KR20000031736A

KR20000031736A - 항암활성을 갖는 초두구 추출물

Info

Publication number: KR20000031736A
Application number: KR1019980047919A
Authority: KR
Inventors: 윤성준; 이덕근; 함은령; 신동혁; 장환봉; 박세연; 양철학
Original assignee: 양철학; 황규언; 동화약품공업 주식회사
Priority date: 1998-11-10
Filing date: 1998-11-10
Publication date: 2000-06-05

Abstract

본 발명은 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물, 초두구로부터 화학식 1의 화합물인 7,8-다이하이드록시플라바논(7,8-dihydroxyflavanone)을 제조하는 방법 및 항암활성이 있는 초두구 추출물에 관한 것이다.

화학식 1의 화합물인 7,8-다이하이드록시플라바논은 준-포스 다이머의 형성 또는 준-포스 다이머와 DNA가 결합하는 것을 저해하여 종양세포의 증식을 억제하는 물질로서, 화학식 1의 7,8-다이하이드록시플라바논이 포함된 초두구 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항암활성을 갖는 초두구 추출물

본 발명은 다음 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물, 초두구로부터 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법 및 항암활성을 갖는 초두구 추출물에 관한 것이다.

초두구를 유기용매로 추출한 본 발명의 초두구 추출물에는 항암활성을 갖는 다음 화학식 1의 7,8-다이하이드록시플라바논(7,8-dihydroxyflavanone)이 포함되어 있어 경구투여용 제제 또는 주사제 등의 약학적 조성물로 제조하여 항암제로 유용하게 사용할 수 있다.

화학식 1

전사조절 인자는 세포에서 외부신호를 받아서 특정한 유전자를 발현시키며, 그로 인하여 복잡한 생물학적 과정을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 전사조절 인자 에이피 1(이하, "AP1"이라 약칭한다)는 성장인자나 종양촉진 인자, 발암제 또는 src나 ras 같은 발암 유전자의 증가된 발현 등에 반응하여 유전자의 발현을 변경시킬 수 있다. 이러한 AP1은 준(Jun)이나 포스(Fos)-프로토암 유전자군(Protooncogenes)의 단백질들로 구성된 복합체로서, AP1의 인식자리로 알려진 특정한 염기 서열을 같는 DNA에 결합하여 전사를 조절하는 것으로 알려져 있다 (P. Angel and M. Karin, "The role of Jun, Fos and AP-1 complex in cell proliferation and transformation", Biochem. ＆ Biophy. Acta 1072, p.129∼157, 1991).

준 단백질은 단독으로 호모다이머(homodimer)를 형성할 수 있으며, 포스 단백질과 함께 헤테로 다이머(heterodimer)를 형성할 수도 있다. 그러나, 포스 단백질은 호모다이머를 형성할 수 없어 포스 단백질 단독으로는 DNA에 결합될 수 없다.

준-준 다이머(Jun-Jun dimer)나 준-포스 다이머(Jun-Fos dimer)는 로이신 지퍼(leucine zipper)라는 결합을 통해서 이루어지며, 다이머와 DNA의 결합은 로이신 바로 앞쪽에 위치한 염기성 아미노산들을 통하여 이루어진다 (T.D. Halazonetis et al., "c-Jun Dimerizes with itself and with c-Fos forming complexes of different binding affinities", Cell 55, p.917∼924; T. Kouzarides and E. Ziff, "The role of the leucine zipper in the fos-jun interaction", Nature 336, p.646∼650, 1988).

AP1 복합체는 신호전달 과정에서 결정적인 역할을 수행하여 세포의 증식과 분화과정에 매우 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 복합체 자체의 활성도 정교하게 조절된다.

AP1과 관련된 유전자의 발현이 증가된 경우가 여러 종양에서 발견되는데, AP1의 역할에서 볼 수 있듯이 단백질과 단백질의 상호작용이 신호전달 과정이나 세포분열 후기조직에서 핵심적인 기능을 하므로 최근에 분자생물학적으로 암을 연구하는 분야에서는 이러한 상호작용이 중요하게 대두되고 있으며, 유전자를 조작하여 준-포스 다이머의 형성을 방해하면 이 다이머의 전사조절 능력과 종양세포를 만드는 활성이 감소하는 것으로 밝혀졌다.

초두구는 그 생약이 수렴지사작용, 건위작용 및 진토작용을 하는 것으로 알려져 있으나, 항암작용 등에 관한 효과는 알려진 바 없으며, 초두구 추출물에 포함되어 있는 화학식 1의 7,8-다이하이드록시플라바논의 경우도 항암제로서의 용도는 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 준-포스 다이머의 형성 또는 다이머와 DNA가 결합하는 것을 저해하면 종양세포의 증식이 억제된다는 점에 착안하여 준-포스 다이머의 작용을 저해하는 물질을 연구해 오던 중, 수렴지사작용, 건위작용 및 진토작용이 있다고 알려져 있는 초두구 추출물이 항암활성을 갖는다는 것을 알아내어 준-포스 다이머와 DNA 결합을 저해하는 성분을 분리한 후 그의 구조와 분자량을 규명하고, 그 성분인 7,8-다이하이드록시플라바논이 항암활성을 갖는다는 것을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다. 7,8-다이하이드록시플라바논은 공지의 화합물이지만 본 발명자들에의해 초두구로부터 처음으로 단리된 것이다.

본 발명의 목적은 화학식 1의 화합물을 포함하는 항암제용 약학적 조성물, 초두구로부터 7,8-다이하이드록시플라바논을 제조하는 방법 및 항암활성을 갖는 초두구 추출물을 제공하는 것이다.

도 1 은 초두구 추출물 및 분획의 전기영동 결과를 나타낸 것이며,

1 열 : 실시예(헥산과 에틸아세이트 분획 중 비활성분획)

2 열 : 실시예(초두구 에테르 추출물)

3 열 : 실시예(벤젠 분획)

4 열 : 비교실시예

5 열 : 실시예(헥산과 에틸아세이트 분획 중 활성분획)

도 2 는 도 1 의 활성분획을 재결정하여 분리한 7,8-다이하이드록시플라바논의 농도별 저해정도를 측정한 결과를 나타낸 것이며,

1 열 : 비교실시예

2 열 : 실시예(0.369 ㎍/㎕)

3 열 : 실시예(0.436 ㎍/㎕)

4 열 : 실시예(0.501 ㎍/㎕)

5 열 : 실시예(0.565 ㎍/㎕)

6 열 : 실시예(0.626 ㎍/㎕)

7 열 : 실시예(0.686 ㎍/㎕)

도 3 은 7,8-다이하이드록시플라바논의 분자량을 결정하기 위해 측정한 질량 스펙트럼의 결과이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 다음 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암제용 약학적 조성물, 초두구로부터 항암활성을 갖는 7,8-다이하이드록시플라바논을 분리·정제하여 제조하는 방법 및 항암활성을 갖는 초두구 추출물을 제공한다. 본 발명의 초두구 추출물은 경구 및 비경구 투여용 제제로 제조되어 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

화학식 1

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에서는 초두구를 유기용매로 추출하여 얻은 초두구 추출물을 제공한다. 이때 사용되는 유기용매로는 에테르 또는 벤젠 등이 있는데, 이들 외에도 메탄올, 에탄올, 부탄올,클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 또는 헥산을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 초두구로부터 항암활성을 갖는 화학식 1의 7,8-다이하이드록시플라바논을 제조하는 방법을 제공한다. 즉, 초두구를 유기용매로 추출하고 농축한 다음, 실리카겔 크로마토그래피와 재결정에 의하여 7,8-다이하이드록시플라바논을 분리·정제하여 제조한다.

이때, 바람직한 유기용매에 의한 추출은 에테르 및 벤젠으로 순차적으로 추출하여 수행하며, 실리카겔 크로마토그래피는 헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매(9:1, 4:1, 2:1)를 사용하여 수행하며 재결정을 위하여는 획득된 60개의 분획 중에서 23 번째의 분획을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 항암활성을 갖는 초두구 추출물을 단독으로 또는 유효성분을 부가적으로 함유한 약학적 조성물로 제조하여 항암제로 사용할 수 있다.

본 발명은 위 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 활성물질인 위 화학식 1의 7,8-다이하이드록시플라바논은 담체와 함께 배합하여 정제, 캡슐제, 트로키제, 액제 및 현탁제 등의 경구투여용 제제; 주사용 액제 및 주사시에 증류수를 혼합하여 사용할 수 있는, 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 주사용 제제; 연고제, 크림제 및 액제 등의 국소투여용 제제 등의 통상적인 제제로 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 담체로는 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 즉, 경구투여용 제제의 경우에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등이 있으며, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 및 안정화제 등이 있고, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등이 있다. 또한, 경구투여시 약제가 위산에 의해 분해되는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나, 정제 등의 경구투여용 고형제제를 장용피로 피복된 제제로 제형화하여 투여할 수도 있다.

이렇게 제조된 약제학적 제제는 경구 투여하거나, 정맥내, 피하, 복강내 또는 환부 등에 비경구 투여할 수 있다.

본 발명의 활성성분의 인체 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 치료할 질병의 중증정도 및 환자의 연령, 성별 및 상태 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게는 2일에 10∼1000㎎ 정도를 투여하되, 추출물의 경우에는 200∼500㎎, 화학식 1의 화합물의 경우에는 50∼250㎎ 정도를 투여하는 것이 좋다. 따라서, 본 발명의 초두구 추출물을 단위투여형 약제로 제조할 때 각각의 단위투여형 제제는 전술한 유효용량 범위를 고려하여 본 발명의 활성물질을 10∼1000㎎의 함량이 되도록 제조한다. 바람직하게는, 추출물의 경우에는 200∼500㎎이, 화학식 1의 화합물의 경우에는 50∼250㎎이 함유되도록 제형화하는 것이 좋다. 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나, 일정한 시간 간격으로 수회 투여할 수 있으며, 바람직하게는 1주에 1회 내지 6회, 더욱 바람직하게는 2일에 1회 투여하는 것이 좋다.

본 발명에서는 초두구 추출물, 초두구 분획 및 초두구 추출물로부터 분리·정제된 7,8-다이하이드록시플라바논이 DNA와 준-포스 단백질의 결합을 저해하는 정도를 측정하여 이들 물질의 항암활성을 조사하기 위해 젤-리타데이션(Gel- retardation)방법을 사용하여 검색하였다. 젤-리타데이션 방법이란 일반적으로 사용되는 전기영동법에 속하는 스크리닝 방법으로서 다음과 같이 수행하는 것으로 알려져 있다. 우선, DNA에 방사능 원소를 표지하고, 준-포스 다이머를 결합시킨 후 전기영동시킨다. 이때 DNA에 준-포스 단백질이 결합된 것은 이동속도가 느려서 준-포스 단백질이 결합되지 않은 DNA와 다른 위치에서 띠가 나타나게 된다. 전기영동 후 젤을 엑스선 필름에 노출시키고 현상하면 준-포스 단백질의 작용을 억제하는 물질을 넣은 실험군에서는 준-포스 다이머와 DNA의 결합체가 형성되지 않으므로 대조군과 구별할 수 있게 된다 (D.S. Latchman, "Transcription Factors. A practical aproach", IRL press, p.1∼26, 1993).

이러한 방법으로 상기물질들이 준-포스 단백질의 결합을 저해하는 정도를 실험한 결과 이들물질은 모두 준-포스 단백질의 결합을 저해하였으며, 특히 7,8-다이하이드록시플라바논이 우수한 저해력을 나타내었다.

또한, 본 발명에서는 초두구 추출물, 그의 분획 및 7,8-다이하이드록시플라바논을 이용하여 암세포에 대한 억제효과실험, 동물실험 및 독성실험을 수행하였다.

이하, 하기 실시예에서 본 발명을 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 한편, 본 발명의 초두구 추출물 및 분획의 저해 효과를 측정하는데 사용되는 준-포스 다이머, 방사성 동위원소(³²P)가 표지된 DNA 탐침(probe) 및 젤의 제조방법은 제조예에서 설명하기로 한다. 또한, 항암활성 측정은 초두구 추출물, 초두구 분획 및 초두구 추출물에서 분리·정제된 7,8-다이하이드록시플라바논을 사용하였다.

제조예 1 : 준-포스 다이머의 제조

포스와 준 유전자가 pLM1벡터에 클론된 발현벡터(J.N. Mark Glover, Havard Univ.)를 각각 대장균 BL21(DE3)에 넣어주었다(Nature 373, p.257∼261). 벡터가 삽입된 대장균을 항생제인 앰피실린(100㎍/㎖)이 들어있는 LB배지에서 37℃로 24시간 배양한 후 이 배양액을 다시 1ℓ의 앰피실린 LB배지에 접종하여 600㎚에서 흡광도가 0.6 정도로 될때까지 배양하였다. 이 배양액에 1mM의 IPTG를 넣어 대장균에서 단백질을 발현시키고, 6시간 동안 더 배양한 후 균액을 원심분리해서 침전된 균을 얻었다. 이 침전물에 용균 용액(250mM NaCl 수용액, 50mM KH₂PO₄수용액, 1mM EDTA, 0.1% BME, 1㎍/㎖ 류펩틴 및 1mg/㎖ PMSF)을 넣고 초음파를 가하여 용균시킨 후 용균된 균액을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)을 실시하여 단백질의 발현을 확인하였다. 이렇게 수득된 준 단백질과 포스 단백질을 동일한 양으로 섞어서 실온에서 30분동안 반응시켜 준-포스 다이머를 얻었다.

제조예 2 :³²P 방사성 동위원소가 표지된 DNA 탐침의 제조

AP1 공통서열의 DNA(1.75p㏖/㎕)에 γ³²P-ATP(5 μCi/㎕)와 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase)를 넣어 30℃에서 30분 동안 반응시켜 인산화시킨 후 0.5M EDTA로 반응을 중단시키고 증류수(39㎕)로 희석시켜 방사성 동위원소(³²P)가 표지된 DNA 탐침을 제조하였다.

제조예 3 : 젤의 제조

10×TBE 완충용액 350㎕, 20% 아크릴비스[acrylbis(80:1)] 2.1㎖, 80% 글리세롤(glycerol) 210㎕, 증류수 4.1㎖, 1.5% APS 350㎕와 TEMED 20㎕를 넣은 혼합용액을 젤을 만드는 틀에 부어서 응고시킨 후 0.25×TBE 완충용액을 전개액으로 하여 150V에서 약 1시간 동안 예비 전개(prerunning)시켰다.

실시예 1 : 초두구 추출물 및 분획의 저해효과 측정

초두구(200g)를 에테르(200㎖)로 3회 추출한 후 용매를 농축하고, 다시 벤젠(80㎖)으로 2회 추출하고 용매를 농축하였다. 벤젠 분획을 다시 헥산과 에틸아세테이트의 용매 비율을 9:1, 4:1, 2:1로 한 혼합용매로 실리카겔 크로마토그래피하여 분리하였으며 분리된 60개의 분획을 각각 얇은 막 크로마토그래피로 확인하여 거의 단일 물질로 보이는 23번째 분획을 활성분획으로 분리하였다.

여기서 얻은 초두구 에테르 추출물, 벤젠 분획 및 활성분획을 각각 준-포스 다이머와 방사능 표지된 DNA 및 5배의 젤 이동 완충액을 넣은 반응액에 넣고 실온에서 30분 이상 반응시킨 후 DNA 전개 버퍼용액을 가하여 젤에 전개시켜 1시간 동안 전기영동을 실시하였다. 전기영동된 젤은 엑스선(X-ray) 필름에 하루동안 노출시킨 후 필름을 현상하여 준-포스 다이머와 DNA간의 결합이 저해되었는지 그 여부를 확인하였으며, 그 결과 초두구 에테르 추출물(도 1의 제 2열)과 초두구 벤젠 분획(도 1의 제 3열)에서 저해효과가 나타났으며 활성분획(도 1의 제 5열)도 적절히 분리가 된 것으로 나타났다. (도 1 참조).

실시예 2 : 7,8-다이하이드록시플라바논의 분리·정제 및 저해효과 측정

위 실시예 1에서 분리한 활성분획을 공지의 방법으로 재결정하여 순수한 화합물로 정제하였다. 순수하게 분리된 화합물은, 질량분석 스펙트럼(Mass Spectrum) 및 핵자기 공명 스펙트럼(NMR)으로 화학구조를 분석한 결과 화학식 1의 7,8-다이하이드록시플라바논으로 확인되었다.(도 3, 표 1 및 표 2 참조)

7,8-다이하이드록시플라바논을¹³C NMR(400MHz)로 분석하여 얻은 스펙트럼

C	C의 화학적 이동(δ)	DEPT	HMQC	HMBC
1	44.18	CH₂	H-1,H-2
2	80.43	CH	H-3	H-2,H-6
3	96.22	CH	H-4b	H-4a
4	97.17	CH	H-4a	H-4b
5	103.32			H-1,H-4a,H-4b
6	127.35	CH	H-6	H-3,H-5a,H-6
7	129.68	CH	H-5a	H-6
8	129.71	CH	H-5b	H-5b
9	130.84	impurity
10	140.41			H-1,H-2,H-3,H-5b
11	164.63			H-4b
12	165.47			H-4a
13	168.43			H-4a,H-4b
14	197.36			H-1,H-2,H-3,H-4b

7,8-다이하이드록시플라바논을¹H NMR(400MHz)로 분석하여 얻은 스펙트럼

H	H의 화학적 이동(δ)	COSY
1	2.69	H-2,H-3
2	2.98	H-1,H-3
3	5.36	H-1,H-2
4a	5.79	H-4b
4b	5.83	H-4a
5a	7.28
5b	7.31	H-6
6	7.38	H-5b

또한, 위 실시예 1과 동일한 방법으로 이 화합물의 저해효과를 확인하고 젤의 방사능 띠를 오려서 섬광계수기로 방사능활성을 측정하여 저해정도를 정량적으로 측정하였는데, 50% 저해시의 농도(IC₅₀)가 1.807mM이었다. (도 2 및 표 3 참조)

섬광계수기에 의한 7,8-다이하이드록시플라바논의 농도별 저해효과

번호	농도(㎍ /㎕)	결합된 DNA량(CPM)	저해율(%)
1	0	3323.7	-
2	0.369	2416.4	17.2
3	0.436	1951.7	41.3
4	0.501	1544.9	54.5
5	0.565	1105.2	66.7
6	0.626	871.3	73.8
7	0.686	477.5	85.6

한편, 상기 실시예 1 및 2와 비교하기 위하여 하기에 비교실시예를 나타내었으며, 비교실시예를 대조군으로 사용하였다.

비교실시예 1

준-포스 다이머와 방사능이 표지된 DNA, 5배의 젤 이동 완충용액을 넣은 반응액에 위 실시예의 시료물질 대신 기초완충액 3㎕를 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 DNA 전개(DNA loading)완충용액을 젤에 전개시킨 뒤 1시간 동안 전기영동시켰다. 전기영동된 젤은 엑스선 필름에 하루동안 노출시킨 후 필름을 현상하여 준-포스 다이머와 DNA간의 결합이 저해되었는지 그 여부를 확인하였으며, 젤에서 나타난 띠를 오려서 섬광 계수기로 방사능 활성을 측정하여 저해정도를 정량적으로 측정하였으며 이를 양의 대조용 물질로 사용하였다 (도 1 및 도 2 참조).

실시예 3 : 암세포에 대한 억제 효과 측정

초두구 에테르 추출물 및 화학식 1의 화합물에 대한 시험관내 세포독성을 이중(double)간격으로 암세포 균주에 대하여 MTT 검색법으로 측정하여 암세포의 성장을 50% 억제하는 각 시험물질의 농도(IC₅₀)를 구하였다.

실험용 암세포인 인간 폐암 세포(A549) 및 인간 혈액암 세포(K562)를 10%(부피/부피) 소 태아혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 10,000 세포/웰로 현탁시킨 후 암세포를 각각 100㎍ 씩 96개의 마이크로플레이트 웰에 접종하고, 5% 이산화탄소로, 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 각 웰에 상기 실시예의 초두구 에테르 추출물 및 7,8-다이하이드록시플라바논을 희석한 용액을 가하였다. 이때 희석용액은 디메틸설폭사이드(이하, "DMSO"라 약칭한다) 용매에 상기 초두구 에테르 추출물 및 7,8-다이하이드록시플라바논을 20㎎/㎖의 농도로 각각 용해시키고, 0.22㎛ 필터로 여과한 후 RPMI 1640 배지를 사용하여 200㎍/㎖에서 0.0128㎍/㎖까지의 공비를 5로 하여 적정농도로 희석하여 제조하였으며, 각 웰에는 초두구 에테르 추출물 및 7,8-다이하이드록시플라바논 희석용액의 최종농도가 0.0064∼100㎍/㎖가 되도록 조절하여 각각 100㎕씩 접종하고, 대조군에는 100㎕의 RPMI 1640 배지를 접종하였다. 암세포를 72시간 동안 약물에 노출시킨 후 각 웰에 MTT 용액 (2㎎/㎖, 생리식염수)을 25㎕씩 첨가하고, 다시 4시간 동안 배양한 후 원심분리(1,000rpm, 10분)하여 상등액을 제거하고 생성된 포르마잔 결정을 100㎕의 DMSO에 용해시켜 이를 마이크로플레이트 판독기로 540nm에서 흡광도를 측정하여 IC₅₀을 계산하였다.

MTT 검색법에 의하여 초두구 에테르 추출물, 초두구 벤젠 분획 및 7,8-다이하이드록시플라바논이 인체 암세포에 대해 나타내는 세포독성의 실험결과는 하기 표 4에 나타내었다.

암세포에 대한 시험물질의 세포독성

물 질	세 포 주
물 질	인간 폐암세포 (A549)(㎍/㎖)	인간혈액암세포 (K562)(㎍/㎖)
7,8-다이하이드록시플라바논	42.7	14.4
초두구 에테르 추출물	89.3	65.2
초두구 벤젠 분획	63.5	53.2

실시예 4 : 동물 실험

6주령 암컷 Balb/c 마우스를 1주일 동안 실험실에서 적응시키고 생체 내(in vivo)에서 계대유지하던 마우스 대장암괴(Colon26)를 무균적으로 적출하여 콜라게나아제(collagenase) 및 DNA 분해효소액으로 단세포 부유액을 제조하고 쥐 한 마리당 5,105개의 세포를 이식하였다. 대장암괴를 이식한지 6일 후 종양의 체적이 약 100㎣에 도달하면 종양의 체적에 따라 군(군당 5마리)으로 분리하였다.

에테르 추출물 및 7,8-다이하이드록시플라바논을 각각 Na-CMC(0.5%)에 현탁시켰는데, 마우스의 체중 1㎏ 당 초두구 에테르 추출물은 100㎎/5㎖ 그리고 7,8-다이하이드록시플라바논은 50㎎/5㎖이 투여되도록 제조한 뒤, 위에서 군을 분리한 다음 날부터 3일 간격으로 하루에 2회 피하에 투여하였다. 그 결과, 2회 투여 후부터 심한 기모(起毛; piloerection)증상을 보였으며, 약물 투여부위가 괴사되어 피부가 박리되며, 체중도 감소하는 현상이 관찰되었다.

종양의 체적은 버어니어 캘리퍼스(vernier calipers)를 이용하여 종양의 장경 및 단경을 측정하고 다음 식에 의하여 계산하였는데, 얻어진 데이터는 스튜던트 t 테스트(Students t test)에 의해 통계처리 하였다.

상기에서 결정된 종양체적을 비교하여 보면, 초두구 에테르 추출물을 투여한 군에서 암세포의 평균 성장 억제율은 13.4%였으며, 7,8-다이하이드록시플라바논을 투여한 군에서의 평균 성장억제율은 25.6%였다.

또한, 종양이식 15일 후(최종투여 후 5일 경과) 생존하는 모든 마우스를 경추탈골에 의해 안락사시키고, 복부 피내에 형성된 종양괴를 적출하여 그 중량을 측정하였는데, 그 결과 초두구 에테르 추출물을 투여한 군에서의 성장억제율은 11.8%였으며, 7,8-다이하이드록시플라바논을 투여한 군에서의 성장억제율은 24.8%였다.

실시예 5 : 독성 시험

또한, 상기 실시예에서 얻은 초두구 에테르 추출물 및 7,8-다이하이드록시플라바논을 이용하여 마우스에 대한 독성시험을 실시하였다. 에테르 추출물 및 7,8-다이하이드록시플라바논을 각각 0.5% Na-CMC에 현탁시켜 상기 실시예 4에서 분리한 동물군(군당 5마리)에 각각 1회 투여한 뒤 14일 동안 관찰하여 사망률을 측정하였다.

이때 초두구 에테르 추출물은 100㎎/㎏, 200㎎/㎏, 400㎎/㎏, 800㎎/㎏ 및 1000㎎/㎏, 그리고 7,8-다이하이드록시플라바논은 50㎎/㎏, 100㎎/㎏, 200㎎/㎏, 400㎎/㎏ 및 800㎎/㎏의 5 단계로 각각의 투여량을 정하여 투여하였다.

그 결과, 상기에서 사용한 약물의 50% 치사량(LD₅₀)은 초두구 에테르 추출물이 약 550㎎/㎏, 그리고 7,8-다이하이드록시플라바논이 약 320㎎/㎏였다.

이상에서 살펴본 바와 같이 수렴지사작용, 건위작용 및 진토작용이 있다고 알려져 있는 초두구의 추출물은 항암활성 효과가 있으며, 그 성분 중 7,8-다이하이드록시플라바논이 그 효과를 나타내는 것이 동물실험을 통하여 확인되었다. 또한, 초두구 추출물 및 7,8-다이하이드록시플라바논을 이용하여 독성시험을 실시한 결과, 독성이 적은 물질임이 확인되었다. 따라서, 초두구 추출물 또는 7,8-다이하이드록시플라바논을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물

화학식 1
초두구를 유기용매로 추출하여 얻은 항암활성이 있는 초두구 추출물.
제 2 항에 있어서, 유기용매가 메탄올, 에탄올, 부탄올, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 에틸아세테이트 중에서 1 또는 2 이상이 선택된 용매로 구성된 초두구 추출물.
초두구를 유기용매로 추출하고 농축한 다음 헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매로 실리카겔 크로마토그래피하고 재결정하여 분리·정제하는 과정으로 이루어지는 초두구로부터 7,8-다이하이드록시플라바논을 제조하는 방법
제 4항에 있어서, 유기용매가 에테르 또는 벤젠이거나 에테르 및 벤젠인 초두구로부터 7,8-다이하이드록시플라바논을 제조하는 방법.