JP2007248476A - 生物学的試料におけるアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされたタンパク質の特徴付けに対するプロテオーム解析 - Google Patents

生物学的試料におけるアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされたタンパク質の特徴付けに対するプロテオーム解析 Download PDF

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Abstract

【課題】どのタンパク質または核酸が疾患においてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされるかを決定するための方法および解析システム、ならびに潜在的な診断もしくは治療組成物を試験するための方法およびシステム、およびこのような疾患を診断または処置するための方法を提供すること。
【解決手段】アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされるかのいずれかであって、そして影響を受けた細胞と影響を受けていない細胞とを区別する影響を受けたタンパク質、またはインビトロまたはインビボで処理されるかまたは病理学的に影響を受けているいずれかである影響を受けたタンパク質から分泌されたタンパク質の、定性的変化または定量的変化を同定または特徴づける方法。
【選択図】なし

Description

発明の背景
発明の分野
分子生物学およびコンピューター画像解析の分野における本発明は、診断的もしくは治療的適用のために、影響を受けたまたは影響を受けていない状態においてアップまたはダウンレギュレーションされる細胞性および分泌性タンパク質および／または核酸を特徴づけるために、生物、器官、組織、生検、一次培養、二次培養または樹立した培養細胞株および体液（血清、血漿、脳脊髄液、尿など、または培養培地）（以下、「細胞」と称する）のプロテオーム（proteome）を解析するための方法およびコンピューターシステムに関する。また、そのような方法またはコンピューターシステムを使用して特徴づけたタンパク質、ならびにペプチドフラグメント、およびタンパク質またはフラグメントをコードする核酸もまた、診断的適用における使用のために提供される。
関連技術
タンパク質および二次元ゲル電気泳動。 二次元ゲル電気泳動(2-DGE)は、タンパク質混合物の分離のための特に有効な手段である。細胞タンパク質抽出物がゲルにのせられ、そして個々のタンパク質が、まず電荷により、次いで大きさにより分離される。その結果は、各々が通常、単一のタンパク質である1000〜5000スポットほどの多くの特徴的な写真となる。解像度は、ゲルサイズを大きくすること、ならびに放射性標識法、銀染色を使用し、そしてゲルの厚さを1.5mm以下の厚さまで減少させて感度を増強させることにより改善し得る。Jungblutら、Journal of Biotechnology 41: 111-120 (1995)は、5000までのタンパク質スポットが、大きさ23×30cmのゲル上でマウス脳細胞抽出物から泳動されたということを報告している。
高画像度2ーDGEは、塩基性および酸性のタンパク質を解析するために用いられている。一次元の等電点フォーカシング(IEF)が、二次元的にドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲル電気泳動と併用され得る(IEF-SDS)。あるいは、一次元の非平衡ｐＨ勾配電気泳動(NEPHGE)が、二次元的にSDSゲル電気泳動と併用され得る(NEPHGE-SDS)。そのような手法は、O'Farrell、 J. Biol. Chem. 250:4007-4021 (1975)およびO'Farrellら Cell, 12:1133-1142 (1977)（これらは、その全体が本明細書中で参考として援用される）により記載されている。NEPHGEゲルは、タンパク質の等電点の決定のためには使用され得ない。タンパク質の等電点は通常、既知のタンパク質に関して、安定なpH勾配で決定される。O'Farrell(1977)により議論されたように、酸性タンパク質の良好な解像度は平衡IEFにより得られる。塩基性タンパク質の良好な解像度は、pH7-10のNEPHGEゲルを使用し得る。タンパク質の全範囲の最も高い解像度のために、２つのゲルが使用される：（１）酸性タンパク質に対してはIEFゲル；および（２）塩基性タンパク質に対してはNEPHGEゲル。pIに従ってタンパク質を分離するための代わりの方法は、公知の方法工程に従って、固定化pH勾配ゲル電気泳動(IPG)を使用することである。
一度、2-DGEゲルを泳動すると、そのタンパク質は、染色（クーマシーブルー、銀もしくは金）、蛍光色素（試料が例えば、モノブロモビマンを使用して適切に調製された場合）、またはＸ線もしくはホスホルイメージングプレート上に捕獲された画像（試料が、例えば[35S]-メチオニン、[14C]-アミノ酸、もしくは[32P]-リン酸を使用して放射性標識された場合）を含む、種々の手法で可視化され得る。染色したならびに蛍光体画像は、例えば、カメラを使用して電気的に捕獲されるが、一方、Ｘ線フィルムおよびホスホルイメージングプレートは、適当なデバイスにおいて走査されて電気画像を得る。例えば、電気泳動後、2-DGEゲルは、メタノールおよび酢酸で固定され、AMPLIFY(R)(Amersham)で処理され、そして乾燥され得る。次いで、そのゲルは、Ｘ線フィルムに接触して配置され、露光される。そのゲルはＸ線フィルムのダイナミックレンジの不足を補うために、長時間、露光され得る。各々のフィルム画像は、位置、大きさ、形状、および光学密度の異なる多様なスポットを包含する。画像のスポットは、スポットとタンパク質との間の対応性を決定するために解析される。ホスホルイメージング技術の使用は、ホスホルイメージングプレートの応答が線形であり、かつ多重露出の必要性を除き、フィルムの非線形応答を避ける1:100、000の範囲をカバーするため、好ましい。
2DGEゲルの解析。 ゲル画像の手動の視覚的検査ならびに解析は、解像可能なスポットの数において制限される(Jungblutら, Neuhoff, V. (編) Electrophoresis, Verlag Chemie GmbH, Weinheim, 301〜303頁; (1984); Andersenら、 Diabetes 44巻:400〜407 (４月、1995)。さらに、ゲルサイズの増加は視覚的解析を困難で時間のかかるものとする。１フィルムの解析は、当該分野で熟練レベルの技術および経験を有する人でさえも、少なくとも８〜20時間かかり得る。さらに、視覚的解析による定量は制限される。代表的には、視覚的解析は２以上のファクターのタンパク質量の変化を検出するのみである。
種々のコンピュータープログラムならびにコンピューター評価システムが、定量を改良し、そして個々のゲルフィルムの評価を補助するために開発されている。例えば、PDQUEST (Protein Database Inc., New York)、 BioImage (Ann Arbor, MA, USA)、Phoretix (Phoretix International, Newcastle, UK)、およびKepler(Large Scale Biology Corporation,Rockville,MD)。 BioImageのようなコンピュータープログラムを使用するために、ゲルフィルムの画像は通常、デジタルカメラを使用して走査されるかまたは捕獲され、そしてそのデジタル画像は、コンピューターのメモリーもしくは保存へ入力される。デジタル化されたゲル画像は、コンピュータープログラムにより解析される。各々のスポットは、積分光学密度パーセント(IOD%)のような強度値および「Ｘ,Ｙ」直角座標のようなゲル上の位置を割り当てられる。BioImageのようなコンピュータープログラムは、解像度における最も高い品質およびスポット位置の最も高い再現性を必要とする。ゲル媒体は非常に弾性であるので、ゲルパターンは同一ではない。すなわち、本質的に同一の条件下で泳動した２つのゲルは、全く同じ位置に存在する各々のタンパク質スポットを有さない。２つのゲルを本質的に同じでない条件下で泳動した場合、対応するタンパク質スポットの位置の変動は、より多くなる。
上述のようなコンピューター評価システムは、ゲル画像に対する「スポットリスト」の生成のためにスポット強度およびIOD％の定量を改良している。しかしながら、上述のようなコンピューター評価システムは、編集に関して、重要なオペレーターの努力をなおも必要とする。評価されるべきゲル画像が、例えば走査によりコンピューターへ入力される。デジタル化された画像は、感度許容限界を越える強度もしくは光学密度を有するスポットを位置決定するように検索される。それから、オペレーターはゲル画像を編集しなくてはならない。例えば、２つの非常に大きなスポットが共に密接している場合、コンピューターは２つのスポットを１つの伸長したスポットであると同定し得る。コンピューターは、実際には２つのスポットが存在するということを解決し得ない。そこでオペレーターは、そのスポットを２つのスポットへ分けるために画像の手動編集を必要とする。別の例として、コンピューターは、ゲル画像において、高い強度のしまの(streak)ような非タンパク質スポットをタンパク質スポットとしてまちがって同定し得る。そこでオペレーターは、非タンパク質スポットを消すために、画像の手動編集を必要とする。熟練したオペレーターが従来の、コンピューター評価システムを使用して、評価されたゲル画像を編集するには、６〜８時間かかり得る。この手動編集はかなりの程度の主観性を解析へ導入し、そして、これは２Ｄゲル画像の解析にとって大きな障害である。同じオペレーターが全解析を実施することにより、これを減少する試みがたとえなされ得たとしても、その者がどのようにスポットを規定するか、そしてコンピューターがどのように成すかということには、どうしても差異がでてしまう。これはある程度の誤差を解析に導入する。
Jungblutら(1995)によって報告されたように、多くの研究者たちは、種々の組織または細胞型について2-DGEデータベースを作成するために、従来のコンピューター評価システムを使用してきた。しかしながら、これらのシステムは、新しいゲル画像について正確なスポットリストを作成するために、オペレーターの役目において重要な努力を必要とする。より重要なことには、従来のコンピューター評価システムは、オペレーターが新しいゲル画像を迅速かつ効率的に解析して解釈することを可能にするために、同じ細胞型の他のゲル画像からの情報を使用する、解析および解釈の手段を提供しない。従来のコンピューター評価システムは、少量でのみ存在するタンパク質を信頼して検出するために使用され得ない。従って、当該分野では、オペレーターに要求される努力を減少させ、かつ新しいゲル画像が解析および解釈され得るスピードを増加させるコンピューターに基づく解析システムに対する必要性がある。さらに、当該分野では、同じ細胞型の他のゲル画像からの情報を使用する、新しいゲル画像を解析および解釈するための、コンピューターに基づく解析システムに対するさらなる必要性がある。
また、ほとんどの従来のコンピューター評価システムは、ゲル画像の群間の統計的比較のための解析手段を提供しない。従って、当該分野では、新しいゲル画像を解析および解釈することができるだけでなく、種々のゲル画像の群間の統計的比較を実行することもできる、コンピューターに基づく解析システムに対するさらなる必要性がある。
従って、どのタンパク質または核酸が疾患においてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされるかを決定するための方法および解析システム、ならびに潜在的な診断もしくは治療組成物を試験するための方法およびシステム、およびこのような疾患を診断または処置するための方法を提供する必要性がある。
本発明によって以下が提供される：
（１）アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされるかのいずれかであって、そして影響を受けた細胞と影響を受けていない細胞とを区別する影響を受けたタンパク質、またはインビトロまたはインビボで処理されるかまたは病理学的に影響を受けているいずれかである影響を受けたタンパク質から分泌されたタンパク質の、定性的変化または定量的変化を同定または特徴づける方法であって、該細胞が、特定の細胞タイプの試料、細胞株、組織、または病理学的試料に由来し、該試料は、該影響を受けないかまたは影響を受けたタンパク質を含む２次元ゲル電気泳動（2DGE）ゲルを提供するために2DGEに供され、該方法が、
(1)少なくとも１つのタンパク質を含む該電気泳動ゲルの新しい画像を捕獲する工程であって、ここで、該新しい画像が、少なくとも１つのタンパク質に対応する多数の新しい画像スポットを含み、各新しい画像スポットが、積分した光学密度パーセント（IOD％）および位置を有する、工程；および
(2)該新しい画像を分析するために使用されるマスター合成画像を生成する工程であって、ここで、該マスター合成画像が、多数のマスター混成スポットデータリストを含み、各マスター混成スポットデータリストが、少なくともIOD％および位置によって規定される、工程；
(3)マスター混成スポットデータリストを生成する工程であって、ここで、該マスター混成スポットデータリストが、該多数のマスター混成スポットデータリストの各々の少なくとも位置、IOD％、スポット数、および飽和値を含む、工程、を包含し、
ここで、該マスター混成スポットデータリストまたはマスター合成画像は、必要に応じて少なくとも１つの該タンパク質の少なくとも１つの特徴をさらに含み、該特徴が、pI、分子量、各スポットについての位置および定量的データについての信頼性係数、形状情報、局所的バックグラウンドレベル、アミノ酸配列、質量スペクトル、およびタンパク質修飾を含む群より選択される、を含む方法。
（２）項目１に記載の方法であって、
(4)データベースを生成する工程であって、該データベースが、分析される試料のタイプ；細胞のタイプ；生物のタイプ；その症状、病気または感染、および程度のタイプ；生物の処理のタイプおよび量；該データベース中のタンパク質のタイプ；該タンパク質の特徴づけまたは同一性；該試料が収集されそして処理される様式；該試料または該タンパク質で行われる実験のタイプ；および該データベースに既に存在する情報のタイプからなる群より選択される情報を含む、工程、
をさらに包含する、方法。
（３）項目１に記載の方法であって、
(5)前記新しい画像を前記マスター合成画像と位置合わせさせる工程、
をさらに包含する、方法。
４）項目３に記載の方法であって、
(6)前記マスター混成スポットデータリストからアンカー点のセットを選択する工程、
をさらに包含する、方法。
（５）項目４に記載の方法であって、
(7)対応するアンカー点の位置の位置耐性内である位置を有し、そして対応するアンカー点のIOD％のIOD％耐性内であるIOD％を有する、新しい画像スポットを検出する工程、および適合した新しい画像スポットのセットを形成するために該対応するアンカー点に該検出された新しい画像スポットを適合させる工程、
をさらに包含する、方法。
（６）項目５に記載の方法であって、
(8)前記マスター合成画像においておよび前記新しいゲル画像において同じ数のスポットを連結するベクトルのセットを算出する工程；および各ベクトルについて長さおよび角度を決定する工程、
をさらに包含する、方法。
（７）項目６に記載の方法であって、
(9)ベクトルの差分のセットを形成するために適合した新しい画像スポットのセットのそれぞれについてベクトルの差分を算出する工程、および該ベクトルの差分が、適合されていない新しい画像スポットのセットを形成するために該ベクトルの差分のセット内の最大のベクトルの差分の所定のパーセントの中に含まれる適合した新しい画像スポットを、該適合した新しい画像スポットのセットから除去する工程、
をさらに包含する、方法。
（８）項目７に記載の方法であって、
(10)前記マスター混成スポットデータリストから十分に規定されたスポットのセットを選択する工程、対応する明確なスポットの位置の位置耐性内である位置を有する新しい画像スポットを検出する工程、該対応する明確なスポットに該検出された新しい画像スポットを適合させる工程、および該適合した新しい画像スポットのセットに該適合した新しい画像スポットを付加する工程、
をさらに包含する、方法。
（９）項目８に記載の方法であって、
(11)前記マスター混成スポットデータリストから飽和したスポットのセットを選択する工程、対応する飽和したスポットの位置の位置耐性内である位置を有する新しい画像スポットを検出する工程、該対応する飽和したスポットに該検出された新しい画像スポットを適合させる工程、および該適合した新しい画像スポットのセットに該適合した新しい画像スポットを付加する工程、
をさらに包含する、方法。
（１０）項目９に記載の方法であって、
(12)前記マスター混成スポットデータリストから弱いスポットのセットを選択する工程、対応する弱いスポットの位置の位置耐性内である位置を有する新しい画像スポットを検出する工程、該対応する弱いスポットに該検出された新しい画像スポットを適合させる工程、および該適合した新しい画像スポットのセットに該適合した新しい画像スポットを付加する工程、
をさらに包含する、方法。
（１１）項目１０に記載の方法であって、
(13)未同定の新しい画像スポットを配置するために前記適合した新しい画像スポットのセットの外側で新しい画像を検索する工程、
をさらに包含する、方法。
（１２）項目１に記載の方法であって、工程(2)が、
(1)選択された画像のセットを決定する工程であって、ここで該セット中の各選択された画像が、他の選択された画像中の対応するスポットに対応するスポットを有する、工程、および
(2)該選択された画像のセットを平均する工程であって、ここで、該平均する工程が、
(i)該選択された画像のセットの各スポットから局所的バックグラウンドを減算する工程、
(ii)各マスター混成スポットデータリストについて平均混成IOD％を形成するために、該選択された画像のセット中の対応するスポットのIOD％を平均する工程、
(iii)各マスター混成スポットデータリストについて平均物理的形状を形成するために、該選択された画像のセット中の対応するスポットの物理的形状を平均する工程、
(iv)各マスター混成スポットデータリストについて平均スポット位置を形成するために、該選択された画像のセット中の該対応するスポットのスポット位置を平均する工程、
(v)各マスター混成スポットデータリストについて該平均混成IOD％についての標準偏差を計算する工程、および
(vi)各マスター混成スポットデータリストについて該平均スポット位置についての標準偏差を計算する工程、を包含する、工程、
を包含する、方法。
（１３）項目２に記載の方法であって、工程(4)が、
(a)共通アンカー点を同定する工程であって、ここで該共通アンカー点が、新しい画像におよびマスター混成スポットデータリスト共通アンカースポットに対応する、工程；
(b)該マスター混成スポットデータリスト共通アンカースポットの位置を決定する工程；
(c)該新しい画像共通アンカースポットの位置を決定する工程；および
(d)該新しい画像共通アンカースポットの位置が、該マスター混成スポットデータリスト共通アンカースポットの位置と位置合わせされるように、位置修正を適用する工程、
を包含する、方法。
（１４）項目１３に記載の方法であって、
(e)前記マスター混成スポットデータリスト共通アンカースポットについてスポット数を決定する工程；および
(f) 前記新しい画像共通アンカースポットに、該マスター混成スポットデータリスト共通アンカースポットについてのスポット数と同じであるスポット数を割り当てる工程、
をさらに包含する、方法。
（１５）項目１に記載の方法であって、画像のセットにおいて、前記データベースに加えられた、１つまたは複数の値に対する各スポットについてのIOD％を比較する工程、
（12）画像の第一のセットおよび画像の第二のセットと比較する工程、
をさらに包含する、方法。
（１６）項目１５に記載の方法であって、工程(12)が、
(a)第１のセットにおいて各スポットについてのIOD％の統計学的平均を計算する工程；
(b)第２のセットにおいて各スポットについてのIOD％の統計学的平均を計算する工程；および
(c)該第１のセットにおける各スポットが、該第２のセットにおける各スポットと統計学的に異なるかどうかを決定する工程、
を包含する、方法。
（１７）項目１に記載の方法であって、前記定性的変化が、前記2DGEゲルにおける前記タンパク質の少なくとも１つの構造の変化である、方法。
（１８）項目１に記載の方法であって、前記定量的変化が、前記2DGEゲルにおける前記タンパク質の少なくとも１つの量の変化である、方法。
（１９）項目１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの特徴が、pI、分子量、％IOD、アミノ酸配列、質量スペクトルタンパク質同一性、およびタンパク質修飾からなる群より選択される、方法。
（２０）項目１に記載の方法であって、前記細胞タイプまたは細胞株が、原核生物または真核生物細胞に由来する、方法。
（２１）項目２０に記載の方法であって、前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または鳥類細胞である、方法。
（２２）項目１に記載の方法であって、前記処理された細胞が、前記細胞試料を提供する前に、少なくとも１つの化合物で処理されている、方法。
（２３）項目２２に記載の方法であって、前記化合物が、タンパク質、核酸、および化学化合物からなる群より選択される、方法。
（２４）項目２２に記載の方法であって、前記化合物が潜在的薬物である、方法。
（２５）項目１に記載の方法であって、前記細胞が、器官、組織、生検、または細胞培養物に由来する、方法。
（２６）単離された形態での少なくとも１つのタンパク質であって、該タンパク質が、項目１に記載の方法によって同定または特徴付けされるタンパク質に対応する、タンパク質。
（２７）項目２６に記載のタンパク質の少なくとも５アミノ酸ペプチド部分をコードするかまたは相補的である、オリゴヌクレオチドプローブ。
（２８）ストリンジェント条件下で項目２７に記載のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする、核酸。
（２９）細胞において少なくとも１つの影響を受けたかまたは影響を受けないタンパク質の発現を阻害または増強する方法であって、
項目２８に記載の核酸と前記同じかまたは異なる核酸の少なくとも１つを、細胞または生物に投与する工程であって、該少なくとも１つのタンパク質が、インビトロまたはインビボで、処理されているかまたは病理学的影響を受けている細胞で発現され、該細胞が、細胞または細胞株の試料に由来する、工程、
を包含する、方法。
（３０）細胞において少なくとも１つの影響を受けたかまたは影響を受けないタンパク質の発現を阻害または増強する方法であって、
項目２６に記載の影響を受けたかまたは影響を受けないタンパク質と前記同じかまたは異なるタンパク質、あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニストの少なくとも１つを、細胞または該細胞を含む生物に投与する工程であって、該少なくとも１つのタンパク質が、インビトロまたはインビボで、処理されているかまたは病理学的影響を受けている細胞で発現され、該細胞が、細胞または細胞株の試料に由来する、工程、
を包含する、方法。
（３１）影響を受けないタンパク質を同定または特徴づけるための、ならびに影響を受けたタンパク質（アップレギュレートまたはダウンレギュレートのいずれかである）の定性的もしくは定量的変化を同定または特徴づけるためのコンピュータベースのシステムであって、そしてこれは、インビトロまたはインビボで処理されているかまたは病理学的に影響を受けているいずれかである影響を受けた細胞（またはそれらから分泌されるタンパク質）と影響を受けない細胞を区別し、該細胞は、特定の細胞タイプの試料、細胞株、組織、または病理学的試料に由来し、該試料は、該影響を受けないかまたは影響を受けたタンパク質を含む２次元ゲル電気泳動（2DGE）ゲルを提供するために2DGEに供され、該システムが、
(a)該影響を受けないかまたは影響を受けたタンパク質を含む該2DGEゲルの少なくとも一部の保存された少なくとも１つのタンパク質画像またはタンパク質合成画像、および必要に応じてさらに、該ゲル画像の解釈において援助し得る情報のデータベースを有する、コンピュータ読み出し可能な媒体であって、該タンパク質が、該タンパク質画像におけるスポットとして解像可能であり、該情報が、該ゲル上の特定のタンパク質スポットに関するデータの任意の形態とともに、試料の起源、その処理、調製、および実験の条件に関連し、該情報が、他の電子媒体およびネットワークからのデータをダウンロードするための手動エントリーを含む任意のソースから得られ得る、媒体；
(b)コンピュータで実行される場合、該影響を受けないかまたは影響を受けたタンパク質の少なくとも１つを示す出力データを提供するために、必要に応じて該データベースに関して該タンパク質画像またはタンパク質合成画像をコンピュータに分析させる、少なくとも１つの計算サブルーチンであって、該出力データが、必要に応じて、該影響を受けないかまたは影響を受けた細胞からの各2DGEゲルに存在する少なくとも１つのマーカータンパク質を示す少なくとも１つのマーカー画像またはマーカー合成画像をさらに含み、ここで、該タンパク質画像またはタンパク質合成画像が、該影響を受けないおよび影響を受けたタンパク質の画像または合成画像を比較するために使用される場合、(i)該影響を受けたタンパク質の少なくとも１つの定性的または定量的変化；または(ii)該影響を受けたタンパク質の少なくとも１つの少なくとも１つの同定した特徴を同定する、サブルーチン；
(c)該タンパク質画像またはタンパク質合成画像を含む該出力データを記録するための検索手段であって、必要に応じて、(i)該マーカー画像またはマーカー合成画像についてのデータ；(ii)該定性的または定量的変化についてのデータ；または(iii)該少なくとも１つの特徴についてのデータをさらに含み、
ここで、該出力データが、
(1)該ゲルにおいて該影響を受けないタンパク質の少なくとも１つに対応する影響を受けない部分画像または影響を受けない合成画像であって、該影響を受けない部分画像または影響を受けない合成画像が、対応する分子量およびpIを有する影響を受けないタンパク質の少なくとも１つの画像を含む、画像；
あるいは、上の(1)または(2)に示すデータまたはその一部の表示のデータ表、グラフ、ヒストグラム、デンドログラム、または他の手段；および
(2)該ゲルにおいて該影響を受けたタンパク質の少なくとも１つに対応する影響を受けた部分画像または影響を受けた合成画像であって、該影響を受けた部分画像または影響を受けた合成画像が、対応する分子量およびpIを有する影響を受けたタンパク質の少なくとも１つの画像を含む、画像；
からなる群より選択される少なくとも１つの画像または合成画像を含み：そして
ここで、該出力データが、必要に応じて、さらに
(3)該ゲルにおいて該マーカータンパク質の少なくとも１つに対応するマーカー部分画像またはマーカー合成画像であって、該マーカー部分画像またはマーカー合成画像が、対応する分子量およびpIを有するマーカータンパク質の少なくとも１つの画像を含む、画像；を含み、あるいは、
ここで、該タンパク質の少なくとも１つの該少なくとも１つの特徴が、pI、分子量、各スポットについての位置および定量的データについての信頼性係数、形状情報、局所的バックグラウンドレベル、アミノ酸配列、IOD％、質量スペクトル、およびタンパク質修飾、タンパク質同一性、または該データベースから選択された他の情報を含む群より選択される画像を含む、検索手段、
を含む、コンピュータベースのシステム。
（３２）項目３１に記載のコンピュータシステムであって、ここで、前記分析する工程が、データ処理および整理編集、光学密度処理および積分、強度スケーリング、強度併合、位置アンカリングおよび精密化、バックグラウンド分析、タンパク質配位分析、正常か、低いか、または高い感度で境界または形状特徴を使用するタンパク質スポット同定、タンパク質スポット適合、自動指標づけ、統計学的分析、ゴムシート化、およびベクトル分析からなる群より選択される少なくとも１つの計算サブルーチンを利用する、コンピュータシステム。
（３３）項目３１に記載のコンピュータシステムであって、前記定性的変化が、前記2DGEゲルにおける前記タンパク質の少なくとも１つの構造の変化である、コンピュータシステム。
（３４）項目３１に記載のコンピュータシステムであって、前記定量的変化が、前記2DGEゲルにおける前記タンパク質の少なくとも１つの量の変化である、コンピュータシステム。
（３５）項目３１に記載のコンピュータシステムであって、前記少なくとも１つの特徴が、pI、分子量、アミノ酸配列、質量スペクトル、およびタンパク質修飾からなる群より選択される、コンピュータシステム。
（３６）項目３１に記載のコンピュータシステムであって、前記処理された細胞が、前記細胞試料を提供する前に少なくとも１つの化合物で処理されている、コンピュータシステム。
（３７）項目３６に記載のコンピュータシステムであって、前記化合物が、タンパク質、核酸、および化学化合物からなる群より選択される、コンピュータシステム。
（３８）項目３１に記載のコンピュータシステムであって、前記病理学的に影響を受けた細胞が、器官、組織、生検、体液、初代細胞株、二次細胞株、または樹立された細胞株から得られており、そしてそれらの分泌されたタンパク質を含む、コンピュータシステム。
（３９）項目３６に記載のコンピュータシステムであって、前記化合物が、潜在的薬物である、コンピュータシステム。
（４０）項目３９に記載のコンピュータシステムであって、前記潜在的薬物が、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、タンパク質、または化学化合物からなる群より選択される、コンピュータシステム。
（４１）項目３１に記載のコンピュータシステムによって提供されるその上に記録された出力データを有する、コンピュータ読み出し可能な媒体。
（４２）影響を受けないタンパク質を同定または特徴づけるための、および影響を受けたタンパク質（アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされるかのいずれかである）の定性的または定量的変化を同定または特徴づけるための方法であって、そしてこれは、インビトロまたはインビボで処理されるかまたは病理学的に影響を受けているいずれかである影響を受けた細胞と影響を受けない細胞（またはそれらから分泌されるタンパク質）を区別し、該細胞が、特定の細胞タイプの試料、細胞株、組織、または病理学的試料に由来し、該試料が、該影響を受けないかまたは影響を受けたタンパク質を含む２次元ゲル電気泳動（2DGE）ゲルを提供するために2DGEに供され、該方法が、
(a)該影響を受けないかまたは影響を受けたタンパク質を含む該2DGEゲルの少なくとも一部の保存された少なくとも１つのタンパク質画像またはタンパク質合成画像を有する、コンピュータ読み出し可能な媒体を提供する工程であって、該タンパク質が、該タンパク質画像においてまたは該タンパク質合成画像においてスポットとして解像可能である、工程；
(b)コンピュータにおいて、該コンピュータで実行される少なくとも１つの計算サブルーチンを使用して必要に応じて該データベースに関して該少なくとも１つのタンパク質画像またはタンパク質合成画像を分析して、該影響を受けないかまたは影響を受けたタンパク質の少なくとも１つを示す出力データを提供する工程であって、該出力データが、必要に応じて、該正常、処理された、または病理学的に影響を受けた細胞からの各2DGEゲルに存在する少なくとも１つのマーカータンパク質を示す少なくとも１つのマーカー画像またはマーカー合成画像をさらに含み、
ここで、該タンパク質画像またはタンパク質合成画像が、該影響を受けないかまたは影響を受けたタンパク質の画像または合成画像を比較するために使用される場合、(i)該影響を受けたタンパク質の少なくとも１つの定性的または定量的変化；または(ii) 少なくとも１つの該影響を受けたタンパク質の少なくとも１つの同定した特徴を同定する、工程；
(c)該タンパク質画像またはタンパク質合成画像を含み、そして必要に応じて、(1)該マーカー画像またはマーカー合成画像についてのデータ；(2)該定性的または定量的変化についてのデータ；あるいは(3)該少なくとも１つの特徴についてのデータをさらに含む、該出力データを得る工程であって、
ここで、該出力データが、
(1)該ゲルにおいて該影響を受けないタンパク質の少なくとも１つに対応する影響を受けない部分画像または影響を受けない合成画像であって、該影響を受けない部分画像または影響を受けない合成画像が、対応する分子量およびpIを有する影響を受けないタンパク質の少なくとも１つの画像を含む、画像；
あるいは、上記の(1)または(2)に示すデータまたはその一部のデータを表示するデータ表、グラフ、ヒストグラム、デンドログラム、または他の手段；および
(2)該ゲルにおいて該影響を受けたタンパク質の少なくとも１つに対応する影響を受けた部分画像または影響を受けた合成画像であって、該影響を受けた部分画像または影響を受けた合成画像が、対応する分子量およびpIを有する影響を受けたタンパク質の少なくとも１つの画像を含む、画像；
からなる群より選択される少なくとも１つの画像または合成画像を含み：そして
ここで、該出力データが、必要に応じて、さらに
(3)該ゲルにおいて該マーカータンパク質の少なくとも１つに対応するマーカー部分画像またはマーカー合成画像であって、該マーカー部分画像またはマーカー合成画像が、対応する分子量およびpIを有するマーカータンパク質の少なくとも１つの画像を含む、画像；を含み、
ここで、該タンパク質の少なくとも１つの該少なくとも１つの特徴が、pI、分子量、アミノ酸配列、IOD％、質量スペクトル、およびタンパク質修飾を含む群より選択される、工程、
を含む、方法。
（４３）項目４２に記載の方法であって、ここで、前記分析する工程が、データ処理および整理編集、光学密度処理および積分、強度スケーリング、強度併合、位置アンカリングおよび精密化、バックグラウンド分析、タンパク質配位分析、正常か、低いか、または高い感度で境界または形状特徴を使用するタンパク質スポット同定、タンパク質スポット適合、自動指標づけ、統計学的分析、ゴムシート化、およびベクトル分析からなる群より選択される少なくとも１つの計算サブルーチンを利用する、方法。
（４４）項目４２に記載の方法であって、前記定性的変化が、前記2DGEゲルにおける少なくとも１つの前記タンパク質の構造の変化である、方法。
（４５）項目４２に記載の方法であって、前記定量的変化が、前記2DGEゲルにおける少なくとも１つの前記タンパク質の量の変化である、方法。
（４６）項目４２に記載の方法であって、前記少なくとも１つの特徴が、pI、分子量、アミノ酸配列、質量スペクトル、および翻訳後修飾からなる群より選択される、方法。
（４７）項目４２に記載の方法であって、前記処理された細胞が、前記細胞試料を提供する前に少なくとも１つの化合物で処理されている、方法。
（４８）項目４７に記載の方法であって、前記化合物が、タンパク質、核酸、および化学化合物からなる群より選択される、方法。
（４９）項目４８に記載の方法であって、前記病理学的に影響を受けた細胞が、器官、組織、生検、体液、初代細胞株、二次細胞株、または樹立された細胞株から得られており、そしてその分泌されたタンパク質を含む、方法。
（５０）項目４７に記載の方法であって、前記化合物が潜在的薬物である、方法。
（５１）項目５０に記載の方法であって、前記潜在的薬物が、IL-1アンタゴニスト、IL-1抗体、タンパク質アゴニスト、またはタンパク質アンタゴニストからなる群より選択される、方法。
（５２）項目４２に記載の方法によって提供されるその上に記録された出力データを有する、コンピュータ読み出し可能な媒体。
（５３）単離された形態での少なくとも１つのタンパク質であって、該タンパク質が、項目４２に記載の方法によって同定または特徴づけられるタンパク質に対応する、タンパク質。
（発明の要旨）
本発明は、生物、器官、組織、生検、一次、二次または樹立細胞株、および体液(血清、血漿、脳脊髄液、尿など、または培養培地)(以後「細胞」という)の特異的細胞型プロテオームの画像を分析する方法およびコンピューターシステムに関する。このプロテオームを分析し、処置されたか、疾病に罹ったか、または免疫学的に影響を受けた状態においてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるタンパク質または核酸を特徴付ける。従って、本発明は、このようなタンパク質および核酸を精製形態または単離形態で提供し、そして、フラグメント、プローブおよび関連する診断および治療用の組成物および方法を提供する。
１つの局面において、本発明は、正常細胞を、処置されたか、疾患に罹っているか、もしくは免疫学的に影響を受けた細胞(インビトロまたはインビボの)、特定の細胞型の試料に由来する細胞、またはこれに由来する細胞株と区別する、影響を受けていないタンパク質および影響を受けたタンパク質を同定または特徴付けるための方法およびコンピューターシステムを提供する。この試料を、二次元ゲル電気泳動(2DGE)にかけて、影響を受けていないかまたは影響を受けたタンパク質を含む2DGEゲルおよびその記録画像を提供し得る。
これらの画像はカラーまたは白黒であり得る(カラー画像は、原色について３グレースケール域を有し得、したがって、これを下記と同様の方法で分析し得る)。この説明のためだけに、１つのグレースケールが検討されるが、当業者には、この説明を三原色、またはそれらの組み合わせに拡張することは容易である。
生物工学において、適用には、ノーザン、サザンまたはウエスタンブロット、一次元ゲル電気泳動(1DGE)ゲルおよび／または2DGEゲルが含まれ得るが、これらに限定されない。本発明は、ゲル電気泳動画像を分析して、タンパク質およびコード核酸を同定し、そしてゲル画像を比較してタンパク質または核酸発現における変化を同定することに関して以下に記載される。
本発明の１つの局面において、画像を分析する方法を提供する。この方法は、以下の工程、例えば(しかし、これらに限定されない)、(1)〜(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)または(12)のうちの少なくとも１工程を包含する：
(1)新規画像を捕獲する工程。ここで、新規画像は、電気泳動ゲル中の１以上のタンパク質に対応する複数の新規画像スポットを含み、各新規画像スポットは、スポット番号、積分光学密度パーセント(IOD％)および位置を有する：
(2)新規画像の分析に使用するためのマスター合成画像を作成する工程。ここで、マスター合成画像は、複数のマスター合成スポットデータリストを含み、各マスター合成スポットデータリストは、スポット番号、IOD％および位置を有する；
(3)マスター合成スポットデータリストを作成する工程。ここで、マスター合成スポットデータリストは、複数のマスター合成スポットデータリストのそれぞれについて、スポット番号、IOD％、位置、位置およびIOD％についてのスポットの変動性(例えば、パーセントで表現された標準偏差)、ならびに飽和値((問題のスポットを誘導するために使用した元の画像からの)任意のスポットに見出される最大ピクセル強度値に対応する)(この値は、白(0)から黒(1)までのスケールでの割合として表現される)を含む；
(4)ゲル画像を意味のある方法で解釈するために必要であり得る情報を含むデータベースを作成する工程。この情報は、以下を含み得るがこれに限定されない：分析される試料の型(生物、器官、組織試料、生検、体液、単離細胞、一次細胞培養物、二次細胞培養物であるかまたは樹立細胞培養物由来であるかどうか；全細胞抽出物、細胞により産生されたタンパク質含有上清または培地かどうかを含む)；細胞型(起源、種、年齢を含む)；試料が疾病に罹った生物に由来するか、または疾病についてのコントロール試料であるかどうか；個々の生物または試料が、いずれかの形態の微生物、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、プリオンまたは他の感染性因子を含む別の生物に感染していたかどうか(そして、感染していた場合、どんな感染で、どのように感染し、そしてどの程度まで進行していたのか)；個々の生物または試料がいずれかの形態の薬物または化学化合物で処置されていたかどうか(そして、処置されていた場合、どんな処置で、どのように処置され、そしてどの程度の量か)；個々の生物または試料が、その反応に影響を及ぼすと予想されるいずれかの形態のストレスまたは環境因子で処置されていたかどうか(そして、処置されていた場合、どんな処置で、どのように処置され、そしてどの程度の量か)；試料を収集および処置した様式；実験の実行に関する情報；種々の供給源(インターネットを含む)からマニュアルで入力したかまたは読み込んだタンパク質の特徴、例えば、タンパク質の同一性、細胞局在性など；または他のゲル画像のいくつかまたは全てを分析して作成された他のデータ；
(5)新規画像をマスター合成画像と位置合わせさせる工程；
(6)マスター合成スポットデータリストから１セットのアンカー点を選択する工程；
(7)対応するアンカー点の位置の位置許容範囲内に位置を有し、そして対応するアンカー点のIOD％のIOD％許容範囲内にIOD％を有する新規画像スポットを検出し、そして検出された新規画像スポットを、対応するアンカー点に整合(match)させて、１セットの整合した新規画像スポットを作成する工程；
(8)マスター合成画像および新規ゲル画像において同じ番号のスポットを結ぶ１セットのベクトルを算出し、そして各ベクトルについて長さおよび角度を決定する工程；
(9)問題のベクトルと所定の番号を起点とするベクトルとの間の差に対応する、整合新規画像スポットの各セットについてベクトル差分を算出する工程(例えば、問題のスポットに最も近いスポットの２〜500。これは、新しい整合新規画像スポットのそれぞれについてベクトル差分を作成し、後の工程において、整合新規画像スポットのセットから、ベクトル差分が、最良(最短の長さで、数量的に最小の角度)のベクトル差分の所定の割合より大きな整合物を除去する。これらのベクトル差分を使用して、画像の位置合わせを定性的に検査し、そして最適な整合が得られるまで反復して不整合の補正をガイドする手段)；
(10)マスター合成スポットデータリストから１セットの十分に規定されたスポットを選択し、対応する十分に規定されたスポット位置の位置許容範囲内に位置を有する新規画像スポットを検出し、検出された新規画像スポットを対応する十分に規定されたスポットと整合させ、そして、整合新規画像スポットを整合新規画像スポットのセットに加える工程；
(11)マスター合成スポットデータリストから１セットの飽和スポットを選択し、対応する飽和スポット位置の位置許容範囲内に位置を有する新規画像スポットを検出し、検出された新規画像スポットを対応する飽和スポットと整合させ、そして整合新規画像スポットを整合新規画像スポットのセットに加える工程；
(12)マスター合成スポットデータリストから１セットの弱スポットを選択し、対応する弱スポット位置の位置許容範囲内に位置を有する新規画像スポットを検出し、検出された新規画像スポットを対応する弱スポットと整合させ、そして整合新規画像スポットを整合新規画像スポットのセットに加える工程；および
(13)(必要に応じて、上記の工程(5)と置換する)整合新規画像スポットセット以外の新規画像を検索して、未同定の新規画像スポットの位置決めをする工程。
本発明の別の局面において、マスター合成スポットデータリストまたはマスター合成画像は、必要に応じて、前記タンパク質のうちの少なくとも１つタンパク質の少なくとも１つの特徴をさらに含み、前記特徴は、pI、分子量、アミノ酸配列、質量スペクトルおよび翻訳後修飾を含む群から選択される。
本発明の別の局面において、方法は、さらに、第一のセットの画像を第二のセットの画像と比較する工程を包含する。
本発明のなおさらなる局面において、共通アンカー点の使用により、新規画像をマスター合成画像と位置合わせさせる。共通アンカー点は、新規画像およびマスター合成画像の両方に存在するスポットに対応する。マスター合成スポットデータリストから選択されるアンカー点には、一次アンカー点および二次アンカー点が含まれ得る。一次および二次アンカー点を、異なる選択基準を使用して、画像処理における異なる段階で得て、使用されるマスター合成スポットデータリストタンパク質を選択する。
本発明のなおさらなる局面において、十分に規定されたスポットは、0.2＜Ｓ＜0.8の範囲の飽和値Ｓを有する。飽和スポットは、飽和値Ｓ≧0.8を有する。弱スポットは、飽和値Ｓ≦0.2を有する。
別の局面において、本発明の関連方法は、
(a)影響を受けていないタンパク質または影響を受けたタンパク質を含む2DGEゲルの少なくとも一部分の少なくとも１つの記録画像を提供する工程であって、このタンパク質がタンパク質画像においてスポットとして解像可能である、工程；
(b)この画像を分析して(i)影響を受けていないタンパク質または影響を受けたタンパク質のうちの少なくとも１つ；(ii)影響を受けたタンパク質のうちの少なくとも１つの定性的または定量的変化；(iii)影響を受けたタンパク質のうちの少なくとも１つを同定する特徴のうちの少なくとも１つ；または(iv)正常な、処理された、疾病に罹った、または免疫学的に影響を受けた細胞由来の各2DGEゲルに存在する少なくとも１つのマーカータンパク質を同定する工程
を包含する。
この方法において、少なくとも１つのタンパク質は、影響を受けていないタンパク質、影響を受けたタンパク質、またはマーカータンパク質からなる群から選択され得る。
本発明は、別の局面において、影響を受けていないタンパク質および影響を受けたタンパク質を同定するかまたは特徴付けるための方法およびコンピューターシステムであって、イントロまたはインビボで、正常細胞を、処理されたか、疾病に罹ったかまたは免疫学的に影響を受けた細胞と区別する方法およびコンピューターシステムを提供する。試料を二次元(2D)ゲル電気泳動にかけて、影響を受けていないタンパク質または影響を受けたタンパク質を含む2DGEゲルを提供し得る。
別の局面において、コンピューターベースシステムは、
(a)影響を受けていないタンパク質または影響を受けたタンパク質を含む少なくとも一部分の2DGEゲルの少なくとも１つのタンパク質画像またはタンパク質合成画像を貯蔵したコンピューター読み取り可能媒体であって、このタンパク質がタンパク質画像またはタンパク質合成画像においてスポットとして解像可能である、媒体；
(b)コンピューター上で実行した場合、コンピューターにタンパク質画像またはタンパク質合成画像を分析させ、影響を受けていないタンパク質または影響を受けたタンパク質のうちの少なくとも１つを表す出力データを提供する、少なくとも１つの計算サブルーチンであって、出力データが、必要に応じて、影響を受けた細胞および影響を受けていない細胞由来の各2DGEゲルに存在する少なくとも１つのマーカータンパク質を表す、少なくとも１つのマーカー画像またはマーカー合成画像をさらに含む、サブルーチン。ここで、タンパク質画像またはタンパク質合成画像は、影響を受けていないタンパク質および影響を受けたタンパク質の画像または合成画像を比較するために使用される場合、(i)影響を受けたタンパク質のうちの少なくとも１つの定性的または定量的変化；または(ii)影響を受けたタンパク質の少なくとも１つを同定する特徴のうちの少なくとも１つを同定する；および
(c)タンパク質画像またはタンパク質合成画像を含み、そして必要に応じてさらに、(1)マーカー画像またはマーカー合成画像のデータ；(2)定性的または定量的変化のデータ；または(3)前記の少なくとも一種の特性データを含む出力データを記録する検索手段からなる。
さらなる局面において、本発明は、以下からなるコンピューター方法を提供する。
(a)非発症または発症タンパク質を含み、そのタンパク質がタンパク質画像またはタンパク質合成画像のスポットとして分離する少なくとも一種の2DGEゲル部分の少なくとも一種のタンパク質画像またはタンパク質合成画像を記憶させたコンピューター読み取り媒体を提供する工程；
(b)少なくとも一種の計算サブルーチンを使用して、コンピューターで実行し、少なくとも一種のタンパク質画像またはタンパク質合成画像を分析して少なくとも一種の非発症または発症タンパク質を示す出力データ、必要に応じてさらに、正常、処理性、疾病性または免疫発症細胞からの各2DGEゲルに存在する少なくとも一種のマーカータンパク質を示す少なくとも一種のマーカー画像またはマーカー合成画像を含む出力データを得る。このとき、タンパク質画像またはタンパク質合成画像を使用し、非発症および発症タンパク質の画像または合成画像と比較して、(i)少なくとも一種の発症タンパク質の定性的または定量的変化または(ii)少なくとも一種の発症タンパク質の少なくとも一種の同定特性を同定する工程；および
(c)タンパク質画像またはタンパク質合成画像を含み、必要に応じてさらに、(1)マーカー画像またはマーカー合成画像のデータ；(2)定性的または定量的変化データ；または(3)少なくとも一種の特性データを含む出力データを得る工程。
上記のコンピューターシステムまたは方法において、少なくとも一種の前記タンパク質の少なくとも一種の特性は、タンパク質同一性、pI、分子量、アミノ酸配列、IOD％、質量スペクトルまたはタンパク質修飾などの多くの方法で特徴付けられ得るが、これらに限定されない。
本発明はまた、上記コンピューターシステム方法によって提供された出力データを有するコンピューター読み取り媒体を提供する。
好ましい実施態様において、本発明のコンピューターシステムまたは方法を提供し、処理性細胞を少なくとも一種の化合物で処理した後、細胞試料を提供する。化学的または生物学的分子などの化合物は、潜在的診断用または治療用化合物となり得る。
本発明の方法、コンピューターシステムまたはゲルにおいて、定性的変化は、上記2DGEゲルの少なくとも一種の上記タンパク質の構造における変化で、定量的変化は、上記2DGEゲルの少なくとも一種の上記タンパク質量の変化であり得る。
本発明の方法、コンピューターシステムまたはゲルにおいて、少なくとも一種の特性をpI、分子量、％IOD、アミノ酸配列、質量スペクトルおよびタンパク質修飾からなる群から選択し得る。
本発明の方法、コンピューターシステムまたはゲルにおいて、細胞型または細胞株を原核性または真核性細胞から得ることができるが、真核細胞が哺乳類細胞または鳥類細胞であるのが好ましい。
本発明の方法、コンピューターシステムまたはゲルにおいて、処理性細胞を少なくとも一種の化合物で処理した後、前記細胞試料に提供し得る。このとき、好ましい化合物を、タンパク質、核酸および化学化合物からなる部類から選択し、さらに化合物が潜在的薬剤であることが好ましい。
本発明に従って、少なくとも一種の精製タンパク質を本発明により提供する。このとき、タンパク質は、本発明の方法、コンピューターシステムまたはゲルにより同定し、特徴化されるタンパク質に相当する。
本発明の特徴は、新規ゲル画像を分析し、解釈し得ることであり、また、ゲル画像の部群の統計比較を実施し得ることである。
本発明のさらなる特徴は、単一ゲル（欠如性許容値）またはマスター合成画像からの情報を使用して、新規ゲル画像の分析および解釈を誘導し得ることである。
本発明のなおさらなる特徴は、新規ゲル画像に位置するスポットの積分視覚濃度率および位置を使用することである。
本発明の利点は、オペレーターからの最小入力により、新規ゲル画像を分析して、解釈し得ることである。
本発明のさらなる利点は、新規ゲル画像を迅速かつ効率的に分析し、解釈し得ることである。
本発明のなおさらなる利点は、少量中に存在するタンパク質を確実に検出し得ることである。
本発明のなおさらなる利点は、二次元ゲル電気泳動画像の分析および解釈に限定されることなく、これを使用して、白黒またはカラーあるいは画像解釈および認識を行う任意の状況において、任意の二種の類似画像をも比較し得ることである。この過程には、いずれかの画像捕獲装置からの「新たに誘導された画像」とコンピューター記憶装置から回収した画像との比較も含まれ得る。
本発明の他の目的は、当業者にとって、以下の詳細な説明および本発明に関連する実施例から明らかである。
好ましい実施様態の詳細な説明
本発明は、診断的適用または治療的適用のいずれかのために、影響を受けていない（例えば、正常）または影響を受けた（例えば、処置された、羅患した、および／または免疫学的に影響を受けた）状態において、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされる細胞性および分泌性タンパク質ならびに核酸を特徴づけるために、組織、生検、細胞株、および体液（血清血漿脳脊髄液、尿、など）のプロテオソームを解析するための方法ならびにコンピューターシステムに関する。また、このような方法もしくはコンピューターシステムを用いて特徴づけられたタンパク質もまた、精製または単離された形態で提供される。
本発明の文脈で、用語「タンパク質」とは、アミノ酸鎖であるタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを包含し、これらはすべての改変（例えば、プロセシング、短縮化、グリコシル化、リン酸化、もしくは任意の他の改変）を含む。この用語はまた、天然のタンパク質、ならびに合成のもしくは組換えのタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを包含する。
用語「影響を受けたタンパク質」とは、発現において改変されたかまたは構造的に改変されたタンパク質を意味する。従って、影響を受けたタンパク質は、その発現が１つ以上の化合物での処置、羅患もしくは病理学的状態、および／またはタンパク質が由来する細胞内もしくは細胞外の免疫学的な変化に起因して改変されるタンパク質であり得る。また影響を受けたタンパク質は、代替的にまたは付加的に、アップもしくはダウンレギュレーションされるように改変した発現を示すか、またはその発現が、このような処置、疾患、もしくは免疫学的変化の不在下のタンパク質（例えば、「影響を受けていないタンパク質」）の発現と比較して、本発明の方法により検出され得るいかなる方法においても構造的に改変されている、タンパク質であり得る。
用語「タンパク質改変」とは、タンパク質の構造上の如何なる変化（すなわち、質的変化）も包含する。このような改変は、当該分野において周知のように、アミノ酸配列の変化、転写もしくは翻訳スプライス多様性、DNAもしくはRNA配列への翻訳前もしくは翻訳後修飾、DNA、RNAまたは、タンパク質への巨大分子または小分子の付加（例えば、ペプチド、イオン、ビタミン、原子、糖含有分子、脂質含有分子、小分子など）を包含するが、これらに限定されない。
本発明によるタンパク質改変の１タイプは、アミノ酸配列中の１つ以上の変化（置換、欠失、もしくは挿入）による。そのような変化は、１つ以上のアミノ酸における、帯電アミノ酸から別の帯電アミノ酸、非帯電アミノ酸から帯電アミノ酸、帯電アミノ酸から非帯電アミノ酸への変化（例えば、pIまたは分子量において可能な差異を引き起こす）を包含し得る。また、アミノ酸配列における任意の他の変化も、本発明に包含される。また、変化したアミノ酸配列を有する改変タンパク質のゲル中の全体としての位置の変化は、全体としての変化(charge)が、当該分野において公知であるように、タンパク質中にどれだけ存在するかに依存する。ゲルの解像度の変化（例えば、pHもしくは別の勾配成分を変化する）は、少数のもしくは多数のアミノ酸配列変化の検出を可能にし得る。解析のタイプはまた、どのように変化が検出されるか（例えば、配列決定、質量解析法、標識抗体結合法を使用する）に影響し得る。
改変の別のタイプは、細胞において、オープンリーディングフレームが読まれる方法に影響する、タンパク質をコードするDNAもしくはRNAにおける鎖長、構造、スプライシングもしくは配向性の変化により、これは、ゲル上のスポットの位置の大きな変化を与え得、かつゲル中のタンパク質のタイプおよび位置の解析に影響し得る。
タンパク質改変の別のタイプは、細胞におけるタンパク質のプロセシングにおける変化による。限定されない例は、いくつかのタンパク質が、細胞内（もしくは外）でそれらが使用されるべき場所を特定する「アドレス標識」を有する場合である。そのような標識またはタグ(tag)はペプチド、糖または脂質の形態をとり得る。そして、それはタンパク質に加えられたかまたはタンパク質から取り除かれた時、タンパク質の細胞内に位置する場所を決定する。
タンパク質改変のさらなるタイプは、タンパク質への他の巨大分子の付着による。このグループはこのような巨大分子のいかなる添加／除去をも包含し得るが、これらに限定されない。これらの分子は多くのタイプのものであり得、そして永久のまたは一時的などちらかであり得る。例は、以下を包含する：(i)ポリリボース化；(ii)DNA/RNA（一本鎖または二本鎖）；(iii)脂質およびリン脂質（例えば、膜付着に対する）；(iv)サッカライド／ポリサッカライド;ならびに(v)グリコシル化（異なるタイプの多数の糖およびシアル酸の添加--可能な変動数が大きいために、種々の一本鎖構造および枝分かれ構造において）。
タンパク質改変の別のタイプは、タンパク質への他の小分子の付着による。例は以下を包含し得るが、これらに限定されない：（i）リン酸化；（ii）アセチル化；（iii）ウリジン化；（iv）アデニル化；（v）メチル化、および（vi）キャッピング（分類される理由に対して、タンパク質のN-末端の多様な複合体改変）。これらの変化のほとんどは、タンパク質活性の調節に度々使用される。（v）ならびに（vi）はまた、タンパク質自身の半減期を変化させるために使用される。これらのタンパク質変化は、当該分野で公知なように、標識化、pI変化、抗体もしくは分子自身に対する他の特定の技術のようないくつかの技術を使用することにより、2Dにより検出され得る。分子量変化は2DGEにより検出され得るが、通常では検出され得ない。MALDI（飛行型質量分析法のマトリックス補助レーザー吸収／イオン化時間）は、これらの改変を検出し、そして特徴づけるために好ましい。
用語「発現」とは、タンパク質の物理的な発現だけでなく、発現したタンパク質の活性の測定までを包含することを意味する。例えば、タンパク質は、不活性形態として発現され得、これはリン酸化によって活性化される。実際のタンパク質発現は変化しない一方、その効果的な発現（活性）は改変されている。ゲル上で、活性の変化は、タンパク質の改変形態の発現の変化として測定され得る。
用語「実質的に純粋」とは、ポリペプチドについていう場合、少なくとも６０重量％が、天然に付随している、タンパク質および天然に存在する有機分子を含まないポリペプチドを意味する。実質的に純粋なタンパク質は、分子量で、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％のタンパク質である。実質的に純粋なタンパク質は、天然源からの抽出により；タンパク質をコードする組換え核酸の発現により、またはタンパク質の化学合成により、得られ得る。純度は、いかなる適当な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC解析により測定され得る。
本明細書中で用いられる「ポリヌクレオチド」とは、別個のフラグメントまたはより大きな構築物の成分の形態のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド核酸配列をいう。本発明のポリペプチド配列のDNAコード部分もしくは全ては、cDNAフラグメントから、または組換え転写単位で発現され得る合成遺伝子を提供するオリゴヌクレオチドから構築され得る。本発明のポリヌクレオチド配列は、cDNA、RNA、および改変ヌクレオチドを使用した誘導体を包含し、そして、天然源由来であり得るか、もしくは合成配列が当該分野で公知の方法により合成され得る。
本明細書中で用いられる「単離された」ポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいてはそれが直接隣接しているコード配列のいずれか（例えば、５’末端での配列および３’末端での配列）と直接隣接（例えば、共有結合）していないポリヌクレオチドである。それ故に、その用語は、例えば、ベクターへ、自律的に複製しているプラスミドもしくはウイルスへ、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAへ組み込まれているか、あるいは、他の配列とは独立した別個の分子として存在する組換えポリヌクレオチドを包含する。それはまた、さらなるポリペプチドの配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを包含する。
また、本発明の単離および精製されたポリヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されたポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を包含する。用語「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズしているポリヌクレオチド配列間の特異性を保証するハイブリダイゼーション条件を意味する。当業者は、非常に相補性の高い配列のみが同定されるように非特異的なハイブリダイゼーションの数を減少させるハイブリダイゼーション後洗浄条件（温度および塩濃度を包含する）を選択し得る(Sambrookら、 Molecular Cloning. 第２版.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)、これによって、詳細に参考として援用される）。例えば、そのような条件は、記載された条件下のハイブリダイゼーションである。例えば、5×SSC中に予め浸漬し、そして20%ホルムアミド、５×Denhardt溶液、pH6.8の50mMリン酸ナトリウム、および50μgの音波処理変性した仔ウシ胸腺DNAの溶液中に約40℃で１時間プレハイブリダイズして、続いて、100μM ATPを加えた同じ溶液中に約40℃で18時間ハイブリダイズすることを包含する(Sambrookら、前出(1989))。また本発明の単離および精製されたポリヌクレオチドの配列は、糖尿病を媒介するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的な配列（アンチセンス配列）およびリボザイムを包含する。
“変化したタンパク質”もしくは“変化したタンパク質発現”では、処置、疾患および／または免疫学的変化に応じて発現が定量的に変化する（例えば、増加した（「アップレギュレートされた」）、減少した（「ダウンレギュレートされた」）、阻害された（すなわち、オフにされた）、もしくは誘導された（すなわち、オンにされた））タンパク質を意味する。
ゲル画像解析のためのコンピューターに基づく方法およびシステム
本発明は、１つの局面において、画像解析のためのコンピューターに基づくプロセスに関する。本発明は、二次元ゲル電気泳動（2DGE）画像解析の状況において記載される。しかしながら、本発明は2DGE画像の解析に限定されず、そして、黒と白もしくはカラー、または画像解釈および認識が関与するいかなる状況であっても、任意の２つの類似の画像を比較するために使用され得ると理解されるべきである。このプロセスは、コンピューターメモリーデバイスから回収した画像との任意の画像捕獲デバイスからの「新たに誘導された画像」の比較を包含し得る。このような画像の例は、以下を包含し得るが、これらに限定されない：組織切片、タンパク質、RNAもしくはDNAのゲルもしくはブロット画像。
本発明の方法は、最低限のオペレーター入力で迅速かつ効率的にゲル画像を解析および解釈する解析手段を提供する。ゲル画像は、新規のタンパク質が同定され得るようにコンピューター解析により解析および解釈される。本発明の方法はまた、影響を受けたもしくは影響を受けていないタンパク質に対して、タンパク質における変化（すなわち、アップもしくはダウンレギュレーション）を同定するために、ゲル画像を比較するための比較手段を提供する。
本発明の方法は、新しいゲル画像の解析をガイドするためのマスター合成画像からの情報を使用する。このようにして、同じ細胞型の他のゲル画像からの情報が、新しいゲル画像の解析および解釈をガイドするために使用され得る。この技術は、新しいゲル画像を解析するために必要な時間を顕著に減少させる。この技術はまた、新しいゲル画像を解析するために必要なオペレーターの労力および解釈を顕著に減少させる。
本発明の方法を実施するために、マスター合成画像は、オペレーターもしくはユーザーにより選択された画像から生成される。マスター合成画像の生成における使用のためにオペレーターにより選択された画像は、典型的には同じ細胞型のものであり、そして、実施されているプロジェクトもしくは実験のタイプに関連する。本明細書中で使用される「画像」とは、画素で構成される表示をいう。各々の画素は、それに割り当てられたグレーレベルユニットレス値を有する。例えば、８ビット画像の各画素は、０（白）から２５５（黒）の範囲であるそれに割り当てられたグレーレベル、および飽和値（０から１まで変動する値、各スポットの最も暗い画素を２５５で割った値に相当する（８ビット画像について））、ならびに、X、Y（位置）およびZ（スポットが１つより多いゲルに適合した場合の各スポットに対する定量値）の標準偏差を有する。より高いビット数を有する画像は、さらに細かいステップでのより広い範囲のグレーレベルを有する。
マスター合成画像に相当するマスター合成スポットデータリストが、生成される。以下においてより詳細に記載されるように、マスター合成スポットデータリストは、マスター合成画像における各スポットの特徴を表すデータ、例えば、スポット位置、積分光学密度百分率(IOD%)、スポット数、および飽和値を包含するが、これらに限定されない。マスター合成スポットデータリストは、新しい画像の解析および解釈を援助するために簡単に検索され得るデータのコンパイルを提供する。マスター合成スポットデータリストにおけるスポットに相当する新しい画像のスポットが位置決定されたとき、位置決定された新しい画像スポットは、マスター合成スポットデータリスト中のスポットに「適合」する。マスター合成スポットデータリストが新しい画像のスポットに一度適合すると、それはマスター合成スポットデータリストの利用可能なプールから除去される。本発明の方法は、マスター合成スポットデータリストの全てを新しい画像スポットに適合させることを一連の検索を通して繰り返す。マスター合成スポットデータリストの全てを新しい画像スポットに適合された後、新しい画像に存在する適合されなかったいずれのスポットも、同定されていない新しい画像スポットを表す。このような、同定されていない新しい画像スポットは、以前に同定されていないタンパク質を表し得る。
本発明の別の適用において、同じ試料の異なるゲルの同じ画像の異なる露出は、画像が読み取られる媒体の「ダイナミックレンジを拡張する」ことが可能であるように共に適合され得る。この媒体は代表的には、以下であるが、これらに限定されない：Ｘ線フィルム、写真、ビデオレコーディング、デジタルレコーディング、または化学染色ゲル、免疫染色ゲルもしくはそのブロットの任意の他のレコーディング、あるいはこれらの併用または変形。この手順は、以下の理由によりしばしば有用である。すなわち、細胞内のタンパク質の発現の比率は100,000より大きい（例えば、約100〜1,000であるＸ線フィルムもしくは約10〜100のダイナミックレンジを有する染色ゲルの応答のダイナミックレンジを超える）；または上述の媒体の応答が線形でない（タンパク質スポットの正確な定量に問題を導入する）ためである。
マスター合成画像が一度生成されると、新しい画像がそれと合わされ得る。本発明の方法は、アンカー点の使用を介して、新しい画像をマスター合成画像に合わせる。アンカー点は、新しい画像とマスター合成画像との両方に存在するスポットに相当する一般のアンカー点、ならびに、規定の判断基準に基づいてマスター合成スポットデータリストから選択された一次および二次のアンカー点を包含する。ベクトル差分質制御解析(vector differencingquality control analysis)は、アンカー点が新しい画像スポットに適切に適合されることを確実にするために行われる。
本発明の方法は、以前に一致しなかったマスター合成スポットデータリストに存在する３つの異なるタイプのスポットについて、新しい画像において検索を実施する。スポットの第１のタイプは「十分に規定された」スポットである。以下においてより十分に説明されるように、十分に規定されたスポットは、約0.2と約0.8との間の飽和値「Ｓ」を有するスポットである。十分に規定されたスポットは、弱くなく飽和されてもいないスポットである。スポットの二番目のタイプは、「飽和」スポットである。飽和スポットは、0.8以上である飽和値Ｓを有する。スポットの三番目のタイプは、「弱い」スポットである。弱いスポットは、0.2以下である飽和値を有する。十分に規定されたスポット、飽和スポット、および弱いスポットに対応する新しい画像中で位置決定されたスポットが適合され、そして対応するマスター合成スポットデータリストと同じスポット数を与えられる。
一度、十分に規定されたスポット、飽和スポット、そして弱いスポットに対する検索が終了すると、適合された新しい画像スポットの外側の新しい画像が、未同定のスポットの位置決定のために検索される。未同定のスポットの検索は、２つの異なる感度レベルを使って実施される。位置決定された未同定のスポットは、さらなる解析および評価のためにオペレーターに提示される。
本発明の別の適用において、新しいゲルおよびMCIとして選択された画像は、同じゲルのものもしくは同じ試料のものかのいずれかであることを利用者が指定する場合、同じ画像の異なる露光は、上述に概略が説明され、かつ以下に詳細に記載されるような同じ手順を使用して、共に適合され得る。これらのカテゴリーにおける２つ以上の組み合わせによって、%IODは再計算され、そしてこれらの値はさらなる解析のために使用される。
上述のような本発明の方法は、新しい画像の解析および解釈のための効率的な解析手段を提供する。本発明の方法は、以前に解釈された種々の画像の比較というさらなる能力を提供する。例えば、オペレーターは、特別な様式で処理された細胞の１つの群ならびに未処理細胞の１つの群のような、比較すべき画像の２つ以上の群を同定し得る。ゲル画像の処理細胞群の各々のスポットが、統計学的に有意な差異があるかどうかを見るために、ゲル画像の未処理細胞群の相当するスポットと比較される。これは、選択された画像間でオペレーターが統計学的な比較をするための便利な方法を提供する。
ここで、図１を参照すると、本発明の方法の１つの実施様態を図示するブロック図100が示される。以下においてより十分に記載されるように、本発明は、ハードウェア、ソフトウェア、またはその併用を使用して実施しされ得、そして、コンピューターシステムまたは他の処理システムにおいて実施され得る。工程110において、新しい画像が捕獲される。本発明は2DGEゲル画像である新しい画像に限定されず、従って、本発明は画像のいかなる適切なタイプをも解析するために使用され得ることが理解されるべきである。その画像はまた、関連分野の当業者に公知の方法において、コンピューターへその画像を走査することによって捕獲され得る。その画像はまた、ランダムアクセスメモリー(RAM)、読み出し専用メモリー(ROM)、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリー、光学ディスク、フロッピー（登録商標）ディスクなどのような記憶デバイスからそれを回収することによって捕獲され得る。その画像はまた、別のコンピューター、カメラから、インターネットを介したサイトから、もしくは任意の他の源から、通信インターフェースを介してそれをダウンロードすることによって捕獲され得る。
工程120では、マスター合成画像およびマスター合成スポットデータリストが生成され、そして解析のタイプが選択される（マスター合成スポットデータリストへの新しいゲルの適合、同一ゲルの２つの露光または同じ試料の２つのゲル）。工程130では、新しい画像が、マスター合成画像と位置合わせをされる。
工程140では、アンカー点が、マスター合成スポットデータリストから選択される。新しい画像は、アンカー点に相当する新しい画像スポットに位置することを検索される。アンカー点に相当するスポットが新しい画像に位置する場合、新しい画像スポットは相当するアンカー点に適合される。
工程150で、ベクトル差分が、各々の適合した新しい画像スポットについて計算される。最大ベクトル差分を有する適合した新しい画像スポットは、適合されない。
工程160で、新しい画像が、十分に規定されたスポットを検出し、そして適合させるために検索される。工程170では、新しい画像が、飽和スポットを検出し、そして適合させるために検索される。工程180では、新しい画像が、弱いスポットを検出し、そして適合させるために検索される。
工程190では、新しい画像が、同定されていない新しい画像スポットの位置を決定するために検索される。新しい画像はすでに適合されているスポットの外側を検索される。
手順の始め（工程120）で、利用者が適合されるゲルが、同一のゲルの２つの露光、または同じ試料の２つのゲルのどちらかを選択する場合、コンピューターはすべてのタンパク質に対して％IODを再計算する。
最終的に、工程195では、種々の画像セットが比較され得る。オペレーターは、比較されるべき画像のグループ、およびなされるべき統計学的比較のタイプを選択し得る。
本明細書中に含まれる本発明の実施の記述、および付随するフローチャートから、コンピューターシステムまたはプロセッサーの操作を制御するコンピュータープログラムを使用して本発明をどのようにして実施するかということは、関連分野の熟練したプログラマーまたは分子生物学者に、容易に明らかである。例えば、関連分野の熟練したプログラマーは、限定されない例として、Ｃ++プログラミング言語、または当該分野で周知の任意の他の適切な言語を使用する本発明の方法を実施するためのコンピュータープログラムを提供し得る。
好ましい実施態様においては、本発明のコンピューターシステムまたは方法は、細胞試料が組織、生検、単離細胞もしくは細胞培養物に由来するかどうか、または解析されるべきタンパク質が細胞性であるかもしくは分泌されたものであるかどうかとは関係なく、処理された細胞が細胞試料を提供する前に少なくとも１つの化合物で処理されている場合に提供される。化学的もしくは生物学的分子のような化合物は、強力な診断用もしくは治療用化合物であり得る。
発明の実行
上記の通り、本発明をハードウエア、ソフトウエアまたはそれらの組み合わせにおいて実行し、コンピューターシステムまたは他の処理システムにより実行し得る。１つの実施態様において、本発明を、本明細書中に記載の機能性を実行し得るコンピューターシステムに指令する。図２に例示的なコンピューターシステム1102を示す。コンピューターシステム1102は、プロセッサー1104などの１つ以上のプロセッサーを具備する。プロセッサー1104は、通信バス1106に連結されている。様々なソフトウエア実施態様をこの例示的なコンピューターシステムの用語で記載する。この説明の読解の後、関連技術における当業者に、他のコンピューターシステムおよび／またはコンピューター体系を使用して本発明をいかに実行するかが、明らかになる。
また、コンピューターシステム1102は、メインメモリ1108、好ましくは等速呼び出しメモリ(RAM)を具備し、二次メモリ1110もまた具備し得る。二次メモリ1110は、例えば、ハードディスクドライブ1112および／または脱着可能なメモリドライブ1114を（フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブなどが示される）を具備し得る。脱着可能なメモリドライブ1114は、周知の様式により、脱着可能なメモリ単位1118から読み取り、および／または脱着可能なメモリ単位1118に書き込む。脱着可能なメモリ単位1118とは、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、光ディスクなどを示し、これは、脱着可能なメモリドライブ1114により、読み取られおよび書き込まれる。理解されるように、脱着可能なメモリ単位1118は、コンピューターに使用可能なメモリ媒体を具備し、そこにコンピューターソフトウエアおよび／またはデータが記憶されている。
別の実施態様において、二次メモリ1110は、他の類似手段またはメモリ装置を具備し、コンピュータープログラムまたは他の命令を、コンピューターシステム1102にロードさせ得る。このようなメモリ装置は、例えば、脱着可能なメモリ単位1122およびインターフェース1120を含み得る。このような例として、プログラムカートリッジおよびカートリッジインターフェース（ビデオゲーム機に見られるものなど）、脱着可能なメモリチップ（EPROMまたはPROMなど）および関連ソケット、ならびに他の脱着可能なメモリ単位1122およびインターフェース1120が含まれ得、ソフトウエアおよびデータを脱着可能なメモリ単位1122からコンピューターシステム1102へ転送し得る。
また、コンピューターシステム1102は、通信インターフェース1124を具備し得る。通信インターフェース1124は、ソフトウエアおよびデータを、コンピューターシステム1124および外部装置（無表記）間で転送し得る。このような外部装置には、ゲル画像をコンピューターシステム1102へ入力する走査機などがある。通信インターフェース1124の例として、モデム、ネットワークインターフェース（例えば、Ethernet（登録商標）カード）、INTERNETを仲介するのに適したネットワークインターフェース、通信ポート、PCMCIAスロットおよびカードなどがあり得る。通信インターフェース1124を介して転送されるソフトウエアおよびデータは、信号1126形式であり、これは、通信インターフェース1124により受信可能な電子信号、電磁気信号、光信号または他の信号であり得る。信号1126をチャネル1128を介して通信インターフェースへ提供する。チャネル1128は、信号1126を運び、そしてワイヤーまたはケーブル、光ファイバー、電話回線、セル方式電話リンク、RFリンクおよび他の通信チャネルを使用して実行され得る。
この明細書において、用語「コンピュータープログラム媒体」、「コンピュータープログラム製品」、「プログラムメモリ装置」、および「コンピューターに使用可能な媒体」を使用して、一般的に、脱着可能なメモリ装置1118、ハードディスクドライブ1112にインストールされたハードディスク、ならびに信号1126などの媒体を言及する。これらのコンピュータープログラム製品は、ソフトウエアをコンピューターシステム1102に提供する。
コンピュータープログラム（コンピューター制御論理とも呼ぶ）をメインメモリおよび／または二次メモリ1110に記憶する。また、コンピュータープログラムを、通信インターフェース1124を介して受信し得る。このようなコンピュータープログラムは、実行されると、本明細書中に記載するように、本発明の特徴を、コンピューターシステム1102が実行し得るようにする。特に、コンピュータープログラムを実行した場合、プロセッサー1104は、本発明の特徴を実行し得る。従って、このようなコンピュータープログラムは、コンピューターシステム1102のコントローラーに相当する。
本発明を、ソフトウエアを使用して実行する１つの実施態様において、ソフトウエアをコンピュータープログラム製品に記憶し、そして脱着可能なメモリドライブ1114、ハードドライブ1112、または通信インターフェース1124を使用してコンピューターシステム1102にロードし得る。制御論理（ソフトウエア）は、プロセッサー1104により実行されると、プロセッサー1104に、本明細書中に記載のような本発明の機能を実行させる。
別の実施態様において、本発明を、主として、例えば、特定用用途向けの集積回路(ASIC)などのハードウエア成分などのハードウエアで実行する。本明細書において述べる機能を実行するようなハードウエア状態機器の実行は、関連分野の当業者に明らかである。
なお別の実施態様において、本発明を、ハードウエアとソフトウエアとを組み合わせて使用して実行する。
本発明により提供する影響を受けたおよび影響を受けていない、タンパク質、ならびにコードされた核酸。特定のアップレギュレートおよび／またはダウンレギュレートされたタンパク質--本発明の影響を受けたペプチド、疾患性ペプチド、処置されたペプチド、または免疫影響を受けたペプチドに対応する--は、今や本発明の方法を使用して発見される。従って、本発明は、影響を受けた、疾患性、もしくは影響を受けていない、ペプチド、および／またはコードされた核酸、または相補的な核酸、ならびにその作製方法および使用方法（組換え体の発現、精製、および薬物スクリーニングなどを含む）を、少なくとも１つの影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドアミノ酸配列、またはコードされたまたは相補的な核酸を利用し、提供する。
影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドまたはタンパク質。影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドを、それらのフラグメント、コンセンサス配列、または反復単位として、影響を受けたかまたは影響を受けていない、ペプチド、タンパク質、もしくは改変ペプチドの任意のサブセットと言及し得る。本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドを、以下により調製し得る：
(a)組換えDNA法；
(b)インタクトな分子またはそのフラグメントのタンパク質消化；および、
(c)影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドを生成し得る任意の他の方法。影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドは、インビトロ、インサイチュ、インシリコまたはインビボで、公知のスクリーニングアッセイによりスクリーニングし得る、生物学的活性を有し得る。活性を有するべき最小のペプチド配列は、少なくとも１つの影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドの、特定の領域、ドメイン、コンセンサス配列を含むか、これらからなる最小単位またはその反復単位に基づく。
本発明に従って、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドは、２つ以上のポリペプチドドメイン（例えば、膜貫通、細胞質性、疎水性、親水性、リガンド結合、またはポア内層ドメイン、またはその断片）の結合を含み、これは、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドに相当する（例えば、１〜40ドメインまたは任意のその範囲もしくは値について）。さらに、このペプチドは、本明細書中で規定されるかまたは当該分野で公知の任意の修飾を含み得る。当業者に理解されるように、上記のドメインの配置は、本発明の、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドの部分として提供され、その結果、機能的に影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドは、適当な細胞で発現された場合、影響を受けた細胞型で認められる生物学的活性に関連し得る。影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチド活性アッセイにより測定た場合、このような活性は、本発明の１つ以上の影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質活性またはペプチド活性を確立する。
一つの局面において、このような影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドは、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質生物活性またはペプチド生物活性を維持し得る。本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドが、天然に存在しないか、または天然に存在するが、天然に存在しない精製形態または単離形態であることが好ましい。
従って、当業者は、本明細書中に示される説明および指導によって、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの他の位置に、他のアミノ酸残基を添加、欠失、または置換して、当該分野で公知の置換、欠失または付加的変異を含む、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドを得る方法を理解する。
また、本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドには、ペプチド内の少なくとも１つのアミノ酸残基が、少なくとも１つの異なるアミノ酸により保存的に置換、付加、または欠失されている変異体が含まれる。タンパク質化学および構造に関する詳細な説明は、例えば、Schulzら、タンパク質の構造原理、Springer-Verlag、New York、1978およびCreighton、T.E.、タンパク質：構造および分子特性、W.H.Freeman & Co.、San Francisco、1983を参照すること、これらは本明細書中に参照として援用される。コドン選択性などのヌクレオチド配列置換の提示については、Ausubelら、編、Current Protocal of Molecularbiolgy、Greene Publishing Assoc.、New York、NY(1987、1992、1993、1994、1995)の§§A.1.1-A.1.24およびSambrookら、分子クローニング：実験室マニュアル、第二版、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY(1989)の補遺Cおよび補遺Dを参照のこと。
従って、別の置換を、日常的な実験方法により（例えば、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質活性またはペプチド活性を与える、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチド断片の１つ以上の保存的置換を行うことにより）行い、本発明の別の影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドを提供し得る。しかし、置換、欠失、または付加の正確な効果を確認すべき場合には、当業者は、生物学的活性を確認するために、少なくとも１つの置換、付加、または欠失の効果を（例えば、イムノアッセイまたバイオアッセイなどであるが、これに限定しない）、少なくとも１つの活性スクリーニングアッセイにより評価することを理解する。発明の試料には、細胞、細胞のタンパク質抽出物もしくは膜抽出物、または体液が含まれる。試料は、測定形式、検出方法、および試料として使用される、組織、細胞または抽出物の性質によって異なる。
細胞および／または組織には、例えば、正常または病理学的な動物の細胞または組織およびその抽出物、またはそれらの細胞培養物が含まれ、これらは、インビボ、インサイチュまたはインビトロで、培養、継代、非継代、形質転換、組換え体、または単離細胞および／もしくは組織として提供され得る。
当該分野において公知の種々の方法を使用して、本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドを獲得し得る。１つの実施態様において、ペプチドを、このペプチドを天然に産生する組織または細胞から精製する。あるういは、上述の単離した核酸フラグメントを使用して、任意の生物における、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドタンパク質を発現し得る。
任意のより高度な真核生物を、本発明の少なくとも１つの影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドの供給源として使用し得るが、供給源の生物がこのようなペプチドを天然に含有する場合に限られる。本明細書中で使用する場合、「供給源の生物」とは、ペプチドが発現される生物、および／または最終的にそこから単離される生物とは関係なく、ペプチドのアミノ酸配列が由来する生物をいう。少なくとも１つの影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドまたはコードされた核酸の供給源として好ましい生物体は、哺乳動物または鳥類などの任意の脊椎動物であり得る。哺乳動物間で、好ましい被験体は、Orders Primata（ヒト、サル（ape）、サル（monkey）を含む）、Arteriodactyla（ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ブタを含む）、Rodenta（マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターを含む）およびCarnivora（ネコおよびイヌを含む）の哺乳動物である。最も好ましい生物はヒトである。
当業者は、天然の夾雑物を含まないペプチドを得るために、タンパク質を単離するための公知の方法を容易に行い得る。これらには、イムノクロマトグラフィー、サイズ排除（size-exclusion）クロマトグラフィー、HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、およびイムノアフィニティークロマトグラフィーがあるが、これらに限定されない。例えば、Ausubel、下記;Sambrook、下記;Colligan、下記を参照のこと。
影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドをコードする単離された核酸分子。１つの実施態様において、本発明は、新規の、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドに相当するアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。別の好ましい実施態様において、単離された核酸分子は、本発明による１つ以上のタンパク質をコードする影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドヌクレオチド配列を有する。
核酸の単離。本発明の別の局面において、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドに対応するアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
公知の方法（例えば、プライマー増幅またはcDNAクローニングであるが、これらに限定されない）により、核酸分子を、核酸を含有する生物学的試料から単離し得る。
核酸分子を、ゲノムDNAを含有する生物学的試料またはゲノムライブラリーから単離し得る。適切な生物学的試料には、膵臓、肝臓、肺、脾臓、骨髄、血液または血液成分、中枢神経系(CNS)、腺、皮膚、毛髪、精巣、卵巣、腎臓、甲状腺、脳脊髄液(CSF)、末梢神経系（ニューロン、ガングリオン）および末梢神経系の一部など（しかしこれらに限定されない）の、正常または病態的な動物細胞または組織、心臓細胞、平滑筋、骨格筋または心筋、自律神経系など（しかし、これらに限定されない）の正常または病理的動物細胞または組織、およびその抽出物または培養物などが含まれ、培養、継代、非継代、形質転換、組換え体、または単離の細胞および／または組織として、インビボ、インサイチュまたはインビトロで提供される。生物学的試料を得る方法は、試料の性質により異なる。
当業者は、哺乳動物ゲノムが、個体間の軽度の対立遺伝子的変化を受け、これらの変化がタンパク質配列において異なる場合、プロテオーム（proteome）分析（2Dゲル電気泳動および／または質量分析法）により検出し得ることを、理解する。従って、単離された核酸分子はまた、配列が影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドをコードする場合に限り、対立遺伝子的変化を含むように意図される。影響を受けたまたは影響を受けていないペプチド対立遺伝子が、本発明の１つ以上のタンパク質または少なくともそれらのドメインに認められるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードしない場合、それは、本明細書中で使用される同じ技術（特に、本明細書に開示される配列に基づくプライマー用いる適切な遺伝子を増幅する核酸増幅技術）を使用して、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドとして単離または同定され得る。このような変化は、例えば、表１および表２に示す。
大きなcDNAのクローニングは、より小さいcDNAと同じであるがより日常的な実験法を必要とする。有用な方法の一つは、cDNAバクテリオファージライブラリースクリーニングによる（例えば、Sambrook、下記、またはAusubel、下記を参照のこと）。スクリーニング用のプローブを、例えば、ランダムヘキサマーおよびKlenow酵素(Pharmaciaキット)で標識する。5'cDNAをこれらのアプローチにより得られない場合、オリゴdTまたはランダムプライマーの代わりに特異的に影響を受けたタンパク質をコードするプライマーを使用して逆転写反応を促進することにより、サブcDNAライブラリーを調製し得る。次に、cDNAサブライブラリーをλzapなどの標準ベクターにクローニングし、そして従来の技術によりスクリーニングする。全長cDNAの構築を、オーバーラップフラグメントを（原核生物または真核生物のいずれかの）発現ベクターにサブクローニングすることにより行う。この課題は、大きなcDNAでは、独自の制限部位が少ないため、より困難であるが、日常的な制限、クローニング、またはPCRを使用してフラグメントを結合する。
生体試料中の影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドコード核酸の存在を検出する方法。別の実施態様において、本発明は、試料中の核酸をコードする影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質コード核酸またはペプチドコード核酸の存在を検出する方法に関する。このような方法は、(a)試料を上述の核酸プローブと、ハイブリダイゼーションが起こるような条件下で接触させ、そして(b)核酸プローブに結合した標識プローブの存在を検出する。当業者は、上述のような当該分野において公知の技術により、適切な標識核酸プローブを選択し得る。試験を行う試料は、哺乳動物組織のRNA試料であるが、これに限定されない。
影響を受けたペプチドまたはタンパク質は、特定の症状と関連する特定の細胞型で発現することが認められている。従って、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドプローブを使用して、このような生物学的試料における細胞からRNAの存在を検出し得る。さらに、正常レベルと比較した場合、個体における影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの変化した発現レベルは、疾患の存在を示唆し得る。さらに、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドプローブを使用して、影響を受けた組織中の一般的または特異的な細胞活性を測定し得る。また、影響を受けたタンパク質のフラグメントまたは全タンパク質を体液（脳脊髄液および尿が含まれるが、これらに限定されない）中で検出し得る。
影響を受けたまたは影響を受けていないペプチド核酸分子をコードするDNA構築物およびこれらの構築物を含む宿主。本発明の、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドをコードする核酸配列を、従来の技術に従って、ベクターDNAで遺伝子を組換え得る。この技術には、連結のための平滑末端または接着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化が含まれ、所望でない結合を回避するための適切なアルカリホスファターゼ処理のような接着末端を充填し、そして適切なリガーゼで連結する。このような操作技術は、例えば、Ausubelら、下記により開示され、また当該分野において周知である。
したがって、本発明は、原核生物または真核生物細胞のいずれかにおける、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドの発現を含み得るが、真核生物発現が好ましい。
好ましい宿主は、インビボまたはインサイチュでの細菌宿主もしくは真核生物宿主（細菌、酵母、昆虫、真菌を含む）、または哺乳動物、昆虫、鳥または酵母を起源とする宿主細胞である。ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌ、またはネコを起源である哺乳動物細胞または組織が好ましいが、他の哺乳動物細胞も使用し得る。
真核生物宿主は、酵母、昆虫、真菌、および哺乳動物細胞をインビボ、組織中、生検または組織培養物中に含み得る。また、好ましい真核生物宿主は、昆虫細胞に限定しないが、哺乳動物細胞をインビボまたは組織培養物中に含み得る。好ましい哺乳動物細胞は、Xenopus卵母細胞、HeLa細胞およびVEROまたはCHO-K1などの繊維芽細胞を起源とする細胞、またはリンパ球を起源とする細胞およびその誘導体である。
哺乳動物細胞は、正しい部位での正しい折り畳みまたはグリコシル化を含むタンパク質分子に、翻訳後修飾を提供する。宿主として有用であり得る哺乳動物細胞には、NIH 3T3、VEROまたはCHOのような線維芽細胞起源の細胞（しかし、これらに限定されない）、またはハイブリドーマSP2/O-Ag14またはマウスミエローマP3-X63Ag8、ハムスター細胞系（例えば、CHO-K1および始原細胞、例えば、CHO-DUXB11)およびその誘導体のような（しかし、これらに限定されない）リンパ球を起源とする細胞が含まれる。哺乳動物細胞の好ましい型の一つは、インビボで、遺伝的に欠損した細胞の機能を置換することが意図される細胞である。
哺乳動物細胞宿主について、少なくとも１つの影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの発現のための、多くの可能なベクター系が適用される。広範な多様な転写調節配列および翻訳調節配列を、宿主の性質に依存して使用し得る。転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、ウイルス源（例えば、アデノウイルス、ウシパルボウイルス、Simianウイルスであるが、これらに限定されない）に由来し得る。ここで、調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連する。あるいは、アクチン、コラーゲン、ミオシン、タンパク質産生などであるが、これらに限定されない哺乳動物発現産物のプロモーターである。Ausubel、下記;Sambrook、下記を参照のこと。
生存する昆虫を使用する場合、カイコガ毛虫（silk moth caterpillar）およびバキュロウイルスベクターは、本発明に従う、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの大量生産に現在好ましい宿主である。昆虫における影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの産生を、例えば、当業者に公知の方法により、昆虫宿主を、少なくとも１つの、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドを発現するように操作したバキュロウイルスで感染させることにより達成し得る。Ausubelら、eds.Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience、§§16.8-16.11(1987-1996)を参照のこと。
好ましい実施態様において、導入されたヌクレオチド配列は、被験宿主において自律増殖し得るプラスミドまたはベクターに組み込まれる。任意の広範な多様なベクターを、この目的のために用い得る。例えば、Ausubelら、下記、§§1.5、1.10、7.1、7.3、8.1、9.6、9.7、13.4、16.2、16.6および16.8-16.11を参照のこと。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する上で重要な因子は、以下：ベクターを含む被験細胞を、ベクターを含まない被験細胞から認識し、選択し得る簡易性；特定の宿主で所望されるベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル」し得ることが望ましいか否か、を含む。
異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後のプロセシングおよび改変（例えば、グリコシル化、切断）に対して特徴および特異的メカニズムを有する。適切な細胞系または宿主システムを選択して、発現された外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを保証し得る。例えば、細菌系での発現を使用して、非グリコシル化コアタンパク質産物を生成し得る。酵母における発現は、グリコシル化産物を生成する。哺乳動物細胞での発現を使用して、影響を受けたまたは影響を受けていない異種のタンパク質またはペプチドタンパク質の「天然」グリコシル化を保証し得る。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、タンパク質分解性切断などのプロセシング反応を異なる程度に達成し得る。
上記のように、真核性宿主における影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの発現は、真核性調節領域を使用する必要がある。このような領域は、一般的に、RNA合成の開始を指向するのに十分なプロモーター領域を有する。例えば、Ausubel、（下記）；Sambrook、（下記）を参照のこと。
影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドの単離。本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドタンパク質またはフラグメントを、上記のように、遺伝子組換えDNAから発現により獲得し得る。あるいは、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドを、生体物質から精製し得る。望ましければ、発現された、少なくとも一つの影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドを、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動などの従来の方法段階に従って単離し、精製し得る。例えば、適切なレベルで少なくとも一種の影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドを発現する細胞を、遠心分離、または適切な緩衝液により収集し、溶解し、次に、タンパク質を、例えば、DEAE-セルロース、ホスホセルロース、ポリリボシチジル酸ーアガロース、ヒドロキシアパタイトにおけるカラムコロマトグラフィーまたは電気泳動または免疫沈降法により単離し得る。あるいは、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドを、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドあるいは影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチド抗体など、しかし、これらに限定しない特異的抗体を使用することにより単離し得る。このような抗体を公知の方法段階により獲得し得る（例えば、Colligan、（下記）;Ausubel、（下記）を参照のこと）。
しかし、当業者にとって公知の他の方法を使用して、サイズに基づいて分子を効率的に分離し得る。影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドの精製プロトコールにおける第四段階で、免疫反応性ピークをドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分析し、さらに、クロマトグラフィーによる精製段階後、例えば、銀染色などの染色を行い得る。精製方法の第五段階は、SDS-PAGE後に得られた影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドを、親和性クロマトグラフィーまたは、単離される物質と特異的に結合する分子間の親和性に基づく任意の他の手順に供することを含み得る。影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドをさらに精製するため、抗影響を受けたペプチドmAb(実質的に純粋な影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドに対して生成された特異的mAB)に結合されたSEPHAROSEに基づく親和性クロマトグラフィーを使用し得る。逆相HPLCなどの代替方法またはピーク分解性の良好な迅速分離を特徴とする任意の他の方法が有用である。
他の精製段階を上記の好ましい方法と置き換え得ることは、明らかである。当業者は、過度の実験を行うことなく、代替の精製スキームを考案し得る。
影響を受けたおよび影響を受けていないペプチドに結合親和性を有する抗体およびその抗体を含むハイブリドーマ。別の実施態様において、本発明は、上記の影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドまたはそのフラグメントに特異的な結合親和性を有する抗体に関する。影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドに選択的に結合する抗体は、以下を含み得る方法における使用について選択されるが、方法はこれに限定されない：影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドを含む組織における影響を受けたまたは影響を受けていないまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチド発現変性の分析。
本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドを抗体の生成など様々な手順や方法に使用し、薬学的組成物の同定およびDNA/タンパク質相互作用の研究に使用し得る。
本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドを使用して、抗体またはハイブリドーマを生成し得る。当業者は、抗体を所望する場合には、このようなペプチドを本明細書の記載のように生成し、免疫原としての使用することを認識している。
本発明の抗体には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、およびこれらの抗体のフラグメントがある。さらに、本発明は、１本鎖抗体を含む。分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントを公知の技術により生成し得る。
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、キメラ抗体、溶解または結合型で標識し得る抗体に対する抗イディオタイプ（抗-Id）抗体および、酵素的切断、ペプチド合成または組み換え技術などの公知の技術（これらに限定されない）により提供される、これらのフラグメントなどを意味する。ポリクローナル抗体は、抗原で免疫した動物の血清から得られた抗体分子の異種の群である。モノクローナル抗体は、抗原に特異的な抗体の実質的に同種の集団であり、この抗体集団は、実質的にに類似したエピトープ結合部位を含有する。MAbを当業者にとって公知の方法により獲得し得る。例えば、KohlerおよびMilstein、Nature 256:495-497(1975);米国特許第4,376,110号;Ausubelら、編、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Greene Publishing Assoc.およびWiley Interscience、N.Y.(1987-1996);およびHarlowおよびLane, ANTIBODIES：A LOBOROTORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory(1988);Colliganら、編、Current Protocols in Immunology、Greene Publishing Assoc.およびWiley Interscience、N.Y.、(1992-1996)を参照のこと。この内容は全て、本明細書中で参考として援用される。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、GILDを含む任意の免疫グロブリンクラスおよび任意のそのサブクラスであり得る。本発明のmAbを産生するハイブリドーマをインビトロ、インサイチュまたはインビボで培養し得る。インビボまたはインサイチュでmAbを高力価で産生するのが、現在好ましい産生方法である。
キメラ抗体は、その異なる部分が、異なる動物種から得られる分子で、例えば、マウスmAbから得られた可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するキメラ抗体などがある。これらのキメラ抗体は、適用における免疫原性を抑え、産生収量を増加させるために主に使用される。例えば、マウスmAbが、ハイブリドーマからより高い収率で得られるが、ヒトでより高い免疫原性がある場合、このようなヒト／マウスキメラmAbを使用する。キメラ抗体およびその産生方法は、当該分野において公知である（Cabillyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3273-3277(1984);Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984);Boulianneら、Nature 312:643-646(1984);Cabillyら、欧州特許出願第125023号;Neubergerら、Nature 314:268-270(1985);Taniguchiら、欧州特許出願第171 496号;Morrisonら、欧州特許出願第173 494号;Neubergerら、PCT出願 WO86/01533;Kudoら、欧州特許出願第184 187号;Morrisonら、欧州特許出願第173 494号;Sahaganら、J.Immunol.137:1066-1074(1986);Robinsonら、国際特許公開第PCT/US86/02269号;Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443(1987);Sunら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218(1987);Betterら、Science 240:1041-1043(1988);およびHarlow、（下記））。これらの参照文献は、本明細書中で参考として援用される。
抗イディオタイプ（抗-Id）抗体は、一般的に抗体の抗原ー結合部位と関連する独自の決定因子を認識する抗体である。Id抗体を、抗-Idが調製されるmAbに関するmAbの供給源として、同じ種および遺伝子型（例えば、マウス株）の動物を免疫することにより調製し得る。免疫された動物は、イディオタイプ決定因子（抗-Id抗体）に対する抗体を産生することにより、免疫抗体のイディオタイプ決定因子を認識し、これに反応する。例えば、米国特許第4,699,880号を参照のこと。これらすべてを本明細書中で参考として援用する。
また、抗-Id抗体を「免疫原」として使用して、いわゆる抗-抗-Id抗体を産生する、さらに別の動物において免疫反応を誘発し得る。抗-抗-Idは、抗-Idを誘発した元のmAbとエピトープ的に同一であり得る。従って、mAbのイディオタイプ決定因子に対する抗体を使用することにより、同じ特異性の抗体を発現する他のクローンを同定し得る。
従って、本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドに対して生成されたmAbを使用して、BALB/cマウスなどの適した動物において抗-Id抗体を誘発し得る。このように免疫されたマウスの脾臓細胞を使用して、抗-Id mAbを分泌する抗-Idハイブリドーマを生成する。さらに、抗-Id mAbをキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)などのキャリアに連結し、これを使用してさらにBALB/cマウスを免疫し得る。これらのマウスの血清は、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチド特異的エピトープに特異的な元のmAbの結合特性を有する抗-抗-Id抗体を含有する。従って、抗-Id mAbは、これ自体のイディオタイプエピトープまたは、評価を行うエピトープと構造的に類似する「イディオタイプ」を有する。
また、用語「抗体」は、無傷分子およびそのフラグメントの両方、例えば、FabおよびF(ab')2などを意味し、これらは抗原を結合し得る。FabおよびF(ab')2フラグメントは、無傷抗体のFcフラグメントを欠き、循環からより速やかに消失し、次に無傷抗体より低度の非特異的組織結合を有し得る（Wahlら、J.Nucl.Med. 24:316-325(1983))。FabやF(ab')2、および本発明において有用な抗体の他のフラグメントを使用し、無傷抗体分子に対して本明細書で開示する方法により、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドを検出および／または定量し得ることが理解される。このようなフラグメントを、代表的には、パパイン（Fabフラグメントを生成するため）またはペプシン（F(ab')2フラグメントを生成するため）などの酵素を使用してタンパク質分解性切断により生成する。抗体は、分子と特異的に反応し、それによって分子を抗体に結合し得る場合、分子を「結合し得る」と言う。用語「エピトープ」は、抗体によっても認識し得る抗体により結合可能な任意の分子部分とみなすことを意味する。エピトープまたは、「抗原決定基」は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面群性化からなり、特異的な三次元構造特性および特異的電荷特異性を有する。
「抗原」は、動物を付加的に誘発して抗原のエピトープに結合可能な抗体を生成する抗体により結合可能な分子または分子部分である。抗原は、一種以上のエピトープを有し得る。上記に引用した特異的反応とは、抗原が高度に選択的な様式でその対応する抗体と反応するが、他の抗体により惹起され得る多数の他の抗体とは反応しないことを意味する。
免疫アッセイ。影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドに指向された、本発明の抗体を使用して、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドまたは影響を受けたまたは影響を受けていないペプチド関連病状を検出または診断し得る。本発明により、以下を含むスクリーニング方法が提供される。例えば、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドに対する特異的抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）の生成に基づく放射免疫アッセイ(RIA)または酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)方法論を利用する免疫アッセイがある。これらのアッセイに対して、生体試料を生検、または他の組織サンプリングから得る。例えば、RIAの１つの形態において、試験下の基質を希釈血清と放射標識抗原存在下で混合する。この方法において、試験物質の濃度は、特異的抗原に結合された標識抗原量に逆比例し、遊離標識抗原量と直接的に関連する。他の適切なスクリーニング方法は、当業者にとって容易に明らかである。
さらに、当業者は、現在利用可能な手順、および抗体に関する上記の技術、方法およびキットを容易に適合させて、合理的に設計された抗ペプチドペプチドを生成するため、特異的ペプチド配列に結合可能なペプチドを生成し得る。例えば、Hurbyら、「合成ペプチドの適用：アンチセンスペプチド」、Synthetic Peptides, A User's Guide、W.H.Freeman、NY. 289-307頁(1992)、およびKaspczakら、Biochemistry 28:9230-8(1989)を参照のこと。
影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドを含む生物学的試料に関する本発明の診断アッセイを実施する１つの実施態様は、
(a)検出可能な標識された影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドに特異的な抗体を固相支持体と接触させて、上記影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドに特異的な抗体またはそのフラグメントを固定化する工程、
(b)影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドを含有すると推測される試料を上記固相支持体と接触させる工程、
(c)上記の検出可能な標識された影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドに特異的な抗体を上記支持体と、固定化影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドに特異的な抗体を影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドに結合させるのに十分な時間インキュベートする工程、
(d)固相支持体を工程 (c)で得られたインキュベーション混合物から分離する工程、および、
(e)結合された標識を検出し、それによって、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドを検出し、定量する工程を包含する。
検出可能な標識抗体および影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの特定の濃度、インキュベーションの温度や時間、および他のアッセイ条件は、試料中の影響を受けたまたは影響を受けていないペプチド濃度、試料の性質などを含む種々の因子に依存して異なり得る。所定の多くの抗-影響を受けたペプチド抗体の結合活性を周知の方法により測定し得る。当業者は、日常的な実験法を利用して各測定に対して操作可能で最適なアッセイ条件を決定し得る。洗浄、攪拌、振とう、ろ過などの他のこのような手順工程を、目的または特定の状況に対して必要に応じてアッセイに追加し得る。
検出を任意の種々のアッセイにより達成し得る。例えば、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチド特異的抗体または抗体フラグメントを放射標識することにより、放射免疫アッセイを使用して影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドを検出することが可能である。放射免疫アッセイの良好な記載は、Colligan、（下記）、およびAusubel、（下記）に記載されており、すべて本明細書中で参考として援用される。好ましくは、影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドを発現する細胞の検出をインビボ画像技術により達成し得、この場合、標識抗体（またはそのフラグメント）を被験体に与え、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの存在を検出するもので、事前に任意の組織試料を採取する必要がない。このようなインビボ検出手順は、他の検出方法より侵襲性が少なく、しかも、脳組織など、患者から容易に採取し得ない組織中の影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの存在を検出し得るという利点がある。
当業者に公知の多くの異なるインビボ標識および標識方法がある。本発明で使用され得る標識のタイプの例には、放射性同位元素および常磁性同位体が挙げられる。当業者には、本発明で使用される抗体に結合するために適切な他の標識が公知であり、あるいはルーチンの実験を使用して、これを確認し得る。さらに、これらの標識の抗体への結合は、当業者に普通の標準的技法を使用して行われ得る。
診断インビボイメージングについて、利用可能な検出装置のタイプは、所定の放射性核種を選択することにおける主要な因子である。選択された放射性ヌクレオチドは、所定のタイプの装置に検出可能である崩壊のタイプを有さなければならない。一般に、診断イメージングを可視化する任意の従来の方法が、本発明に従って利用され得る。例えば、ポジトロン放出断層撮影法（PET）、γ、β、および磁気共鳴画像（MRI）検出器が、診断イメージングを可視化するために使用され得る。
本発明に有用な抗体はまた、インビボ診断の目的で常磁性同位体で標識され得る。磁気共鳴画像（MRI）におけるような特に有用である元素には、157Gd、55Mn、162Dy、および56Feが挙げられる。本発明に有用な抗体（またはそのフラグメント）はまた、体組織、体液（例えば、CSF）、または細胞抽出物において影響を受けたまたは受けないペプチドの存在を検出するために、インビトロイムノアッセイにおける使用に特に適切である。このようなイムノアッセイでは、抗体（または抗体フラグメント）は、液相で、または好ましくは、上記のように、固相キャリアに結合した液相で有用であり得る。
インサイチュ検出は、患者から組織学的標本を取り出すこと、およびこのような標本に本発明の標識された抗体の組み合わせを提供することによって完了され得る。抗体（またはフラグメント）は、好ましくは、生物学的試料に標識された抗体（またはフラグメント）を適用することによってまたは上張りすることによって提供される。このような手順の使用によって、影響を受けたまたは受けないペプチドの存在だけでなく、検査される組織における影響を受けたまたは受けないペプチドの分布も決定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、広範な種々の組織学的方法（例えば、染色手順）のいずれかが、このようなインサイチュ検出を達成するために改変され得ることを、容易に認識する。本明細書中で使用される場合、有効量の診断試薬（例えば、抗体または抗体フラグメント）は、所望の診断識別を達成し得るものであり、そして被験体の年齢、症状、性別、疾患の程度、反体の前兆(counter-indication)、あるならば、および主治医によって判断されるべき他の変動のような因子に依存して変化する。診断試験に代表的に使用されるこのような物質の量は、一般的に、0.01と５mgとの間、および好ましくは0.1と0.5mgとの間である。本発明のアッセイはまた、理想的には、キットの調製に適切である。このようなキットは、バイアル、チューブなどのような１つ以上の容器手段とともに厳しい制限で受けるために区分されるキャリア手段を含み得、この容器手段のそれぞれは、イムノアッセイの別々のエレメントを含む。
例えば、固相支持体に固定された第１抗体を含む容器手段、および溶液中に第２の検出可能に標識された抗体を含むさらなる容器手段があり得る。さらなる容器手段は、検出されるべき影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドの連続希釈を含む標準溶液を含み得る。影響を受けたまたは受けないペプチドの標準溶液は、横軸にプロットした影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドの濃度と、縦軸の検出シグナルとの、標準曲線を作製するために使用され得る。影響を受けたまたは受けないペプチドを含む試料から得た結果は、影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドの濃度を与えるために、このようなプロットから内挿され得る。
本発明のアッセイはまた、理想的には、キットの調製に適切である。このようなキットは、バイアル、チューブなどのような１つ以上の容器手段とともに厳しい制限で受けるために区分されるキャリア手段を含み得、この容器手段のそれぞれは、イムノアッセイの別々のエレメントを含む。
例えば、固相支持体に固定された第１抗体を含む容器手段、および溶液中に第２の検出可能に標識された抗体を含むさらなる容器手段があり得る。さらなる容器手段は、検出されるべき影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドの連続希釈を含む標準溶液を含み得る。影響を受けたまたは受けないペプチドの標準溶液は、横軸にプロットした影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドの濃度と、縦軸の検出シグナルとの標準曲線を作製するために、使用され得る。影響を受けたまたは受けないペプチドを含む試料から得た結果は、影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドの濃度を与えるために、このようなプロットから内挿され得る。
診断スクリーニング。以下の議論は特にヒト患者に関するが、技法はまた、少なくとも１つの影響を受けたまたは受けないペプチドを発現する任意の動物に適用可能であることが、理解されるべきである。本発明の診断およびスクリーニング方法は、家族歴に基づく影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドの変化した発現レベルに関連する疾患を発生する危険性がある疑いのある患者、あるいは影響を受けたまたは受けないペプチド関連疾患を診断することが所望される患者に、特に有用である。
本発明によれば、このようなスクリーニングの必要な個体の前兆スクリーニングは、現在、本発明の影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドタンパク質をコードするDNAを使用して可能である。本発明のスクリーニング方法は、個体における欠けているまたは異常な影響を受けたもしくは受けないペプチド遺伝子の存在の、出生前診断を含む前兆診断を可能にし、したがって、見解は、このような個体が影響を受けたまたは受けないペプチド関連疾患を発生するまたは発生した可能性に関する。これは、例えば、影響を受けたまたは受けないペプチド関連症状の家族歴を有する個体から、変化したまたは欠けている影響を受けたまたは受けないペプチド遺伝子のキャリアの同定について、特に価値がある。初期診断はまた、適切な時期の介在を最大にすることが所望される。
スクリーニング方法の１つの好ましい実施態様では、組織試料は、このような個体から採取され、そして(1)「正常な」影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチド遺伝子の存在；(2)影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドmRNAの存在；および／または(3)影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドタンパク質の存在について、スクリーニングされる。正常ヒト遺伝子は、例えば、本発明で教示された影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチド配列（またはその機能的フラグメント）に対して調製されたDNAプローブを使用して、「正常な」DNA対患者のDNAでの制限切断パターンの検出（RFLP分析を含む）に基づいて特徴づけられ得る。同様に、影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドmRNAは、特徴づけられ、そして、同様のプローブを使用して、影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチド関連疾患を発生する危険性のないヒト集団で見られるような、正常な影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドmRNA(a)レベルおよび／または(b)サイズと比較され得る。最後に、影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドタンパク質は、影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチド活性についての生物学的アッセイを使用して、あるいは免疫学的アッセイおよび影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチド抗体を使用して、(a)検出および／または(b)定量され得る。影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドタンパク質をアッセイする場合、免疫学的アッセイは、そのスピードについて好ましい。(1)異常な影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドDNAサイズパターン、および／あるいは(2)異常な影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドmRNAサイズもしくはレベル、および／あるいは(3)異常な影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドタンパク質レベルは、患者が、影響を受けたまたは受けないペプチド関連疾患を発生する危険があることを示す。
本発明のスクリーニングおよび診断方法は、完全な影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドDNAコード配列がプローブについて使用されることを必要としない。むしろ、正常または罹患した個体からのDNA調製物中の影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチド遺伝子の存在、このような遺伝子またはこのような遺伝子の変化した物理的特性（例えば、電気泳動移動パターンの変化）の不在を検出するために十分である、核酸のフラグメントまたは長さを使用することのみ必要である。
出生前診断は、所望の場合、羊水穿刺、絨毛膜絨毛サンプリング（CVS）、および胎児検査（fetoscopy）を含む、胎児細胞を得るための任意の公知の方法を使用して、行われ得る。出生前染色体分析は、正常な影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチド遺伝子を有する染色体の部分が、ヘテロ接合体状態で存在するか否かを決定するために使用され得る。
同定されたタンパク質を使用する薬物スクリーニングならびに診断剤および／または治療剤との関連。本発明の診断または治療の影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチド調節薬剤またはリガンドは、核酸、化合物、タンパク質、元素、脂質、抗体、糖類、アイソトープ、炭水化物、イメージング剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、検出可能プローブ、および抗体またはそのフラグメント、あるいはそれらの任意の組み合わせから選択された少なくとも１つであり得るが、これに限定されず、これは、本明細書に記載のように、抗体を標識することについては検出可能に標識され得る。このような標識には、酵素標識、放射性同位元素または放射性化合物または元素、蛍光化合物または金属、化学発光化合物、および生物発光化合物が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、任意の他の公知の診断または治療剤が、本発明の方法で使用され得る。
本発明で使用される治療剤は、特定の細胞タイプ、細胞の群（必ずしも隣接しない）、または循環タンパク質複合体としての標的細胞に対する治療効果を有し得、この効果は、以下から選択されるが、これらに限定されない：欠損遺伝子またはタンパク質を修正すること、薬物作用、毒性効果、増殖刺激効果、増殖阻害効果、代謝効果、カタボリック効果、アナボリック効果、神経液効果、細胞分化刺激効果、細胞分化阻害効果、神経調節効果、多能性幹細胞刺激効果、および本発明に従って薬学的投与によってまたは送達ベクターによって標的細胞に送達される治療剤によって提供され得る特定の細胞タイプの細胞において、少なくとも１つの影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドを調節する任意の他の公知の治療効果。
治療剤としての治療核酸は、標的細胞における以下の治療効果の少なくとも１つを有し得るが、これらに限定されない：DNA配列の転写を阻害すること；RNA配列の翻訳を阻害すること；RNAまたはDNA配列の逆転写を阻害すること；タンパク質の翻訳後修飾を阻害すること；DNA配列の転写を誘導すること；RNA配列の翻訳を誘導すること；RNAまたはDNA配列の逆転写を誘導すること；タンパク質の翻訳後修飾を誘導すること；RNAとしての核酸の転写；タンパク質または酵素としての核酸の翻訳；および治療核酸の構成的または一過性発現のために標的細胞の染色体に核酸を組み込むこと。
治療核酸の治療効果には、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：アンチセンスRNAまたはDNAのような、欠損遺伝子を遮断すること(turnning off)またはその発現を加工処理すること(processing)；ウイルス複製または合成を阻害すること；治療タンパク質をコードする異種核酸を発現することまたは欠損タンパク質を修正することとしての遺伝子治療；RNA（例えば、hnRNA、mRNA、tRNA、またはrRNA）の欠損または過小発現を改変すること；薬物またはプロドラッグ、あるいは影響を受けたタンパク質またはペプチドを発現する病理学的または正常細胞における薬物またはプロドラッグとしての化合物を生成する酵素をコードすること；および任意の他の公知の治療効果。
病原性細胞への送達のための任意の公知の毒素、プロドラッグ、または遺伝子薬物をコードするあるいは治療効果を提供する本発明の治療核酸はまた、病原性の影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチド含有細胞に特異的な組織特異的転写調節配列（TRS）の制御下に遺伝子を含み得る。このようなTRSは、公知の方法に従って、標的細胞での治療剤の発現をさらに限定する。
本発明の薬剤またはリガンドを調節するこのような影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチド、およびその方法の、限定されない例には、影響を受けたまたは受けないタンパク質またはペプチドに対する抗体または抗イディオタイプ抗体、センスまたはアンチセンス核酸などが挙げられる。
影響を受けたペプチドアンタゴニストは、特定の細胞タイプまたは器官に関連する病理、あるいは少なくとも１つの天然に存在する影響を受けたまたは受けないペプチドの発現の異常に高いレベルに関連する病理を処置するために使用され得、ここで影響を受けたまたは受けないペプチドアンタゴニストはまた、少なくとも１つの影響を受けたまたは受けないペプチドを阻害し、あるいは病理は、影響を受けたまたは受けないペプチドによってある程度まで媒介される。このような病理には、炎症性疾患、神経変性(neurodegerative)疾患、および免疫系関連疾患、ならびに当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載の他の疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
炎症性疾患には、慢性炎症性病理および血管炎症性病理が挙げられ得るが、これらに限定されない。慢性炎症性病理には、サルコイドーシス、慢性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、およびクローン病が挙げられるが、これらに限定されず、そして血管炎症性病理には、汎発性血管内凝固症候群、アテローム性動脈硬化症、および川崎病が挙げられるが、これらに限定されない。
神経変性疾患には、脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症および急性横断脊髄炎）；過運動性障害（例えば、ハンチントン舞踏病および老人舞踏病）；運動機能減少障害（例えば、パーキンソン病）；進行性核上麻痺；脊髄小脳変性（例えば、脊髄性運動失調症、フリードライヒ運動失調）；多発系変性（Mencel、Dejerine-Thomas、Shi-Drager、およびMachado-Joseph）；および全身性障害（レフサム病、無βリポタンパク質血症、運動失調、毛細管拡張症、およびミトコンドリア多系障害）；脱髄性コア障害（例えば、多発性硬化症、急性横断性脊髄炎）；運動単位の障害（例えば、神経原性筋萎縮（前角細胞変性、例えば、筋萎縮側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮、および若年性脊髄性筋萎縮））；またはその任意のサブセットが挙げられるが、これらに限定されない。
影響を受けたタンパク質またはペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、少なくとも１つの影響を受けたペプチドの発現の異常に低いまたは高いレベルに関連する病理を処置するために使用され得、ここで影響を受けたペプチドアゴニストまたはアンタゴニストはまた、それぞれ少なくとも１つの影響を受けたペプチドを増強または阻害する。このような病理には、神経変性疾患、腸神経系の機能不全による胃腸管の疾患（例えば、結腸炎、回腸炎、炎症性腸症候群）；心臓血管系の疾患（例えば、高血圧およびうっ血性心不全）；交感神経および副交感神経支配に関連する性尿器管の疾患（例えば、良性前立腺過形成、陰萎）；神経筋系の疾患（例えば、筋ジストロフィー、多発性硬化症、癲癇）、および内分泌系の疾患（例えば、糖尿病）が挙げられるが、これらに限定されない。
ここで本発明を一般的に記載すると、このことが、例示によって提供される以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、そして特に記載がなければ、本発明の限定を意図しない。
実施例
実施例１：ゲル画像分析
実施例1A。実施例によって、３匹の個々のラットのような、３匹の異なる動物が、３つの異なる血圧を有する理由を同定することが所望され得る。３匹の異なる動物からの動脈血についての2-DGEゲル画像を比較する。ゲルを、その発現で変化し、そして動物における血圧と統計学的に相関し得るタンパク質を捜すために比較する。統計学的分析のタイプは、直線回帰である。動物の血圧と比較した各スポットの発現の直線回帰を行う。
実施例1B。他の実施例として、ゲル画像の１つの群は、島のような正常または未処理の細胞に関連し得る。ゲル画像の第２の群は、インターロイキン（IL)-1βで処理された細胞のような、処理された細胞に関連し得る。ゲル画像の各セットにおける各スポットの統計学的平均を計算する。ゲル画像の第１のセットにおける各スポットの統計学的平均を、統計学的に異なるかどうかを決定するために、ゲル画像の第２のセットにおける各スポットの統計学的平均と比較する。このように、オペレーターは、どのタンパク質がIL-1β処理によって変化（アップまたはダウンレギュレートのいずれか）するかを迅速かつ容易に決定し得る。
実施例1C。さらに他の実施例として、画像の１つの群は、正常ラットに関連し、そして画像の他の群は、糖尿病ラットに関連し得る。目的は、２つの群間の差を見いだすことである。ゲル画像を２つのセットに分割する：正常ラットについてはゲル画像の第１のセット；および糖尿病ラットについてはゲル画像の第２のセット。分析を、正常と糖尿病ラットとの間のタンパク質発現における差を決定するために、処理および未処理島について上記と同様の様式で行う。
実施例２：ラット島におけるタンパク質発現のインターロイキン-1DF誘導した
変化：コンピューター処理化データベース
要約
膵臓島タンパク質の２次元（2-D）ゲル電気泳動は、インスリン依存性糖尿病の分子病原論の研究を容易にする重要なツールであり得る。インスリン依存性糖尿病は、ランゲルハンス島のβ細胞の自己免疫破壊によって引き起こされる。サイトカインのインターロイキン1βはインスリン放出を阻害し、そして単離された膵臓のラット島におけるβ細胞に対して選択的に細胞傷害性である。抗原誘発免疫応答、ならびにインターロイキン1β媒介β細胞細胞傷害性の作用の細胞内メカニズムは、公知ではない。しかし、これまでの研究は、タンパク質合成の変化に関連することを見いだしている。したがって、島タンパク質の2-Dゲル電気泳動は、1)β細胞の免疫破壊を開始する一次抗原の同定、2)サイトカインによって誘導される特定の島タンパク質の定性および定量的変化の決定、および3)サイトカイン作用を調節する薬剤の効果の決定に至る。したがって、この研究の目的は、標準化された培養条件下で標識された、新生仔ラット島における10％および15％アクリルアミド2-Dゲル（10％および15％DB）上のすべての再生可能な検出可能なタンパク質スポットのデータベースを生成することであった。1792スポットが、15％DBにおける５つのゲルのうちの５つに存在したが、1373スポットが、10％DBにおける５つのゲルのうちの５つに存在し、75.2％と91.7％との間の定性的再生性を得た。両方のDBでは、すべてのゲルに存在するスポットについての積分した光学密度のパーセントの変動の平均係数（％IODのCV％）は、42.4％と45.7％との間であった。同じ試料を、異なる日に、ゲルの連続セットで分析した場合（アッセイ間分析）、％IODの平均CV％は、35.3％〜36.1％であった。同じ試料をゲルの１つのセットで繰り返して分析した場合（アッセイ内分析）、％IODの平均CV％は、IEFゲルでは30.2％であったが、％IODの平均CV％は、NEPHGEゲルでは変わらなかった（45.7％）。IL-1βによって発現が変化したタンパク質を区別するために10％DBにアプライすると、105の現在未同定のタンパク質スポットは、IL-1βによってアップ／ダウンレギュレートまたは新規合成されることを見いだした。結果として、本発明者らは、ランゲルハンスの新生仔ラット島の第１の10％および15％アクリルアミド2-Dゲルタンパク質データベースを示し、そしてIL-1βによって発現が変化したタンパク質を同定するための利用を証明する。
序論
サイトカインのインターロイキン1βは、インスリン放出を阻害し、そして単離された膵臓ラット島においてβ細胞に対して選択的に細胞傷害性である（Mandrup-Poulsen, T, Diabetologia 印刷中 (1996)）。活性タンパク質合成は、サイトカインのような侵襲後のβ細胞破壊、防御、および修復の重要な部分である。遊離ラジカル一酸化窒素（NO）は、島α細胞におけるサイトカインの有害な効果の重要なメディエーターであることが証明されている（Southernら, FEBS. Lett. 276:42-44 (1990)；Welshら, Endocrinol. 129:3167-3173 (1991)；Corbettら, J. Biol. Chem. 266:21351-21354 (1991)）。したがって、NO産生のための基質のL-アルギニンのアナログは、インターロイキン1β（IL-1β）の有害な効果を抑制し（Southernら, FEBS. Lett. 276:42-44 (1990)；Welshら, Endocrinol. 129:3167-3173 (1991)；Corbettら, J. Biol. Chem. 266:21351-21354 (1991)）、そしてサイトカイン誘導性イソ型のNOシンターゼ（iNOS）についてのmRNAは、β細胞でIL-1βによって誘導されるがα細胞では誘導されない（Corbettら, J. Clin. Invest. 90:2384-2391 (1992)）。本発明者らは、最近、新生仔ラット島からiNOSをクローニングし、そして２次元（2-D）ゲル上の一連のスポットとして、おそらくリン酸化したイソ型としての組換えiNOSの発現を証明し、131kDaの予測分子量および6.8〜7.0の範囲のpI値を有する（Karlsenら, Diabetes 44:753-758 (1995)）。
さらに、タンパク質合成のインヒビターは、島機能におけるIL-1βの阻害効果をブロックし（Hughesら, J. Clin. Invest. 86:856-863 (1990)）、新たなタンパク質合成がIL-1βの有害な効果に必要であることを示す。IL-1βはまた、熱ショックタンパク質（HSP）HSP32（ヘムオキシゲナーゼ）およびHSP70の合成を誘導し（Helqvistら, Acta Endocrinol. (Copenh.) 121:136-140 (1989)；Helqvistら, Diabetologia 34:150-156 (1991)；Welshら, Autoimmunity 9:33-40 (1991)）、細胞性ストレスに対する防御および細胞修復において役割を果たすことが公知である（Kaufmann, Immunol. Today 11:129-136 (1990)）。さらに、IL-1βは、島における45、50（Hughesら, J. Clin. Invest. 86:856-863 (1990)）、75、85、95、120kDa（Welshら, Autoimmunity 9:33-40 (1991)）の分子量を有する多くの未知タンパク質の合成を阻害する。2-Dゲル電気泳動を使用して、本発明者らは、最近、IL-1βが、新生仔ラット島においてそれぞれ29および３タンパク質をアップおよびダウンレギュレートすることを証明した。
内分泌島細胞は、β細胞破壊およびおそらく生存に重要な役割を果たし得る。島細胞の分散およびソーティングは、タンパク質合成パターンに影響を及ぼし得る潜在的に有害な手順である。選択した島細胞材料の不利点は、他の細胞からの合成によって希釈されるので、１つの細胞タイプにおけるタンパク質発現の何らかの変化が、より小さいようであることである。
したがって、この研究の目的は、スポット検出再現性を決定すること、およびすべての(３５S)-メチオニン標識した島タンパク質データベーススポットについて積分した光学密度の割合の変動（％IODのCV％）の係数を算出することであった。さらに、発明者らは、スポットの％IODの総CV％に対するゲル調製のアッセイ内およびアッセイ間変動の寄与を研究する必要があった。最後に、発明者らは、コンピュータ分析によって島タンパク質パターンのIL-1β誘導した変化の数を規定する必要があった。
材料および方法
試薬。DMEM、RPMI 1640、およびハンクス平衡化塩溶液（HBSS）を、Gibco, Paisley, Scotlandから購入した。RPMI 1640に、20mM HEPES緩衝液、100,000 IU/Iペニシリン、および100mg/Lストレプトマイシンを補充した。標準の組換えヒトIL-1βは、Novo Nordisk Ltd. (Bagsvaerd, Denmark)によって提供された。比活性は、400 U/ngであった（Moelvigら, Scand. J. Immunol. 31:225-235 (1990)）。以下の他の試薬を使用した：2-メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン（BSA）、Tris HCl、Tris塩基、グリシン（Sigma, St. Louis USA）；トリクロロ酢酸（TCA）、リン酸、NaOH、グリセロール、n-ブタノール、ブロモフェノールブルー（Merck, Darmstadt, Germany）；(３５S)-メチオニン（SJ 204, 比活性：＞1.000 Ci/mmol、0.1％ 2-メルカプトエタノールを含む）、Amplify(R)（Amersham International. Amersham, UK）；フィルター（HAWP 0.25μm孔サイズ）（Millipore, Boston, USA）；RNA'se A、DNA'se I（Worthington, Freehold, NJ, USA）；尿素（超純粋）（Schwarz/Mann, Cambridge, MA, USA）；アクリルアミド、ビスアクリルアミド、TEMED、過硫酸アンモニウム（BioRad, Richmond, CA, USA）；両性電解質：pH 5-7、pH 3.5-10,pH 7-9、pH 8-9.5（Pharmacia, Uppsala, Sweden）；Nonidet P-40（BDH, Poole, UK）；両性電解質：pH 5-7およびドデシル硫酸ナトリウム（Serva, Heidelberg, Germany）；アガロース（Litex, Copenhagen, Denmark）；エタノール（無水96％）（Danish Distillers, Aalborg, Denmark）；メタノール（Prolabo, Brione Le Blanc, France）；酢酸（技術品質、
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RP-2）（AGFA）。
島単離および培養。データベースおよびアッセイ変動実験について、12の異なる島単離を行い、データベースについては10、アッセイ内分析については１、およびアッセイ間分析については１で行った。IL-1βに関する研究については、３つのさらなる島単離を行った。
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の膵臓からの島を、コラゲナーゼ消化後に単離した(Brunstedt, Larner, J, Polh, S.L.(編), Methods In Diabetes Research, 1巻 (Laboratory methods, Part C). Wiley & Sons, New York, 254-288頁(1984)）。RPMI 1640＋10％ウシ胎児血清中での４日間のプレ培養後、150島を、300μl RPMI 1640＋0.5％正常ヒト血清（NHS）中で24時間インキュベートした。別のシリーズの実験では、150個の島を、150pg/ml IL-1βの添加ありまたはなしで、300μl RPMI 1640＋0.5％NHS中で24時間インキュベートした。
島標識。培養の24時間後、150個の島細胞を採取し、HBSSで２回洗浄し、そしてアミノ酸および200μCi(３５S)-メチオニンについて透析した10％NHSを含む200μlのメチオニン非含有ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で４時間標識した。2-メルカプトエタノールを除去するために、(３５S)-メチオニンを、標識前に少なくとも４時間凍結乾燥した。標識後、計数をHBSSで３回洗浄し、ペレットにし、そして−80℃で凍結した。
試料調製。凍結した島を、100μl DNAse I/RNAse A溶液に再懸濁し、そして２回凍結融解することによって溶解した。２回目の融解後、核酸の消化のために30分間氷上に放置した。次いで、溶解した試料を一晩凍結乾燥した。試料を、最大４時間120μl溶解緩衝液（8.5M 尿素、２％Nonidet P-40、５％ 2-メルカプトエタノール、および２％両性電解質pH範囲7-9）中で振盪することによって溶解した。
(３５S)-メチオニン組込みの決定。(３５S)-メチオニン組込みの量を、各試料の1:10希釈の５μlにキャリアとして10μg BSA（0.2μg/ml H２O）を、次いで0.5mlの10％TCAを添加することによって、二連で定量した。これを、0.25μmフィルターを通して濾過する前に、40℃にて30分間沈殿させた。HAWPフィルターを乾燥し、そして計数のためにシンチレーション液に入れた。
2-Dゲル電気泳動。手順は、本質的に、O'Farrellら, Cell 12:1133-1142 (1977)およびFey, S.J.ら, The protein variation in basal cells and certain basal cell related benign and malignant diseases, Faculty of Natural Science, University of Aarhus, Denmark (1984)に記載のとおりであった。簡単にいえば、第一次元ゲルは、４％アクリルアミド、0.25％ビスアクリルアミド、および両性電解質（実際の比はバッチに依存する）を含み、そして175mm長および1.55mm直径であった。各試料の計数の等しい数（10６cpm）を、ゲルにアプライした。より低い量の放射活性の場合、比較できる総光学密度を得るようにゲルの曝露時間を調節する必要があった。試料を、等電点フォーカシング（IEF；pH 3.5-7）および非平衡pHグラジエント電気泳動（NEPHGE；pH 6.5-10.5）ゲルの両方で分析した。IEFゲルを、140μA/ゲル（限界電流）で約４時間プレフォーカシングし、次いで、試料をアプライし、そして1200V（限界電圧）にて18時間フォーカシングした。NEPHGEゲルを、限界パラメータとして140μA/ゲルおよび1200Vを使用して約6.5時間フォーカシングした。
第二次元ゲルは、１mm厚、200mm長、および185mm幅であり、これは15％アクリルアミドおよび0.75％ビスアクリルアミド、または10％アクリルアミドおよび0.05％ビスアクリルアミドのいずれかを含み、そして一晩流した。電気泳動後、ゲルを、45％エタノールおよび7.5％酢酸中で45分間固定し、そして乾燥前に45分間Amplify(R)で蛍光画像法で処理した。ゲルを、Ｘ線フィルムと接触して置き、そして−70℃で１〜40日間曝露した。各ゲルを、少なくとも３倍の期間曝露して、Ｘ線フィルムのダイナミックレンジ（dynamic range）の欠乏を補った。
分子量およびpIの決定。タンパク質の分子量を、標準ゲルとの比較によって決定した（Fey, S.J.ら, The protein variation in basal cells and certain basal cell related benign and malignant diseases, Faculty of Natural SCience, University of Aarhus, Denmark (1984)）。ゲル上の個々のタンパク質のpIを、pI較正キットの使用によって決定した。目標タンパク質を、以下の技法の１つまたはいくつかによってゲルで同定した：免疫ブロッティング、免疫沈降法、マイクロ配列決定、またはペプチドマッピング。
実験設計。研究は、３つの異なるシリーズの分析を含んだ：データベース分析、アッセイ内分析、およびアッセイ間分析。各分析について、IEFおよびNEPHGEゲルを、第二次元で10％および15％アクリルアミドを使用して流した。これは４つの亜群を提供した：10％IEF；15％IEF；10％NEPHGE；15％NEPHGE。10％アクリルアミドゲルでは、検出のおおよそのMW範囲は20と250kDaとの間であったが、15％アクリルアミドゲルでの検出のおおよその範囲は６と125kDaとの間であった。結果として、20と125kDaとの間のMWを有するタンパク質は両方のデータベースに含まれるが、より低いおよびより高いMWを有するタンパク質は、それぞれ15％および10％DBに特定された。10％および15％DBの比較は、10％IEFおよびNEPHGE亜群の両方で検出可能なスポットのより低い数を示した（結果を参照のこと）。結果として、アッセイ内およびアッセイ間分析（以下を参照のこと）を、15％IEFおよびNEPHGEゲルでのみ行った。
データベースは、ゲルの１つのセットにおいて分析した10の異なる単離物に基づいた。2-Dゲル電気泳動後、最良の技術的品質および比較可能な光学密度を有する５つのゲルを、コンピュータ分析のために選択した。コンピュータ分析前に、各亜群における１つのゲルを、他の４つのデータベースゲル、５つのアッセイ内ゲル、および５つのアッセイ間ゲルでの比較のために使用した「マスターゲル」であるために任意に選択した（図４）。データベース「マスターゲル」を、アッセイ内およびアッセイ間分析についてマスターとして使用して、所定のスポットが、３つのシリーズの分析において同じ適合数を有することを確実にした。「マスターゲル」からのデータは、データベース分析にのみ含まれる。「マスターゲル」は、すべての４つの亜群における同じ単離物からであるが、４つの他のデータベースゲルを生じる単離物の同定は、亜群から亜群までわずかに変化した（表３）。
アッセイ内分析について、同じ試料の10ゲルを、１つのセットのゲルで分析した。2-Dゲル電気泳動後、最良の技術的品質および比較可能な光学密度を有する５つのゲルを、コンピュータ分析のために選択した（表３）。
アッセイ間分析について、同じ試料を、異なる日に10の連続したセットのゲルで分析した。2-Dゲル電気泳動後、最良の技術的品質および比較可能な光学密度を有する５つのゲルを、コンピュータ分析のために選択した（表３）。
IL-1βによって発現が変化したタンパク質同定について、これまでに可視的に分析された(Andersenら, Diabetes 44:400-407 (1995)）、IL-1β曝露した島の10％IEFおよびNEPHGEゲルを、10％IEFおよびNEPHGE DBに適合させた。
蛍光画像のコンピュータ分析。コンピュータ分析を、SunsparcワークステーションでBioImage(R)プログラム（バージョン 4.6M）を使用して行った。第１に、蛍光画像をスキャンし、そしてスポットを同定し、そしてBioImage(R)プログラム, BioImage, Ann Arbor, MA, USAによって定量した。次に、各非マスターゲルを、「マスターゲル」と比較し、そしてコンピュータプログラムによって最初に見いだされないスポットの同定および定量を確実にするために手動で編集した。この比較を、BioImage(R)プログラムを使用して同じ観察者（H.U.A.）によって行った。これに続いて、ゲルをBioImage(R)プログラムによって適合させ、そして適合の正確性を検査し、そして同じ観察者によって修正した。最後に、データを、Quattro Pro(R)スプレッドシート（Borland バージョン 4.0）での算出について抽出した。
IEFおよびNEPHGE亜群における２連のスポットの存在を避けるために、IEFゲルの塩基性部分またはNEPHGEゲルの酸性部分のいずれかでの重複スポットを、データベースおよびアッセイ分析において分析から省いた。
統計学的分析。２つの異なる分析を適用して、IL-1βによって発現が変化したタンパク質を区別した。第１の分析では、変化は、IL-1β曝露したゲルにおけるスポットの平均％IODが、DBにおける同じスポットの平均％IOD±2SDよりも高いか低いかどうかの有意性を考慮した。２つの群間の第２の比較では、スチューデントt検定を適用し、そしてP＜0.01を有意のレベルとして選択した。
新生児ラット島タンパク質データベースおよびアッセイ分析の定性的再現性。1293〜1411（IEF）および605〜764（NEPHGE）スポットを、15％DBを構築するために使用された個々のゲルで見いだしたが、1101〜1200（IEF）および462〜577（NEPHGE）スポットを、10％DBについて使用したゲルで見いだした（表４および５）。図５は、10％IEFおよびNEPHGE DBの「マスターゲル」を示す。全体で、1792スポットが、15％DBにおける５つのゲルのうちの５つに存在したが、1373スポットが10％DBにおける５つのゲルのうちの５つに存在し、75.2％（NEPHGE10％）と91.7％（IEF15％）との間の亜群における定性的再現性（５つのゲルのうちの５つで見られるスポットの割合の平均）を得た（表４および５）（５つのゲルのうちの５つに存在する各スポットについて、データベースは、スポット適合数、５つの個々のスポットについての％IOD、平均％IOD、％IODの標準偏差、％IODのCV％、MW、およびpIからなる）。ゲルの再現性を図6A〜Hに示し、これはIEF10％DBにおける５つのゲルの拡大した領域を示す。
表４および５に示すように、個々のゲルにおけるスポットの総数ならびに５つのゲルのうちの５つに存在するスポットの数および割合は、15％DBにおけるよりも10％DBでより少なかった。しかし、データベースを、５つのゲルのうちの少なくとも３つに存在するスポットを含ませるために拡張する場合、存在するスポットの割合の差は、２つのデータベース間で見られなかった（IEF：15％：98.8±1.2；10％：97.4±1.5；NEPHGE：15％：94.8±5.7；10％：94.1±3.5、表４および５）。両方のデータベースでは、５つのゲルのうちの５、４、３、または２つに存在するスポットの割合は、IEFゲルにおけるよりもNEPHGEゲルでより低かった（表４および５）。５つ未満のゲルに存在するスポットの空間的位置を図7A〜Dで研究し、スポットが１、２、３、または４つのゲルに存在するかどうかに依存して、スポットがゲルの特定の領域で群にならないことを示した。
検出可能なスポットの数がこのデータベースにおいてより高かったので、アッセイ内およびアッセイ間分析を、15％ゲルでのみ行った。両方の分析で、個々のゲルにおけるスポットの数ならびに５つのゲルのうちの５つに存在するスポットの数および割合は、15％DBと比較してわずかに(9%〜19％）減少した（表４および６を比較する）。
新生児ラット島タンパク質データベースおよびアッセイ分析の定量的再現性。定量的再現性を、５つのゲルのうちの５つに存在する各スポットについての％IODのCV％の平均として規定した。データベースについて、平均CV％は、ゲルの10％および15％IEFおよびNEPHGE亜群の両方において比較可能なレベル（42.4％〜45.7％）であった（表７）。すべてのDB亜群について、CV％は、3.0％と167.9％との間の範囲であった（表７）。低い、中程度、および高いCV％を有する10％IEF DBスポットを、図8A〜Dに示す。アッセイ間分析については、平均CV％は、IEFおよびNEPHGEゲルの両方について35.5％〜36.1％であったが、平均CV％は、IEFゲルのアッセイ間分析では30.2％、およびNEPHGEゲルについては45.7％であった。
その後、すべてのゲルに存在するデータベーススポットを、％IODのCV％の増加する順に並べ、４つのすべてのデータベース亜群におけるスポットについて類似のシグモンド形状曲線を得た（図9A〜D）。したがって、スポットの30％は、29.7％〜32.5％よりも低いCV％を有し、スポットの50％は、37.8％〜42.8％よりも低いCV％を有し、スポットの90％は、68.4％〜80.6％よりも低いCV％を有した（図9A〜D）。曲線のスロープは、最も高いCV％を有する５％〜10％スポットが、％IODの平均CV％に有意に寄与することを示す（図9A〜D）。これは、データベース亜群の中央値が、亜群の平均値よりも2.3％〜5.5％低いという事実によって支持される（表７）。
データベース亜群における各スポットについての平均％IODと％IODのCV％との間の回帰分析。NEPHGE10％および15％DB亜群において、最高の平均IOD％を有する10スポットのうちのそれぞれ２および６を、最低のCV％を有するパーセント点で見いだした（上を参照のこと）。最高の平均IOD％を有する10スポットのうち、IEF DB亜群におけるこのパーセント点で見いだされるものはなかったが、回帰分析を、相互関係がスポット平均％IODとCV％との間に存在するかどうかを研究するために行った。回帰分析は、有意な負の相互関係がこれらの２つのパラメータ間に存在することを示した（範囲：p＝0（IEF 10％）〜p＝0.00288（IEF 15％）、図9A〜D）。しかし、R２値がすべての亜群について非常に低いので（範囲：R２＝0.0072（IEF 15％）R２＝0.0317（IEF 10％）、図9A〜D）、CV％の変動の大多数は、平均％IODの変動によって説明されない。図9A〜Dでは、所定の亜群におけるすべてのスポットの回帰線は、挿入図として示されるが、主図は、０と１％IODとの間の間隔でのすべてのスポットの96.8％〜99.1％を含む回帰線を示し、これは、回帰線が、ほとんどのスポットを含む％IODの間隔でほとんど水平であることを示す。
IL-1βによって発現が変化したタンパク質を区別するための10％IEFおよびNEPHGE DBの適用。最近の論文において、本発明者らは、IL-1βが、新生児ラット島タンパク質の2-Dゲルにおいてそれぞれ29および４タンパク質をアップおよびダウンレギュレートすることを示した（Andersenら, Diabetes 44:400-407 (1991)）。10％ゲルを、本研究と類似の条件下で培養した(３５S)-メチオニン標識したWistar Furth新生児ラット島から調製した。結果として、ラット島10％IEFおよびNEPHGE DBを、これまでの論文で可視的に分析された、IL-1β曝露した島のコンピュータ分析したゲルとの比較のために使用した（Andersenら, Diabetes 44:400-407 (1991)）。（可視分析における有意なアップまたはダウンレギュレーションについての基準と比較可能な）カットオフレベルとして各DBスポットのIOD％の±2SDを使用して、10％DBとの比較は、これらの変化のうちの32を確認し、そして予測どおりにいくつかの新しいタンパク質変化を同定した。したがって、 IL-1βによって、合計183スポットがアップレギュレートし、113がダウンレギュレートし、そして34が新たに合成された（結果は示さず）。スチューデントt検定におけるカットオフレベルとしてp＜0.01を使用した場合、最終分析は、 IL-1βによって、52スポットをアップレギュレートし、47をダウンレギュレートし、そして６を新たに合成し、これらのうちの13が可視分析によって選択された33スポットに含まれることを示した。
論考：
この研究では、本発明者らは、新生児ラットのランゲルハンス島の10％および15％アクリルアミド2-Dゲルタンパク質DBを示し、これは任意の種における島またはインスリン分泌細胞の第１のタンパク質データベースを含む。1792スポットが、15％DBにおいて５つのゲルのうちの５つに存在したが、1373スポットが、10％DBにおける５つのゲルのうちの５つに存在し、75.2％と91.7％との間の定量的再現性を得た。両方のデータベースにおいて、％IODの平均CV％は、42.4％と45.7％との間であった。IL-1βによって発現が変化したタンパク質を区別するために10％DBを適用すると、105の現在未同定のタンパク質スポットを、IL-1βによってアップ／ダウンレギュレートまたは新たに合成されたことを見いだした。
新生児Wistar Furthラット島の特徴づけ。変動を減少させるために、近交系Wistar Furth系のラットを、データベースについての島ドナーとして選択した。この系は、研究室で島実験にルーチンで使用される異系交配Wistarの近交系変種である（Andersenら, Diabetes 43:770-777 (1994)）。発明者らは、これまでに、IL-1βありでまたはなしで培養したWistar Furth新生児ラット島の機能が、Wistar新生児ラット島の機能と同等であることを証明しており（Andersenら, Diabetes 44:400-407 (1995)；Andersenら, Acta Endocrinol. 120:92-98 (1989)）、そしてWistar Furth島の2-Dゲルタンパク質パターンにおけるIL-1βの効果を証明した（Andersenら, Diabetes 44:400-407 (1995)）。本データベースが、成熟ラット島ではなく新生児ラット島に基づくので、発明者らは、成熟島のタンパク質パターンが異なることを除外し得ない。しかし、異種交配Wistarラットからの成熟および新生児島は、IL-1の有害な効果に等しく感受性である。（Mandrup-Poulsenら, Diabetes 36:641-647 (1987)）。
島単離に使用された新生児ラットの各同産群は、代表的には、雄および雌の種々の頻度の８〜12子からなる。雄および雌の異種交配Wistarラットからの肝臓タンパク質のクーマシーブルー染色したゲルの比較が、250の分析したスポットのうちの７つで定量的差を示したので、そして６つのタンパク質が雄にのみそして１つのタンパク質が雌のみに見いだされたので（Steinerら, Electrophoresis 16:1969-1976 (1995)）、発明者らのデータベースにおけるタンパク質のいくつかが、性特異的であるまたは性調節されるようである。結果として、本発明者らは、雄および雌ラットからの島の別々のデータベースを構築するために選択した場合、データベース中のスポットのいくつかの高い変動が減少し得る可能性がある。しかし、肝臓タンパク質のゲルを、非培養細胞で行い、これは、６つの決定されたタンパク質変動が、循環している６つのステロイドによって誘導され得ること、および肝臓細胞自体の本来の特性によるものではないことを意味し得た。I)発明者らは実験前に４日間島をプレ培養し、そしてII)性ステロイドの血清濃度の差が発情期前には見られないので、循環ホルモンは、タンパク質のパターンを妨害しないようである。さらに、発明者らは、これまでに、雄および雌の異種交配Wistarラットからの島が、IL-1の有害な効果に等しく感受性であることを示した（Steinerら, Electrophoresis 16:1969-1976 (1995)）。
島タンパク質の検出。いくつかのスポットが他のタンパク質の改変（例えば、アセチル化、メチル化、リン酸化、またはカルバミル化）を示し得るので、発明者らのデータベースで検出されるスポットが、すべて異なるタンパク質実体ではない。しかし、タンパク質データベースは、感度限界以下のタンパク質、メチオニンを含まないタンパク質、６kDa以下または250kDa以上の分子量を有するタンパク質、あるいは3.5以下または10.5以上のpHを有するタンパク質を含まないので、スポットの検出された数は、島タンパク質の総数の過小評価である。さらに、検出限界以上のIODでのスポットの約40％は、これまでは、他のスポットによってはっきりしないので、見落とされると推定されている（Garrels, J. Biol. Chem. 264:5269-5282 (1989)）。最後に、４時間の標識期間は、高い合成速度でタンパク質を標識するのに好ましいが、より長い標識期間は、すべてのタンパク質が一定な状態であるデータベースを生じるために必要とされ得る。
定性的再現性。2-Dゲルタンパク質データベースの定性的再現性のこれまでの報告はほとんどなく、そして結果は変動的である：クーマシーブルー染色した2-Dゲルのマウス肝臓タンパク質データベースでは、826スポットがマスター画像に存在し、そして他のマウス肝臓パターンの85％では、平均500スポットが適合させた（Giomettiら, Electrophoresis 13:970-991 (1992)）。(３５S)-メチオニン標識したマウス胚のタンパク質データベースでは、４つのゲル画像のそれぞれにおいてスポットの80％以上は、標準画像に自動的に適合させた（Shiら, Molec. Reprod. Develop. 37:34-47 (1994)）。発明者らの研究では、1792スポット（75.2％〜91.7％）が15％DBにおける５つのゲルのうちの５つに存在するが、５つのゲルのうちの５つに存在するスポットの平均割合は、10％DBでは５〜10％低かった。これは、おそらく、より少ないタンパク質が、15％ゲルで分析可能の低分子量領域のみでよりも10％ゲルで分析可能な高分子量領域のみに存在するという事実による。分析したすべての群では、NEPHGEゲルの定性的再現性は、IEFゲルよりも低かった。NEPHGEゲルは、EFゲルとは逆に、非平衡ゲルなので、同一のスポットがわずかに異なる水平位置を有する危険性が増加する。しかし、発明者らのマニュアル編集は、この問題ができるだけ多く排除されることを確実にした。
定量的再現性。定量的再現性に関して、スポット同定に使用される方法は同一ではないので、他の研究との比較は困難である。さらに、これまでに公表されたデータベースのほとんどにおいて％IODのCV％の算出に含まれるスポットは、種々の基準に従って適合したスポットの総数から選択される。雄および雌Wistarラット肝臓タンパク質の10のクーマシーブルー染色したゲルでは、「マスターゲル」に存在する1,000以上のスポットのうちの250を、これまでの実験における良好な形状、サイズ、および解像、ならびに存在および良好な品質に従って選択した（Steinerら, Electrophoresis 16:1969-1976 (1995)）。これらの基準を使用して、スポットの３分の１は20％以下のCV％を有し、半分以上が30％以下のCV％を有し、そして４分の３が40％以下のCV％を有した（Steinerら, Electrophoresis 16:1969-1976 (1995)）。コンパクトになった８細胞（CEC）のマウス胚の５ゲルおよび胚盤胞段階（BS）マウス胚の４ゲルからなる(３５S)-メチオニン標識したタンパク質データベースでは、それぞれ1,674および1,653スポットが、すべてのゲルで適合した（Shiら, Molec. Reprod. Develop. 37:34-47 (1994)）。すべての適合したスポットに基づいて算出すると、これらのスポットの74％（CEC）または79％（BS）のパーセント誤差（SEM×100/平均として規定される）は、50％以下であり、そしてスポットの45％（CEC）または47％（BS）は、30％以下のパーセント誤差を有した（Shiら, Molec. Reprod. Develop. 37:34-47 (1994)）。比較については、SDのSEMへの変換（SEM＝SD/√n）は、島IEF 15％DBにおいて20.3％の平均CV％を与え、そしてスポットの97.7％および83.2％は、それぞれ50％および30％以下のパーセント誤差を有する。
本研究の定量的再現性は、マウス胚における研究に匹敵するかまたはより良好であるが（Shiら, Molec. Reprod. Develop. 37:34-47 (1994)）、本データベースにおける％IODの平均CV％は、比較的高い。既述のように、島の異種細胞群および島単離の雄／雌の比は、ゲル変動性に寄与し得た。発明者らは、匹敵する総光学密度を有するゲルを使用することを試みたが（各亜群内の最大の差は3.5の係数までであった（ゲルDB10対ゲルDB3、IEF 15％DB、表３））、Ｘ線フィルムの非直線飽和は、すべてのデータベーススポットについてのCV％のサイズに寄与する。本研究が開始された時に研究室で利用可能ではなかった技法である、ホスホイメージングの適用は、CV％の程度(magnitude)へのこの現象の寄与を減少させる。最後に、コンピュータ分析におけるスポット境界規定の電子的ノイズおよび差は、CV％の程度に寄与し得る。いくつかの他のゲル分析プログラムとは逆に、BioImage(R)プログラムは、境界規定について局所的であって全体ではないバックグラウンドを使用し、CV％に対する後者の係数の寄与を減少させる。
複製ゲルの研究。(３５S)-メチオニン標識したREF 52細胞の10の複製ゲルの研究において、Garrelsは、約2,000スポットの総数からの最も顕著なスポットの1109を選択し、そして＜５％と＞100％との間の範囲および10％と15％との間の様式値とともに、26.5％の平均CV％を見いだした(Garrels, J. Biol. Chem. 264:5269-5282 (1989)）。試料がゲルの連続または同じセットで分析されたかどうかは不明である。スポット品質に従ってスポットを群分けし（Gaussian形状に適合し、隣接スポットに重複すること）そしてすべてのゲルにおいて低密度のスポットを省く場合、最高の品質の19.1％スポットは、13.0％の平均CV％を有した(Garrels, J. Biol. Chem. 264:5269-5282 (1989)）。予測したように、％IODの平均CV％は、15％IEFおよびNEPHGEアッセイ内分析を15％IEF DBと比較した場合に減少し、減少は約９％であった。ゲル調製の日毎の変動をアッセイ内分析で排除したので、平均CV％がさらに減少することを予測した。15％ IEF亜群では、CV％がデータベースと比較して約15％減少したが、15％ NEPHGE亜群では減少が見られなかった。すべての亜群の最低の定性的再現性も有する（表４〜６）、15％NEPHGEにおけるアッセイ内亜群高い平均CV％の理由は不明である。データベースゲルはまたゲルの１つのセットで分析されたので、生物学的変動に寄与し得るCV％の画分は、所定のスポットについてのデータベースとアッセイ内分析との間のCV％の差によって得られるべきである。したがって、15％NEPHGEアッセイ内分析の結果が無視されるならば、％IODの平均CV％の約３分の１は、生物学的変動による。
島タンパク質発現におけるIL-1βの効果。IL-1βは、これまで未同定のタンパク質の発現を変化させた。島細胞における作用のIL-1βメカニズムは十分に明らかにされていないが、３つの異なる群のタンパク質が、重要な役割を果たし得る：タンパク質は、シグナル伝達に関与し、そしてタンパク質は、いわゆる初期応答および後期応答遺伝子によってコードされる（Eizirikら, Diabetologia 39:875-890 (1996)）。標的細胞においてIL-1β誘導したシグナル伝達は、４つの主要なシグナリング経路に関連すると考えられる：核因子-κb、ストレス活性化プロテインキナーゼ（SAPK/JNK）、プロテインキナーゼＣ、およびチロシンキナーゼ（Mandrup-Poulsen, T., Diabetologia 39:1005-1029 (1996)；Eizirikら, Diabetologia 39:875-890 (1996)）。３つの経路は、c-fos、c-jun、およびインターフェロン応答因子-1が島細胞におけるサイトカイン作用に関与している初期応答遺伝子の迅速かつ一過性の誘導を導く。初期応答遺伝子は、島におけるおそらく有害な（iNOS、シクロオキシゲナーゼ-2、およびリポキシゲナーゼ）および防御的（HSP72、ヘムオキシゲナーゼ、Mnスーパーオキシドジスムターゼ）作用を有する特定の遺伝子を活性化する（Mandrup-Poulsen, T., Diabetologia 39:1005-1029 (1996)；Eizirikら, Diabetologia 39:875-890 (1996)）。したがって、島細胞における作用のIL-1βメカニズムについての情報は、さらに限定され、そしてIL-1βによる発現が変化した105タンパク質の同定は、シグナル伝達ならびに防御的および有害な作用を有するタンパク質についての新しい知見を導き得る。
結論
発明者らは、他の細胞および組織において既に公表されたデータベースで改良する高い定性的再現性および定量的再現性を有する、新生児ラットのランゲルハンス島のタンパク質データベースを確立した。さらに、発明者らは、新生児ラット島タンパク質データベースのアッセイ内およびアッセイ間変動を決定した。データベースは、さらに、IL-1βによって発現か変化したタンパク質を同定するために適用され、これはIL-1βの作用メカニズムに重要な役割を果たし得る。IL-1βは、インスリン産生ラットＢ細胞に細胞傷害性であるので、現在マススペクトロメトリーおよびマイクロ配列決定法によって行われている、タンパク質の同定は、インスリン依存性糖尿病の病原についての著しい知見を得ることが期待される。
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本発明を現在十分に記載したので、本発明の意図および範囲から逸脱せずに、および過度の実験を行わずに、広範な等価のパラメータ、濃度、および条件内で、本発明が行われ得ることが、当業者に理解される。
本発明はその特定の実施態様に関連して記載されているが、さらなる改変が可能であることが理解される。本出願は、一般的に、本発明の原理に従って本発明のあらゆる変動、使用、または適用をカバーすることを意図し、本発明が関与する当該技術分野内の公知または慣習的実施の範囲内で生じるような、そして添付の請求の範囲の範囲に従って記載される本明細書中上記の本質的な特徴に適用され得るような本発明の開示からの逸脱を含む。
雑誌記事または要約、公表されたまたは対応する米国または外国特許出願、発行された米国または外国特許、あるいはあらゆる他の参考文献を含む、本明細書中に引用されたすべての参考文献は、引用された参考文献に示されるすべてのデータ、表、図、および文章を含む、その全体が、参考として本明細書中に援用される。さらに、本明細書中で引用された参考文献内で引用された参考文献の全体の内容も、全体が参考として援用される。
公知の方法工程、従来の方法工程、公知の方法、または従来の方法への参照は、決して、本発明のあらゆる局面、説明、または実施態様が、関連技術で開示、教示、または示唆されることの承認ではない。
特定の実施態様の上記の説明は、過度の実験なしに、本発明の一般的概念から逸脱することなく、当業者の範囲内の知見（本明細書中に引用された参考文献の内容を含む）を適用することによって、他者が、このような特定の実施態様を種々の適用について容易に改変および／または適用し得る、本発明の一般的性質を十分に示す。したがって、このような適用および改変は、本明細書中に示される教示および指針に基づいて、開示された実施態様の等価の意味および範囲内であることが意図される。本明細書中の語法または用語法は、説明の目的であって限定の目的ではなく、そのため本明細書中の語法または用語法が、当業者の知見と組み合わせて、本明細書中に示される教示および指針を鑑みて、当業者によって解釈されるべきであることが理解されるべきである。
図１は、本発明の方法の一実施態様を説明するブロック図を示す。 図２は、本発明の使用に適した例証コンピューターシステムのブロック図を示す。 図３は、データベース、測定内および測定間分析を示す。データベース分析を各4サブ群の10％IEF、15％IFE、10％NEPHGEおよび15％NEPHGEについて行った。一方、測定内および測定間分析を15％IEFおよび15％NEPHGEについてのみ実施した。各データベースは、一組のゲルで分析された５個の異なる小島分離片からなる。測定内分析は、一組のゲルで分析された５個の同じ試料ゲルからなるが、測定間分析は、異なる日に連続するゲル群で分析された５個の同じ試料ゲルからなる。異なる分離片をデータベース、測定内および測定間分析に使用した。コンピューター分析の前に、各サブ群で一つのゲルを任意に選択して、「マスターゲル」とし、他の四つのデータベースゲル、５測定内ゲルおよび５測定間ゲルとの比較に使用した。データベース「マスターゲル」を測定内および測定間分析のマスターとして使用し、所定のスポットが三系列分析において確実に同じ整合番号であるようにした。「マスターゲル」からのデータは、データベース分析においてのみ含まれる。「マスターゲル」は、全４サブ群の同じ分離片からのものであったが、他の４データベースゲルを生成する分離片の同一性は、サブ単位間で僅かに変動した（図３）。 図４は、統計学的研究を示す流れ図を示し、疾患関連タンパク質（すなわち、処理、疾患または免疫状態に関連した変性発現を示すタンパク質）を本発明による方法により、選択または同定する。「正常１」、「正常２」および「正常３」と表示されたゲル画像は、正常対照細胞からのプロテオームゲル画像である。「疾患１」、「疾患２」および「疾患３」と表示されたゲル画像は、疾患性細胞として発症細胞からのゲル画像である。ゲル画像マスター合成スポットデータリスト（「正常合成」と表示）は、各正常または対照タンパク質の変動性統計値を含む対照画像の合成である。ゲル画像マスター合成スポットデータリスト（「疾患合成」と表示）は、各疾患性または発症タンパク質の変動性統計値を含む疾患性または発症画像の合成である。最下部の「データベース」と表示されたゲル画像は、正常合成および疾患性合成間を統計的に比較したものであり、疾患、処理または免疫傷害状態により障害を受けたタンパク質を同定する。 図５は、新生児ラットランゲンハンス島の10％2-D DB「マスターゲル」の蛍光写真であり、（35S）-メチオニンで４時間標識した後、RPMI 1640＋0.5％正常ヒト血清中で24時間インキュベーションしたものである。右側は、当電点電気泳動(IEF;pH3.5〜７）ゲル、左側は、非平衡pH-勾配電気泳動(NEPHGE;pH6.5〜10.5)ゲルである。矢印は、IL-1βによる発現で変化した105個のスポットである。番号は、10％IEFおよびNEPHGE DBの整合番号に相当する。 図５は、新生児ラットランゲンハンス島の10％2-D DB「マスターゲル」の蛍光写真であり、（35S）-メチオニンで４時間標識した後、RPMI 1640＋0.5％正常ヒト血清中で24時間インキュベーションしたものである。右側は、当電点電気泳動(IEF;pH3.5〜７）ゲル、左側は、非平衡pH-勾配電気泳動(NEPHGE;pH6.5〜10.5)ゲルである。矢印は、IL-1βによる発現で変化した105個のスポットである。番号は、10％IEFおよびNEPHGE DBの整合番号に相当する。 図6A〜Hは、新生児ラット島タンパク質の10％IEF DB 2-Dゲルの拡大領域(6A〜6E)およびIL-1β-暴露島ゲルの相当領域(6F〜6H)を示す。6A：ゲルDB3、6B:ゲルDB6、6C:ゲルDB8、6D:ゲルDB9、6E:ゲルDB10(「マスターゲル］）、6F:ゲルIL1A、6G:ゲルIL1Bおよび6H:ゲルIL1C。スポット番号は、データベースの番号に相当する。10％IEF DBにおいて、スポットの％IODのCV％は、次の通りであった。382:16.7％；387:17.6％；471:60.2％；480:13.9％；483:14.6％；484:15.4％；561:18.9％および563:47.1％。 図6A〜Hは、新生児ラット島タンパク質の10％IEF DB 2-Dゲルの拡大領域(6A〜6E)およびIL-1β-暴露島ゲルの相当領域(6F〜6H)を示す。6A：ゲルDB3、6B:ゲルDB6、6C:ゲルDB8、6D:ゲルDB9、6E:ゲルDB10(「マスターゲル］）、6F:ゲルIL1A、6G:ゲルIL1Bおよび6H:ゲルIL1C。スポット番号は、データベースの番号に相当する。10％IEF DBにおいて、スポットの％IODのCV％は、次の通りであった。382:16.7％；387:17.6％；471:60.2％；480:13.9％；483:14.6％；484:15.4％；561:18.9％および563:47.1％。 図6A〜Hは、新生児ラット島タンパク質の10％IEF DB 2-Dゲルの拡大領域(6A〜6E)およびIL-1β-暴露島ゲルの相当領域(6F〜6H)を示す。6A：ゲルDB3、6B:ゲルDB6、6C:ゲルDB8、6D:ゲルDB9、6E:ゲルDB10(「マスターゲル］）、6F:ゲルIL1A、6G:ゲルIL1Bおよび6H:ゲルIL1C。スポット番号は、データベースの番号に相当する。10％IEF DBにおいて、スポットの％IODのCV％は、次の通りであった。382:16.7％；387:17.6％；471:60.2％；480:13.9％；483:14.6％；484:15.4％；561:18.9％および563:47.1％。 図6A〜Hは、新生児ラット島タンパク質の10％IEF DB 2-Dゲルの拡大領域(6A〜6E)およびIL-1β-暴露島ゲルの相当領域(6F〜6H)を示す。6A：ゲルDB3、6B:ゲルDB6、6C:ゲルDB8、6D:ゲルDB9、6E:ゲルDB10(「マスターゲル］）、6F:ゲルIL1A、6G:ゲルIL1Bおよび6H:ゲルIL1C。スポット番号は、データベースの番号に相当する。10％IEF DBにおいて、スポットの％IODのCV％は、次の通りであった。382:16.7％；387:17.6％；471:60.2％；480:13.9％；483:14.6％；484:15.4％；561:18.9％および563:47.1％。 図6A〜Hは、新生児ラット島タンパク質の10％IEF DB 2-Dゲルの拡大領域(6A〜6E)およびIL-1β-暴露島ゲルの相当領域(6F〜6H)を示す。6A：ゲルDB3、6B:ゲルDB6、6C:ゲルDB8、6D:ゲルDB9、6E:ゲルDB10(「マスターゲル］）、6F:ゲルIL1A、6G:ゲルIL1Bおよび6H:ゲルIL1C。スポット番号は、データベースの番号に相当する。10％IEF DBにおいて、スポットの％IODのCV％は、次の通りであった。382:16.7％；387:17.6％；471:60.2％；480:13.9％；483:14.6％；484:15.4％；561:18.9％および563:47.1％。 図6A〜Hは、新生児ラット島タンパク質の10％IEF DB 2-Dゲルの拡大領域(6A〜6E)およびIL-1β-暴露島ゲルの相当領域(6F〜6H)を示す。6A：ゲルDB3、6B:ゲルDB6、6C:ゲルDB8、6D:ゲルDB9、6E:ゲルDB10(「マスターゲル］）、6F:ゲルIL1A、6G:ゲルIL1Bおよび6H:ゲルIL1C。スポット番号は、データベースの番号に相当する。10％IEF DBにおいて、スポットの％IODのCV％は、次の通りであった。382:16.7％；387:17.6％；471:60.2％；480:13.9％；483:14.6％；484:15.4％；561:18.9％および563:47.1％。 図6A〜Hは、新生児ラット島タンパク質の10％IEF DB 2-Dゲルの拡大領域(6A〜6E)およびIL-1β-暴露島ゲルの相当領域(6F〜6H)を示す。6A：ゲルDB3、6B:ゲルDB6、6C:ゲルDB8、6D:ゲルDB9、6E:ゲルDB10(「マスターゲル］）、6F:ゲルIL1A、6G:ゲルIL1Bおよび6H:ゲルIL1C。スポット番号は、データベースの番号に相当する。10％IEF DBにおいて、スポットの％IODのCV％は、次の通りであった。382:16.7％；387:17.6％；471:60.2％；480:13.9％；483:14.6％；484:15.4％；561:18.9％および563:47.1％。 図6A〜Hは、新生児ラット島タンパク質の10％IEF DB 2-Dゲルの拡大領域(6A〜6E)およびIL-1β-暴露島ゲルの相当領域(6F〜6H)を示す。6A：ゲルDB3、6B:ゲルDB6、6C:ゲルDB8、6D:ゲルDB9、6E:ゲルDB10(「マスターゲル］）、6F:ゲルIL1A、6G:ゲルIL1Bおよび6H:ゲルIL1C。スポット番号は、データベースの番号に相当する。10％IEF DBにおいて、スポットの％IODのCV％は、次の通りであった。382:16.7％；387:17.6％；471:60.2％；480:13.9％；483:14.6％；484:15.4％；561:18.9％および563:47.1％。 図7A〜7Dは、各分析DBサブ群(7A:NEPHGE 15％；7B:NEPHGE 10％；7C:IEF 15％;7D:10％）に対して、５ゲルののうち１（白四角）、２（＊）、３（＋）または４（黒四角）に存在するスポットの空間的位置を示す。スポットが１ゲル以上で存在するとき、マスター画像の座標を使用する。スポットが１ゲルのみで存在するとき、所定ゲルの座標を使用する。 図7A〜7Dは、各分析DBサブ群(7A:NEPHGE 15％；7B:NEPHGE 10％；7C:IEF 15％;7D:10％）に対して、５ゲルののうち１（白四角）、２（＊）、３（＋）または４（黒四角）に存在するスポットの空間的位置を示す。スポットが１ゲル以上で存在するとき、マスター画像の座標を使用する。スポットが１ゲルのみで存在するとき、所定ゲルの座標を使用する。 図8A〜Dは、各分析サブ群（8A:NEPHGE 15％；8B:NEPHGE 10％；8C:IEF 15％；8D:IEF 10％）に対するグラフを示す。５ゲルのうちの５つに存在するスポットを、％IODの変動係数(CV％）の増加順に後に並べた。グラフ上の「０」および「100」の符号は、それぞれ各サブ群の％IODの最小および最大CV％をもつスポットのCV％である。所定パーセンタイルに対するCV％は、5％、10％、20％など、最小CV％をもつ実測スポットのCV％である。 図8A〜Dは、各分析サブ群（8A:NEPHGE 15％；8B:NEPHGE 10％；8C:IEF 15％；8D:IEF 10％）に対するグラフを示す。５ゲルのうちの５つに存在するスポットを、％IODの変動係数(CV％）の増加順に後に並べた。グラフ上の「０」および「100」の符号は、それぞれ各サブ群の％IODの最小および最大CV％をもつスポットのCV％である。所定パーセンタイルに対するCV％は、5％、10％、20％など、最小CV％をもつ実測スポットのCV％である。 図9A〜Dは、10％および15％IEFおよびNEPHGE DB(9A:NEPHGE 15％；9B:NEPHGE 10％；9C:IEF 15％；9D:IEF 10％）の５ゲルのうちの５つに存在する各スポットのグラフを示し、全積分視覚濃度（％IOD）の平均率を算出した。各分析サブ単位に対して、平均％IODの増加順にスポットを並べた。図は、回帰直線および全スポット（挿入）および％IOD≦1（主図）のスポットに対する95％信頼区間を示す。主図は、次のスポット総数に対する割合を有する。IEF 15％ DB：1224/1235(99.1％);NEPHGE 15％ DB:547/557(98.2％)；IEF 10％DB:981/995(98.6％)；NEPHGE 10％ DB:366/378(96.8％)。回帰分析の結果は以下の通りであった。IEF 15％DB:y=46.1-0.0093x、R2=0.0072、p=0.00288;NEPHGE 15％DB:y=44.7-0.028x、R2=0.0160、p=0.00282;IEF 10％DB:y=47.3-0.165x、R2=0.0317、p=0.00(t=-5.69);NEPHGE 10％DB:y=43.9-0.060x、R2=0.0273、p=0.00127。 図9A〜Dは、10％および15％IEFおよびNEPHGE DB(9A:NEPHGE 15％；9B:NEPHGE 10％；9C:IEF 15％；9D:IEF 10％）の５ゲルのうちの５つに存在する各スポットのグラフを示し、全積分視覚濃度（％IOD）の平均率を算出した。各分析サブ単位に対して、平均％IODの増加順にスポットを並べた。図は、回帰直線および全スポット（挿入）および％IOD≦1（主図）のスポットに対する95％信頼区間を示す。主図は、次のスポット総数に対する割合を有する。IEF 15％ DB：1224/1235(99.1％);NEPHGE 15％ DB:547/557(98.2％)；IEF 10％DB:981/995(98.6％)；NEPHGE 10％ DB:366/378(96.8％)。回帰分析の結果は以下の通りであった。IEF 15％DB:y=46.1-0.0093x、R2=0.0072、p=0.00288;NEPHGE 15％DB:y=44.7-0.028x、R2=0.0160、p=0.00282;IEF 10％DB:y=47.3-0.165x、R2=0.0317、p=0.00(t=-5.69);NEPHGE 10％DB:y=43.9-0.060x、R2=0.0273、p=0.00127。 図9A〜Dは、10％および15％IEFおよびNEPHGE DB(9A:NEPHGE 15％；9B:NEPHGE 10％；9C:IEF 15％；9D:IEF 10％）の５ゲルのうちの５つに存在する各スポットのグラフを示し、全積分視覚濃度（％IOD）の平均率を算出した。各分析サブ単位に対して、平均％IODの増加順にスポットを並べた。図は、回帰直線および全スポット（挿入）および％IOD≦1（主図）のスポットに対する95％信頼区間を示す。主図は、次のスポット総数に対する割合を有する。IEF 15％ DB：1224/1235(99.1％);NEPHGE 15％ DB:547/557(98.2％)；IEF 10％DB:981/995(98.6％)；NEPHGE 10％ DB:366/378(96.8％)。回帰分析の結果は以下の通りであった。IEF 15％DB:y=46.1-0.0093x、R2=0.0072、p=0.00288;NEPHGE 15％DB:y=44.7-0.028x、R2=0.0160、p=0.00282;IEF 10％DB:y=47.3-0.165x、R2=0.0317、p=0.00(t=-5.69);NEPHGE 10％DB:y=43.9-0.060x、R2=0.0273、p=0.00127。 図9A〜Dは、10％および15％IEFおよびNEPHGE DB(9A:NEPHGE 15％；9B:NEPHGE 10％；9C:IEF 15％；9D:IEF 10％）の５ゲルのうちの５つに存在する各スポットのグラフを示し、全積分視覚濃度（％IOD）の平均率を算出した。各分析サブ単位に対して、平均％IODの増加順にスポットを並べた。図は、回帰直線および全スポット（挿入）および％IOD≦1（主図）のスポットに対する95％信頼区間を示す。主図は、次のスポット総数に対する割合を有する。IEF 15％ DB：1224/1235(99.1％);NEPHGE 15％ DB:547/557(98.2％)；IEF 10％DB:981/995(98.6％)；NEPHGE 10％ DB:366/378(96.8％)。回帰分析の結果は以下の通りであった。IEF 15％DB:y=46.1-0.0093x、R2=0.0072、p=0.00288;NEPHGE 15％DB:y=44.7-0.028x、R2=0.0160、p=0.00282;IEF 10％DB:y=47.3-0.165x、R2=0.0317、p=0.00(t=-5.69);NEPHGE 10％DB:y=43.9-0.060x、R2=0.0273、p=0.00127。

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  1. 本願明細書等に記載されるような、プロテオーム解析。
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