KR20000050776A

KR20000050776A - 5'-이노신산 생산 미생물 및 그 생산방법

Info

Publication number: KR20000050776A
Application number: KR1019990000863A
Authority: KR
Inventors: 이진호; 강성구; 김정환; 정성오; 이병춘; 황수연; 권영기; 이재철; 이재흥
Original assignee: 손경식; 제일제당 주식회사
Priority date: 1999-01-14
Filing date: 1999-01-14
Publication date: 2000-08-05
Also published as: KR100424847B1

Abstract

본 발명은 공지의 특허균주 브레비박테리움 암모니아게네스 CS1019753(KFCC-10814)을 친주로 하고 이를 변이처리하여 아자세린 내성을 부여한 후 이를 배양하여 아자세린 내성변이주 브레비박테리움 암모니아게네스 CIAZ109(KFCC-11068)을 선별한 다음 상기 친주와 본 발명 변이주의 아자세린 내성농도를 비교하고 본 발명 브레비박테리움 암모니아게네스 CIAZ109을 직접 발효배양하여 고농도, 고수율의 5'-이노신산을 생산할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

5'-이노신산 생산 미생물 및 그 생산방법 {5'-inosinic acid producing microorganism and process for production thereof}

본 발명은 5'-이노신산(5'-inosinic acid)을 생산하는 미생물과 그 생산방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 공지의 특허균주 KFCC-10814에 아자세린 내성을 부여한 후 직접발효배양하므로써 5'-이노신산을 고농도, 고수율로 생산할 수 있는 아자세린 내성균주 및 이 균주를 이용한 5'-이노신산의 생산방법에 관한 것이다.

5'-이노신산은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질뿐 아니라 식품, 의약품 및 의료적으로 다양하게 이용되고 있으며 특히 글루타민산 나트륨과 같이 사용하면 맛의 상승효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고있는 핵산계 조미료중의 하나이다.

퓨린계열의 핵산의 선구물질인 PRPP(5-phosphoribosyl-α-1-pyrophosphate)로부터 5'-이노신산 합성에는 2분자의 글루타민이 필요하며 이때, 글루타민산 나트륨으로부터 글루타민을 합성하는 효소인 글루타민 신서테이즈(glutamine synthetase)는 글리신, 알라닌, 히스티딘 등의 아미노산 및 CTP, AMP 등에 의해서 대단히 정교하게 조절(Escherichia coli and Salmonella typhimurium, 1987, p302-320)을 받기 때문에 5'-이노신산을 합성하는데 있어서 글루타민의 원활한 공급은 필수적이다. 또한, 생성된 글루타민은 여러 반응의 전구체로서 대단히 많이 사용되고있다. 5'-이노신산 합성에 있어서도 PRPP amidotransferase 및 FGAR(5-phosphoribosyl-N-formylglycinamide) amidotransferase 두효소(Escherichia coli and Salmonella typhimurium, 1987, p445-473)가 글루타민을 기질로서 이용하고 있다. 따라서, 5'-이노신산 합성이 보다더 효율적으로 이루어 지기 위해서는 글루타민의 원활한 합성 및 글루타민을 요구하는 여러반응 중에서도 5'-이노신산을 합성하는데 관여하는 PRPP amidotransferase 및 FGAR amidotransferase 두효소가 다른 효소들보다도 글루타민에 대한 친화력(affinity)을 높이는 것이 대단히 중요하다.

본 발명자들은 L-글루타민을 5'-이노신산 발효배지에 첨가하여 5'-이노신산의 발효농도가 증가함을 확인하였고, L-글루타민의 적절한 공급이 5'-이노신산 생산의 속도조절단계(rate-limiting step)임을 확인하였으며 L-글루타민의 유사체로 작용하는 아자세린(azaserine) 및 DON(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)에 대한 내성을 부여한 결과 직접발효법에 의해 5'-이노신산을 기존에 비해서 고농도, 고수율로 생산하였다. 지금까지 5'-이노신산을 생산하는 방법들이 공지되어 있으며 가장 중요한 점은 5'-이노신산을 경제적으로 고농도, 고수율로 생산하는데 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 점에 착안하여 브레비박테리움 암모니아게네스 (ATCC 6872)의 변이주로 종래 5'-이노신산을 생산하는 아데닌 (Adenine) 누출형 변이주 (Leaky Mutant) [Agr, Bio, Chem., Vol; 47(5) ,p1035-1041, 1983, (KY13102, KY13171, KY13184등)] 또는 아데닌과 크산틴(Xanthine) 또는 구아닌(Guanine) 동시 요구성 균주와는 아데닌을 요구하는 반면 크산틴 또는 구아닌을 요구하지 않으나 첨가함으로서 생육이 촉진되며, 우레아(Urea)를 자화 할수 있는 우레아제(Urease)가 결손되고, 새포내에 생성된 다량의 5'-이노신산을 세포밖으로 잘 분비할 수 있도록 세포벽 합성 능력이 부분적으로 결손된 것으로 여겨지는 세포벽 분해효소인 라이소자임(Lysozyme)에 감수성이 높으며, 배양중에서 첨가된 고농도의 포도당 또는 기타 탄소원에 의하거나 배양 후기에 5'-이노신산이 배양액내에 축적이되면 균체 외부의 삼투압이 증가되어 5'-이노신산 생산 세포의 정상적인 생리활성이 저해되고 균체성장이 둔화되며 5'-이노신산 생성이 저하되는것을 방지 할 수 있는 삼투압 내성 형질이 부여된 공지 특허균주 KFCC-10814로부터 퓨린계 합성시스템에서 필수적으로 요구되는 글루타민(glutamine)에 대한 유사체(analogue)인 아자세린(azaserine)내성주를 선별하였으며 이를 이용하여 5'-이노신산을 고수율, 고농도로 배양액중에 직접 축적시키므로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 공지의 특허균주 브레비박테리움 암모니아게네스 CS1019753(KFCC-10814)에 글루타민 유사체인 아자세린(azaserine)내성을 부여하여 직접발효법에 의해 고농도, 고수율의 5'-이노신산을 배양액중에 직접 축적시킬 수 있는 아자세린 내성균주를 선별하여 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 직접발효시켜 고농도, 고수율로 5'-이노신산을 생산하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 친주인 공지 특허균주 브레비박테리움 암모니아게네스 CS1019753(KFCC-10814)을 변이처리하여 아자세린 내성을 나타내는 아자세린 내성균주를 분리선별한 다음 싱기 선별 균주와 친주인 공지 특허균주 KFCC-10814의 아자세린 내성농도를 비교한 후 상기 선별한 본 발명의 아자세린 내성균주를 발효배양하여 5'-이노신산의 생산능률을 평가하므로써 달성하였다.

본 발명은 친주 브레비박테리움 암모니아게네스 CS1019753에 화학변이 유기제를 처리한 후 아자세린 첨가배지에서 배양하여 성장한 콜로니를 다시 영양배지에서 배양하여 5'-이노신산을 고수율로 생산하는 본 발명의 신규한 아자세린 내성균주 브레비박테리움 암모니아게네스 CIAZ109을 분리선별하는 단계; 상기 친주로 사용한 브레비움박테리움 암모니아게네스 CS1019753과 본 발명의 신규한 아자세린 내성균주 브레비박테리움암모니아게네스 CIAZ109의 스트렙토마이신 내성농도를 측정하여 비교하는 단계; 본 발명의 신규한 아자세린 내성균주 브레비박테리움 암모니아게네스 CIAZ109를 종배지에 접종하여 배양하다가 추가로 발효배지를 분주하여 배양하므로써 5'-이노신산을 생산하는 단계 및; 본 발명의 신규한 아자세린 내성균주 브레비박테리움 암모니아게네스 CIAZ109를 상기 종배지 및 발효배지와 성분을 달리하여 배양하므로써 5'-이노신산을 생산하는 단계로 구성된다.

본 발명에서 친주로 사용한 브레비박테리움 암모니아게네스(ATCC 6872)의 변이주 CS1019753은 크산틴 또는 구아닌을 요구하지 않으나 첨가함으로서 생육이 촉진되며, 우레아(Urea) 를 자화 할수 있는 우레아제(Urease)가 결손되고, 세포내에 생성된 다량의 5'-이노신산을 세포밖으로 잘 분비할 수 있도록 세포벽 합성능력이 부분적으로 결손된 것으로 여겨지는 세포벽 분해효소인 라이소자임(Lysozyme)에 감수성이 높으며, 배양중에 첨가된 고농도의 포도당 및 여러 탄소원에 의하거나 배양 후기에 5'-이노신산이 배양액내에 축적이 되면 균체외부의 삼투압이 증가하여 5'-이노신산 생산 세포의 정상적인 생리활성이 저해되어 균체성장이 둔화되고 5'-이노신산 생성이 저하되는것을 방지 할수 있는 삼투압 내성 형질이 부여된 당사 국내 특허 제 127853호 균주이다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예와 실험예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예와 실험예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명 아자세린 내성균주 브레비박테리움 암모니아게네스 CIAZ109의 분리선별

본 발명 변이주는 브레비박테리움 암모니아게네스CS1019753(KFCC-10814)을 친주로 하여 포스페이트 완충액(pH7.0) 또는 시이트레이트 완충액(pH 5.5)에 107-108 cells/mL로 현탁시키고 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도가 10-50㎍/mL가 되도록 첨가하고 실온 혹은 32℃에서 20-40분간 처리하여 돌연변이를 유발시킨 후 2회에 걸처서 0.85% 식염수로 세척 후 아자세린이 각각 50㎍/mL, 75㎍/mL, 100㎍/mL 함유한 아자세린 첨가배지에 적절히 희석 후 도말하여 콜로니(colony)를 얻었다. 각각의 콜로니를 영양배지에서 배양 후 종배지에서 24시간 배양후 발효배지에서 3-4일씩 배양한 다음 발효배양액에 축적된 5'-이노신산 생성량이 가장 우수한 CIAZ109를 선별하였다.

본 발명에서 분리한 신규한 변이주 브레비박테리움 암모니아게네스 CIAZ109(Bravibacterium ammoniagenes CIAZ109)(KFCC-11068)는 1998년 12월 12일 사단법인 한국종균협회에 기탁되었으며 그 생화학적 특성은 표 1에 기재된 바와 같다.

본 발명 미생물 균주의 생화학적 특성

특성	CS1019753(KFCC-10814)	CIAZ109(KFCC-11068)
아데닌	요구성	요구성
구아닌(크산틴)	누출형	누출형
비오틴	요구성	요구성
라이소자임 감수성(최저생육 억제농도)	8㎍/mL	8㎍/mL
3,4-디하이드로프로린내성	83500㎍/mL	3500㎍/mL
아자세린 내성	25㎍/mL	100㎍/mL

본 실시예에서 사용한 영양배지는 펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모엑기스 1%, 한천 2%로 조성되고 pH 7.2로 조절하여 사용하며 최소배지는 포도당 2%, 황산나트륨 0.3%, 인산 제1칼륨 0.1%, 인산 제2칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.3%, 염화칼슘 10mg/L, 황산철 10mg/L, 황산아연 1mg/L, 황산망간 1mg/L, L-시스테인 20mg/L, 칼슘판토테네이트 10mg/L, 티아민염산염 5mg/L, 비오틴 30 g/L, 아데닌 20mg/L, 구아닌 20mg/L, 한천 2%로 조성하고 pH7.3으로 조절하여 사용하였다. 그리고 아자세린 첨가배지는 상기 최소배지에 아자세린을 농도별로 25, 50, 75, 100mg/L 첨가한 배지를 사용하였고 종배지는 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌 100mg/L, 구아닌100mg/L로 조성되어 pH 7.6으로 조절된 배지를 사용하였다. 발효배지는 인산 제1칼륨 1.5%, 인산 제2칼륨 2.5%, 암모늄크로라이드 1%, 황산마그네슘 1%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 10mg/L, 황산망간 10mg/L, 황산아연 10mg/L, 옥수수침지여액 20%, 비오틴 30ug/L, 티아민염산 5mg/L, 아데닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 6%되게 첨가하여 사용하였다.

실험예 1: 본 발명 변이주와 친주의 아자세린 내성농도 측정

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 친주로 사용한 브레비박테리움 암모니아게네스 CS1019753(KFCC 10814)를 상기 실시예 1에서 사용한 최소배지에서 배양하면서 아자세린에 대한 균주의 내성정도를 측정하였다. 실험결과, 친주로 사용한 종래 특허균주 CS1019753(KFCC-10814)는 아자세린 25㎍/mL까지 성장하였고 그 이상에서는 전혀 성장하지 않았으나 본 발명 변이주 브레비박테리움 암모니아게네스 CIAZ109(KFCC-11068)는 상기 실시예 1에서 보는 바와 같이 100㎍/mL에서도 성장을 나타냈다. 이를 표 2에 정리하였다.

아자세린 내성농도

특성	CS1019753(KFCC-10814)	CIAZ109(KFCC-11068)
아자세린 내성농도	25㎍/mL	100㎍/mL

실시예 2: 삼각플라스크 발효역가 실험

본 발명 브레비박테리움 암모니아게네스 CIAZ109(KFCC011068) 변이주를 공시균주로 하여 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%,아데닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L(PH7.6)이 함유된 종배지 3mL를 지름 18mm 시험관에 분주하고 가압 살균 후 상기 공시균주를 접종한 후 30℃에서 24시간 진탕배양하였다. 인산 제1칼륨 1.5%, 인산 제2칼륨 2.5%, 암모늄크로라이드 1%, 황산마그네슘1%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 10mg/L, 황산망간 10mg/L, 황산아연 10mg/L, 옥수수침지여액 20%, 비오틴 30ug/L, 티아민염산 5mg/L, 아데닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L, 과당, 포도당및 당밀 을 혼합하여 환원당으로 6%되게 첨가하여 조성한 발효배지 40mL를 500mL 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 121℃에서 10분간 가압살균하여 종배양액 3mL을 식균한 다음 3-4일간 배양하였다. 회전수 분당 200회, 온도 30℃, pH 7.0으로 조절 하였다. 실험결과, 배지내 5'-이노신산 축적량은 17.1g/L 이었다.

실시예 3: 5L 발효조에서의 발효역가 실험

본 발명 브레비박테리움 암모니아게네스 CIAZ109 변이주를 공시 균주로 하고 실시예 1과 동일한 종배지를 사용하되 상기 종배지액 40mL를 500mL 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 가압 살균 후 상기 공시균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕 배양하였다. 인산 2%, 수산화칼륨 2%, 황산마그네슘 1%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 10mg/mL, 황산망간 10mg/mL, 황산아연 10mg/mL, 옥수수침지여액 20%, 비오틴 30㎍/mL, 티아민염산염 5mg/L, 아데닌 200mg/L, 구아닌100mg/L, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 총환원당으로 18%되게 첨가하여 조성한 발효배지 1600mL를 5L-시험 발효조에 넣고 121℃에서 15분간 가압살균하여 종배양액 200mL를 식균한 다음 3-4일간배양하였다. 회전수 분당 900회, 온도 28-34℃, pH 7.0 으로 조절하였다. 또 발효시 당이 2%가 되었을때 1차 및 2차, 3차 추가당을 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 최종 환원당으로 각각 8% 되도록 첨가했다. 실험결과, 최종 발효액내 5'-이노신산 축적량은 65.1g/L이었다.

이상의 실시예와 실험예를 통하여 상세히 설명한 바와 같이 본 발명은 공지의 균주 브레비박테리움 암모니아게네스 CS1019753(KFCC-10814)를 변이처리하여 글루타민 유사체인 아자세린(azaserine) 내성균주 브레비박테리움 암모니아게네스CIAZ109(KFCC-11068)를 선별한 효과가 있으며, 본 발명 변이주는 직접발효법에 의해 고농도, 고수율의 5'-이노신산을 생산하는 뛰어난 효과가 있으므로 발효산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

브레비박테리움(Brevibacterium)에 속하고 아데닌과 비오틴을 요구성이며 구아닌 또는 크산틴 누출형 변이주로서, 라이소자임에 감수성이 높고 3.4-디하이드로프로린의 농도가 3500㎍/mL 이상에서도 생육할 수 있으며, 아자세린 100㎍/mL에도 내성을 갖으며, 직접발효법에 의하여 발효배양액에 5'-이노신산을 생산할 수 있는 미생물 브레비박테리움 암모니아게네스 CIAZ109(KFCC-11068).
제 1 항 기재의 미생물을 이용하여 발효배지(pH 7.0)에서 회전수 분당 200 ~ 900회, 온도 28 ~ 34℃ 조건으로, 3 ~ 4일간 배양함을 특징으로 하는 직접 발효법에 의한 5'-이노신산의 생산방법.

여기서, 발효배지는 인산 2%, 수산화칼륨 2%, 황산마그네슘 1%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 10mg/mL, 황산망간 10mg/mL, 황산아연 10mg/mL, 옥수수침지여액 20%, 비오틴 ㎍/mL, 티아민염산 5mg/L, 아데닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L, 과당, 포도당 및 당밀 혼합물 18%(총 환원당 값)로 조성된 것이다.