysis). 각각의 분석에 있어서, IEF와 NEPHGE 겔은 2차원적으로 10％ 및 15％의 아크릴아미드를 사용해서 작동된다. 이것은 4개의 하위군을 제공한다. 10％의 IEF; 15％의 IEF; 10％의 NEPHGE; 15％의 NEPHGE. 10％의 아크릴아미드 겔에 있어서 대략적인 검출의 MW 범위는 20kDa와 250kDa 사이에 있는 반면, 15％의 아크릴아미드 겔에 있어서는 대략적인 검출의 범위가 6kDa와 125kDa 사이에 있다. 결국 20kDa와 125kDa 사이의 MW를 갖는 단백질이 양자의 데이타베이스에 포함되는 반면에, 보다 낮거나 보다 높은 MW를 갖는 단백질은 각각 15％ 및 10％의 데이타베이스에 한정된다. 10％ 및 15％의 데이타베이스를 비교하면 10％의 IEF 및 NEPHGE 하위군에서 보다 작은 수의 감지 가능한 점들이 드러난다(결과 참조). 결국, 내부 검정 분석과 상호 검정 분석은 오직 15％의 IEF와 NEPHGE 겔 이미지에서만 수행된다.

상기 데이타베이스는 1세트의 겔에서 분석된 10개의 서로 다른 분리물에 근거한다. 2-D 겔 전기영동 후, 최상의 공업 품질과 그에 필적하는 흡광도를 갖는 5개의 겔이 컴퓨터 분석에 의하여 선택된다. 컴퓨터 분석 이전에, 각 서브 그룹에서 1개의 겔이 다른 4개의 데이타베이스 겔과 비교하는 쓰이는 “주 겔”로 임의 선택는데, 5개는 내부 검정 분석 겔이고, 5개는 상호 검정 분석 겔이다(제4도). 상기 데이타베이스 “주 겔”은 주어진 점이 3개의 분석에서 동일한 정합 숫자를 갖는지 확인하기 위하여 내부 검정 분석과 상호 검정 분석에 대한 주로서 쓰인다. “주 겔”로부터의 데이타는 데이타베이스 분석에만 포함되어 있다. 상기 “주 겔”은 모든 4개의 하위군에서 동일한 분리물로부터였지만 그와 달리, 4개의 다른 데이타베이스 겔을 만드는 분리물의 정체는 하위군에서 하위군으로 약간 씩 달라진다(표 3).

내부 검정 분석에 있어서, 동일한 샘플이 다른 날에 연속되는 10개 세트의 겔에서 분석된다. 2-D 겔 전기영동 후, 최상의 공업 품질과 그에 필적하는 흡광도를 갖는 5개의 겔이 컴퓨터 분석을 위하여 선택된다(표 3).

IL-1β로 그 발현이 변경된 단백질을 확인하는 데 있어서, 그 이전에 시각적으로 분석된 노출 섬(islet)의 10％ IEF 겔과 NEPHGE 겔은 10％의 IEF와 NEPHGE 데이타베이스와 정합된다〔Andersen, et al., Diabetes 44:400-407(1995)〕.

형광 사진의 컴퓨터 분석. 컴퓨터 분석은 썬스팍 워크스테이션(Sunsparc workstation) 상에서 바이오이미지(BioImage)^??프로그램을 사용하여 수행된다. 우선 형광 사진을 스캔하고, 바이오이미지 프로그램에 의하여 스폿들이 확인 및 측정된다(BioImage, Ann Arbor, MA, USA). 다음으로 주 겔이 아닌 각각의 겔은 “주 겔”과 비교되고, 컴퓨터 프로그램에 의해 초기에 발견되지 않았던 스폿들의 정체와 그의 양 측정을 보장하기 위해서 수동으로 편집된다. 상기 비교는 바이오이미지(BioImage)^??프로그램을 사용하여 동일한 관찰자에 의하여 수행된다(H.U.A). 그 다음으로, 상기 겔들은 바이오이미지(BioImage)^??프로그램에 의하여 정합되고, 동일한 관찰자에 의해서 검사되고 정정된다. 마지막으로, 데이타가 계산을 위해서 Quattro Pro^??스프레스쉬트에서 추출된다(Borland version 4.0).

IEF와 NEPHGE 하위군 내에서 중복되는 스폿들이 존재하는 것을 피하기 위해서 IEF 겔의 염기 부분이나 NEPHGE 겔의 산 부분 중 어느 한 부분에서의 중복되는 스폿들은 데이타베이스에서의 분석과 정량 분석에서 생략된다.

통계 분석. 2개의 서로 다른 분석은 IL-1β로 그 발현이 변경된 단백질을 구별해내는 데 적용된다. 제1 분석에서, 노출된 겔 IL-1β에 있는 스폿의 평균 ％IOD가 데이타베이스에 있어서 동일한 점의 평균 ％IOD＝2SD보다 높거나 낮으면 변경은 중요하게 여겨진다. 2개의 그룹 사이에 대한 제2 비교에 있어서, 연구자의 테스트가 행해지고, 가중치 레벨로 P ＜ 0.01이 선택된다.

신생 쥐 섬 단백질 데이타베이스와 정량 분석의 정성적인 재생 가능성. 1293 내지 1411(IEF)와 605 내지 764(NEPHGE) 스폿들은 15％ DB를 이루는 데 사용된 각 겔에서 발견되는 반면, 1101 내지 1200(IEF)와 462 내지 577(NEPHGE) 스폿들은 10％ DB를 이루는 데 사용된 겔에서 발견된다(표 4와 표 5). 제5도는 10％ IEF와 NEPHGE DB의 “주 겔”을 도시하고 있다. 종합하면, 1373 점들이 10％ DB에서 5 겔의 5에 위치하는 반면에, 1792 스폿들은 75.2％(NEPHGE 10％)와 91.7％(IEP 15％) 사이의 하위군에서 정성적인 재생 가능성(5 겔의 5에서 발견된 스폿들의 평균 비율)을 보이며, 15％ DB에서 5 겔의 5에 위치한다(표 4와 표 5)(5 겔의 5에 위치한 각각의 점에 대하여, 상기 데이타베이스는 스폿 정합 수, 5개의 개별적 스폿에 대한 ％IOD, ％IOD의 표준 편차, ％IOD의 CV ％, MW와 pI를 포함한다). 상기 겔의 재생 가능성이 제6A도 내지 제6H도에 도시되어 있으며, 이 도면들은 상기 IEF 10％ DB 내에 있는 5 겔의 확장된 영역을 나타내고 있다.

표 4와 표 5에 도시되어 있는 바와 같이, 5 겔의 5 내에 있는 스폿들의 수와 비율뿐만 아니라 각각의 겔 내에 있는 스폿들의 총 수는 15％ DB에서 보다 10％ DB에서가 더 적다. 그러나, 상기 데이타베이스가 적어도 5 겔의 3 내에 있는 스폿들을 포함하기까지에 이르게 되면 2개의 데이타베이스 사이에서 존재하는 스폿들의 비율에 어떠한 차이도 발견되지 않는다(IEF: 15％: 98.8±1.2; 10％: 97.4±1.5; NEPHGE: 15％: 94.8±5.7; 10％: 94.1±3.5, 표 4와 표 5). 양자의 데이타베이스에 있어서, 5 겔의 5, 4, 3 또는 2에 존재하는 스폿들의 비율은 IEF 겔에서보다 NEPHGE 겔에서가 더 적다(표 4와 표 5). 5 이하의 겔에 존재하는 스폿들의 공간적 위치는 제7A도 내지 제7D도에 도시되어 있는데, 본 도면들은 상기 스폿들이 1, 2, 3 또는 4 겔 어디에 존재하는 지에 따라 상기 스폿들은 특정 겔 영역에 그룹지어 있지 않음을 나타내고 있다.

검출 가능한 스폿들의 수가 이 데이타베이스에는 높기 때문에, 내부 검정 분석 및 상호 검정 분석은 단지 15%의 겔에서 행해진다. 양 분석에 있어서, 5 of 5 겔들에 존재하는 스폿들의 수나 퍼센트 뿐만 아니라 각각의 겔의 스폿들의 수는 15% DB(표 4와 표 6을 비교하기 바람)에 비교할 때 약간(9% 내지 19%) 감소한다.

신생 쥐 섬 단백질의 분량적인 재생 가능 가능성과 검정 분석. 정량적인 재생 가능성은 5 of 5 겔들에 있는 각각의 스폿에 대한 %IOD에 대한 평균 CV%로 정의되었다. 데이타베이스에 대해서는, 평균 CV%는 10%와 15% IEF 및 겔들의 NEPHGE 부집단(표 7) 모두에 필적할만한 레벨(42.4% 내지 45.7%)에 있었다. 모든 DB 하위군에 대해서는, CV%는 3.0%와 167.9% 사이에 이른다. 낮은, 중간의, 높은 CV%의 1% IEF DB 점들은 도 8A-도 8D에 도시되었다. 상호 검정 분석들에 대해서는, 평균 CV%는 IEF 겔들의 내부 검정 분석에 대해서 30.2%였고 NEPHGE 겔들에 대해서 45.7%였던 반면, IEF 겔들과 NEPHGE 겔들 모두에 대해서는 35.5% 내지 36.1%였다.

그 후에, 모든 겔들에 있는 데이타베이스 스폿들은 CV% of %IOD의 증가하는 순서로 분류되었고, 모든 4개의 데이타베이스 하위군에 대해 비슷한 S자 모양의 곡선이 되었다(도 9A-도 9D). 따라서, 스폿들의 30%는 29.7% 내지 32.5% 보다 낮은 CV%를 가졌고, 스폿들의 50%는 37.8% 내지 42.8% 보다 낮은 CV%를 가졌고, 스폿들의 90%는 68.4% 내지 80.6% 보다 낮은 CV%를 가졌다(도 9A-도 9D). 곡선들의 경사들은 가장 높은 CV%의 5% 내지 10%의 스폿들이 평균 CV% of %IOD에 크게 기여를 한다(도 9A-도 9D). 이는 데이타베이스 하위군들의 중간값들이 하위군들의 평균값들보다 2.3% 내지 5.5% 낮다는 사실에 의해 뒷받침된다(표 7).

데이타베이스 하위군의 각각의 스폿에 대한 평균 %IOD와 CV% of %IOD 사이의 회귀 분석들. NEPHGE의 10%와 15% DB 부집단에서, 최고 평균 IOD%를 가지는 10개의 스폿들 중 각각 2와 6은 최저 CV%의 백분위수에서 발견되었다. 비록 최고 평균 IOD%를 가지는 10개의 점들 중 어느것도 IEF DB 하위군 내의 상기 백분위수에서 발견되지 않았지만, 회귀 분석들은 스폿 평균 %IOD와 CV% 사이에 상관 관계가 존재하는지를 조사하기 위해 수행되었다. 회귀 분석들은 중요한 역 상관 관계가 두 개의 중요한 매개 변수[범위: p=0(IEF 10%) 내지 p=0.00288(IEF 15%), 도 9A-도 9D] 사이에 존재하였다는 것을 보여주었다. 그러나, R²값들은 모든 하위군들에 대해 매우 낮았기 때문에[범위: R²=0.0072(IEF 15%) 내지 R²=0.0317(IEF 10%), 도 9A-도 9D], CV%의 변동 가능성의 대부분은 평균 %IOD의 변화에 의해 설명되지 않는다. 도 9A-도 9D에서, 주어진 하위군의 모든 스폿들에 대한 회귀선은 삽화로 도시되었는데, 반면에 주 그림들은, 96.8% 내지 99.1% 모든 스폿들을 포함하고, 회귀선들이 대부분의 스폿들을 포함하는 %IOD 내에서 수평인, 0 내지 1 %IOD의 회귀선을 나타낸다.

표현에 있어 IL-1β에 의해 변경된 단백질을 식별하기 위한 10% IEF와 NEPHGE DB의 사용. 최근의 논문에서, 우리는 신생 쥐 섬 단백질들의 2-D 겔들의 각각의, 29 단백질과 4 단백질의 상향 조절과 하향 조절된 IL-1β를 명시하였다[안데르센(Andersen) 등의 디아베테스(Diabetes) 44: 제400 페이지 내지 제407 페이지(1991)]. 10% 겔들는 본 연구와 비슷한 조건 하에서 (35S)-메티오닌이라고 명명된 비스타 퍼스(Wistar Furth) 신생 쥐 섬으로부터 만들어졌다. 따라서, 쥐 섬 10% IEF와 NEPHGE DB는 전술한 논문[안데르센 등의 디아베테스 44: 제400 페이지 내지 제407 페이지(1991)]에서 시각적으로 분석된, IL-1β-노출 섬의 컴퓨터 분석한 겔들과 비교하기 위해 사용되었다. 각 DB 스폿의 IOD%의 ±2SD를 차단 레벨(시각적 분석에서 중요한 상향 또는 하향 조절의 기준과 비교할만한 차단 레벨)로 사용하여, 10% DB와의 비교는 이러한 변경들의 32와 예상되는 확인된 몇몇 새로운 단백질 변경을 확인시켰다. 따라서, 총 183개의 스폿들은 상향 조절되었고, 113개는 하향 조절되었고, 34개는 IL-1β에 의해 디 노보(de novo)로 합성되었다(결과는 제시되지 않음). 학생들의 실험에서 0.01 미만인 p를 사용했을 때, 최종 분석은 52 개의 점은 상향 조절되었고, 47 개는 하향 조절되었고, 6개는 IL-1β에 의해 디 노보로 합성되었는데, 33개의 스폿들에 포함된 것들 중 13개는 시각적 분석에 의해 선택되었다.

논의:

본 연구에서, 우리는 섬들이나 임의의 종의 인슐린 합성 세포의 제1 단백질 데이타베이스들을 포함하는, 랑거한스(Langerhans)의 신생 쥐 섬의 10%와 15% 아크릴아미드 2-D 겔 단백질 DB를 제시하였다. 1792개의 스폿들은 15% DB의 5 of 5 겔들에 있었던 반면, 1373개의 스폿들은 75.2% 내지 91.7% 사이의 분량적인 재생가능성을 내는 10% DB의 5 of 5 겔들에 있었다. 양 데이터베이스에서, %IOD의 평균 CV%는 42.4% 내지 45.7%에 있었다. 표현 상에 있어서 IL-1β에 의해 변경된 단백질을 식별하기 위해 10% DB를 적용하면, 105개의 최근에 미확인된 단백질 스폿들은 상향/하향 조절되거나 또는 IL-1β에 의해 디 노보(de novo)로 합성된 것으로 나타났다.

신생 비스타 퍼스 쥐 섬의 특징들. 변화 가능성을 줄이기 위해서, 비스타 퍼스 혈통의 쥐들이 우리의 데이타베이스를 위한 섬 제공자로 선택되었다. 이 혈통은 우리 연구실에서 섬 실험을 위해 일상적으로 사용되는 아웃브레드(outbred) 비스타의 변종이다[안데르센 등의 디아베테스 43: 제770 페이지 내지 제777 페이지(1991)]. 우리는 이전에 IL-1β로 또는 없이 배양된 비스타 퍼스 신생 쥐의 섬의 기능이 비스타 신생 쥐의 섬의 기능과 유사하다고 정하였고[안데르센 등의 디아베테스 44: 제400 페이지 내지 제407 페이지(1991), 안데르센 등의 악타 엔도크리놀(Acta Endocrinol) 120: 제92 페이지 내지 제98 페이지(1989)] 비스타 퍼스 섬의 2-D 겔 단백질 패턴 이미지의 IL-1β의 효과를 정하였다. 본 데이타베이스는 어른 쥐가 아닌 신생 쥐의 섬에 바탕을 두고 있으므로, 우리는 어른 섬의 단백질 패턴이 다를 것이라는 것을 배제할 수 없다. 그러나, 아웃브레드 비스타 쥐들의 어른과 신생 섬은 IL-1의 해로운 영향에 똑같이 민감하다[만드럽-폴센(Mandrup-Poulsen) 등의 디아베테스(Diabetes) 36: 제641 페이지 내지 제647 페이지(1987)].

섬 분리로 사용되는 각각의 한 배에 새로 태어난 쥐들은 암컷과 수컷의 비율이 일정치 않은 8 내지 12 마리이다. 암컷과 수컷 야생 위스타르로부터의 간 단백질의 코우마 블루스테인(Coomassie Bluestained) 겔들의 비교는 250개의 분석된 스폿들 중 7개에서 정량적인 차이를 나타내고 6개의 단백질들은 숫컷에서만 그리고 1개의 단백질은 암컷에서만 배타적으로 발견되기 때문에[스테이너(Steiner)등의 엘렉트로포레시스(Electrophoresis) 16: 제1969 페이지 내지 제1976 페이지 (1995)], 우리 데이터베이스 중 몇몇 단백질들은 성(性) 특정(gender-specific) 또는 성(性) 조절(gender-regulated)될 것이다. 따라서, 만약에 우리가 암컷 및 수컷 쥐들로부터 섬 분리 데이타베이스를 만들기 위해 선택했다면 우리의 데이타베이스의 몇몇 스폿들의 높은 변화가 감소될 수 있다. 그러나, 간 단백질의 겔들는 배양되지 않은 세포들로부터 수행됐는데, 이는 성 결정된 단백질의 가변성이 간 세포 스스로 타고난 특질에 의함이 아니라 성 스테로이드를 순환시킴으로써 영향을 받을 수 있음을 의미한다. 호르몬의 순환은,

1. 우리는 우리의 섬을 실험 전 4일 동안 미리 배양했고,

2. 성 스테로이드의 혈청 집중에 어떠한 차이점도 성숙기 이전에 발견되지 않기 때문에, 우리의 단백질 패턴에 간섭을 하지 않을 것이다. 게다가, 우리는 이전에 암컷 및 수컷 아웃브레드 비스타 쥐들의 섬이 똑같이 IL-1의 해로운 영향에 민감하다는 것을 보여주었다[스테이너등의 엘렉트로포레시스 16: 제1969 페이지 내지 제1976 페이지(1995)].

섬 단백질의 검출. 몇몇 스폿들은 다른 단백질의 변형[예컨대, 아세틸레이션(acetylation), 메틸레이션(methylation), 포스포리레이션(phosphorylation), 또는 카바니레이션(carbarnylation)]을 보일 수 있기 때문에, 우리의 데이타베이스 내의 검출된 모든 스폿들이 다른 단백질 특질을 나타내지는 않을 것이다. 그러나, 단백질 데이타베이스는 감도의 한계 이하인 단백질, 메티오닌을 포함하지 않는 단백질, 6 kDa 이하나 250 kDa 이상의 분자 질량을 가지는 단백질 또는 pH 3.5 이하나 pH 10.5 이상의 단백질을 포함하지 않기 때문에, 검출된 스폿들의 수는 섬 단백질의 총 숫자를 과소평가한 것이다. 게다가, 검출 한도 이상의 IODs를 가지는 스폿들의 약 40%는 그것들은 다른 스폿들에 의해 약화되었기 때문에, 그것들을 피하기 위해 이전에 측정되었다. 마지막으로, 긴 레벨링 기간은 모든 단백질들이 안정한 상태일 때 데이터베이스를 만들기 위해 필요한 반면, 4시간의 레벨링 피리어드는 높은 합성률의 단백질 레벨링에 좋다.

질적 재생 가능성. 2-D 겔 단백질 데이터베이스의 분량적 재생 가능성에 관한 이전의 보고는 거의 없고 그 결과가 가변적이다. 코우마시 블루스테인(Coomassie Blue-stained) 2-D 겔들의 마우스 간 단백질 데이타베이스에서는, 826개의 스폿들이 주 이미지(master image)에 있었고 평균 500개의 스폿들이 또 다른 마우스간 패턴들의 85%와 일치했다[지오메티(Giometti)등의 엘렉트로포레시스(Electrophoresis) 13: 제970 페이지 내지 제991 페이지 (1992)]. 마우스 태아라고 명명된 (³⁵S)-메티오닌의 단백질 데이타베이스에서는 각 네 개의 겔 이미지 내의 80% 이상의 스폿들은 자동적으로 표준 이미지와 일치했다[쉬(Shi)등의 몰렌(Molec). 레프로드(Reprod). 디벨롭(Develop). 37: 제34 페이지 내지 제47 페이지 (1994)]. 우리의 연구에서는, 5 of 5 겔들의 스폿들의 평균 퍼센트는 10% DB에서 5% 내지 10% 낮았던 반면, 1792개의 점들(75.2% 내지 91.7%)은 15% DB의 5 of 5 겔들에 있었다. 이것은 아마도 보다 소수의 단백질은 단지 15% 겔들 이미지에서 분석 가능한 낮은 분자 질량 영역에서보다 단지 10% 겔들 이미지에서 분석 가능한 높은 분자 질량에 존재 한다는 사실 때문이다. 분석된 모든 집단에서는, NEPHGE 겔들의 분량적인 재생 가능성은 IEF 겔들보다 낮았다. EF 겔들과 대조적으로 NEPHGE 겔들은 비균형 겔들이기 때문에, 동일한 스폿들이 약간 다른 수평적인 위치를 가질 위험이 증가한다. 그러나, 우리는 이 문제는 가능한 한 제거되었다는 사실을 수작업으로 확인하였다.

분량적 재생 가능성. 분량적 재생 가능성에 관하여는, 스폿 확인에 사용된 방법들이 일치하지 않기 때문에 다른 연구들과의 비교는 어렵다. 게다가, 이전에 발표된 대부분의 데이타베이스들의 %IOD의 CV%의 계산에 포함된 스폿들은 가변 기준에 따라 일치된 전체 스폿들로부터 선택된다. 암컷 및 수컷 비스타 쥐의 간 단백질의 열개의 코우마시 블루스테인 겔들에서는, "주 겔(master 겔)"에 있는 1,000개 이상의 스폿들 중 250개의 스폿들이 좋은 형상, 크기 및 해상(resolution)과 이전의 실험들에서 존재 여부와 질적 우수성에 따라 선택되었다[스테이너 등의 엘렉트로포레시스 16: 제1969 페이지 내지 제1976 페이지 (1995)]. 이러한 기준을 사용한 결과, 스폿들의 1/3이 20% 미만의 CV%를 가졌고, 반 이상이 30% 미만의 CV%를 가졌고, 3/4이 40% 미만의 CV%를 가졌다[스테이너등의 엘렉트로포레시스 16: 제1969 페이지 내지 제1976 페이지 (1995)]. 밀집된 8개의 세포(compacted eight-cell;CEC)의 5개의 겔들을 구성하는 단백질 데이타베이스라고 명명된 (³⁵S) 메티오닌에서, 각각 1,674개와 1,653개의 마우스 태아들과 배낭 단계(blastocyst-stage;BS) 마우스 태아들의 4개의 겔들은 모든 겔들에서 일치했다[쉬등의 몰렌. 레프로드. 디벨롭. 37: 제34 페이지 내지 제47 페이지 (1994)]. 모든 일치하는 스폿들을 바탕으로 계산한 결과, 이 스폿들의 74%(CEC)나 79%(BS)의 퍼센트 에러(SEMx100/평균으로 정의됨)는 50% 및 45%(CEC) 또는 30% 이하의 퍼센트 에러를 가졌던 스폿들의 47%(BS)였다[쉬등의 몰렌. 레프로드. 디벨롭(Develop). 37: 제34 페이지 내지 제47 페이지 (1994)]. 비교를 해보면, SD's로부터 SEM's(SEM=SD/√n) 전환은 섬 IEF 15% DB 내의 평균 20.3%의 CV%를 산출할 것이고, 스폿들의 97.7%와 83.2%는 각각 50%와 30% 이하의 퍼센트 에러를 가질 것이다.

비록 우리 연구의 분량적 재생 가능성은 마우스 태아의 연구[쉬등의 몰렌. 레프로드. 디벨롭. 37: 제34 페이지 내지 제47 페이지 (1994)]에 필적할만하거나 심지어 더 나은 것이지만, 우리 데이터 베이스의 %IOD의 평균 CV%는 여전히 비교적 높다. 전술한 바와 같이, 섬의 혼성(heterogeneous) 세포 집단과 섬 분리의 숫컷 대 암컷의 비율은 겔 가변성에 기여한다. 비록 우리는 상당한 광학 밀도[각 하위군 내의 가장 큰 차이는 3.5(겔 DB 10 대 겔 DB 3, IEF 15% DB, 표 3)인 계수에 의한 것임]로 겔들을 사용하려고 했지만, X 레이 필름의 비선형 포화는 모든 데이타베이스 스폿들에 대한 CV%의 크기에 기여할 것이다. 본 연구가 시작되었을 때 우리 연구실에서 불가능한 기술인, 포스포이미지(phosphoimaging)의 적용은 CV%의 크기에 대한 이 현상의 영향을 감소시킬 것이다. 마지막으로, 컴퓨터 분석의 스폿 경계의 전자적 잡음과 차이들은 CV%의 크기에 영향을 미칠 수 있다. 기타의 몇몇 겔 분석 프로그램과 대조적으로, 바이오이미지(BioImage) 프로그램은 경계 한정을 위해 국부적이고 전체 배경에 의한 것이 아니어서, CV%에 대한 후자의 인자의 영향을 감소시킨다.

배양 겔들에 대한 연구. REF 52 세포라고 명명된 (³⁵S)-메티오닌의 10개의 배양 겔들에 관한 연구에서, 가렐즈(Garrels)는 전체 약 2,000개의 스폿들 중 가장 두드러진 1109개의 스폿들을 선택하였고, < 5%와 > 100% 사이의 범위와 10%와 15%의 상태값으로 26.5%의 평균 CV%를 찾았다[가렐즈, 제이. 비올(Garrels, J. Biol)의 켐(Chem) 264: 제5269 페이지 내지 제5282 페이지 (1989)]. 표본들이 연속적이거나 같은 세트의 겔들로부터 분석됐는지는 명확하지 않다. 점의 질[이웃한 스폿들을 오버래핑(overlapping)하는 가우시안 형태에 맞음]에 따라 스폿들을 그룹화하고 겔들 내의 저 밀도의 스폿들을 제외시킬 때, 최고의 질의 19.1%의 스폿들은 13.0%의 평균 CV%를 가졌다[가렐즈, 제이. 비올의 켐 264: 제5269 페이지 내지 제5282 페이지 (1989)]. 예상한 바와 같이, %IOD의 평균 CV%는 15% IEF와 NEPHGE 상호 검정 분석들이 15%의 IEF DB와 비교되었을 때, 약 9%로 감소되었다. 겔 표본이 나날이 변화하는 것은 내부 검정 분석에서 제거되었기 때문에, 평균 CV%는 훨씬 더 감소할 것으로 기대된다. 15% IEF 하위군에서, 15% NEPHGE 하위군에서는 아무런 감소가 없었던 반면, CV%는 데이타베이스에 비해 약 15% 감소되었다. 15% NEPHGE 내부 검정 하위군, 또한 모든 하위군 중에서 가장 낮은 질적 재생 가능성을 가지며(표 4 내지 표 6) 평균 CV%가 높은 이유는 알려지지 않았다. 데이타베이스 겔들도 역시 한 세트의 겔들에서 분석되는 것처럼, 생물학적 변화에 기인한 CV%의 비율은 주어진 스폿들에 대한 데이타베이스와 내부 검정 분석 간의 CV%의 차이에 의해 주어져야 한다. 따라서, 만약 15% NEPHGE 내부 검정 분석의 결과가 무시된다면, %IOD의 약 1/3의 평균 CV%가 생물학적 변화에 기인한다.

섬 단백질 표현 이미지의 IL-1β의 효과. IL-1β는 여지껏 확인되지 않은 105개의 단백질의 표현을 변경하였다. 섬 세포 이미지의 활동에 대한 IL-1β 메카니즘은 충분히 증명되지 않았으나, 단백질의 세개의 구별되는 집단들이 중요한 기능을 할 것이다. 즉, 신호 변환에 관여하는 단백질과 소위 초기 반응과 나중 반응 유전자에 의해 암호화된 단백질의 기능을 한다[아이지릭(Eizirik)등의 디아베토로지아(Diabetologia) 39: 제875 페이지 내지 제890 페이지 (1996)]. 목적 세포의 신호 변환을 유발하는 IL-1β는 네개의 주요 신호 경로를 포함할 것으로 생각된다. 즉, 핵 인자-kb, 압력 활성 단백질 카나아제(Stress-Activated Protein Kinase;SAPK/JNK), 단백질 키나아제 C 및 티로진(tyrosine) 키나아제[만드럽-폴센 등의 디아베테스 39: 제1005 페이지 내지 제1029 페이지(1996), 아이지릭등의 디아베토로지아 39: 제875 페이지 내지 제890 페이지 (1996)]. 세개의 경로는 c-fos, c-jun 및 인터페론 반응 인자-l이 섬 세포들 이미지의 시토킨(cytokine) 활동에 연류된 초기 반응 유전자를 신속하고 일시적으로 유도한다. 초기 반응 유전자는 섬 이미지에 특정 유전자의 가능한 해로운(iNOS, cycloxygenase-2와 lipoxygenase) 보호적인(HSP72, haem oxygenase, Mn superoxide dismustase) 활동을 촉진시킨다[만드럽-폴센 등의 디아베테스 39: 제1005 페이지 내지 제1029 페이지(1996), 아이지릭등의 디아베토로지아 39: 제875 페이지 내지 제890 페이지 (1996)]. 따라서, 섬 세포 이미지의 활동의 IL-1β 메카니즘에 관한 정보는 제한되고 IL-1β에 의해 표현상에 변경된 105 단백질의 확인은 신호 전환과 보호적이고 해로운 활동의 단백질에 관한 새로운 정보를 유도할 것이다.

결론.

우리는 높은 질적 재생 가능성과 이전에 발표된 기타의 세포와 조직에 관한 데이터베이스를 향상시키는 분량적 재생 가능성을 가지는 랑겔한스의 신생 쥐 섬에 관한 단백질 데이타베이스를 만들었다. 게다가, 우리는 신생 쥐 섬 단백질 데이타베이스의 내부 검정 분석 및 상호 검정 분석 변수들을 결정하였다. 상기 데이타베이스는, 활동의 IL-1β 메카니즘의 중요한 기능을 가질 수 있는, 표현상에 있어 IL-1β에 의해 변경된 단백질들을 확인하는데 더 적용되어졌다. IL-1β는 쥐 B 세포들을 생산하는 인슐린에 대한 시토톡식(cytotoxic)이기 때문에, 일반적으로 매스 광분계(spectrometry)와 마이크로시퀀싱(microsequencing)에 의해 행해지는, 이 단백질들의 확인은 디아베트 멜리터스(diabetes mellitus)에 독립적인 인슐린의 패토지니시스(pathogenesis)에 관한 중요한 정보를 산출할 것으로 기대된다.

표 3

DB 내의 주 겔 및 비주 겔의 전체 광학 농도간의 인자, 즉 신생 쥐 섬 단백질의 2-D 겔에 대한 내부 검정 분석 및 상호 검정 분석을 보정

15% 겔
		IEF
		상호 검정		상호 검정
DB		y		y
겔 DB10(주)	1	겔 IE3	1	겔 IA2	1
겔 DB3	0.293	겔 IE4	1.096	겔 IA3	0.620
겔 DB6	0.303	겔 IE8	1.129	겔 IA4	0.738
겔 DB8	0.840	겔 IE9	0.784	겔 IA6	1.014
겔 DB9	0.284	겔 IE10	0.804	겔 IA10	0.747
		NEPHGE
DB		상호 검정		상호 검정
		y		y
겔 DB10(주)	1	겔 IE3	1	겔 IA1	1
겔 DB3	0.542	겔 IE4	1.901	겔 IA2	1.599
겔 DB6	1.067	겔 IE8	1.761	겔 IA3	0.841
겔 DB8	0.986	겔 IE9	1.408	겔 IA4	0.908
겔 DB9	0.831	겔 IE10	1.599	겔 IA5	1.135
10% 겔
IEF		NEPHGE
DB		DB
겔 DB10(주)	1	겔 DB10(주)	1
겔 DB1	0.947	겔 DB1	1.660
겔 DB4	0.358	겔 DB7	3.215
겔 DB6	1.167	겔 DB8	2.959
겔 DB8	1.145	겔 DB9	1.197

상호 검정 분석은 한 세트의 겔내에서 분석된 동일한 샘플의 10개의 겔로 구성되고, 내부 검정 분석은 다른 날에 10개의 연속 세트의 겔내의 동일한 샘플 런의 분석에 따르는 반면에, 데이터베이스는 한 세트의 겔내에서 분석된 10개의 상이한 분리에 따른다. 컴퓨터 분석에 앞서, 각 데이터베이스 하위군내의 하나의 겔은 다른 4개의 데이터베이스 겔과, 5개의 내부 검정 겔 및 5개의 상호 검정 겔을 비교하기 위해 사용될 “주 겔(master gel)”을 독단적으로 선별한다. 선택된 분리/배양의 수(1-10)는 표에 표시된다. 주 겔과 비주 겔의 전체 광학 밀도간의 보정 인자는 바이오이미지(BioImage) 프로그램 순서 분석으로 계산된다. 보정 인자<1을 갖는 겔은 “주 겔”, 예를 들어 15% IEF DB내에서 겔의 전체 광학 밀도 DB10=0.293×겔 DB3보다 더 높은 총 광학 밀도를 갖는다. 내부 검정 분석 및 상호 검정 분석에 대해, 보정 인자는 독단적으로 선택된 겔 및 4개의 다른 겔간에 계산된다. 1의 보정 인자를 갖는 겔은 절대적으로 동일한 밀도를 갖는 것은 아니기 때문에 하위군들 간에서는 비교할 수 없다.

표 4

신생 쥐 섬 단백질의 15% IEF및 NEPHGE 2-DGE DB내의 스폿 검출의 재생성율

IEF	스폿의 전체 수	5개의 겔중 5내의 스폿		5개의 겔중 4-5내의 스폿		5개의 겔중 3-5내의 스폿		5개의 겔중 2-5내의 스폿
		수	%	수	%	수	%	수	%
겔 DB3	1325	1235	93.2	1299	98.0	1320	99.6	1325	100
겔 DB6	1352	1235	91.3	1322	97.8	1346	99.6	1352	100
겔 DB8	1293	1235	95.5	1276	98.7	1287	99.5	1292	99.9
겔 DB9	1355	1235	91.1	1319	97.3	1339	98.8	1355	100
겔 DB10	1411	1235	87.5	1327	94.0	1365	96.7	1398	99.1
평균±SD			91.7±3.0		97.2±1.8		98.8±1.2		99.8±0.4
NEPHGE
겔 DB3	663	557	84.0	604	91.1	633	95.5	658	99.2
겔 DB6	6.5	557	92.1	584	96.5	598	98.8	604	99.8
겔 DB8	629	557	88.6	597	94.9	614	97.6	623	99.0
겔 DB9	634	557	87.9	601	94.8	617	97.3	630	99.4
겔 DB10	764	557	72.9	601	79.8	648	84.4	701	91.8
평균±SD			85.1±7.4		91.4±6.8		94.8±5.7		97.8±3.4

2-D 겔 데이터베이스의 구조: 5개의 상이한 분리에 의한 신생 쥐 섬은 1640＋0.5% HS RPMI로 24시간 동안 만들어지고, (³⁵S)-메티오닌을 이용하여 4시간 동안 2번 세척되고 동위 원소를 이용 분류된다. 한 세트의 겔 내에서 2-DGE(물질과 방법 참조)를 따르고, X선 형광 촬영이 주사되고 스폿이 확인되며 BioImage프로그램에 의해 정량화된다. 각 겔은 비교되고, 독단적으로 선택된 “주 겔”(겔 DB10)에 대조된다. 표는 모든 겔, 5개의 겔중 적어도 4의 겔, 5개의 겔중 적어도 3의 겔 및 5개의 겔중 적어도 2의 겔 내에 나타나는(좌측에서 우측으로) 스폿의 수와 비율을 각 겔에 대하여 나타낸다.

표 5

신생 쥐 섬 단백질의 10% IEF 및 NEPHGE 2-DGE DB내의 스폿 검출의 재생성율

IEF	스폿의 전체 수	5개의 겔중 5내의 스폿		5개의 겔중 4-5내의 스폿		5개의 겔중 3-5내의 스폿		5개의 겔중 2-5내의 스폿
		수	%	수	%	수	%	수	%
겔 DB1	1101	995	90.4	1060	96.3	1070	97.2	1072	97.4
겔 DB4	1200	995	82.9	1094	91.2	1143	95.3	1163	96.9
겔 DB6	1120	995	88.8	1075	96.0	1106	98.8	1108	98.9
겔 DB8	1119	995	88.9	1084	96.9	1106	98.8	1113	99.5
겔 DB10	1198	995	83.1	1106	92.3	1162	97.0	1193	99.6
평균±SD			86.8±3.5		94.5±2.6		97.4±1.5		98.5±1.2
NEPHGE
겔 DB1	516	378	73.3	438	84.9	475	92.1	489	94.8
겔 DB7	462	378	81.8	424	91.8	442	95.7	445	96.3
겔 DB8	480	378	78.8	440	91.7	468	97.5	472	98.3
겔 DB9	492	378	76.8	441	89.6	474	96.3	482	98.0
겔 DB10	577	378	65.5	455	78.9	513	88.9	539	93.4
평균±SD			75.2±6.3		87.4±5.5		94.1±3.5		96.2±2.1

표 6

신생 쥐 섬 단백질의 복제 15% IEF 및 NEPHGE 2-DGE 겔내의 스폿 검출의 재생성율

내부 검정 분석	IEF	스폿의 전체 수	5개의 겔중 5내의 스폿		내부 검정 분석	IEF	스폿의 전체 수	5개의 겔중 5내의 스폿
			수	%				수	%
	겔 IA2	1289	1085	84.2		겔 IE3	1319	1082	82.0
	겔 IA3	1337	1085	81.2		겔 IE4	1348	1082	80.3
	겔 IA4	1289	1085	84.2		겔 IE8	1333	1082	81.2
	겔 IA6	1303	1085	83.3		겔 IE9	1342	1082	83.2
	겔 IA10	1326	1085	81.8		겔 IE10	1300	1082	80.6
	평균±SD			82.9±1.4		평균±SD			81.5±1.2
	NEPHGE
	겔 IA1	526	345	65.6		겔 IE3	574	421	75.0
	겔 IA2	542	345	63.7		겔 IE4	589	421	73.3
	겔 IA3	538	345	64.1		겔 IE8	566	421	71.5
	겔 IA4	565	345	61.1		겔 IE9	590	421	74.4
	겔 IA5	450	345	76.7		겔 IE10	561	421	71.4
	평균±SD			66.2±6.1		평균±SD			73.1±1.6

동일한 섬 세포 리세이트(lysate)의 5개의 독립 겔은 한 세트의 겔로 내부 검정 분석이 행해진다. 동일한 섬 세포 리세이트의 5개의 독립 겔은 상이한 날에 연속하는 세트의 겔에서 상호 검증 분석이 행해진다. 상이한 섬 분리는 내부 검증 분석 및 상호 검증 분석 데이터베이스에 사용된다. BioImage프로그램으로 분석될 때, X선 형광 촬영으로 표 2의 NEPHGE “주 겔”의 15% IEF와 비교되고 대조된다.

표 7

신생 쥐 섬 단백질의 복제 2-D겔과 데이터베이스내의 5개의 겔중 5내에서 검출가능한 스폿의 % 통합 광학 밀도의 분산의 평균 계수

분석	평균 CV%	중간(범위) CV%
IEF 15% DB	45.4±25.0	39.9(5.0-165.3)
IEF 15% 상호 검정	36.1±19.8	32.6(2.7-190.6)
IEF 15% 내부 검정	30.2±17.1	27.3(0.0-130.4)
NEPHGE 15% DB	44.3±22.5	42.0(3.9-155.1)
NEPHGE 15% 상호 검정	35.5±19.7	33.1(2.2-118.5)
NEPHGE 15% 내부 검정	45.7±22.8	43.9(4.3-130.9)
IEF 10% DB	45.7±21.3	42.7(3.0-133.4)
NEPHGE 10% DB	42.4±22.4	37.7(7.3-167.9)

분산 평균 계수(CV%)는 분석의 각 하위군내의 5개의 겔중 5에 나타나는 모든 스폿의 %IOD의 CV%로부터 게산된다. 결과는 평균±SD(왼쪽 칼럼)로 나타내고, 중간(범위)가 표시된다. 각 하위군내의 5개의 겔중 5에서의 스폿의 수는 표 2-4로 나타난다. 설계 데이터베이스와 배양 분석을 좀더 자세히 하기 위해 물질과 방법을 참조하시오.

지금까지 본 발명에 대하여 기술하였으며, 당업자라면 동등한 파라미터, 농도 및 조건 내에서 본 발명의 범주에서 벗어나지 않고 동일하게 수행할 수 있으며 부당하게 실험하지 않고 동일하게 수행할 수 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명은 특정 바람직한 실시예를 이용하여 기술하였지만, 다르게 변경하여 실시가능한 것을 알 수 있다. 따라서 대체로 어떤 변화나, 사용이나 적용에 부합하도록 의도될 수 있다. 따라서 첨부된 청구의 범위를 통해 본 발명을 제한하려 한다.

본원에 참조된 모든 참조 문헌은 저널 기사나 발췌를 포함하며, 대응하는 미국 또는 외국 특허 출원 및 특허 등록된 것으로서 단지 참조로서 인용된 것이다.

Claims

상승 조절되거나 하강 조절되는 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법으로서, 이 방법은 비변형 세포를 변형 세포와 구별하거나, 분비된 단백질을 시험관내에서 또는 생체내에서 처리되거나 또는 병리학적으로 변형되는 변형 단백질과 구별하는 것이며, 이 때, 상기 세포는 특이 세포형, 세포주, 조직의 샘플 또는 생리학적 샘플로부터 유래한 것이며, 상기 샘플은 상기 비변형 단백질 또는 변형 단백질을 포함하는 2DGE 겔을 얻기 위해 2차원 겔 전기영동을 실시한 것이며, 이 방법은,

(1) 하나 이상의 단백질을 함유하는 상기 전기영동 겔의 새로운 이미지를 포착하는 단계로서, 여기서, 새로운 이미지는 하나 이상의 단백질에 상응하는 다수의 새로운 이미지의 스폿을 포함하며, 이 때, 각각의 새로운 이미지의 스폿은 통합 광학밀도 비율(IOD%) 및 위치를 가지는 것인 단계;

(2) 새로운 이미지를 분석하는 데 사용되는 주복합체 이미지를 생성시키는 단계로서, 여기서, 주복합체 이미지는 다수의 주복합체 스폿 데이타 목록을 포함하며, 각각의 주복합체 스폿 데이타 목록은 하나 이상의 IOD% 및 하나 이상의 위치에 의해 정해지는 것인 단계;

(3) 주복합체 스폿 데이타 목록을 생성시키는 단계로서, 여기서, 주복합체 스폿 데이타 목록은 다수의 주복합체 스폿 데이타 목록의 각각에 대해 하나 이상의 위치, 하나 이상의 IOD%, 하나 이상의 스폿 번호 및 하나 이상의 포화치를 포함하며, 상기 주복합체 스폿 데이타 목록 또는 주복합체 이미지는 추가로 하나 이상의 상기 단백질의 하나 이상의 특징을 포함할 수도 있고, 상기 특징은 pI, 분자량, 각 스폿에 대한 위치 데이타 및 정량 분석 데이타에 대한 신뢰도 계수, 모양 정보, 국부 배경 레벨, 아미노산 서열, 질량 스펙트럼 및 단백질 변형으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 단계를 포함하여 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제1항에 있어서, (4) 분석된 샘플 유형; 세포 유형; 생물 유형; 상태, 질병 또는 감염 유형 및 감염 정도; 생물의 치료 유형 및 치료량; 데이타베이스내 단백질 유형; 상기 단백질의 특성 또는 동일성; 샘플을 수집하고 처리하는 방법; 샘플 또는 단백질에 수행된 실험 유형; 및 데이타베이스에 이미 존재하는 정보 유형으로 구성되는 군에서 선택되는 정보를 포함하는 데이타베이스를 생성시키는 단계를 추가로 포함하는, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제1항에 있어서, (5) 새로운 이미지를 주복합체 이미지와 함께 정렬시키는 단계를 추가로 포함하는, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제3항에 있어서, (6) 주복합체 스폿 데이타 목록으로부터 한 세트의 고정점 (anchor point)을 선별하는 단계를 추가로 포함하는, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제4항에 있어서, (7) 상응하는 고정점의 위치의 위치 허용 범위내의 위치를 가지고, 상응하는 고정점의 IOD%의 IOD% 허용 범위내의 IOD%를 가지는 새로운 이미지 스폿을 검출하고, 검출된 상응하는 새로운 이미지 스폿을 상응하는 고정점과 대조하여 한 세트의 대조된 새로운 이미지 스폿을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제5항에 있어서, (8) 주복합체 이미지 및 새로운 겔 이미지내의 동일한 수의 스폿들을 연결하는 한 세트의 벡터를 계산하고, 각 벡터에 대해 길이 및 각도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제6항에 있어서, (9) 대조된 새로운 이미지 스폿 세트 각각에 대해 벡터차를 계산하여 한 세트의 벡터차를 얻고, 대조된 새로운 이미지 스폿 세트로부터 벡터차가 벡터차 세트내에서 최대의 벡터차의 기정된 비율 범위내에 속하는 상기 대조된 새로운 이미지 스폿을 제거하여 한 세트의 비대조된 새로운 이미지 스폿을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제7항에 있어서, (10) 주복합체 스폿 데이타 목록으로부터 한 세트의 명확한 스폿을 선별하고, 상응하는 명확한 스폿의 위치의 위치 허용 범위내의 위치를 가지는 새로운 이미지 스폿을 검출하며, 검출된 새로운 이미지 스폿을 상응하는 명확한 스폿과 대조하고, 대조된 새로운 이미지 스폿을 대조된 새로운 이미지 스폿 세트에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제8항에 있어서, (11) 주복합체 스폿 데이타 목록으로부터 한 세트의 포화된 스폿을 선별하고, 상응하는 포화된 스폿의 위치의 위치 허용 범위내의 위치를 가지는 새로운 이미지 스폿을 검출하며, 검출된 새로운 이미지 스폿을 상응하는 포화된 스폿과 대조하고, 대조된 새로운 이미지 스폿을 대조된 새로운 이미지 스폿 세트에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제9항에 있어서, (12) 주복합체 스폿 데이타 목록으로부터 한 세트의 희미한 스폿을 선별하고, 상응하는 희미한 스폿의 위치의 위치 허용 범위내의 위치를 가지는 새로운 이미지 스폿을 검출하며, 검출된 새로운 이미지 스폿을 상응하는 희미한 스폿과 대조하고, 대조된 새로운 이미지 스폿을 대조된 새로운 이미지 스폿 세트에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제10항에 있어서, (13) 대조된 새로운 이미지 스폿 세트 외부에서 새로운 이미지를 검색하여 미확인된 새로운 이미지 스폿을 찾아내는 단계를 추가로 포함하는, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (2)는,

(1) 한 세트의 선별된 이미지를 측정하는 단계로서, 여기서, 세트내의 각각의 선별된 이미지는 다른 선택된 이미지의 상응하는 스폿에 상응하는 스폿을 가지는 단계와;

(2) 선택된 이미지 세트를 평균화하는 단계를 포함하며, 상기 평균화 단계는,

(i) 선택된 이미지 세트의 각 스폿으로부터 국부 배경을 공제하는 단계,

(ii) 선택된 이미지 세트의 상응하는 스폿의 IOD%를 평균하여 각각의 주복합체 스폿 데이타 목록에 대해 평균 복합 IOD%를 얻는 단계,

(iii) 선택된 스폿 세트의 상응하는 스폿의 물리적 모양을 평균화하여 각 주복합체 스폿 데이타 목록에 대해 평균 물리적 모양을 얻는 단계,

(iv) 선택된 이미지 세트의 상응하는 스폿의 스폿 위치를 평균화하여 각각의 주복합체 스폿 데이타 목록에 대해 평균 스폿 위치를 얻는 단계,

(v) 각각의 주복합체 스폿 데이타 목록에 대한 평균 복합 IOD%에 대한 표준편차를 계산하는 단계 및

(vi) 각각의 주복합체 스폿 데이타 목록에 대한 평균 스폿 위치에 대한 표준편차를 계산하는 단계를 포함하는 것인, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 (4)는 (a) 공통 고정점을 확인하는 단계로서, 여기서, 공통 고정점이 새로운 이미지에 상응하며, 주복합체 스폿 데이타 목록의 공통 고정점에 상응하는 것인 단계, (b) 주복합체 스폿 데이타 목록의 공통 고정점의 위치를 측정하는 단계, (c) 새로운 이미지의 공통 고정점의 위치를 측정하는 단계 및 (d) 새로운 이미지의 공통의 고정점의 위치가 주복합체 스폿 데이타 목록의 공통 고정점의 위치와 함께 정렬되도록 하는 위치 보정을 수행하는 단계를 포함하는 것인, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제13항에 있어서, (e) 주복합체 스폿 데이타 목록의 공통 고정점에 대한 스폿의 수를 측정하는 단계 및 (f) 주복합체 스폿 데이타 목록의 공통 고정점에 대한 스폿의 수와 동일한 스폿의 수로 새로운 이미지의 공통 고정점을 할당하는 단계를 추가로 포함하는, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제1항에 있어서, 데이타베이스 내에 포함된 값(들)에 대한 각 스폿에 대해 한 세트의 이미지에서 IOD%를 비교하는 단계로서, (12) 제1 세트의 이미지를 제2 세트의 이미지와 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제15항에 있어서, 단계 (12)는 (a) 상기 제1 세트내의 각 스폿에 대해 IOD%의 통계적 평균을 계산하는 단계, (b) 상기 제2 세트내의 각 스폿에 대해 IOD%의 통계적 평균을 계산하는 단계 및 (c) 상기 제1 세트내의 각 스폿이 제2 세트내의 각 스폿과 통계적으로 상이한지 여부를 측정하는 단계를 포함하는 것인, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 정성적 변화는 상기 2DGE 겔내의 하나 이상의 상기 단백질의 단백질의 구조의 변화인, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 정량적 변화는 상기 2DGE 겔내의 하나 이상의 상기 단백질의 단백질의 양의 변화인, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 특성은 pI, 분자량, %IOD, 아미노산 서열, 질량 스펙트럼 단백질 동일성 및 단백질 변형으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포형 또는 세포주는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 유래한 것인, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 진핵 세포는 포유류 세포, 곤충 세포 또는 조류 세포인, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 처리된 세포는 상기 세포 샘플의 제공 전에 하나 이상의 화합물로 처리된 것인, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 화합물은 단백질, 핵산 및 화학적 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것인, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 화합물은 잠재적 약제인 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포는 기관, 조직, 생검 또는 세포 배양으로부터 유래한 것인, 변형 단백질에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제1항에 따른 방법에 의해 확인되고 특성 분석된 단백질에 상응하는 분리된 형태의 하나 이상의 단백질.
제26항에 따른 단백질의 5개 이상의 아미노산 펩티드 부분을 암호화하거나 또는 그 부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브.
엄중 조건하에 제27항에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드되는 핵산.
세포에서 하나 이상의 변형된 단백질 또는 비변형된 단백질의 발현을 저해하거나 또는 증강시키는 방법으로서, 제28항에 따른 핵산과 동일하거나 또는 상이한 핵산중 하나 이상을 세포 또는 생물에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 하나 이상의 단백질은 시험관내에서 또는 생체내에서 처리되거나 또는 병리학적으로 변형된 세포에서 발현되며, 상기 세포는 세포 또는 세포주 샘플로부터 유래한 것인, 세포에서 하나 이상의 변형된 단백질 또는 비변형된 단백질의 발현을 저해하거나 또는 증강시키는 방법.
세포에서 하나 이상의 변형된 단백질 또는 비변형된 단백질의 발현을 저해하거나 또는 증강시키는 방법으로서, 제26항에 따른 동일하거나 또는 상이한 하나 이상의 변형된 단백질 또는 비변형된 단백질, 또는 그 작동 물질 또는 길항 물질을 세포 또는 이 세포를 포함하는 생물에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 하나 이상의 단백질은 시험관내에서 또는 생체내에서 처리되거나 또는 병리학적으로 변형된 세포에서 발현되며, 상기 세포는 세포 또는 세포주 샘플로부터 유래한 것인, 세포에서 하나 이상의 변형된 단백질 또는 비변형된 단백질의 발현을 저해하거나 또는 증강시키는 방법.
비변형 단백질을 확인하거나 또는 특성 분석하고 변형 단백질(상승 조절되거나 하강 조절됨)에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 컴퓨터 기반 시스템으로서, 이 시스템은 비변형 세포를 시험관내에서 또는 생체내에서 처리되거나 또는 병리학적으로 변형되는 변형 세포(또는 이들로부터 분비된 단백질)와 구별하며, 이 때, 상기 세포는 특이 세포형, 세포주, 조직의 샘플 또는 생리학적 샘플로부터 유래한 것이며, 이 샘플은 상기 비변형 단백질 또는 변형 단백질을 포함하는 2DGE 겔을 얻기 위해 2차원 겔 전기영동(2DGE)을 실시한 것이며, 이 시스템은,

(a) 상기 비변형 단백질 또는 변형 단백질을 포함하는 상기 2DGE 겔의 적어도 일부의 하나 이상의 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지가 저장되어 있는 컴퓨터 판독 가능한 매체 및 선택적으로는 또한 겔 이미지의 해석에 도움이 될 수 있는 정보의 데이타베이스로서, 여기서, 상기 단백질은 상기 단백질 이미지내의 스폿으로서 해상될 수 있는 것이고, 상기 정보는 겔 이미지의 특이 단백질 스폿과 관련되는 임의의 형태의 데이타와 함께 샘플의 기원, 그 처리, 제조 및 실험의 조건과 관련되며, 이 정보는 다른 전자 매체 및 네트워크로부터 데이타를 다운로드하기 위한 수동 입력 수단을 포함하는 임의의 정보원으로부터 얻을 수 있는 것인 컴퓨터 판독 매체 및 선택적으로는 정보의 데이타베이스;

(b) 하나 이상의 계산용 서브루틴으로서, 이 서브루틴은 컴퓨터 상에서 실행될 때 컴퓨터가 상기 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 상을 선택적으로는 데이타베이스와 관련하여 분석하게 하여 상기 하나 이상의 비변형 단백질 또는 변형 단백질을 나타내는 출력 데이타를 제공하는 것이며, 이 때, 상기 출력 데이타는 선택적으로는 또한 상기 비변형 세포 또는 변형 세포로부터 각각의 2DGE 겔에 존재하는 하나 이상의 마커 단백질을 나타내는 하나 이상의 마커 이미지 또는 마커 복합체 이미지를 포함할 수도 있고, 상기 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지는 상기 비변형 단백질 및 변형 단백질의 이미지 또는 복합체 이미지를 비교하는 데 사용할 때 (i) 상기 하나 이상의 변형 단백질에서의 정성적 또는 정량적 변화 또는 (ii) 상기 하나 이상의 변형 단백질의 하나 이상의 확인 특성을 확인하는 것인 하나 이상의 계산용 서브루틴;

(c) 상기 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지를 포함하고, 선택적으로는 또한 (i) 상기 마커 이미지 또는 마커 복합체 이미지에 대한 데이타, (ii) 상기 정성적 또는 정량적 변화에 대한 데이타 또는 (iii) 상기 하나 이상의 특성에 대한 데이타를 포함할 수도 있는 상기 출력 데이타를 기록하는 복구 수단으로서, 여기서, 출력 데이타는 (1) 상기 겔내 상기 하나 이상의 비변형 단백질에 상응하며, 상응하는 분자량 및 pI를 가진 하나 이상의 비변형 단백질의 이미지를 포함하는 비변형 부분 이미지 또는 비변형 복합체 이미지; 또는 상기 (i) 또는 (ii)에 나타낸 데이타 또는 그 일부를 나타내는 데이타 표, 그래프, 히스토그램, 덴드로그램 또는 기타 수단, 및 (2) 상기 겔내 상기 하나 이상의 변형 단백질에 상응하며, 상응하는 분자량 및 pI를 가진 하나 이상의 변형 단백질을 포함하는 변형 부분 이미지 또는 변형 복합체 이미지로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 이미지 또는 복합체 이미지를 포함하며, 상기 출력 데이타는 선택적으로 (3) 상기 겔내 상기 하나 이상의 마커 단백질에 상응하며, 상응하는 분자량 및 pI를 가진 하나 이상의 마커 단백질의 이미지를 포함하는 마커 부분 상 또는 마커 복합체 이미지를 포함할 수도 있는 것인 상기 출력 데이타를 기록하는 복구 수단을 구비하며,

상기 하나 이상의 단백질의 상기 하나 이상의 특성이 pI, 분자량, 각 스폿에 대한 위치 데이타 및 정량 분석 데이타에 대한 신뢰도 계수, 모양 정보, 국부 배경 레벨, 아미노산 서열, IOD%, 질량 스펙트럼 및 단백질 변형, 단백질 동일성 또는 데이타베이스에서 선택되는 기타 정보로 구성된 군에서 선택되는 것인, 컴퓨터 기반 시스템.
제31항에 있어서, 상기 분석이 데이타 처리 및 감축, 광학밀도 처리 및 통합, 강도 설정(intensity scaling), 강도 통합(intensity merging), 위치에 따른 고정 및 정교화(refinement), 배경 분석, 단백질 배위 분석, 정상이거나 낮거나 또는 높은 민감도로 경계 또는 모양 특성 분석을 사용하는 단백질 스폿 확인, 단백질 스폿 대조, 자동 가치 수정(indexing), 통계적 분석, 고무 분출(sheeting) 및 벡터 분석으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 계산용 서브루틴을 이용하는 것인 컴퓨터 기반 시스템.
제31항에 있어서, 상기 정성적 변화는 상기 2DGE 겔내 하나 이상의 상기 단백질 구조의 변화인 컴퓨터 기반 시스템.
제31항에 있어서, 상기 정량적 변화는 상기 2DGE 겔내 하나 이상의 상기 단백질 양의 변화인 컴퓨터 기반 시스템.
제31항에 있어서, 상기 하나 이상의 특성은 pI, 분자량, 아미노산 서열, 질량 스펙트럼 및 단백질 변형으로 구성된 군에서 선택되는 것인 컴퓨터 기반 시스템.
제31항에 있어서, 상기 처리된 세포는 상기 세포 샘플의 제공 전에 하나 이상의 화합물로 처리된 것인 컴퓨터 기반 시스템.
제36항에 있어서, 상기 화합물은 단백질, 핵산 및 화학적 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것인 컴퓨터 기반 시스템.
제31항에 있어서, 상기 병리학적으로 변형된 세포는 기관, 조직, 생검, 체액, 1차 세포주, 2차 세포주 또는 확립 세포주로부터 얻어지고, 분비된 단백질을 포함하는 것인 컴퓨터 기반 시스템.
제36항에 있어서, 상기 화합물은 잠재적 약제인 컴퓨터 기반 시스템.
제39항에 있어서, 상기 잠재적 약제는 길항 물질, 작동 물질, 항체, 단백질 또는 화학적 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것인 컴퓨터 기반 시스템.
제31항에 따른 컴퓨터 기반 시스템에 의해 제공되는 출력 데이타가 기록되어 있는 컴퓨터 판독 가능한 매체.
비변형 단백질을 확인하거나 또는 특성 분석하고 변형 단백질(상승 조절되거나 하강 조절됨)에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법으로서, 이 방법은 비변형 세포를 시험관내에서 또는 생체내에서 처리되거나 또는 병리학적으로 변형되는 변형 세포(또는 이들로부터 분비된 단백질)와 구별하며, 이 때, 상기 세포는 특이 세포형, 세포주, 조직의 샘플 또는 생리학적 샘플로부터 유래한 것이며, 이 샘플은 상기 비변형 단백질 또는 변형 단백질을 포함하는 2DGE 겔을 얻기 위해 2차원 겔 전기영동(2DGE)을 실시한 것이며, 이 방법은

(a) 상기 비변형 단백질 또는 변형 단백질을 포함하는 상기 2DGE 겔의 적어도 일부의 하나 이상의 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지가 저장되어 있는 컴퓨터 판독 가능한 매체로서, 여기서, 상기 단백질은 상기 단백질 이미지 또는 상기 단백질 복합체 이미지내의 스폿으로서 해상될 수 있는 것인 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공하는 단계;

(b) 상기 컴퓨터에서 실행되는 하나 이상의 계산용 서브루틴을 사용하여 컴퓨터상에서 상기 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지를 선택적으로는 데이타베이스와 관련하여 분석하여 상기 하나 이상의 비변형 단백질 또는 변형 단백질을 나타내는 출력 데이타를 제공하는 단계로서, 이 때, 상기 출력 데이타는 선택적으로는 또한 상기 정상 세포, 처리된 세포 또는 병리학적으로 변형된 세포로부터 각각의 2DGE 겔에 존재하는 하나 이상의 마커 단백질을 나타내는 하나 이상의 마커 상 또는 마커 복합체 상을 포함할 수도 있고, 상기 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지는 상기 비변형 단백질 및 변형 단백질의 이미지 또는 복합체 이미지를 비교하는 데 사용할 때 (i) 상기 하나 이상의 변형 단백질에서의 정성적 또는 정량적 변화 또는 (ii) 상기 하나 이상의 변형 단백질의 하나 이상의 확인 특성을 확인하는 것인 단계;

(c) 상기 단백질 이미지 또는 단백질 복합체 이미지를 포함하고, 선택적으로는 또한 (i) 상기 마커 이미지 또는 마커 복합체 이미지에 대한 데이타, (ii) 상기 정성적 또는 정량적 변화에 대한 데이타 또는 (iii) 상기 하나 이상의 특성에 대한 데이타를 포함할 수도 있는 상기 출력 데이타를 얻는 단계로서, 여기서, 출력 데이타는 (1) 상기 겔내 상기 하나 이상의 비변형 단백질에 상응하며, 상응하는 분자량 및 pI를 가진 하나 이상의 비변형 단백질의 이미지를 포함하는 부분 비변형 이미지 또는 비변형 복합체 이미지; 또는 상기 (i) 또는 (ii)에 나타낸 데이타 또는 그 일부를 나타내는 데이타 표, 그래프, 히스토그램, 덴드로그램 또는 기타 수단, 및 (2) 상기 겔내 상기 하나 이상의 변형 단백질에 상응하며, 상응하는 분자량 및 pI를 가진 하나 이상의 변형 단백질의 이미지를 포함하는 부분 변형 이미지 또는 변형 복합체 이미지로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 이미지 또는 복합체 이미지를 포함하며, 상기 출력 데이타는 선택적으로 (3) 상기 겔내 상기 하나 이상의 마커 단백질에 상응하며, 상응하는 분자량 및 pI를 가진 하나 이상의 마커 단백질의 이미지를 포함하는 부분 마커 이미지 또는 마커 복합체 이미지를 포함할 수도 있는 것인 상기 출력 데이타를 얻는 단계를 포함하며,

상기 하나 이상의 단백질의 상기 하나 이상의 특성이 pI, 분자량, 아미노산 서열, IOD%, 질량 스펙트럼 및 단백질 변형으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 비변형 단백질을 확인하거나 또는 특성 분석하고 변형 단백질(상승 조절되거나 하강 조절됨)에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제42항에 있어서, 상기 분석 방법은 데이타 처리 및 감축, 광학밀도 처리 및 통합, 강도 설정, 강도 통합, 위치에 따른 고정 및 정교화, 배경 분석, 단백질 배위 분석, 정상이거나 낮거나 또는 높은 민감도로 경계 또는 모양 특성 분석을 사용하는 단백질 스폿 확인, 단백질 스폿 대조, 자동 가치 수정, 통계적 분석, 고무 분출 및 벡터 분석으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 비변형 단백질을 확인하거나 또는 특성 분석하고 변형 단백질(상승 조절되거나 하강 조절됨)에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제42항에 있어서, 상기 정성적 변화는 상기 2DGE 겔내 하나 이상의 상기 단백질 구조의 변화인, 비변형 단백질을 확인하거나 또는 특성 분석하고 변형 단백질(상승 조절되거나 하강 조절됨)에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제42항에 있어서, 상기 정량적 변화는 상기 2DGE 겔내 하나 이상의 상기 단백질 양의 변화인, 비변형 단백질을 확인하거나 또는 특성 분석하고 변형 단백질(상승 조절되거나 하강 조절됨)에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제42항에 있어서, 상기 하나 이상의 특성은 pI, 분자량, 아미노산 서열, 질량 스펙트럼 및 헤독후 변형으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 비변형 단백질을 확인하거나 또는 특성 분석하고 변형 단백질(상승 조절되거나 하강 조절됨)에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제42항에 있어서, 상기 처리된 세포는 상기 세포 샘플의 제공 전에 하나 이상의 화합물로 처리된 것인, 비변형 단백질을 확인하거나 또는 특성 분석하고 변형 단백질(상승 조절되거나 하강 조절됨)에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제47항에 있어서, 상기 화합물은 단백질, 핵산 및 화학적 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것인, 비변형 단백질을 확인하거나 또는 특성 분석하고 변형 단백질(상승 조절되거나 하강 조절됨)에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제48항에 있어서, 상기 병리학적으로 변형된 세포는 기관, 조직, 생검, 체액, 1차 세포주, 2차 세포주 또는 확립 세포주로부터 얻어지고, 그들의 분비된 단백질을 포함하는 것인, 비변형 단백질을 확인하거나 또는 특성 분석하고 변형 단백질(상승 조절되거나 하강 조절됨)에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제47항에 있어서, 상기 화합물은 잠재적 약제인, 비변형 단백질을 확인하거나 또는 특성 분석하고 변형 단백질(상승 조절되거나 하강 조절됨)에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제50항에 있어서, 상기 잠재적 약제는 IL-1 길항 물질, IL-1 항체, 단백질 작동 물질 또는 단백질 길항물질로 구성된 군에서 선택되는 것인, 비변형 단백질을 확인하거나 또는 특성 분석하고 변형 단백질(상승 조절되거나 하강 조절됨)에서의 정성적 변화 또는 정량적 변화를 확인하거나 또는 특성 분석하는 방법.
제42항에 따른 방법에 의해 제공되는 출력 데이타가 기록되어 있는 컴퓨터 판독 가능한 매체.
제42항에 따른 방법에 의해 확인되거나 또는 특성 분석되는 단백질에 상응하는 분리된 형태의 하나 이상의 단백질.