KR20000026775A - 오수유로부터 분리한 안지오텐신 ⅱ 수용체 결합 저해제 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 오수유로부터 분리한 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 다음 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염으로 구성된 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제, 그리고 유기용매 추출 및 다양한 크로마토그래피 수행하여 오수유로부터 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제는 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성이 우수하고, 안지오텐신 Ⅱ에 의해 유도된 혈관수축에 대한 길항작용이 우수하므로, 안지오텐신 Ⅱ와 관련된 질환 즉, 고혈압, 동맥경화, 심혈관계 비후, 그리고 울혈성 심부전 및 당뇨병성 신증 같은 신장질환에 이용될 수 있는 효과가 있다.
화학식 1
상기 화학식 1에서 R은 탄소수 5 ∼ 20의 지방족기를 나타낸다.

Description

오수유로부터 분리한 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제 및 이의 제조방법
본 발명은 오수유로부터 분리한 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 오수유로부터 분리된 안지오텐신 Ⅱ 길항제의 역할을 하는 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성을 갖는 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
오수유(Evodiae Fructus)는 운향과(Rutaceae)에 속하는 미성숙 과실을 건조한 것으로서 맵고 쓴 맛을 지니고 있다(Namba T., Coloured Illustration of Wakan-Yaku, Hoikusha Publishing, Osaka, I, 233 ∼ 234(1980)). 상기 오수유는 예로부터 방향성 건위, 진통약으로 소화불량, 복통, 토사, 변비 또는 구풍약으로서 각기 산통, 근골동통, 자궁수축, 수렴살균, 보온의 용도로 사용되어 왔고 일부 욕탕료로 이용되어 왔었다.
또한, 상기 오수유로부터는 다양한 종류의 정유, 지방유, 고미성분인 리모노이드, 비고미성분으로 인돌 알칼로이드, 퀴놀론 알칼로이드, 베타카르볼린계 알칼로이드 등의 성분이 분리되었고, 상기 성분은 뇌혈류량 증가, 자궁수축, 혈관확장 등의 작용을 나타낸다고 보고되었다(Wen-Fei C., J. Nat. Prod., 59, 374 ∼ 378(1996); King C.L., J. Nat. Prod., 43, 577 ∼ 582(1980)).
한편, 안지오텐신 Ⅱ는 레닌-안지오텐신계에서 혈압의 조절과 생체액내의 전해질의 항상성에 중요한 역할을 하는 호르몬으로서, 혈관 평활근 수축작용, 부신피질과 뇌하수체 후엽으로부터 알도스테론과 바소프레신의 분비촉진 작용 등 말초계 또는 중추계 양면으로부터 생체순환기 조절에 있어 다양한 역할을 하는 호르몬이다. 상기 안지오텐신 Ⅱ의 작용기전은 각각의 표적 장기의 세포표면에 존재하는 안지오텐신에 특이한 수용체를 매개로하여 생리작용을 나타낸다(Smith et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32, 135 ∼ 165(1992); Valloton et al., Trends Pharmacol. Sci., 8, 69 ∼ 74(1987)).
상기 안지오텐신 Ⅱ 수용체는 기능적으로 2개의 서브타입이 있는 바, 조직에 따라 이의 분포가 다르다는 것이 알려져 있다(Iwai et al., FEBS Lett., 298, 257 ∼ 260(1992); Dudley et al., Mol. Pharmacol., 38, 370 ∼ 377(1990)).
한편, 상기 안지오텐신 Ⅱ 수용체의 서브타입 가운데 AT1수용체는 G-단백질을 매개로하여 아데닐레이트 사이클라제(adenylate cyclase)를 활성화하고, 이에 따라 세포내 cAMP의 양이 감소되고, 이어 세포막의 포스포리파제 C(phospholipase C)가 활성화되고, 그런 다음 상기 효소에 의해 이노시톨트리포스페이트(inositol triphosphate)가 형성되고 이는 세포내 유리 칼슘의 농도를 상승시킴으로써 세포내 정보가 전달되는 것으로 알려져 있다.
또한, 상기 안지오텐신 Ⅱ 수용체의 서브타입 가운데 AT2수용체는 최근에 그 유전자가 클로닝되어 DNA 및 아미노산 서열이 알려졌는 바, AT1수용체와 32 ∼ 34%의 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 상기 AT2수용체는 AT1수용체와는 다른 G-단백질을 매개로하여 그 신호 전달이 이루어지며, AT1수용체의 신호 전달 체계에서 나타나는 이노시톨트리포스페이트, 다이아실글리세롤(diacylglycerol), 세포내 칼슘농도, cAMP, 세포내 인산화 등의 변동은 특별히 관찰할 수 없다. 더욱이, 상기 AT2수용체에 의한 신호전달에서는 cGMP 양의 감소가 관여하는 것으로 보고 되었으나, 그 상세한 신호전달 체계는 알려져 있지 않다(Mukoyama et al., J. Biol. Chem, 268, 24539 ∼ 24542(1993); Kambayashi et al., J. Biol. Chem, 268, 24543 ∼ 24546(1993)).
한편, 상기 안지오텐신 수용체의 두 서브타입은 종 및 조직에 따라 다른 분포를 나타내는 바, 혈관 평활근에는 AT1수용체만 존재하여 혈관 수축을 야기하며, 그 외에 뇌, 간, 신장, 부신피질, 폐, 비장 등에도 AT1수용체가 존재하는 것으로 알려져 있다.
상기 AT1수용체에 선택적이며 비펩타이드 성분으로 구성되어 있는 안지오텐신 Ⅱ 길항제는 혈관수축, 알도스테론 유리, 심혈관계 비후(cardiovascular growth)와 같은 안지오텐신 Ⅱ의 작용을 차단하는 것으로 잘 알려져 있다. 또한, 안지오텐신 Ⅱ 길항제는 아포리포프로테인 E가 결핍된 쥐에서 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein: LDL)의 과산화와 동맥경화를 억제하는 것으로 보고 되어 있다(Kidar S., Biochem. Biophys. Res. Commun., 236, 622 ∼ 625(1997); Scheidergger K.J., J. Biol. Chem., 272, 21609 ∼ 21615(1997)).
상술한 바와 같이, 당업계에서는 AT1수용체, 즉 안지오텐신 Ⅱ 수용체에 선택적인 안지오텐신 Ⅱ의 길항제가 우수한 혈압조절제로 이용될 가능성이 크고, 심부전 또는 동맥경화, 당뇨병성 신증 등 신장질환에도 그 효과가 탁월할 것으로 기대하고 있는 실정이다.
본 발명의 발명자들은 상기한 안지오텐신 Ⅱ 수용체에 선택적인 안지오텐신 Ⅱ의 길항제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 오수유로부터 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성을 갖는 물질을 분리한 다음, 이의 구조를 분광학적으로 분석하고, 안지오텐신 Ⅱ 길항작용을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제를 유효성분으로 포함하는 안지오텐신 Ⅱ 길항제용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
도 1은 본 발명 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제의 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성을 나타낸 그래프,
도 2는 안지오텐신 Ⅱ에 의해 유도된 흉곽 대동맥 수축에 대한 본 발명 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제의 길항작용을 나타낸 그래프.
본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염으로 구성된 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제를 그 특징으로 한다:
상기 화학식 1에서 R은 탄소수 5 ∼ 20의 지방족기를 나타낸다.
본 발명은 오수유로부터 상기 화학식 1로 표시되는 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제를 제조하는 방법을 다른 특징으로 한다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 안지오텐신 Ⅱ 길항제용 약학적 조성물을 또 다른 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다:
오수유로부터 분리 및 제조된 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성을 갖는 신규 물질은 상기 화학식 1로 표시되는 퀴놀론계 알칼로이드이다. 상기 화학식 1에서 R은 탄소수 5 ∼ 20의 포화 또는 불포화 지방족기로서, 오수유로부터 분리되는 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성물질에서 특히 큰 활성을 나타내는 경우는 상기 R이,,,,,및으로 구성된 군에서 선택되는 지방족기인 경우이다.
본 발명의 오수유로부터 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제의 제조방법은 다음과 같다: 우선, 오수유를 저급알코올로 추출하고, 아세트산에스테르로 다시 추출한 다음, 실리카겔 칼럼크로마토그래피, 역상저압 칼럼크로마토그래피 및 고압액상크로마토그래피를 수행한다.
상기 오수유로부터 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제 성분을 추출하는 데 이용되는 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올이 바람직하고, 이중 메탄올을 이용하는 것이 가장 바람직한 바, 그 이유는 메탄올의 활성물질의 추출능력이 뛰어나고 가격이 저렴하기 때문이다. 또한, 상기 저급 알코올은 오수유 1 g당 5 ∼ 15 ㎖를 사용하는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 오수유 1 g당 10 ㎖를 사용하는 것이며, 오수유 1 g당 5 ㎖ 미만을 사용한 경우에는 추출 능력이 저하되고, 15 ㎖를 초과하여 사용하는 경우에는 전체적인 분리 효율이 저하된다.
상기 알코올 추출단계에 이어 아세트산에스테르로 다시 용매 추출하는 바, 아세트산에스테르는 에틸아세테이트를 이용하는 것이 가장 바람직하고, 그 이유는 상기 오수유의 저급알콜 추출물로부터 비활성 분획과 활성 분획을 선택적으로 나눌 수 있기 때문이다.
상기 추출단계에 이어, 일련의 칼럼크로마토그래피 과정을 수행하는 바, 우선 흡착크로마토그래피의 일종인 실리카겔 칼럼크로마토토그래피 및 역상저압 칼럼크로마토그래피를 실시한다. 상기 실리카겔 칼럼크로마토토그래피 과정에서는 헥산 및 에틸아세테이트의 혼합액을 전개용매로 이용하는 것이 바람직한 바, 그 이유는 상기 혼합용매의 활성분획 분리능이 양호하기 때문이다. 또한 상기 역상저압 칼럼크로마토그래피 과정에서는 메탄올 및 물의 혼합액을 전개용매로 이용하는 것이 바람직하다. 상기 흡착 크로마토그래피 과정에 이어, 고압액상 크로마토그래피를 수행한다. 고압액상 크로마토그래피 과정에서는 메탄올 및 물의 혼합액을 전개용매로 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 안지오텐신 Ⅱ 길항제용 약학적 조성물은 상기 화학식 1의 퀴놀론계 알칼로이드를 유효성분으로 포함하고, 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자가 용이하게 알 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제제형태는 오일 또는 수성매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 상기 화학식 1의 퀴놀론계 알칼로이드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물이 안지오텐신 Ⅱ 길항제로 작용하는 것은, 본 발명의 화합물이 안지오텐신 Ⅱ가 그 수용체에 결합하는 것을 저해함으로써 달성되는 것이다.
상기 본 발명의 안지오텐신 Ⅱ 길항제용 약학적 조성물의 투여방법은 경구투여 및 정맥투여가 바람직하고, 그 유효량은 경구투여인 경우에는 보통 성인을 기준으로 1일 3회 투여하되 1회에 50 ∼ 500 ㎎이 바람직하며, 정맥투여인 경우에는 10 ∼ 100 ㎎이 바람직하다.
한편, 본 발명의 안지오텐신 Ⅱ 길항제용 약학적 조성물은 통상적인 제제화 방법에 따라, 과립제, 정제, 캅셀제, 주사제 등으로 제조될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성 물질의 조사
우선, 안지오텐신 Ⅱ 수용체는 스프라그-다울리(Sprague-Dawley: SD)계 흰쥐의 간으로부터 더들리(Dudley)의 방법을 약간 수정하여 다음과 같이 분리하였다(참조: Dudley D.T. et al., Mol. Pharmacol., 38, 370 ∼ 377(1990)): 상기 흰쥐로부터 적출한 간을 완충액 A(10 mM HEPES 및 단백질 분해 저해제(아프로티닌, 류펩틴 및 펩스타틴 10 ㎍/㎖, 벤자미딘 16 ㎍/㎖, 1 mM PMSF), pH 7.4)로 세척하고, 10 g의 간을 30 ㎖의 완충액 A에 넣어 조직분쇄기로 분쇄하였다. 이어, 상기 분쇄액을 3,000 × g에서 10분간 원심분리하여 일차적으로 침전물을 제거하고, 상등액을 10,000 × g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 그런 다음, 상기 상등액을 100,000 × g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 침전물을 냉각된 완충액 A로 세척한 다음 100,000 × g에서 30분간 원심분리하여 최종적으로 침전물을 취하여 안지오텐신 Ⅱ 수용체 분획을 수득하였다. 최종적으로 수득한 침전물은 즉시 사용하거나 -70℃에서 보관하면서 필요로 할 때 사용하였다.
수용체 결합시험은 완충액 B(10 mM MgCl2및 0.25% 소 혈청 알부민을 함유하는 10 mM HEPES, pH 7.4)를 사용하여 유리관에서 최종 부피가 0.5 ㎖이 되도록하여 실시하였다. 전결합(total binding) 시험에서는 기질로서 2 nM [3H]-안지오텐신 Ⅱ를 이용하였고, 비특이적 결합(non-specific binding) 시험에서는 기질로서 2 nM [3H]-안지오텐신 Ⅱ 및 1 μM의 안지오텐신 Ⅱ를 이용하였다.
한편, 수용체 결합 저해 활성 조사의 대상인 약용식물은 메탄올로 처리하여 그 추출물을 수득함으로써 본 실험의 시료로 사용하였으며, 또한 전국 토양으로부터 분리한 방선균 및 곰팡이의 배양액을 80% 아세톤/물로 추출하여 시료로 사용하였다.
상기 과정에서 수득한 수용체 분획 및 시료 10 ㎕을 상기 기질이 포함된 완충액 B에 첨가한 후 25℃에서 50분간 수욕상에서 반응시켰으며, 이어 냉각된 완충액 B 3 ㎖을 가하여 반응을 종결시킨 후 반응액을 여지(GF/C 유리섬유 여지, Whatman)로 여과하고, 액상 씬틸레이션 카운터로 여지에 잔존하며 수용체와 결합되어 있는 상기 기질의 방사선 동위원소의 양을 측정하였다.
상기 시료에 의한 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해율은 다음 수학식 1과 같이 계산하였다:
저해율(%) = (Sc - Ss)/Sc×100
상기 수학식 1에서, Sc는 시료를 넣지 않는 경우의 반응 후 특이적 결합을 나타내는 dpm 값이고, Ss는 시료를 넣은 경우의 반응 후 특이적 결합을 나타내는 dpm 값이다.
상기 실험결과, 시료중 오수유로부터 얻은 메탄올 추출물이 최종농도 100 ㎍/㎖의 농도에서 저해율 67%로서 가장 저해활성이 큼을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 오수유로부터 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 물질의 분리
상기 실시예 1에서 가장 큰 결합 저해 활성을 갖는 것으로 확인된 오수유 5 ㎏을 메탄올 50 ℓ에 침지시킨 후 실온에서 7일간 방치하여 활성 물질을 추출하였으며, 이 추출액을 여과하고, 1회 더 추출하여 여과액을 합하였다.
이어, 상기 메탄올 추출물을 감압건조하고 증류수에 현탁시킨 다음, 에틸아세테이트 5 ℓ을 가하여 추출하였으며, 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성이 높은 에틸아세테이트 분획을 수득하였다.
그런 다음, 상기 에틸아세테이트 분획을 감압농축하고 동량의 실리카겔에 흡착시킨 후 실리카겔 칼럼크로마토그래피를 수행하였다. 이때 전개용매로서 헥산 및 에틸아세테이트의 혼합액을 사용하였으며, 헥산 및 에틸아세테이트가 10:1로 된 혼합액으로 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성이 없는 부분을 제거하였고, 5:1 ∼ 1:1까지 전개용매의 극성을 증가시키면서 저해활성 물질을 용출시켰다.
그리고 나서, 상기 용출된 활성분획을 농축하여 소량의 메탄올에 용해시킨 후 역상저압 칼럼크로마토그래피(Lobar, 머크사)를 행하였다. 이때 전개용매로서 메탄올 및 물의 50:1, 70:1 및 90:1의 혼합액을 사용하여 극성을 단계적으로 증가시키면서 용출시키고, 최종적으로 100% 메탄올로 용출시켜 결합 저해 활성을 나타내는 3개의 소분획, 즉 분획 1, 분획 2 및 분획 3을 수득하였다.
최종적으로 고압액상 칼럼크로마토그래피을 수행하였는 바, 상기 분획 1은 85% 메탄올/물(v/v) 혼합액을 전개용매로하고, 칼람으로는 J'sphere ODS-H80, 4 ㎛, 80 Å, Φ20×150 ㎜를 사용하여 유속 8 ㎖/분, 광원 254 ㎚의 UV 검출기의 조건하에서 고압액상 칼람크로마토그래피를 실시하여 5종의 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성 물질을 수득하였다. 이하, 상기 5종의 결합 저해 활성 물질을 화합물 1, 2, 3, 4 및 5라 한다. 분획 2 및 분획 3은 90% 메탄올/물(v/v) 혼합액을 전개용매로 하고, 상기 분획 1과 동일한 칼람 및 조건하에서 고압액상 칼람크로마토그래피를 실시하여 2종의 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성 물질을 수득하였다. 이하, 상기 2종의 결합 저해 활성 물질을 화합물 6 및 7이라 한다.
실시예 3: 오수유로부터 분리된 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성 물질의 이화학 적 특성 조사 및 동정
(1) 화합물 1
물질의 성상: 무색 오일상
자외선 분광광도 스펙트럼[λmax(㎚)MeOH]: 213, 239, 321, 333
양성자 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, CDCl3, δ(ppm)] 8.50(1H, dd, J=2, 8.0Hz, H-5), 7.3 ∼ 7.8(3H, m, H-6,7,8), 6.26(1H, s, H-3), 5.40(2H, m, olefinic proton), 3.76(3H, s, N-Me), 2.07(4H, m), 1.70(2H, m, H-2'), 1.29 ∼ 1.53(12H, m), 0.90(3H, t, J=7.0Hz, H-13')
13C 핵자기 공명스펙트럼[75MHz, CDCl3, δ(ppm)] 158.8(C-2), 111.1(C-3), 179.6(C-4), 127.0(C-4a), 126.7(C-5), 125.1(C-6), 133.8(C-7), 117.8(C-8), 143.5(C-8a), 35.4(N-Me), 35.6, 29.6, 30.2, 30.8, 28.1, 130.7, 130.9, 27.9, 29.7, 33.1, 23.3, 14.3
상기 측정한 이화학적 특성을 근거로하여 화합물 1은 분자량이 339이고, 분자식이 C23H33NO인 다음 화학식 2로 표시되는 에보카르핀(evocarpine)임을 알 수 있었다:
(2) 화합물 2
물질의 성상: 무색 오일상
자외선 분광광도 스펙트럼[λmax(㎚)MeOH]: 213, 240, 321, 334
양성자 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, CDCl3, δ(ppm)] 8.44(1H, dd, J=2, 8.0Hz, H-5), 7.3 ∼ 7.7(3H, m, H-6,7,8), 6.24(1H, s, H-3), 5.40(2H, m, olefinic proton), 3.73(3H, s, N-Me), 2.07 ∼ 2.8(4H, m), 2.0 ∼ 2.2(4H, m), 1.80(2H, m, H-2'), 1.2 ∼ 1.4(6H, m), 0.90(3H, t, J=7.0Hz, H-13')
13C 핵자기 공명스펙트럼[75MHz, CDCl3, δ(ppm)] 155.9(C-2), 110.4(C-3), 176.4(C-4), 125.3(C-4a), 126.5(C-5), 124.1(C-6), 132.7(C-7), 115.6(C-8), 141.7(C-8a), 34.6(N-Me), 34.3, 28.4, 26.6, 130.6, 127.3, 25.7, 127.8, 130.1, 27.2, 29.3, 31.5, 22.5, 14.0
상기 측정한 이화학적 특성을 근거로하여 화합물 2는 분자량이 337이고, 분자식이 C23H31NO인 다음 화학식 3으로 표시되는 1-메틸-2[(4Z,7Z)-4,7-트리데카디에닐]-4(H)-퀴놀론임을 알 수 있었다:
(3) 화합물 3
물질의 성상: 무색 오일상
자외선 분광광도 스펙트럼[λmax(㎚)MeOH]: 214, 239, 321, 333
양성자 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, CDCl3, δ(ppm)] 8.44(1H, dd, J=2, 8.0Hz, H-5), 7.25 ∼ 7.8(3H, m, H-6,7,8), 6.15(1H, s, H-3), 5.40(4H, m, olefinic proton), 3.69(3H, s, N-Me), 2.70(4H, m), 2.08(4H, m), 1.40(12H, m, H-2'), 0.90(3H, t, J=7.0Hz, H-15')
13C 핵자기 공명스펙트럼[75MHz, CDCl3, δ(ppm)] 154.9(C-2), 110.8(C-3), 177.5(C-4), 126.2(C-4a), 126.4(C-5), 123.3(C-6), 132.0(C-7), 115.3(C-8), 141.8(C-8a), 34.1(N-Me), 34.6, 28.4, 28.8, 29.1, 26.9, 129.4, 127.6, 25.6, 128.4, 130.3, 27.1, 29.1, 31.4, 22.5, 14.0
상기 측정한 이화학적 특성을 근거로하여 화합물 3은 분자량이 365이고, 분자식이 C25H35NO인 다음 화학식 4로 표시되는 1-메틸-2[(6Z,9Z)-6,9-펜타데카디에닐]-4(H)-퀴놀론임을 알 수 있었다:
(4) 화합물 4
물질의 성상: 무색 오일상
자외선 분광광도 스펙트럼[λmax(㎚)MeOH]: 213, 239, 321, 333
양성자 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, CDCl3, δ(ppm)] 8.50(1H, dd, J=2, 8.0Hz, H-5), 7.3 ∼ 7.8(3H, m, H-6,7,8), 6.28(1H, s, H-3), 3.78(3H, s, N-Me), 2.73(2H, brt, J=8Hz), 2.0 ∼ 2.2(4H, m), 1.80(2H, m, H-2'), 1.27(14H, m), 0.90(3H, t, J=7.0Hz, H-9')
13C 핵자기 공명스펙트럼[75MHz, CDCl3, δ(ppm)] 154.7(C-2), 111.1(C-3), 177.7(C-4), 126.2(C-4a), 126.6(C-5), 123.2(C-6), 132.0(C-7), 115.3(C-8), 142.0(C-8a), 34.1(N-Me), 34.7, 28.5, 29.3, 29.5, 29.6, 31.9, 22.7, 14.1
상기 측정한 이화학적 특성을 근거로하여 화합물 4는 분자량이 285이고, 분자식이 C19H27NO인 다음 화학식 5로 표시되는 1-메틸-2-노닐-4(H)-퀴놀론임을 알 수 있었다:
(5) 화합물 5
물질의 성상: 무색 오일상
자외선 분광광도 스펙트럼[λmax(㎚)MeOH]: 213, 239, 321, 333
양성자 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, CDCl3, δ(ppm)] 8.50(1H, dd, J=2, 8.0Hz, H-5), 7.3 ∼ 7.8(3H, m, H-6,7,8), 6.28(1H, s, H-3), 3.78(3H, s, N-Me), 2.73(2H, brt, J=8Hz), 2.0 ∼ 2.2(4H, m), 1.80(2H, m, H-2'), 1.27(18H, m), 0.90(3H, t, J=7.0Hz, H-11')
13C 핵자기 공명스펙트럼[75MHz, CDCl3, δ(ppm)] 154.2(C-2), 111.1(C-3), 177.7(C-4), 126.2(C-4a), 126.6(C-5), 123.2(C-6), 132.0(C-7), 115.3(C-8), 142.0(C-8a), 34.1(N-Me), 34.7, 28.5, 29.3, 29.5, 29.6, 31.9, 22.7, 14.1
상기 측정한 이화학적 특성을 근거로하여 화합물 5는 분자량이 313이고, 분자식이 C21H31NO인 다음 화학식 6으로 표시되는 1-메틸-2-언데실-4(H)-퀴놀론임을 알 수 있었다:
(6) 화합물 6
물질의 성상: 무색 오일상
자외선 분광광도 스펙트럼[λmax(㎚)MeOH]: 213, 239, 321, 333
양성자 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, CDCl3, δ(ppm)] 8.50(1H, dd, J=2, 8.0Hz, H-5), 7.3 ∼ 7.8(3H, m, H-6,7,8), 6.24(1H, s, H-3), 3.76(3H, s, N-Me), 2.70(2H, brt, J=8Hz), 1.60(2H, m), 1.27(20H, m), 0.90(3H, t, J=7.0Hz, H-13')
13C 핵자기 공명스펙트럼[75MHz, CDCl3, δ(ppm)] 154.7(C-2), 111.1(C-3), 177.7(C-4), 126.2(C-4a), 126.6(C-5), 123.2(C-6), 132.0(C-7), 115.3(C-8), 142.0(C-8a), 34.1(N-Me), 34.7, 28.5, 29.3, 29.5, 29.6, 31.9, 22.7, 14.1
상기 측정한 이화학적 특성을 근거로하여 화합물 6은 분자량이 341이고, 분자식이 C23H35NO인 다음 화학식 7로 표시되는 1-디하이드로-에보카르핀임을 알 수 있었다:
(7) 화합물 7
물질의 성상: 무색 오일상
자외선 분광광도 스펙트럼[λmax(㎚)MeOH]: 213, 239, 321, 333
양성자 핵자기 공명스펙트럼[300MHz, CDCl3, δ(ppm)] 8.50(1H, dd, J=2, 8.0Hz, H-5), 7.3 ∼ 7.8(3H, m, H-6,7,8), 6.26(1H, s, H-3), 3.79(3H, s, N-Me), 2.76(2H, brt, J=8Hz), 1.64(2H, m), 1.28(24H, m), 0.90(3H, t, J=7.0Hz, H-15')
13C 핵자기 공명스펙트럼[75MHz, CDCl3, δ(ppm)] 155.2(C-2), 111.1(C-3), 177.8(C-4), 126.2(C-4a), 126.2(C-5), 123.0(C-6), 131.8(C-7), 115.4(C-8), 142.0(C-8a), 34.3(N-Me), 34.9, 28.7, 29.4, 29.7, 29.9, 32.0, 22.8, 14.0
상기 측정한 이화학적 특성을 근거로하여 화합물 7은 분자량이 369이고, 분자식이 C25H39NO인 다음 화학식 8로 표시되는 1-메틸-2-펜타데실-4(H)-퀴놀론임을 알 수 있었다:
실시예 4: 화합물 1, 2 및 3의 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성 측정
상기 실시예 2에서 최종적으로 분리된 화합물 1(에보카르핀), 화합물 2(1-메틸-2[(4Z,7Z)-4,7-트리데카디에닐]-4(H)-퀴놀론) 및 화합물 3(1-메틸-2[(6Z,9Z)-6,9-펜타데카디에닐]-4(H)-퀴놀론)의 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성을 상기 실시예 1에 개시되어 있는 방법과 동일하게 측정하였으며, 그 결과는 첨부된 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 화합물 1, 2 및 3은 안지오텐신 Ⅱ와 안지오텐신 Ⅱ 수용체의 결합을 농도 의존적으로 저해함을 알 수 있었다. 상기 각각의 화합물의 IC50, 즉 50%의 저해율을 나타내는 농도는 화합물 1의 경우는 43.4 μM, 화합물 2의 경우는 34.1 μM, 그리고 화합물 3의 경우는 48.2 μM이다. 따라서, 본 발명 화합물 2가 안지오텐신 Ⅱ 결합 저해 활성이 우수함을 알 수 있었다.
실시예 5: 화합물 1의 흉곽 대동맥에 대한 이완 작용 조사
안지오텐신 Ⅱ에 의해 유도된 토끼의 흉곽 대동맥의 수축에 대하여 상기 실시예 2에서 분리된 화합물 1(에보카르빈)의 길항효과를 다음과 같이 확인하였다:
우선, 1.5 ∼ 2.0 ㎏ 토끼의 이(耳)정맥에 펜토바비탈을 체중 1 ㎏당 30 ㎎의 양으로 투여하여 마취시킨 후에 실혈치사시키고, 신속하게 흉곽 대동맥을 적출한 다음, 산소를 공급한 타이로드 용액에서 내피가 손상되지 않도록 주의하면서 대동맥에 붙어있는 결합조직을 제거하였다. 이어, 직경 4 ㎜ 정도의 링을 반응조(organ bath)에 현수한 후, 피지오그래피(Havard Osiloscophy)의 센서에 연결하고, 상기 반응조에 5 ㎖ 타이로이드 용액을 넣은 다음, 산소:이산화탄소가 95:5로 되어 있는 혼합가스를 공급하면서 37℃를 유지하였다.
화합물 1의 혈관 이완작용의 특성과 효력을 평가하기 위하여 먼저, 내피를 제거하지 않은 상기 흉곽 대동맥에 3×10-6M의 농도로 페닐에프린을 가하여 최대 수축력의 80% 정도까지 수축시켰다. 이어, 수축반응이 최대치에서 안정화되었을 때 농도-반응곡선을 그리기 위하여 화합물 1을 낮은 농도에서부터 높은 농도로 누적적으로 가하였고, 이에 따른 반응은 상기 피지오그래피의 기록지에 나타내었다. 이 실험 결과, 화합물 1은 전체농도에서 페닐에프린에 의해 유발된 혈관수축을 이완하지 않음을 확인하였다.
한편, 안지오텐신 Ⅱ에 의해 유도된 혈관의 수축에 대한 화합물 1의 길항작용을 확인하기 위하여, 상기 적출된 토끼 흉곽 대동맥에 3.3×10-6M의 페닐네프린을 가하고, 최대 장력에 도달하였을 때 1.0×10-6M의 아세틸콜린을 가하여 이완반응을 관찰하여 내피의 손상여부를 확인한 후에 안지오텐신 Ⅱ를 3.3×10-10M ∼ 3.3×10-8M의 농도로 누적적으로 가하여 농도-반응곡선을 얻었다. 또한, 화합물 1의 안지오텐신 Ⅱ에 대한 길항작용을 확인하기 위하여, 안지오텐신 Ⅱ 처리 15분전에 화합물 1을 가하여 혈관의 이완작용을 피지오그래피로 조사하였으며, 그 결과는 첨부 도 2에 나타내었다. 이때, 화합물 1 자체가 토끼 흉곽 대동맥혈관 수축에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 화합물 1만을 처리하였는 바, 화합물 1은 혈관 평활근에 대하여 어떠한 영향도 미치지 않음을 확인하였다. 도 2에서 대조군은 화합물 1을 처리하지 않는 경우를 나타낸 것이다.
첨부된 도 2에서 알 수 있듯이, 화합물 1은 3.3×10-7M ∼ 3.3×10-6M의 농도에서 안지오텐신 Ⅱ에 의해 유발된 수축을 현저히 감소시킴을 나타내었다. 또한, 화합물 1은 안지오텐신 Ⅱ의 농도-반응곡선을 우측으로 이동시켰으며, 혈관의 최대 수축력을 화합물 1의 3.3×10-7M, 1.0×10-7M 및 3.3×10-6M 농도에서 각각 51%, 65% 및 95% 감소시켰다.
따라서, 본 발명의 화합물 1(에보카르빈)은 안지오텐신 Ⅱ에 대해 특이적인 길항제임을 확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 오수유로부터 분리된 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제 및 이의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제를 유효성분으로 포함하는 안지오텐신 Ⅱ 길항제용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 화합물은 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해 활성이 우수하고, 안지오텐신 Ⅱ에 의해 유도된 혈관수축에 대한 길항작용이 우수하다. 따라서, 본 발명의 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제 및 안지오텐신 Ⅱ 길항제용 약학적 조성물은 안지오텐신 Ⅱ와 관련된 질환 즉, 고혈압, 동맥경화, 심혈관계 비후, 그리고 울혈성 심부전 및 당뇨병성 신증 같은 신장질환에 이용될 수 있는 효과가 있다.

Claims (4)

  1. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 유도체 또는 이의 염으로 구성된 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제:
    화학식 1
    상기 화학식 1에서 R은 탄소수 5 ∼ 20의 지방족기를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 R은,
    ,,,,및으로 구성된 군에서 선택되는 지방족인 것을 특징으로 하는 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제.
  3. 오수유를 저급알코올로 추출하고, 아세트산에스테르로 다시 추출한 다음, 실리카겔 칼럼크로마토그래피, 역상저압 칼럼크로마토그래피 및 고압액상 칼럼크로마토그래피를 수행하는 것을 특징으로 하는 다음 화학식 1로 표시되는 안지오텐신 Ⅱ 수용체 결합 저해제의 제조방법:
    화학식 1
    상기 화학식 1에서 R은 탄소수 5 ∼ 20의 지방족기를 나타낸다.
  4. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 안지오텐신 Ⅱ 길항제용 약학적 조성물:
    화학식 1
    상기 화학식 1에서 R은 탄소수 5 ∼ 20의 지방족기를 나타낸다.
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KR100577320B1 (ko) * 2002-10-23 2006-05-10 한국생명공학연구원 아실 코에이:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 활성 저해제인 퀴놀론 알칼로이드 화합물을 유효성분으로 함유하는 중성지방 강하제
KR101145237B1 (ko) * 2009-06-17 2012-05-24 울산대학교 산학협력단 디디에이에이치를 활성화시키는 오수유 유래의 알카로이드 화합물 및 이를 유효성분으로 하는 췌장 베타세포 사멸 및 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료용 조성물

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