KR20000022067A - 살균 조성물 - Google Patents

Abstract

수용성 폴리머와 유효성분인 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene을 갖는 살균제가 박테리아나 진균 오염원의 조절을 위해 배지의 화학적 살균제로 사용되기 위해 제공된다.

본 발명은 비록 고체나 액체 배지의 살균을 위해 사용될 수 있지만, 특히 체외 배양 식물의 생산에 유용하다. 그리고 놀랍게도 본 발명의 이용은 완벽하게 배지가 필요로 하는 종래의 살균 과정들을 완벽하게 대치할 수 있다. 더더욱, 농작물들의 체외 식물들의 고착 과정에서 필요한 호르몬들의 추가를 대치할 수 있다.

Description

살균 조성물

예를들면, "체외"(in vitro)에서 배양된 식물들의 생산에 있어 배지의 오염은 단지 고압살균기에 의해서 순간적인 오염만을 제거하기 때문에 전 생산과정에 실질적 소실을 야기한다. 어떤 경우에 다른 항생제들, 예를 들면 세포탁심(cefotaxim), 노보비오신(novobiocin)과 디히드로스트렙토마이신(dihydrostrept omycin)이 오염을 방지하기 위해 사용되고 있으나, 만족스럽지 못하다.

반면, 특허출원 WO89/11793은 광범위한 산업 살균제(antimicrobial agent)로서 2-(2-bromo-2-nitroethenyl)-furan의 사용을 개시하고 있다.

합성물 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene은 이미 개시되어 있다(Z.N.나자로바(Nazarova), 1972. "잠재적인 생물학적 활성을 갖는 푸릴니트로올레핀들(furylnitroolefins)의 합성"; Khim. Farm. Zh. 6(10), pp.5-8과 Z.N.나자로바 등, 1972. "푸릴니트로올레핀계의 물리화학적 특성과 반응성, Zh.org.Khim.8(2), pp. 404-11). 그리고 합성물 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene은 항박테리아와 항진균 활성성을 갖는 강력한 제제(agent)로서 또한 알려져 있다(유럽특허출원 번호. EP-A 0 678 516).

본 발명은 미생물학 분야, 특히 유효성분(active principle)으로서 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene를 함유하는 살균 조성물에 관한 것이다. 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene는 박테리아나 진균 오염원의 조절를 위한 배지(culture media)의 화학 살균제로 사용된다.

본 발명은 배지의 박테리아나 진균 오염원들을 조절하기 위해 유익하게 사용될 수 있는 살균 조성물을 제공한다.

본 발명은 비록 고체나 액체 배지의 살균을 위해 사용될 수 있지만, 특히 체외 배양 식물의 생산에 유용하다. 그리고 놀랍게도 본 발명의 이용은 완벽하게 배지가 필요로 하는 종래의 살균과정들을 완벽하게 대치할 수 있다. 더더욱, 농작물들의 체외 식물들의 고착 과정에서 필요한 호르몬들의 추가를 대치할 수 있다.

고체 배지에서 살균제로서 이 유효성분의 사용에 대한 주요한 한계는 액체 배지에서 0에 가까운 물에 대한 용해도와 감소된 용해속도이다. 이 문제에 대한 가능한 해답은 고체분산(solid dispersion)일 수 있다. 이 고체분산은 분자 수준까지 입자 크기를 줄일 수 있다.

본 발명에서 제시되는 방법은 살균제로 유효성분인 합성물 1-(5-brom ofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene를 함유하는 살균 조성물을 제공한다. 또한 이 방법은 생리적으로 불활성이고 물에 쉽게 용해되는 기질(matrix)에서 이 합성물의 용해(fusion) 또는 공침전(co-precipitation)에 의한 분산이다. 이 기질은 큰 분자량을 가진 폴리에틸렌 글리콜과 다른 폴리머들(polymers)에 의해 형성된다.

1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene의 용해에 의한 분산을 행하기 위해서, 교반시간들 뿐만 아니라 제조방법들과 온도를 선택하는 것은 유효성분과 정선된 폴리머들의 녹는 점과 열적 안정성에 기초를 두고 있다.

합성물 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene은 분해되지 않은 채 89-90℃에서 녹고, 110℃까지는 열적으로 안정된다.

그러나, 녹는 점이 110℃보다 높은 폴리머들에 의한 유효성분의 고체 분산 체계들의 완성은 유효성분의 열적 안정성에 영향을 미치므로 용매에서의 공침전법이 추천된다.

1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene의 용해에 의한 분산을 행하기 위해, 1:20 내지 1:1의 비율의 유효성분과 PEG-6000의 물리적 혼합물이 60-80℃에서 용해 때까지 가열되고 용융이 전체적으로 균질화될 때까지 15분동안 일정하게 교반한다. 그후에, 녹은 혼합물은 차가운 스테인레스 강철판 상에 박편(thin layer)이 되도록 부어 펼쳐서 응결 과정의 속도를 보장한다(ensured). 얻어진 고체는 분쇄기에서 가루로 만들고 0.2mm보다 작은 입자 크기로 스크린한다.

유효성분과 PEG-6000의 고체 분산물의 녹는 점의 범위는 혼합물의 조성에 따라 변한다. 즉, 조성이 이원체계인 유효성분-PEG-6000 공융 조성(eutectic composition)과 일치하는 30%의 용해 분산에 의한 고체 분산물의 녹는 점은 53-54℃이다.

1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene의 공침전에 의한 분산을 행하기 위해, 1:20 내지 1:1의 비율의 유효성분과 폴리머의 혼합물이 10-60분 동안 40 내지 60℃ 사이의 온도 범위에서 가열된 극성 용매에서 용해되었다. 그후에, 40-80℃로 온도를 조절하며 진공-회전증발되었다(vacuum-rotoevaporated). 얻어진 고체를 분쇄기에서 가루로 만들고 0.2mm보다 작은 입자 크기로 스크린한다.

1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene를 함유하는 액체 배지의 완성을 위해, 이 합성물은 솔루톨 IIS-15(solutol IIS-15)와 크레모퍼(Cremopher) 등과 같은 신장성 합성물(tensioactive compound)을 사용한 수용성 제제(aqueous formulation)에 첨가되었다. 이 조성물들이 합성물의 높은 안정성과 용해성과, 상기 배지에서 배양된 생물체에 악영향을 미치지 않는 농도를 찾기 위해 준비되었다.

일단 위에서 기재된 방법을 사용하여 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo- 2-nitroethene을 함유하는 안정된 조성물이 얻어지면, 다른 연구들이, 특히 합성물을 "체외" 배양된 식물들의 증식을 위해 사용된 고체 배지의 살균제로 사용할 때의 최적 투여량을 알기 위해 행해진다. 식물독성(phytotoxicity)은 (감자에 대하여) 괴사(necrosis), 백화(chlorosis), 증식 계수(multiplication coefficient)와 접합거리(junction-junction distance)에 대하여 측정되었다.

연구된 배양체들(바나나, 감자와 사탕수수)에 대하여, 1-(5-bromofur -2-yl) -2-bromo-2-nitroethene의 최적 투여량은 30 내지 45㎍/㎖ 사이의 범위에 있었다.

다음의 실시예들은 본 발명을 나타내기 위한 것으로 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1: 온도와 시간이 용해법에 의해 얻어진 고체 분산물의 순도에 미치는 영향.

온도와 시간이 용해법에 의해 얻어진 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo- 2-nitroethene를 함유한 조성물의 순도에 미치는 영향에 대한 연구가 행해졌다.

얻어진 고체 분산물에서 유효성분의 순도는 사용된 온도와 교반시간에 달려있다는 것이 관찰되었다.

표 1은 PEG-6000에서 이 합성물(30:70, 합성물이 30에 해당함)의 고체분산에 의해 얻어진 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene 순도 퍼센트를 나타내고 있다. 이때 용융온도는 80℃ 내지 120℃이었고, 교반 시간은 15분 내지 60분이었다.

모든 경우에서의 연구는 아래 기재된 것처럼 행해졌다.

80℃의 온도와 15분의 교반시간에 대하여, 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo- 2-nitroethene와 PEG-6000(30:70)의 물리적 혼합물은 용융될 때 까지 가열되었고, 용융물의 완전한 균일화에 도달할때까지 15분 동안 일정하게 교반되었다. 용융된 혼합물은 차가운 스테인레스 강철판 상에 박편이 되도록 부어졌다. 그리고 얻어진 고체는 분쇄기에서 가루가 되었고, 0.2mm보다 작은 입자 크기로 스크린되었다.

위의 조건 하에서 얻어진 분산물 속의 유효성분의 순도는 기체 크로마토그래피에 의해 측정되었으며, 99.89%였다.

[표 1]

온도와 시간이 용해법에 의해 얻어진 고체 분산물의 순도에 미치는 영향

온도(℃)	시간(분)	순도(%)
80	15	99.89
80	30	99.61
80	60	99.22
100	15	99.00
100	30	98.35
100	60	97.21
120	15	90.58
120	30	78.19
120	60	63.85

실시예2: 용해 또는 공침전에 의한 분산과정들 이후 1-(5-bromofur-2-yl)-2- bromo-2-nitroethene의 용해특성의 측정

용해특성들은 유효성분의 수용성인 균질화된 용액들/현탁액을 얻는데 있어 중요하다.

표 2는 가습되거나 미분되었거나(micronized) 표준 입자 크기를 갖고있거나 30%의 PEG-6000에 의한 고체 분산물을 사용한 유효성분의 용해 속도들에 대한 비교이다. 유효성분 특성이 의미있을 정도로 어떻게 개선되어 배지에서 분산 속도와 균질화를 보장할 수 있는지가 명확해질 것이다.

[표 2]

여러 형태료 배지에 존재하는 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene의 용해 속도 측정

시간
	10%	50%	90%
유효성분 입자 크기: 0.1-0.2mm	1시간 미만	12시간 미만	48시간 미만
미분된 유효성분	30분 미만	6기간 미만	24시간 미만
가습된 유효성분	15분 미만	3시간 미만	6시간 미만
고체 분산물30%의 유효성분-PEG-6000	5초 미만	10초 미만	15초 미만

실시예3: PEG에서 분산/희석된 유효성분의 화학적 안정도의 측정

폴리에틸렌 글리콜에서 용해-분산된 유효성분의 화학적 안정도는 양적인 분석법으로 기체 크로마토그리피을 사용하여 연구되었다.

385일 계속된 화학적 안정도 연구는 분해(decomposition)가 일어나지 않음을 입증한다.

[표 3]

기체 크로마토그래피에 의한 30%의 PEG-6000에서의 고체 분산물의 유효기간(shelf) 화학적 안정도의 측정

시간(일)	0	60	90	120	150	210	306	385
%유효성분	28.6	28.9	29.9	28.8	29.0	29.0	29.3	28.9

실시예4: 선택된 미생물에 대한 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene를 함유하는 제제의 활성

제제 연구를 마친 후에, 체외 분석이 농업 병원균들과, 체외 배양 식물들의 생산과정에 존재하는 오염 미생물들에 대한 생산물의 활성을 측정하기 위해 행해졌다. 박테리아의 연구는 E. 실베이라(Siveira)에 의해 변형된(실베이라 E. 등, 실제적인 생물활성의 최소 농도 억제자(M.C.I)의 측정, Boletin Cientifico ISCM IV (2), 1986) 튜브들 내에서의 연속희석(serial dilution)에서 의해 행해졌다(베일리.W.R과 스콧.E.S. 증세 미생물학 4판, pp.313-329, C.V 코스비사, 세인트루이스, 1974). 그리고 진균에 대한 활성은 콜로니의 지름성장을 통해 측정되었다(Casadens II: Metodo de investigaciones. Instituto Iberoamericano de cooperacion para Agriculture. San Jose de Costa Rica, 1985).

생성물의 생물활성을 측정하기 위해 사용된 농도는 1-100㎍/㎖이었다. 배지, 온도와 항온배양 시간간격은 분석된 미생물의 조건들이나 특성에 맞추었다.

LD_{_50}은 프로비트법(Probit's method)에 의해 ㎍/㎖로 계산되었다(피니 D. J.(Finney D. J.). 프로비트 분석법. 3판. 캠브리지 대학출판부, 1971).

이 연구로부터 얻어진 결과들이 표 4에 도시되어 있다.

[표 4]

농업적으로 중요한 미생물들에 대한 연관된 LD_{_50}값에 의해 행한 체외 실험

1.1. 그램 음성 박테리아	LD_50(㎍/㎖)
1.1.1.슈도모나하세애 목(Pseudomonadaceae family)
산토모나스 베시카토리아(Xanthomonas vesicatoria)	15-25
슈도모나 시코리이(Pseudomona cichorii)	15-25
1.1.2. 엔테로바세리아세애 목(Enterobaceriaceae family)
에르위니아 크리산테미(Erwinia Chrysanthemi)	20-30
그램 음성 바실러스(식물 오염원)	20-30
1.2. 그램 양성 박테리아
1.2.1. 바시라세애 목(Bacillaceae family)
그램 음성 바실러스(식물 오염물)	20-30
2.1.모노모픽 효모유사 진균(Monomorphic yeastlike fungi)
2.1.1.데마티아세애 목(Dematiaceae family)
알터나리아 폴리(Alternaria porri)	1.9-2.5
알터나리아 솔라니(Alternaria solani)	1.5-2.3
2.1.2.피티아세애 목(Pythiaceae family)
피토프토라 파라시티카(Phythophtora parasitica)	1.9-3.2

2.1.3.투베르규라리아세애 목(Tuberculariaceae family)
푸사리움 옥시스포리움(Fusarium oxysporium)	10.4-11.5
2.1.4.멜란코니아세애 목(Melanconiaceae family)
콜레토트리춤 글로레스포리오이드(Colletotrichum gloesporioedes)	1.0-1.8
2.1.5.에스틸바세애 목(Estilbaceae family)
스크레로디움 롤피이(Sclerotium rolfii)	0.2-0.9
2.1.6.도티데아세애 목(Dothideaceae family)
미코스패레라 무시코라(Mycosphaerella mussicola)	3.0-7.0
미코스패레라 리지엔시스(Mycosphaerella fijiensis)	3.0-7.0
2.1.7.모니리아세애 목(Moniliaceae family)
아스레르질러스 니거(Aspergillus niger)	15.5-17.5
페니시리움 종(Penicillium sp)	15.6-18.5
크라도스포리움 종(Cladosporium sp)	10.6-11.4

실시예5: 체외 배양된 식물들의 생산에 사용되는 배지에 미치는 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene의 활성의 측정

바나나들이나 감자들, 사탕수수들의 체외 육성의 진균이나 박테리아 오염원들에 대한 유효성분의 체외 활성을 입증한 후에, 우리는 다음과 같이 진행했다:

체외 식물들의 생산에 사용될 플라스크들과 뚜껑들의 적절한 세척이 세척제를 사용하여 이들을 충분한 물로 세척하고, 병들을 0.5% 아염화 나트륨에 3분 이상을 담그므로 행해졌다. 다음으로, 플라스크들은 뒤집어 놓였고 24시간 전에 완전히 건조해져 사용될 수 있었다.

일단 배지가 준비되고 대략 60-80℃에 도달하면, 35㎍/㎖의 농도를 얻기 위해 제제의 필요한 양이 첨가되고, 24후에 육성 공정을 진행하는 플라스크 각각에 필요한 부피(volume)가 부어졌다.

농도는 연구된 배지에서의 유효성과 식물독성효과(phytotoxic effects)가 없는가에 기초하여 선택되었다.

연구된 범위는 1-50 ㎍/㎖이었다. 바나나들, 감자들과 사탕수수들의 체외 배양체들의 활성이 증식 배지에서 순차 배양을 행하기 위해 72시간 후에 배양에 필요한 주기 동안 측정되었다. 이와 같은 연구는 고착배지에서 행해졌다.

식물독성은 (감자들에 대하여) 괴사(necrosis), 백화(chlorosis), 증식 계수(multiplication coefficient)와 접합거리(junction-junction distance)에 대하여 측정되었다. 연구된 3개의 배양체들에 최적의 투여량은 약 30-45㎍/㎖이었다.

2단계 크기-증가(two scale-up) 연구들이 증식상태에 있는 무사 종(Musa sp.) 배양체들에 대하여 행해졌다. 세개의 연구 동안 치사율 퍼센트는 유효성분을 첨가하며 행해진 크기-증가에 대해서는 0.81%였고, 표준방법에 대해서는 1%였다.

이 연구들에서 얻어진 결과들이 표5에 도시되었다.

[표 5]

무사 종의 체외 식물들의 생산에 사용된 배지에 있는 오염생물들에 대한 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene를 함유하는 고체 분산물의 활성

크기-증가 번호	클론	실험번호	11일 미만동안 오염의 %	11일 초과동안오염의 %
1	그레인 네인(Gran nayne)	8240	1.72	4.67
2	FHIA-03	15000	3.92	7.26
대조구(witness)	FHIA-03	15000	4.00	5.80

이러한 연구들로부터 오염들은 고압살균기를 사용한 배지의 물리적 살균을 한 대조구들의 오염과 유사하게 행동했고, 오염은 11일부터 증가하기 시작했다는 추론이 가능하다. 또한, 증식계수는 화학적 살균제와 함께 작용했을 때 주목할 만큼 증가했다.

고압살균이나 뿌리유도를 자극하는 호르몬들을 첨가하지 않은 고착 배지는 보다 짧은 기간에 보다 강하고 보다 풍부한 뿌리들의 외향을 갖져, 표준 방법에 의한 고착 배지보다 우수한 가시적 효과를 나타냈다. 조사된 오염퍼센트는 대조구와 비교해서 무의미했다.

[표 6]

1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene을 함유하는 고체 분산물이 체외 식물들의 발달에 미치는 활성

크기-증가 번호	클론	실험번호	증식계수
1	그레인 네인(Gran nayne)	8240	3.87
2	FHIA-03	15000	4.03
대조구(witness)	FHIA-03	15000	3.0

2단계 크기-증기 연구들은 증식 상태에서 무사 종 배양체에 대해여 행해졌다.

또한, 연구는 뿌리-유도 호르몬들을 첨가하지 않은 채 고착 배지에 있는 그레인 네인 클론과 FHIA-03 클론을 가지고 무사 종에 대하여 행해졌다(A.I.A.). 양쪽 클론들은 화학적 살균이 행해진 변종들에서 보다 잘 작용했으므로, 많은 양의 보다 강한 뿌리들이 5일 후에 관찰되었다. 반면, 표준 방법에 의한 대조구는 같은 기간 동안 작은 발달 정도를 나타냈다.

Claims (14)

1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene를 갖고 큰 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 함유하는 살균 조성물.

제1항에 있어서, 상기 큰 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이 바람직하기로 6000과 20000 사이의 분자량을 갖는 살균 조성물.

제2항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 PEG-6000인 것을 특징으로 하는 살균 조성물.

고체분산법을 사용하여 제1항의 살균 조성물을 얻는 방법.

제4항에 있어서, 조성물이 용해에 의한 분산에 의해 얻어지는 제1항의 살균 조성물을 얻는 방법.

제4항에 있어서, 조성물이 용매를 사용한 공침전에 의해 얻어지는 제1항의 살균 조성물을 얻는 방법.

제6항에 있어서, 상기 용매가 극성용매인 것을 특징으로 하는 제1항의 살균 조성물을 얻는 방법.

제7항에 있어서, 상기 용매가 에탄올, 클로로포름, 메탄올 또는 이소프로필 알콜 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제1항의 살균 조성물을 얻는 방법.

1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene과 큰 분자량의 폴리에틸렌 글리콜을 갖는 조성물을 배지의 오염을 조절하기 위한 살균제로 사용하는 방법.

1-(5-bromofur-2-yl)-2- bromo-2-nitroethene과 큰 분자량의 폴리에틸렌 글리콜을 갖는 조성물을 체외 배양 식물들의 생산에 사용되는 배지의 오염을 조절하기 위한 살균제로 사용하는 방법.

1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene과 큰 분자량의 폴리에틸렌 글리콜을 갖는 조성물을 "체외" 배양 식물들의 생산에 사용되는 배지의 고착제로 사용하는 방법.

1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo-2-nitroethene과 큰 분자량의 폴리에틸렌 글리콜을 갖는 조성물을 살균제로 사용하여 "체외" 배양 식물들의 생산에 사용되는 배지를 살균하는 방법.

제12항에 있어서, 상기 살균제가 동시에 "체외" 배양 식물의 생산에 사용되는 배지에서 고착제로 사용되는 방법.

제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 1-(5-bromofur-2-yl)-2-bromo- 2-nitroethene의 최적 투여량이 30 내지 45㎍/㎖의 범위 내에 있는 방법.