KR20000025941A - 오이게놀 또는 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는뇌졸중 개선 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오이게놀(eugenol) 또는 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌졸중 개선치료제에 관한 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 흥분성 아미노산의 주요 결합수용체들인 NMDA(N-methyl-D-aspartate), AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate) 또는 카이네이트(kainate)에 의해 유발된 지연성 또는 급성의 신경세포 독성을 그 원인으로 하는 허혈성 뇌졸중을 유의한 수준으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

오이게놀 또는 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 개선 치료제

본 발명은 오이게놀(eugenol) 및 그 유도체를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke) 개선치료제에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 흥분성 아미노산에 의해 유발되는 지연성 또는 급성의 신경세포 손상을 억제하고, 나아가 허혈성 뇌졸중의 실험실적 및 생체내 모델에서 전기 아미노산의 독성으로부터 유의할 정도로 신경세포를 보호하는 기능을 가진 것으로 확인된 오이게놀 또는 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌졸중 개선 치료제에 관한 것이다.

일반적으로, 허혈성 뇌졸중(중풍)은 뇌혈류의 갑작스런 차단 혹은 외상 등에 의한 두 개강내 뇌동맥 부위의 출혈로 인하여 야기된 뇌실질조직 및 지주막하강내로의 출혈에 의해 유발되는 국소성의 신경장애를 일으키는 질환이다. 현재, 뇌졸중의 약 75%는 뇌동맥 부위의 폐색에 의해, 약 11%는 뇌출혈에 의해, 약 5%는 지주막하강 출혈에 의해 야기되는 것으로 알려져 있다 (참조: Boulton 등, Neuromethods, Vol. 22: Animals Models of Neurological Disease, II, p1 1992; Robins와 Baum, The national survey of stroke incidence, stroke, 12:1-45-1-55, 1981; Sacco등, Survival and recurrence following stroke:The Framingham study, stroke, 13:290-295, 1982). 허혈성 뇌졸중은 신경세포의 죽음과 뇌기능 손상의 원인이 되는 대표적인 난치병의 하나로 알려져 있는데, 허혈로 인한 뇌손상에 대해 신경세포를 보호할 수 있는 약물을 개발함으로써, 이를 예방 및 치료하려는 노력이 있어 왔다. 그러나, 허혈성 뇌졸중 치료약물의 개발은 미흡하여, 해마다 많은 뇌졸중 환자가 우리나라를 비롯한 세계각국에서 발생하고, 이 가운데 약 1/3 정도가 사망하고 있는 실정이며, 설사 생존한다 하더라도 육체적 장애와 더불어 정신적 후유증도 남게되므로 본인은 물론, 환자를 간호하는 가족들에게 고통 뿐만 아니라 경제적 부담을 준다. 이와 같은 현 실정에서는 허혈성 뇌졸중을 치료할 수 있는 약물의 개발이 절실히 요구되고 있다. 이러한 상황에 부응하여 허혈성 뇌졸중의 치료에 관한 심도 있는 연구를 진행한 결과, 지금까지 bFGF(basic fibroblast growth factor) 등과 같은 신경영양성인자(neurotrophic factor), NMDA(n-methyl-D-aspartate) 혹은 non-NMDA 수용체 길항제, 21-아미노스테로이드(21-aminosteroid)와 같은 라자로이드(lazaroid) 계통의 약물, 유리라디칼 스캐빈저(free radical scavanger), 니트릭 옥사이드(nitric oxide) 억제제, 인터루킨-1, 9 억제제, NMDA 수용체 부위에 존재하는 폴리아민 결합부위의 억제제, 글루타메이트 수용체에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 저체온 또는 강글리오사이드(ganglioside) 등이 뇌졸중의 치료에 도움이 되는 것으로 보고되고 있다. 또한, 그 중에서 흥분성 아미노산 수용체인, NMDA 또는 non-NMDA는 허혈성 뇌졸중 , 갑작스럽게 발생하는 지연성 발작, 저혈당, 저산소 유발성 허혈 및 급성 뇌외상 등으로 인하여 야기된 뇌신경세포의 손상에 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 즉, 뇌졸중으로 인하여 뇌신경세포는 글루타메이트를 과다하게 분비하고, 이는 NMDA 수용체 및 non-NMDA 수용체와 연계된 이온채널을 통하여 칼슘을 세포내로 유입케함으로써, 신경세포를 죽음에 이르게 하는 것으로 알려져 있다.

이러한 배경하에서 NMDA 길항제에 관한 연구는 한층 전진하여, NMDA 길항제가 동물실험에서 뇌보호 효과를 가지는 것을 규명하였다. 그러나 대표적인 NMDA 길항제의 한 종류인 MK-801(참조: Buchan 등, Stroke 21:9, 1990)은 안전성에 문제가 있어 임상적 사용으로 부적합하고, 또 다른 종류인 CGS 19755(참조: Grotta 등, Neurology 38(suppl 1):109, 1990)는 현재 미국에서 허혈성 뇌졸중 치료제로서 연구 중에 있다. 따라서, 이미 개발된 또는 개발중인 허혈성 뇌졸중 치료제가 가지는 문제점을 해결할 수 있는 신규의 허혈성 뇌졸중 치료제의 등장이 계속 요구되고 있다.

한편, 오이게놀은 정향과(Myrtaceae) 식물인 정향(Eugenia caryophyllata)의 잎에 주로 분포하고 있는 정유성분으로서, 향료, 향미료, 구풍제, 치과용 진통제 등 여러 가지 식품첨가물 혹은 의약품에 응용되고 있다. 특히 오이게놀은 진통작용, 해열작용, 위액분비 및 위 운동 억제작용, 항경련작용, 항진균작용, 항산화작용, 항균작용, 항스트레스작용, 항암작용, 혈전용해작용, 마취작용, 혈관확장작용 등 다양한 생체액리활성을 갖고 있는 것으로 보고되고 있다. 아울러 오이게놀은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)와 같은 활성 및/또는 항산화능을 가지는 물질, 페놀 화합물, 당 단백질 및 당화프라보노이드 등의 당화합물로 구성된 조성물에 페놀화합물의 1종으로서 첨가되어, 활성산소에 의한 혈관벽의 이상에 의해 유발되는 심근경색, 뇌경색등의 허혈성 질환 개선치료제로 이용될 수 있으며(참조: 일본국 특허공개 제 (평)6-199693), 또한 노인성 치매나 파킨슨병 등의 예방이나 치료에 응용되는 뇌대사촉진, 뇌기능개선치료제로 이용될 수 있다고 보고되고 있다(참조: 일본국 특허공개 제 (평)6-199690). 그러나 오이게놀은 흥분성 아미노산에 의해 유발되는 급성 또는 지연성 신경독성을 발병원인으로 하는 허혈성 뇌졸중의 예방이나 치료에 단일 유효성분으로서 효과적이라는 보고는 아직까지 없었다.

이와 같은 배경하에서, 본 발명자들은 전기의 흥분성 아미노산에 의한 허혈성 뇌졸중을 치료할 수 있는 약물을 천연물로부터 발견하고자, 여러 가지 천연물로부터 추출된 엑스들이 흥분성 아미노산에 의해 유발된 지연성 신경독성에 대하여 유효한 뇌 신경세포 보호효과를 나타내는지를 조사하였다. 그 결과, 정향의 잎에서 추출한 50% 메탄올 추출물이 가장 우수한 뇌세포 손상 억제작용을 나타냄을 확인하였고, 나아가 그 추출물 중의 오이게놀 성분이 흥분성 아미노산으로부터 뇌세포를 유의한 수준으로 보호함을 발견하였다. 아울러 본 발명자들은 흥분성 아미노산에 의해 유발되는 지연성 및 급성의 신경독성시험, 뇌졸중의 실험실적(in vitro) 모델 및 생체내(in vivo)모델 등을 통하여, 오이게놀 또는 그 유도체가 흥분성 아미노산 수용체인 NMDA 또는 non-NMDA의 길항제로 작용하므로써 NMDA 또는 non-NMDA 수용체와의 관련에 의해 유발되는 지연성 및 급성의 신경세포손상을 유의하게 억제할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 오이게놀 또는 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌졸중 개선치료제를 제공하는 것이다.

도 1은 오이게놀 및 그의 몇몇 유도체의 화학구조식을 나타낸다.

도 2는 정향의 수용성 추출물이 NMDA 유발 지연성 신경독성에 대해 용량의 존적으로 억제함을 나타내는 그래프이다.

도 3은 정향의 50% 메탄올 추출물이 흥분독인 NMDA 유발 지연성 신경독성에 대해 용량의존적으로 억제함을 나타내는 그래프이다.

도 4는 정향의 여러 분획(fraction) 가운데에서 메탄올 분획만이 흥분독인 NMDA 유발 지연성 신경독성에 대해 유의하게 억제함을 나타내는 그 래프이다.

도 5는 정향의 메탄올 분획이 흥분독인 NMDA 유발 지연성 신경독성에 대해 용량의존적으로 억제함을 나타내는 그래프이다.

도 6은 오이게놀이 흥분독인 NMDA 유발 지연성 신경독성에 대해 용량의존적

으로 억제함을 나타내는 그래프이다.

도 7은 오이게놀이 흥분성 아미노산 수용체 가운데 하나인 AMPA(α-amino-

3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate)효현제에 의해 유발된

신경세포손상을 용량의존적으로 억제함을 나타내는 그래프이다.

도 8은 오이게놀이 흥분성 아미노산 수용체 효현제(agonist)이며 흥분독

(excitotoxin)으로 작용하는 NMDA(N-methyl-D-aspartate) 에 의해

유발된 급성 신경독성을 용량의존적으로 억제함을 나타내는 그래프이 다.

도 9는 오이게놀 유도체인 미리스티신이 흥분성 아미노산 수용체 효현제

(agonist)이며 흥분독(excitotoxin)으로 작용하는 NMDA(N-methyl-D- aspartate)에 의해 유발된 급성 신경독성을 용량의존적으로 억제함 을 나타내는 그래프이다.

도 10은 오이게놀 유도체인 4-알릴아니솔이 흥분성 아미노산 수용체 효현제

(agonist)이며 흥분독(excitotoxin)으로 작용하는 NMDA(N-methyl-D- aspartate)에 의해 유발된 급성 신경독성을 용량의존적으로 억제함 을 나타내는 그래프이다.

도 11은 5가지 오이게놀 유도체들(미리스티신, α-아사론, 4-알릴아니솔, β -아사론, 이소오이게놀)이 NMDA 유발 급성신경세포 손상을 억제함 을 나타내는 그래프이다.

도 12는 오이게놀이 시험관 뇌졸중 모델에서 산소 및 포도당결핍으로 인한

뇌신경세포독성을 용량의존적으로 억제함을 나타내는 그래프이다.

도 13은 오이게놀이 NMDA로 유발된 신경세포내⁴⁵Ca²⁺의 흡수증가를 용량의존 적으로 억제함을 나타내는 그래프이다.

도 14는 오이게놀이 크산틴(xanthine)/크산틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 에 의해 생성되는 슈퍼옥사이드 유리기에 의해 유발된 급성 신경독 성을 용량의존적으로 억제함을 나타내는 그래프이다.

도 15는 오이게놀이 아라키돈산에 의해 유발된 신경세포독성을 억제함을 나 타내는 그래프이다.

도 16은 오이게놀이 과산화수소 유발에 의한 신경세포의 손상을 용량의존적 으로 억제함을 나타내는 그래프이다.

도 17은 오이게놀이 하이드록실 유리기 유발 신경독성을 용량의존적으로 억 제함을 나타내는 그래프이다.

도 18은 오이게놀이 신경세포의 내인성 항산화효소인 글루타치온을 고갈시키 는 BSO(buthionine-S,R-sulfoximine)로 인한 신경독성을 용량의존 적으로 억제함을 나타내는 그래프이다.

도 19는 오이게놀 자체가 뇌신경세포를 손상시키지 않음을 나타내는 그래프 이다.

도 20a는 직장체온 유지를 실시하지 않은 자연상태에 있는 생체내 뇌졸중 모 델동물의 체온상승변화에 미치는 오이게놀의 농도별 영향을 나타 내는 그래프이다.

도 20b는 직장체온을 37℃로 유지시킨 생체내 뇌졸중 모델동물의 체온상승변 화에 미치는 오이게놀의 농도별 영향을 나타내는 그래프이다.

도 21은 오이게놀이 생체내 뇌졸중 모델동물에서 뇌허혈 유발로 인한 해마 신경세포의 손상을 용량의존적으로 억제함을 나타내는 그래프이다.

도 22는 오이게놀이 흥분독인 NMDA 유발 생체내 경련모델에서 NMDA에 의해 유발된 경련을 용량의존적으로 억제함을 나타내는 그래프이다.

도 23은 오이게놀이 흥분독인 카이네이트(kainate) 유발 생체내 경련모델에 서 카이네이트에 의해 유발된 경련을 억제함을 나타내는 그래프이 다.

도 24는 이소오이게놀이 흥분독인 NMDA 유발 생체내 경련모델에서 NMDA에 의 해 유발된 경련을 용량의존적으로 억제함을 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

흥분독(excitotoxin)인 NMDA 또는 non-NMDA에 의한 허혈성 뇌졸중을 치료할 수 있는 약물을 천연물로부터 발견하고자 여러 가지 천연물로부터 추출된 수용성 혹은 메탄올 엑스들이 흥분독성물질 유발 급성 또는 지연성 신경독성을 억제하는 정도를 측정하였다. 이때 급성독성에는 NMDA를 지연성 신경독성시는 non-NMDA 흥분독인 AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate) 또는 카이네이트(kainate)를 사용한다.

그 결과, 정향의 잎에서 추출한 50% 메탄올 추출물이 가장 우수한 뇌세포 손상 억제작용을 나타냄을 확인하였다. 나아가, 더욱 우수한 뇌신경세포의 보호효과를 나타내는 정향추출물을 얻기 위하여, 정향의 잎을 여러 가지 용매로 추출한 결과 메탄올 분획이 가장 유의한 수준으로 신경세포를 보호함을 확인하였다. 또한, 50% 메탄올추출물에 의한 신경독성의 억제효과를 트리판 블루(Trypan blue) 염색을 통하여 확인한 결과, 50% 메탄올추출물을 첨가하지 않은 대조군에서는 신경세포의 손상 또는 용해(lysis)를 관찰할 수 있는 반면, 50% 메탄올을 처리한 군에서는 대부분 정상적인 신경세포를 관찰할 수 있었다.

전기 50% 메탄올 추출물에 포함된 어떤 단일 화합물이 흥분독 유발 신경손상을 억제하는지 검색한 결과, 오이게놀이 뇌신경세포를 용량의존적으로 보호하는 것을 확인하였다. 또한, 오이게놀에 의한 신경독성의 방어효과는 신경세포 특이면역항체(NSE, neuron specific enolase)를 이용한 염색을 통하여 보다 명백히 확인하였는 바, 오이게놀을 처리하지 않은 대조군에서는 신경세포체의 소실과 신경돌기의 손상을 관찰할 수 있었던 반면, 오이게놀을 처리한 군에서는 정상적인 신경세포를 관찰할 수 있었다.

아울러, 다음과 같은 방법과 이론에 의해 허혈성 손상(ischemic damage)을 나타내는 실험적모델을 이용하여 오이게놀의 효능을 검정하였다. 글리아 위에서 2주간 배양한 신경세포를 산소가 거의 없는(>0.2% O₂) 혐기성 챔버내에서 산소와 포도당이 결핍된 HCSS 배양액으로 갑자기 교환하여 50분간 방치시켰다가, 산소 및 포도당이 포함된 정상의 MEM 배양액으로 바꾸어주면 신경세포는 에너지 고갈 및 재관류에 따른 허혈성 신경손상과 유사한 신경세포 손상과정을 겪게된다. 즉, 최종 교환 배양액을 첨가하면 수분 내지 수시간내에 신경세포는 부풀어 올라 전형적인 종대(swelling) 현상을 나타내며, 세포막 용해와 더불어 신경세포가 죽음에 이르게 된다. 이러한 일련의 과정은 뇌졸중에서 일어나는 여러 가지 신경화학적 퇴행변화와 유사하므로, 상기의 모델은 뇌졸중 치료 후보화합물의 검색을 위한 실험실적 뇌졸중 모델로 이용된다.

상기와 같은 허혈성 손상의 실험실적 모델을 이용하여 오이게놀의 약효를 검정한 결과, 오이게놀을 처리하지 않은 대조군에서는 종대현상을 관찰할 수 있었고, 시간이 경과함에 따라 세포막용해 또는 세포사를 관찰할 수 있는 반면에, 오이게놀을 함께 첨가한 경우는 정상 신경세포를 관찰할 수 있었다.

오이게놀에 대한 약리기전을 밝히려는 한가지 접근방법으로, 오이게놀이 NMDA 수용체를 직접 조절하는지 그 여부를 확인하고자 방사능 동위원소로 표지된⁴⁵Ca²⁺이 NMDA 투여시 신경세포내로의 섭취(uptake)되는지를 조사한 바, 오이게놀이 NMDA 수용체를 통한⁴⁵Ca²⁺섭취를 30% 정도 억제하는 결과를 얻었다. 이는 오이게놀이 부분적이지만 NMDA 수용체를 직접 조절할 수 있는 능력을 가지고 있음을 의미한다. 또한, 이 실험을 통해 오이게놀의 유도체인 이소오이게놀과의 NMDA 수용체의 직접조절 능력에 대한 비교시험에서 이소오이게놀(15% 억제)보다 2배나 더 높은 NMDA 수용체 조절능력을 보여주었다. 이러한 결과는 이소오이게놀이 오이게놀보다 더 저농도에서 슈퍼옥사이드 라디칼 생성으로 인한 신경세포손상 방어능력이 오이게놀 보다는 우수하였으나, 오이게놀의 용량을 증가시 슈퍼옥사이드 라디칼 생성에 대해 이소오이게놀과 비슷한 방어능력 결과를 얻을 수 있었다. 특히, 실험적 뇌졸중 모델을 이용한 실험에서 오이게놀이 신경세포의 직접적인 사망과 연관이 있는 NMDA 수용체의 조절능력을 나타낸 것과 비례하여 농도 의존적으로 신경세포손상에 대해 유의한 수준의 방어효과를 보여주었다. 그리고 하이드록실 유리기로 인한 신경손상, 아라키돈산 유발 신경손상, 산화스트레스 관련 과산화수소 유발 신경손상, 내인성 항산화 효소인 글루타치온을 고갈시의 신경손상 등의 각종 유해 라디칼을 생성하는 실험조건에서 배양신경세포에 대한 오이게놀의 효능을 조사한 결과, 오이게놀은 라디칼에 의한 신경세포의 손상을 효과적으로 억제함을 확인하였다. 따라서 오이게놀은 다양한 라디칼 스카벤져의 기능 뿐만 아니라 직접 흥분성 아미노산의 대표적 수용체 가운데 하나인 NMDA 수용체를 부분적으로 직접 조절함으로써 흥분성 아미노산과 관련한 신경독성을 억제할 수 있다는 가능성을 제시하였다.

또한, 오이게놀 자체는 상기의 급성 및 지연성 세포독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.

오이게놀외에 미리스티신(myristicin), α-아사론(α-asarone: 1,2, 4-trimethoxy-5-prophenylbenzene), 4-알릴아니솔(4-allylanisole), β-아사론(β-asarone: cis-2,4,5-trimethoxyprophenylbenzene), 이소오이게놀(isoeugenol) 등의 오이게놀 유도체도 흥분성 아미노산 유발 신경독성을 억제함을 알 수 있었다. 전기 오이게놀 및 그의 몇몇 유도체의 화학구조식은 도 1에 나타내었다.

아울러, 오이게놀이 생체 뇌졸중 모델동물(Mongolian gerbil 사용)을 이용한 실험에서도 전신성뇌허혈로 유발된 저빌의 해마 CA1 부위의 신경세포손상을 방어하는지를 확인하기 위하여, 오이게놀의 저체온영향을 배제한 [뇌허혈동안(5분)및 뇌허혈후 30분간 정상체온인 37℃을 유지] 상태에서 용량의존적인 신경세포 손상 억제효과를 나타내었다. 또한, 오이게놀 또는 그의 유도체가 흥분성 아미노산으로 인한 마우스의 경련을 억제하는지를 알아본 결과, 오이게놀 또는 그 유도체는 경련발현을 용량의존적으로 억제함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 오이게놀 또는 그의 유도체를 유효성분으로 하는 약물은 흥분성 아미노산에 의해 유발된 지연성 또는 급성의 신경세포 독성을 그 원인으로 하여 유발되는 허혈성 뇌졸중을 유의한 수준으로 예방 또는 치료할 수 있다.

안전성 시험

본 발명에서 허혈성 뇌졸중 개선치료제로서 사용되는 오이게놀의 급성독성을 알아보기 위하여, 오이게놀을 dd-K계 웅성 마우스에 경구투여하고, 투여 후 7일간에 걸쳐 마우스의 사망수를 관찰하여 LD₅₀값을 결정하였다. 그 결과, LD₅₀값은 1850mg/kg이었다. 따라서, 하기에 표시하는 정도의 투여량은 독성으로부터 안전함을 알 수 있었다.

투여방법 및 효과량

허혈성 뇌졸중 개선치료제로서 사용되는 오이게놀의 투여량은 환자의 연령, 체중 및 질환의 정도에 따라 차이가 있으나, 통상 성인(체중 60kg 기준)의 경우, 경구로 1회 200 내지 300mg, 1일 3회까지의 투여가 바람직하다. 또한 비경구로는 1회 150 내지 250mg이 바람직하다.

본 발명의 오이게놀을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 경구 또는 주사형태로 투여할 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체를 첨가한 조성물 형태로 경구 또는 주사 투여할 수 있다. 경구용 조성물로는, 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분이외에 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로스 및/또는 글리신), 활탁제(예:실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제)를 함유한다. 또한 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 글리아 및 신경세포 배양

뇌신경세포에서 배양에 사용될 글리아를 배양하기 위하여, 먼저 꺼즈가 바닥에 깔린 병안에 할로탄(halothane)을 점적하고서 생후 1 내지 3일된 마우스를 넣고, 마개를 막아 마취시켰다. 마취된 마우스의 목 부위를 가위로 절개하고, 머리를 70% 에탄올에 1 내지 2분 동안 담군 다음, 머리를 절개용 배양액에 옮겨 두피를 제거하고 두개골을 가위로 잘라 뇌실질을 취하였다. 이렇게 모은 뇌조직들을 다른 배양액에 옮겨 입체현미경하에서 뇌막을 제거한 다음, 뇌의 피질부위를 멸균된 미세 핀셋으로 절단하였다.

이렇게 채취한 대뇌피질조직들은 0.09% 트립신이 포함된 시험관에 넣어 37℃에서 1시간 배양하고, 이를 꺼내 500xg에서 5분간 원심분리하여 침전을 수득한 다음, 소와 말의 혈청이 각각 10% 포함된 MEM 배양액을 1 ml 첨가하고, 단리세포로 모두 분리될 때까지 파스테르 피펫으로 뇌세포를 부서지게 하였다. 그런다음, 상피세포 성장인자를 첨가하고, 24공 (well) 플레이트에 공당 1/2 대뇌반구의 농도가 되도록 400 μl씩 분주하였다. 처음 2주간은 그냥 방치하고, 그 이후부터는 1주일마다 1회씩 총 배양액 부피의 2/3를 신선한 배양액으로 바꾸어주었다.

이렇게 하여 3 내지 6주 정도 성장한 글리아를 기질로 하여 신경세포를 배양하고자, 상기와 동일한 마취제를 사용하여 임신 14 내지 16일된 마우스로부터 무균적으로 임신된 자궁을 꺼낸 다음, 그로부터 마우스의 태아를 꺼내고 뇌를 적출하였다. 상기와 동일한 방법으로 대뇌피질 부위를 입체현미경하에서 미세핀셋으로 절단하고 단리세포화한 다음, 글리아 위에서 2 주 이상 배양하였다. 이때, 글리아의 성장배지는 모두 제거하고, 소와 말의 혈청이 각각 5% 포함된 MEM 배지를 400μl씩 분주하여 신경세포를 배양하였다. 또한, 배양 5 내지 7일째에 비신경세포의 성장을 억제하기 위해, 시토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside)를 첨가하였다.

상기와 같은 방법으로 배양하여 성숙된 대뇌피질 신경세포를 하기의 실시예에 사용하였다.

실시예 2: 정향 추출물/메탄올분획의 신경세포 보호효과 확인

흥분성 아미노산과 관련하여 허혈성 뇌졸중을 치료할 수 있는 약물을 천연물로부터 발견하고자, 여러 가지 천연물로부터 추출된 수용성 혹은 메탄올 엑스들이 흥분성 아미노산 유발 신경독성을 억제하는 정도를 하기와 같은 방법으로 측정하였다. 그 결과, 정향의 잎에서 추출한 수용성 혹은 50% 메탄올엑스가 가장 우수한 효과를 나타내었다. 그리고 정향의 여러 성분 가운데 어느 단일화합물이 유효한지를 알아보기 위한 중간 단계과정으로 정향 엑스의 분획별 유효활성성분의 이행정도를 알아본 바 메탄올 분획이 가장 우수한 뇌세포 손상억제 작용을 나타냄을 확인하였다.

하기 각 실시예에서 기술되는 정향 추출물에 의한 신경세포의 보호정도는 흥분성 아미노산에 의해 유발된 급성 및 지연성 신경독성에 대한 억제정도로서 다음과 같이 측정하였다: 흥분성 아미노산에 의한 신경세포의 급성독성은 글루타메이트의 수용체인 NMDA를 300 μM의 고농도로 신경세포에 5분정도 처리하고 20-24시간 경과하여, 신경세포막이 완전히 용해(cell lysis)되어 LDH(lactate dehydrogenase)효소가 배양액으로 분비되는 정도를 신경세포 신경세포 손상의 지표로 하여 측정하였다(참조: Koh & Choi, J. Neurosci. Methods 20:83-90, 1987). 아울러 흥분성 아미노산에 의한 신경세포의 지연성 독성은 NMDA 또는 non-NMDA(AMPA or kainate)를 10-30 μM 저농도로 신경세포에 장시간 처리하고 배양액에 존재하는 LDH양으로써 신경세포의 양을 측정하였다. 정향추출물이 흥분성 아미노산에 의해 유발된 급성 및 지연성 독성으로부터 세포를 보호하는 정도는 전기 흥분성 아미노산 수용체 효현제들과 정향추출물을 동시에 처리하여, 흥분성 아미노산 수용체 효현제들만 처리한 대조군과 비교함으로써 검정하였다.

도 2는 정향잎의 수용성추출물이 흥분성 아미노산의 대표적 수용체 가운데 하나인 NMDA에 의해 유발된 신경독성을 억제하는 정도를 나타내는 그래프이다. 이때, 대조군은 20 μM NMDA만을 처리한 경우이며, 정향의 수용성 추출물은 1 내지 100 μg/ml 처리 하였다. 제 2도에서 보듯이, 정향의 수용성 추출물은 신경독성을 용량의존적으로 억제함을 알 수 있으며, 특히 100 μg/ml의 정향추출물은 글루타메이트 수용체의 하나인 NMDA 수용체의 이온채널을 비경쟁적으로 차단하는 화합물로 알려진 MK-801 (Dizocilpine)이 10 μM 농도에서 갖는 약리활성효과와 비슷한 수준의 신경세포 보호효과를 나타냄을 알 수 있었다.

도 3은 정향잎의 50% 메탄올 추출물도 30 내지 100 μg/ml 투여농도에서 수용성 추출물과 비슷한 수준으로 NMDA 유발 지연성 신경독성에 대한 방어효과를 나타내었으며 48시간까지 그 효과를 유지함을 알 수 있으며, 특히 50 내지 100 μg/ml의 정향 추출물은 10 μM의 MK-801(Dizocilpine)이 갖는 약리활성 효과와 비슷한 수준으로 신경세포 보호효과를 나타냄을 알 수 있었다.

아울러, 우수한 신경세포의 보호효과를 나타내는 정향 분획을 얻기 위하여, 정향 잎을 여러 가지 용매로 추출하여 NMDA 유발 지연성 신경독성에 대한 방어효과를 조사한 결과는 도 4에서 알 수 있듯이 메탄올 분획에서 가장 우수한 신경세포 보호효과가 나타남을 관찰하였다. 도 5에서 보듯이, 정향의 메탄올 분획은 신경독성을 용량의존적으로 억제함을 알 수 있으며, 특히 100 내지 200 μM의 정향 메탄올 분획은 글루타메이트 수용체의 하나인 NMDA 수용체의 이온채널을 비경쟁적으로 차단하는 화합물로 알려진 MK-801(Dizocilpine)이 10 μM 농도에서 갖는 약리활성효과와 비슷한 수준의 신경세포 보호효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3: NMDA 유발 지연성 신경독성으로부터 뇌신경세포를 보호하는 단일 성분 오이게놀의 확인

정향의 수용성 및 50% 메탄올 추출물, 그리고 좀 더 정제과정을 거친 메탄올 분획을 대상으로 어느 화합물이 NMDA 유발 지연성 신경독성에 대한 방어효과를 가지는지 검색한 결과, 오이게놀이 뇌신경세포를 보호하는 것으로 확인되었다. 따라서, 이를 검증하기 위하여, 오이게놀 단일 성분만으로 NMDA에 의해 유발된 지연성 신경독성의 억제정도를 측정하였다(참조: 도 6). 도 6에서 보듯이, 오이게놀은 신경독성을 용량의존적으로 억제함을 알 수 있으며, 특히 300 μM의 오이게놀은 10 μM의 MK-801(Dizocilpine)이 갖는 약리활성 효과와 비슷하게 우수한 신경세포 보호효과를 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 오이게놀에 의한 NMDA 유발 지연성 신경독성의 방어효과는 신경세포 특이면역항체(Neuron Specific Enolase, NSE)를 이용한 염색을 통하여 보다 명백히 확인되었다. 즉, 20 μM NMDA만을 처리한 대조군에서는 신경세포체의 소실과 신경돌기의 손상을 관찰할 수 있는 반면, 300 μM의 오이게놀도 함께 처리한 군에서는 정상적인 신경세포를 관찰할 수 있었다.

실시예 4: 오이게놀에 의한 AMPA 유발 지연성 신경독성의 방어효과

오이게놀은 상기의 실시예에서 기술한 NMDA 유발 지연성 신경독성 뿐만 아니라, non-NMDA 수용체인 AMPA 유발 지연성 신경독성을 억제하는지 알아보기 위하여, 흥분성 아미노산 수용체 효현제인 NMDA 대신에 AMPA를 사용하여 실험하였다(참조: 도 7). 이 실험에서는 NMDA 수용체의 관여를 배제하기 위해 대조군 및 실험군에 10 μM의 MK-801을 첨가하였다. 도 7에서 보듯이, 오이게놀은 AMPA에 의한 신경독성을 용량의존적으로 억제함을 알 수 있으며, 특히 300 μM의 오이게놀은 non-NMDA 수용체인 AMPA 수용체의 이온채널을 비경쟁적으로 차단하는 화합물로 알려진 DNQX(6,7-dinitroquinoxaline-2,3(1H,4H)-dione) 50 μM 농도에서 갖는 약리활성의 약 30% 정도에 해당하는 신경세포 보호효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 5: 오이게놀 및 오이게놀 유도체에 의한 NMDA 유발 급성 신경독성의

방어효과

상기 실시예 2에서 언급한 방법으로, 오이게놀이 흥분성 아미노산 NMDA에 의한 신경세포의 급성독성으로부터 신경세포를 보호하는 정도를 측정하였다. 300 μM NMDA를 신경세포에 5분간 노출시킨 결과, 신경세포의 밀도에 따라 40 내지 90%의 사망률을 나타내었으며, 신경세포의 배양시기가 오래되거나 밀도가 높을수록 신경세포의 손상이 더 민감함을 알 수 있었다.

도 8은 오이게놀이 흥분성 아미노산 수용체 효현제인 NMDA에 의해 유발된 급성신경독성을 억제하는 정도를 나타내는 그래프이다. 도 8에서 보듯이, 오이게놀은 신경독성을 용량의존적으로 억제함을 알 수 있으며, 특히 300 μM의 오이게놀은 10 μM의 MK-801(Dizocilpine)이 갖는 약리활성 효과와 비슷한 수준으로 우수한 신경세포 보호효과를 나타냄을 알 수 있었으며, 5분간의 NMDA 손상시만 오이게놀을 동시에 처리한 군보다 NMDA 손상후에도 오이게놀을 처리한 군에서 보다 더 방어효과가 우수함을 나타냄을 알 수 있었다. 도 9 및 도 10은 오이게놀의 유도체인 미리스티신(Myristicin) 및 4-알릴아니솔(4-allylanisole)도 각각 용량의존적으로 NMDA에 의해 유발된 급성신경독성을 억제하는 정도를 나타내는 그래프이다. 그리고 오이게놀과 마찬가지로 특히, 미리스티신은 300 μM의 투여농도에서, 4-알릴아니솔은 100 내지 300 μM의 투여농도에서 10 μM의 MK-801(Dizocilpine)이 갖는 약리활성 효과와 비슷한 수준으로 우수한 신경세포 보호효과를 나타냄을 알 수 있었다. 그리고 300 μM의 투여농도에서 α-아사론, β-아사론, 이소오이게놀등의 다른 오이게놀 유도체들도 10 μM의 MK-801(Dizocilpine)이 갖는 약리활성 효과와 비슷한 수준으로 유의한 신경세포 보호효과를 나타냄을 알 수 있었다(참조: 도 11). 따라서, 오이게놀 뿐만 아니라 오이게놀 유도체도 흥분성 아미노산 유발 신경독성의 저해제로 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 6: 허혈성 손상(ischemic injury)의 실험실적 모델(in vitro)을 이용 한 오이게놀의 효능검정

일반적으로 알려진 하기와 같은 실험실적 뇌졸중 모델을 이용하여 오이게놀의 효능을 검정하였다: 산소가 거의 없는(>0.2% O₂) 혐기성 챔버내에서 실시예 1의 뇌신경세포를 배양하고, 산소가 결핍된 혐기성의 혼합가스(수소:이산화탄소:질소 = 10%:5%:85%)로 포화된 포도당 결핍의 HCSS 배양액으로 교환하고 37℃에서 50분 방치한 다음, 다시 포도당과 산소가 함유된 MEM 배양액으로 교환하였다. 이렇게하여 결정된 신경세포의 손상정도는 약 50%이었으며, 혐기성 챔버에서의 신경세포 배양시 300 μM의 오이게놀을 함께 첨가한 경우는 MK-801(Dizocilpine)을 첨가한 경우(80% 손상억제) 보다는 정도가 약하지만 신경세포손상을 유의한 정도로 억제(60% 손상억제)됨을 확인할 수 있었다(참조: 도 12).

실시예 7: 오이게놀에 의한 급성 NMDA 유발 신경세포내⁴⁵Ca⁺²섭취증가의 억 제효과(오이게놀의 NMDA 수용체 조절능력 확인시험)

흥분성 아미노산 수용체인 NMDA를 300 μM 농도로 5분간 배양 신경세포에 처리시 동시에 방사성 동위원소에 표지된 칼슘이온(⁴⁵Ca⁺²)을 첨가하면 칼슘이온이 신경세포내로 다량 유입되는데, 이 실험을 통해서 오이게놀이 NMDA 수용체를 직접 조절하는지를 확인할 수 있다. 이 때 300 μM의 오이게놀을 동시에 투여하였을 시 30%정도의 유의한⁴⁵Ca⁺²흡수억제효과를 나타내었다. 이 결과는 비경쟁적 NMDA 수용체 차단제인 10 μM의 MK-801(Dizocilpine)을 투여시 신경세포내로⁴⁵Ca⁺²흡수를 완전히(100%)억제한 결과와 비교시, 오이게놀은 MK-801과는 달리 NMDA 수용체에 대한 직접적인 조절작용이 부분적으로 나타나는 것을 알 수 있었다(참조: 도 13).

실시예 8: 오이게놀에 의한 라디칼 유발 신경독성의 방어효과

오이게놀이 라디칼에 의해 유발된 신경세포의 손상을 억제하는지 알아보기 위하여, 1) 슈퍼옥사이드 라디칼 유발 신경독성 억제효과 검정(참조: 도 14), 2) 아라키돈산 유발 신경독성 억제효과 검정(참조: 도 15), 3) 과산화수소(H₂O₂) 유발 신경독성 억제효과 검정(참조: 도 16), 4) 하이드록실 라디칼 유발 신경독성 억제효과 검정(참조: 도 17), 5) 내인성 항산화효소인 글루타치온을 고갈시키는 부치오닌 설폭시민(buthionine-S,R-sulfoximine, BSO)에 의한 신경독성 억제효과 검정(참조: 도 18)등 여러 가지 라디칼 손상모델을 통해 오이게놀의 방어효과를 조사하였다.

먼저, 오이게놀이 슈퍼옥사이드 라디칼 유발 신경손상에 대해 방어효과를 나타내는지를 조사하기 위해, 0.5 mM 크산틴(xanthine), 10 mU/ml 크산틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 및 30 내지 300 μM의 오이게놀을 HCSS 배양액내에서 신경세포에 처리하고 10 분간 경과한 다음, HCSS 및 MEM 용액으로 교환하고 20 내지 24시간 뒤 슈퍼옥사이드(superoxide) 라디칼에 의해 손상된 신경세포의 정도를 배양액에 존재하는 LDH 양으로써 측정하였다(참조: 도 14). 도 14에서 보듯이, 오이게놀을 첨가하지 않은 대조군에서의 신경세포 손상정도는 약 80 내지 90%이었으며, 100 내지 300 μM의 오이게놀을 첨가한 경우는 슈퍼옥사이드 스캐빈져로 알려진 알로퓨리놀(allopurinol) 10 μM 농도를 첨가한 경우와 마찬가지로 세포손상이 유의한 정도로 억제됨을 확인할 수 있었으며 NMDA 수용체 차단제인 MK-801(Dizocilpine)은 억제작용을 보여주지 않은 것으로 보아 오이게놀은 NMDA 수용체를 부분적이지만 직접조절하는 능력을 가지고 있을 뿐만 아니라 이로 인한 슈퍼옥사이드 라디칼의 생성을 차단하는 기능도 지니고 있음을 보여주었다.

오이게놀이 반응성 산소 유리기(reactive oxygen species) 생성을 자극하는 아라키돈산 유발 신경손상에 대해 방어효과를 나타내는지를 조사하기 위해, 50 μM 농도의 아라키돈산을 24시간 MEM 배양액내에서 노출시키고 300 μM의 오이게놀을 동시에 처리하여 20 내지 24시간 뒤 손상된 신경세포의 정도를 배양액에 존재하는 LDH 양으로써 측정하였다(참조: 도 15). 도 15에서 알 수 있듯이, 오이게놀을 첨가하지 않은 대조군에서의 신경세포 손상정도는 약 80 내지 90%이었으며, 300 μM의 오이게놀을 첨가한 경우는 리포옥시게네이즈(lipoxygenase) 억제제로 알려진 에스큘레틴(esculetin) 10 μM 농도를 첨가한 경우와 비슷하게 세포손상이 유의한 정도로 억제됨을 확인할 수 있었다.

오이게놀이 과산화수소(H₂O₂)로 인한 산화스트레스 신경손상에 대해 방어효과를 나타내는지를 조사하기 위해 300 μM 농도의 과산화수소(H₂O₂)를 HCSS 배양액내에서 노출시키고 이때, 10 내지 300 μM의 오이게놀을 동시에 처리하여 30분 뒤 HCSS 및 MEM 배양액으로 교환하고 20 내지 24시간 뒤 손상된 신경세포의 정도 및 방어효과를 배양액에 존재하는 LDH 양으로써 비교측정하였다(참조: 도 16). 도 16에서 알 수 있듯이, 오이게놀을 첨가하지 않은 대조군에서의 신경세포 손상정도는 약 80 내지 90%이었으며, 오이게놀을 첨가한 경우는 농도의존적으로 세포손상이 유의하게 억제됨을 알 수 있었다. 과산화수소로 인한 신경손상 모델이 잘 일어나는지는 이를 억제하는 물질로 알려진 카탈레이즈(catalase)효소 첨가로 완전히 차단되는지를 확인하여 실험을 수행하였다.

오이게놀이 하이드록실 라디칼 유발 신경손상에 대해 방어효과를 나타내는지를 조사하기 위해 50 μM의 염화제이철(ferric chloride), 25 μM의 아스코르브산 및 100 내지 300 μM의 오이게놀을 HCSS 배양액내에서 신경세포에 처리하고 120 분간 경과한 다음, HCSS 및 MEM 용액으로 교환하고 20 내지 24시간 뒤 하이드록실 라디칼에 의해 손상된 신경세포의 정도 및 방어정도를 배양액에 존재하는 LDH 양으로써 측정하였다(참조: 도 17). 도 17에서 보듯이, 오이게놀을 첨가하지 않은 대조군에서의 신경세포 손상정도는 약 70% 이었으며, 100 내지 300 μM의 오이게놀을 첨가한 경우 농도의존적으로 세포손상이 유의하게 억제됨을 확인할 수 있었으며 특히, 300 μM 농도의 오이게놀 첨가한 경우는 하이드록시 라디칼 스캐빈져로 알려진 deferoxamine 500 μM 농도를 첨가한 경우와 마찬가지로 세포손상이 유의할 정도로 억제됨을 확인 할 수 있었다.

내인성 글루타치온을 고갈시켜 신경세포의 라디칼 손상을 촉진시키는 것으로 알려진 부치오닌-S,R-설폭시민(buthionine-S,R-sulfoximine)을 48시간 처리하여 30%의 신경손상을 유발시킨 상태에서 오이게놀을 30 내지 300 μM 농도로 동시에 처리시 농도의존적인 신경손상 억제효과를 나타내었으며 300 μM 농도에서 유의한 방어효과를 나타내었다(참조: 도 18).

이상의 여러 가지 유리 라디칼 생성으로 인한 신경세포의 손상모델에서 오이게놀에 의한 방어효과는 신경세포 특이면역항체 혹은 트리판블루를 이용한 염색을 통해 보다 명백히 확인하였으며, 각각의 대조군에서는 신경세포체의 소실과 신경돌기의 손상을 관찰할 수 있는 반면, 오이게놀 처리군에서는 기존의 알려진 방어물질과 마찬가지로 정상적인 신경세포들을 관찰할 수 있었다.

따라서, 오이게놀은 각종의 라디칼 스카벤져로 작용하여 흥분성 아미노산으로 인한 신경독성을 억제할 수 있다는 가능성을 제시하였다.

실시예 9: 오이게놀의 신경세포에 대한 독성측정

정향의 단일 화합물인 오이게놀 자체가 지니는 독성을 측정하기 위하여, 10 내지 300 μM의 오이게놀을 배양신경세포에 처리하고 배양액에 존재하는 LDH 양을 측정하였다(참조: 도 19). 도 19에서 보듯이, 오이게놀 처리후 1일 경과한 경우, 세포독성은 거의 없거나 아주 미미한 정도만을 나타내었으며, 이러한 결과는 처리 2일째까지 유지됨을 알 수 있었다.

실시예 10: 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke) 생체내(in vivo) 모델을 이용한 오이게놀의 효능 검정

오이게놀이 허혈성 뇌졸중의 생체내 모델인 모래쥐(Mongolain gerbil)에서 유발된 뇌의 해마 CA1 부위(단기기억을 관장하는 뇌 주요 부위) 신경세포손상을 억제하는지 알아보기 위하여, 체중 60 내지 80g의 모래쥐를 70% 질소와 30%의 산소로 조성된 혼합가스에 3% 이소플루란(마취유지는 2.5% 이소플루란으로 함)을 첨가하여 마취를 유도한 다음, 수술현미경 하에서 양측경동맥이 노출되도록 1.5cm의 길이로 경부중앙부를 절개하여 총경동맥을 노출시켰다. 미주신경을 총경동맥과 분리하고 동맥클립으로 5분간 양측동맥의 혈류를 차단하여 허혈을 유발하였고, 그 뒤 원 상태로 하여 혈액이 재관류가 되도록 한 다음, 봉합하여 7일 뒤에 펜토바비탈 소디움 (50mg/kg, 복강내주사)으로 마취하에 심실중격을 통해 전신으로 4% 포름알데히드로 고정시킨 다음 30%의 슈크로오스에 뇌조직을 넣어 냉장상태에서 2일동안 방치하였다. 뇌조직은 30 μm 두께로 절편을 만들고 해마의 CA1 부위를 크레실 바이올렛으로 염색하였으며 1 mm 길이당 살아있는 신경세포수를 계산하여 각 그룹간 비교를 실시하였다.

전신성뇌허혈로 인한 모래쥐의 체온상승변화에 미치는 오이게놀의 농도별 영향관찰 결과는 도 20a 및 도 20b에 나타내었는데, 도 20a는 직장체온의 일정한 인위적 조절이 없는 자연상태조건에서 측정하였고, 도 20b는 직장체온의 일정한 조절이 있는 조건에서 측정하였으며, 모래쥐의 직장체온을 37℃로 유지한 시간은 양측 경동맥을 결찰한 후 5분간 그리고 혈류차단을 중지하고 혈류를 재관류시킨 후 25분간 동안을 포함하여 총 30 분간이었다. 오이게놀은 투여용량(50 내지 200 mg/kg, 복강주사)에 비례하여 전신성 뇌허혈시 일어나는 체온상승을 억제하였으며, 특히 뇌허혈 유발 후 30분째에 이러한 체온상승 및 오이게놀 투여로 인한 저체온현상이 가장 뚜렷하게 관찰되었다. 특히 일정한 체온조절(37℃)을 유지한 동물에서의 오이게놀 투여로 인한 저체온 효과가 인위적 체온조절이 없는 조건에서 보다 훨씬 더 심한 체온강하효과를 나타내었다. 자연상태 및 체온조절조건하(37℃, 30분)에서 모래쥐에 전신성뇌허혈 유발시 해마 CA1부위 신경세포의 손상에 대한 오이게놀의 방어효과 실험 결과(참조: 도 21), 직장온도 비조절군에서 전신성뇌허혈로 인한 해마 CA1부위 신경세포 손상에 대해 오이게놀(50, 100, 200 mg/kg) 투여시 농도의존적인 신경세포 방어효과를 각각 나타내었으며(26%, 43%, 68%의 신경세포가 생존 vs. 뇌허혈대조군은 샴(sham, 가짜수술군으로 100% 신경세포생존을 보였음) 수술군에 비해 12%만 생존, 각군에서 유의한 손상억제를 나타내었다. 그러나 직장온도를 전신성뇌허혈 유발후 37℃로 30분간 유지시켰던 군에서는 50 mg/kg 투여농도에서는 유의한 신경손상 억제효과가 없었으며 100 내지 200 mg/kg 투여용량에서만 각각 32% 내지 52%의 생존율을 나타내어 유의한 방어효과를 보여주었다. 이러한 현상은 허혈시 직장체온을 38℃의 고체온으로 하였을시 두 조건 모두에서 신경세포의 유의한 방어효과는 소실되었다. 이것은 뇌허혈이 일어나는 동안에 체온상태의 변화가 해마 CA1부위의 뇌신경세포의 손상에 결정적으로 관여한다는 것을 보여주었다.

자연상태 및 체온조절상태에서 전신성뇌허혈 유발로 인한 해마 CA1부위 신경세포손상 및 오이게놀(200 mg/kg) 투여시 방어효과에 대한 조직학적 염색(크레실 바이올렛) 시 소견에 대한 대표적 현미경사진으로 확인하였다. 샴 수술을 받은 정상 모래쥐의 해마의 배측(dorsal) 단면을 크래실 바이올렛으로 조직염색을 실시하여 CA1 부위의 신경세포 수를 계산한 바 263±11 개/mm를 나타내었다. 그러나 5분간 양측 경동맥을 동맥감자를 사용하여 혈류를 차단하고 전신성뇌허혈을 유발시킨 다음, 다시 재관류시키는 방법을 사용하여 7일 뒤 해마의 조직학적 소견 및 CA1 부위만이 특징적인 신경세포손상을 받았으며, 그 손상정도를 측정한 바 31±5 개/mm로 정상 신경세포의 88%가 소실되었으며 약 12%의 신경세포만이 정도만이 살아남았음을 알 수 있었다. 온도조절이 없는 자연상태에서 전신성 뇌허혈을 유발시 오이게놀을 200 mg/kg 용량으로 투여시 해마 CA1 부위의 신경세포가 정상군의 68%(179±37 개/mm) 정도가 생존하였다. 그러나 전신성뇌허혈시를 포함한 재관류후 30분간을 37℃로 유지하였을시, 자연상태의 뇌허혈후 저체온보다 더 심한 저체온 현상을 보였으나, 생존한 신경세포의 숫자는 136±59 개/mm로서 정상군의 신경수의 52%가 정상 신경세포 모양을 나타내었다(참조: 도 21).

실시예 11: 흥분성 아미노산 수용체 효현약물(NMDA 혹은 카이네이트)로 유발 된 생체내(in vivo) 경련모델에서의 오이게놀 혹은 오이게놀 유 도체의 효능검정

오이게놀 또는 오이게놀 유도체가 흥분성 아미노산 수용체 효현약물에 의해 마우스에서 유발된 신경독성을 억제하는지 알아보기 위하여, 마우스의 뇌실내로 흥분성 아미노산 수용체 효현약물을 투여하여 경련을 유발시켰다.

도 22는 0.3 μg NMDA를 BALB/c 웅성 마우스의 뇌실내에 투여하기 30분 전에 오이게놀을 복강투여한 마우스 군에서의 경련억제 정도를 나타낸 그래프이다. 도 22에서 보듯이, 오이게놀은 경련 발현을 용량의존적으로 억제함을 알 수 있으며, 0.2 내지 0.3g/kg의 오이게놀은 유의한 억제효과를 나타내어 경련 발현시간이 2 배로 연장됨을 알 수 있었다.

도 23은 non-NMDA 수용체 효현약물인 카이네이트(kainate) 0.5 μg을 BALB/c 웅성 마우스의 뇌실내에 투여하기 30분 전에 오이게놀을 0.1g/kg을 복강 투여한 마우스 군에서의 경련억제 정도를 나타내는 그래프이다. 도 23에서 보듯이, 오이게놀은 경련발현을 유의한 정도로 억제함을 알 수 있었다.

도 24는 0.1 μg NMDA를 BALB/c 웅성 마우스의 뇌실내에 투여하기 30분 전에 오이게놀 유도체인 이소오이게놀을 복강투여한 마우스 군에서의 경련억제 정도를 나타낸 그래프이다. 도 24에서 보듯이, 이소오이게놀은 경련 발현을 용량의존적으로 억제함을 알 수 있으며, 0.5g/kg의 이소오이게놀은 유의한 억제효과를 나타내어 경련 발현시간이 6 배로 연장됨을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 오이게놀 또는 그의 유도체를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌졸증 개선치료제를 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 흥분성 아미노산에 의해 유발된 지연성 또는 급성의 신경세포 독성을 그 원인으로 하는 허혈성 뇌졸증을 유의한 수준으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Claims (4)

1. 오이게놀(eugenol) 또는 오이게놀 유도체를 유효성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 허혈성 뇌졸중 개선치료제.
2. 제 1항에 있어서,

   허혈성 뇌졸중은 흥분성 아미노산에 의해 유발되는 급성 또는 지연성 신 경독성(neurotoxicity)이 그 원인인 것을 특징으로 하는

   허혈성 뇌졸중 개선치료제.
3. 제 1항에 있어서,

   오이게놀 유도체는 미리스티신(myristicin), α-아사론(α-asarone: 1,2,4-trimethoxy-5-propenylbenzene), 4-알릴아니솔(4-allylanisole), β-아사론(β-asarone: cis-2,4,5-trimethoxypropenylbenzene) 및 이소 오이게놀(isoeugenol)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는

   허혈성 뇌졸중 개선치료제.
4. 제 2항에 있어서,

   흥분성 아미노산은 결합 수용체 NMDA(N-methyl-D-aspartate), AMPA(α -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate) 또는 카이네이트 (kainate)인 것을 특징으로 하는

   허혈성 뇌졸중 개선치료제.