KR19990082584A

KR19990082584A - 지속적인 생물학적 마커를 이용하여 이온화 방사제에 대한노출여부를 측정하는 방법

Info

Publication number: KR19990082584A
Application number: KR1019980706322A
Authority: KR
Inventors: 크리스틴 엘 골트리; 조엘 에스 그린버거
Original assignee: 유니버시티 오브 피츠버그 오브 더 코몬웰츠 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Priority date: 1996-02-15
Filing date: 1997-02-18
Publication date: 1999-11-25
Also published as: US6025336A; CA2246387A1; JP2000504583A; WO1997030179A1; AU2262997A; CN1216069A; EP0880605A2; MX9806632A

Abstract

본 발명은 이온화 방사선의 노출에 대한 지속적인 생물학적 지표, 특히 핵산 지표를 사용하여 검체가 이온화 방사선에 노출되었는지를 검사하는 방법에 관한 것이다. 이러한 생물학적 지표는 차별 표시 기술을 사용하여 확인할 수 있다.

Description

지속적인 생물학적 마커를 이용하여 이온화 방사제에 대한 노출여부를 측정하는 방법

이온화 방사선에 노출되므로써 나타나는 잠재적 결과는 과거의 방사 노출에 대한 매우 바람직한 생물학적 지표를 형성한다. 이러한 점에서 종래 접근 방식에서는 과거 방사 노출에 대한 증거가 병리학의 증상 또는 정황(情況) 증거에 의해 크게 한정된다. 즉, 모세혈관확장증(새 혈관)형성, 피부 또는 다른 조직의 섬유증, 탈모증, 백내장 형성, 불임 또는 단종(sterilization), 임신 처음 3개월 때 이온방사선에 노출시 임산부에서 나타나는 모세혈관 확장증(기형아 출산)등의 제한된 증상에 한정한다.

과거 방사 조사에 대한 분자적 증거 또한 상당히 제한되어 왔다. 예를 들면, 염색체에서 2-특정 결실은 200cGy의 이온화 방사량에 노출된 후 백혈병에 걸린 CBA/Ca 마우스의 조혈세포에서 발견되어 왔다. CBA/Ca 마우스는 이에 따라 염색체 비정상으로 인한 일련의 증상을 유발한다.

조혈세포에서 특정 염색체의 변화가 재현 가능하게 입증되었지만, 감마 조사가 조혈 간세포상에 직접 또는 간접적으로 다른 검출가능한 효과(골수 기질 미세 환경의 세포에 대한 효과)를 발휘한다는 보고는 없었다.

또한 수명이 짧은 생물학적 지표가 보고된 바있다. 예를 들면, c-jun, c-fos, 및 p-53 의 mRNA의 발현이 이온화 방사선에 노출된 후에 세포 배양물에서 증가되는 것으로 관찰되었다. 발현의 증가는 일시적이었고 이 레벨은 노출후 1시간 이내에 정상으로 돌아왔다. 이와 비슷하게, 단백질 TGF-β의 증가된 순환 레벨은 방사요법에서 적어도 3000cGy X-레이에 노출된 환자에게서 나타났다. 폐렴으로 진행되지 않은 환자의 경우 이 농도는 방사 치료 후 정상 농도로 돌아가는 반면, 폐렴으로 진행된 대부분의 환자의 경우 이러한 치료 끝무렵에 증가된 농도가 유지된다. 또한 TGF-β의 발현은 개체마다 차이가 있다.

짧은 순간 동안 증가되는 TGF-β와 개체마다 발현 정도가 변화한다는 사실 때문에 과거 노출에 대한 지표로 이러한 증가를 설명하기에는 부적당하다. 실제로, 노출후 몇 주일 또는 몇 개월에 걸쳐서 검출가능한 생물학적 지표는 보고된 것이 없다.

이온화 방사선에 대한 과거의 노출을 검출할 수 있는 지표는 법의학 병인학 및 기본 방사 생물학에서 모두 중요하다. 이것은 방사 노출의 이전 병력이 추정되지 않거나 주어진 병리 조건의 병인학 제제로서 의구심이 드는 환경에서 특히 필요하다.

본 발명은 검체가 이온화 방사선에 노출된 적이 있는지를 측정하는 방법, 이러한 측정법에 사용되는 생물학적 지표, 특히 핵산 지표, 및 이온화 방사선에 대한 노출을 검출하는 데 유용하게 사용되는 생물학적 지표를 확인하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 본 발명에 기술된 바와 같이 차별 표시 겔로부터 분리하고, 서브클로닝 및 서열결정한 밴드 C122와 혈청 아밀로이드 A3 유전자를 서열 비교한 것이다.

도 2A 및 2B는 본 발명에 기술된 바와 같이 차별 표시 겔로부터 분리하고, 서브클로닝 및 서열결정한 밴드 C31과 MSSP-1 및 MSSP-2 결합 단백질 유전자를 서열 비교한 것이다.

이온화 방사선에 노출된 후 수 주 또는 수 개월의 지속되는 것을 특징으로 하는 생물학적 지표, 구체적으로 유전자 또는 유전자 단편에 대응하는 핵산 지표가 발견되었다. 다시 말해서, 본 발명의 생물학적 지표에 의해 제공되는 시그널은 노출에 특이성을 가지며 노출 후 상당 기간 지속된다.

본 발명에 포함되는 추정 생물학적 지표는 이온화 방사선에 세포 배양물, 구체적으로 골수 기질 세포 배양물(BMSCC)을 시험관내 노출시킨 후 생물학적 지표의 농도 변화를 측정하므로써 동정된다. 추정 지표는 또한, 검체를 이온화 방사선에 생체내 노출시킨 후 생물학적 지표의 농도에 대응하는 변화가 있는 지 여부를 측정하므로써 평가된다. 지속성이 있으며, 검체를 이온화 방사선에 노출시킨 후 생체 내의 농도 변화를 검출할 수 있는 생물학적 지표는 과거 이온화 방사선 노출의 생물학적 지표로서 유용하다.

본 발명에 의한 생물학적 지표 농도의 "지속적" 변화란 이온화 방사선에 노출된 후 1 주일 이상 지속되는 변화를 말한다. 보다 구체적으로, 이것은 노출 후 3 주일 이상, 바람직하게는 3 개월 이상, 더욱 바람직하게는 노출 후 1년 또는 그 이상 지속되는 변화를 의미한다.

본 발명에 의한 생물학적 지표의 "검출 가능한" 변화란 상당량의 이온화 방사선에 노출되지 않은, 즉 주위 환경에 일반적으로 존재하는 수준의 이온화 방사선에만 노출된 대조군에 일반적으로 존재하는 생물학적 지표의 발현양에 비해, 통계적으로 실질적인 발현양의 변화를 나타냄을 의미하는 것이다. 검출 가능한 변화란, 보다 구체적으로 대조군에서 발견되는 발현양의 2배 이상의 발현양을 나타내는 것을 말한다. 대조군의 생물학적 지표의 농도는 종래의 기술에 의해서는 실질적으로 검출할 수 없는 것이 바람직하다.

바람직한 일양태에서, 생물학적 지표는 유전자 또는 유전자 단편에 대응하는 핵산 지표이다. 이러한 핵산 지표는 세포 배양물의 시험관 내 조사 후 여러 시점에서 유전자 발현양의 변화를 확인하는 차별 표시 기술을 이용하므로써 동정된다. 차별 표시 기술은 2 이상의 RNA 군 사이의 유전자 발현을 비교하는 유용한 기술이다. 예를 들면 리앙 및 파르디의 문헌[Science 257: 967∼71(1992), 및 리앙 등의 문헌(Nucleic Acids Res. 21: 3269∼75(1993)]을 참조할 수 있으며, 이들의 내용은 본 명세서에 참고 인용한다. 이 기술에 의하면, 2 이상의 RNA 군 사이에 유도된 전사체와 억제된 전사체 양자 간의 차이에 대한 총 스펙트럼을 동시에 관찰할 수 있다. 이 기술은 PCR을 기초로 하기 때문에 희미한 정보도 분리해 낼 수 있다. 따라서 차별 표시 기술은 전통적인 삭제 하이브리드화 기술에 잇점을 제공한다.

차별 표시 기술에 있어서, mRNA를 PCR에 의해 증폭시킨 후 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에 크기에 따라 분포시킨다. 이 기술의 핵심 요소는 올리고누클레오티드 프라이머를 사용한다는 것이며, 그 중 한 프라이머는 mRNA 서브세트의 폴리아데닐레이트 테일에 고정되어 있고 다른 것은 상기 첫 번째 프라이머에 대해 다른 위치에 어니일링되어 있는 짧고 임의적인 것이다. 그러한 프라이머 쌍들에 의해 한정되는 mRNA 아군은 역전사 후 증폭되고 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분해된다. 차별 표시 기술에 의하면 다수의 RNA 개체군 간의 차이에 대한 총 스펙트럼을 동시에 관찰할 수 있을 뿐만아니라, 그러한 차이를 분리하고 특성 분석할 수도 있다.

차별 표시 기술에 의하면 이온화 방사선 노출 후에 발현양의 변화를 나타내는 유전자 또는 유전자 단편을 재현성있게 동정할 수 있다. 예를 들어 본 발명에 따라 쥐의 골수 기질 세포주를 시험관내에서 이온화 방사선에 노출시키면 후술하는 바와 같이 검출 가능한 발현양의 증가 또는 감소에 대응하는 다수의 표시 단편이 재현성있게 생산된다. 따라서, 이온화 방사선에 대한 노출에 의해 그 발현양이 안정적으로 증가 또는 감소하는 추정 쥐의 생물학적 지표가 본 발명에 따라 재현성있게 동정될 수 있다.

유사하게 차별 표시 기술은, 인간 세포에 응용하여 본 명세서의 마우스의 경우에 설명된 것과 유사한 프로토콜로 인간 세포주의 시험관내 방사선 조사 후 검출 가능한 발현 양의 증가 또는 감소에 해당하는 전사체를 확인할 수 있으며, 이 차별 표시는 이온화 방사선에 의해 유도되는 전사체를 동정하는 데 이용할 수 있다. 또한, 일단 생물학적 지표가 마우스 내에서 확인되면, 인간의 1종 이상의 동종 유전자(들)에 특이적인 프라이머를 동종 인간 유전자(들)를 증폭시키는 데 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 생물학적 지표로서 특히 바람직한 것은 혈청 아밀로이드 A(SAA) 계의 유전자로서, 전신 염증 반응 동안 간에서 생성되고, IL-1, IL-6 및 TNF-α를 비롯한 다양한 시토킨류에 반응하는 내피 세포, 섬유아세포 및 대식세포에 의해 국부적으로 생성되는 대부분의 급성상 염증 유전자와 산화성 스트레스 유전자 군이다: 참고 문헌[스틸 등,Immunol. Today15; 81-88(1994)]. SAA는 만성 염증과 관련된 아밀로이드증 질환에 있어서 조직 내에 침적되어 있는 아밀로이드 피브릴의 주요 성분인 아밀로이드 A(AA)단백질의 전구체이다. 조직 손상과 염증제, 예를 들면 리포다당체(LPS)룰 비롯한 다양한 자극은 SAA 농도를 상승시키는 데 효과적이다.

마우스내 SAA 계의 일원은 SAA1, SAA2, SAA3 및 SAA4가 있다. 간은 SAA 합성의 주요 부위이지만, LPS 주입 후 간이외 조직의 노던 블롯 분석에 의하면, 간 이외의 조직도 SAA1, SAA2, SAA3 및 SAA4 발현 패턴을 나타낸다. SAA3은 주요 간이외의 조직에 존재하는 SAA로서, 폐, 신장, 부신, 장, 심장, 비장, 고환, 골격근, 위, 뇌, 뇌하수체 및 췌장에서 발견할 수 있다. SAA3은 프로테아제와 세포 유착 분자의 생성을 유도하며, 조혈 세포의 방향성 이동과 유착성을 유도하는 것으로 보인다:참고 문헌[스틸 등,Immunol. Today14(2); 797-809(1986)]. SAA3이 발견되는 각종 조직, 특히 피부와 간을 분석 시험하여 이온화 방사선에 대한 과거 노출 여부를 측정한다.

또한, LPS 주입 후 SAA3의 검출 가능한 양을 함유하고 있는 광범위한 조직은 각각의 조직 내에 존재하는 단일의 분산된 세포 계가 SAA3 발현의 원인이 된다는 것을 시사한다. 이에 관련한 하이브리드화 연구는 간이외의 조직중 SAA3 발현의 제1 공급원으로서 지방 세포를 지적하고 있다: 참고 문헌[예를 들면, 벤디트 & 미크, J. Exp. Med. 169:1841-1846(1989), 벤디트 & 미크, J. Exp. Med. 164: 2006-17(19806)와; 미크 등, "Mouse SAA3: Detection in Mouse Tissues with Specific Antibodies", AMYLOID AND AMYLOIDOSIS(Kluwer, 1991)]. 따라서, 지방 세포 또는 특히 예비지방 세포내 SAA3 농도의 분석 시험은 이온화 방사선에 대한 과거 노출을 측정할 수 있다.

마우스내 SAA3 유전자는 BMSCC의 시험관내 방사선 조사 후 4 일만에 유도되며, 메시지 농도는 조사 후 3주 이상되어야 최고 수치를 유지한다. 결과에 의하면, 시험관내 이온화 조사에 세포를 노출시키는 것은 장기간의 SAA3 메시지 생성을 유도한다. 투여량-반응 곡선에 의하면, 메시지 농도는 시험관내 100Gy의 이온화 조사량에 노출시킨 후에 검출되고, 500 cGy, 1,000 cGy 및 5,000 cGy로 노출시킨 후에 최대치의 유도를 달성하게 된다.

SAA3가 본 발명에 있어서 바람직한 생물학적 지표이지만, 방사선 조사 이후의 지속적이고 검출가능한 농도의 변화를 나타내는 다른 차별 표시 단편도 유용하다. 시험관내 BMSCC의 노출 이후에 확인되는 차별 표시 단편의 다른 예비적 분석에 의하면, 상기 단편들은 SAA3 이외의 다른 유전자로부터 형성된다. 이러한 결과들은 이온화 방사선에 노출시킨 이후 검출가능하고 지속적인 농도 변화에 의해 특징지워지는 일련의 유전자와 관련이 있다.

이온화 방사선에 노출시킨 후 발현양의 증가를 나타내는 유전들이 바람직하지만, 원칙상 노출 이후에 발현양의 감소를 나타내는 유전자를 사용할 수 있다. 이온화 조사에 대한 노출 이후 발현양이 감소되는 여러 차별 표시 전사체는 본 발명과 일치한 것으로 확인된다. 예를 들면, c-myc 업스트림 1본쇄 결합 단백질, 즉 MSSP-1/MSSP-2을 암호화한 유전자에 상동성이 있는 차별 표시 단편을 들 수 있다.

시험관내 기술에 의해 본 발명에 따라 확인된 유전자와 유전자 단편의 발현은, 조사에 노출된 검체로부터 달성된 BMSCC 내의 유전자 또는 유전자 단편의 양과, 대조군 검체로부터 달성된 BMSCC를 비교하여 연구하였다. CBA/Ca 마우스와 이것의 변형체는 생체내 발현 연구에 적합한 모델이다. CBA/Ca 마우스는 몸 전체에 200 cGy의 조사량을 사용한 후 골수 백혈병으로 진행된다. BMSCC는 200 cGy의 이온화 조사량에 노출된 CBA/Ca 마우스와 노출되지 않은 CBA/Ca 마우스로부터 얻는다.

시험관내 분석에 의해 확인된 유전자 발현양의 측정 가능한 차이 이외에, 대조군 검체로부터 얻은 BMSCC와 비교시에, 방사선 조사된 검체로부터 얻은 BMSCC의 불변 기질 세포주와 클로널 서브세포주 패턴의 정량적인 차이도 존재한다. 이들 세포주의 경우, 대조군 검체와 비교했을 때 방사선 조사된 검체로부터 얻은 기질 세포주의 조혈 지지 성능과 생물학적 조사사이의 차이가 관측된다. 이 자료는 배양액에 외식시킨 후 수개월 동안 지속하는 조혈 기질 세포내에서 생체내 조사-유도된 변화가 있음을 시사한다. 이러한 변화는 간세포내의 조사-유도된 염색체 변화와 함께 백혈병 유발에 영향을 미칠 수 있다.

대조군 마우스와 100일 전에 이온화 방사선 200 cGy에 노출시킨 마우스로부터 골수 기질 세포를 분리한다. 분리한 세포를 시험관내에서 BMSCC 중에 3개월 증식시켰다. 대조군 배양물 및 미리 방사선 조사한 마우스로부터 얻은 배양물 모두로부터 골수 기질 세포주를 형성시켰다.

이렇게 얻은 세포주들을 몇 달 이상 동안 배양물 내에서 증식시킨 후 SAA3 메시지 양을 시험하였다. 대조군 배양물로부터 유도된 세포주는 시험관내에서 50 Gy 이온화 방사선에 노출된 후 1 일주일까지는 현저한 양의 SAA3 메시지를 함유하지 않았다. 이러한 결과는 시험관내에서 조사된 BMSCC로부터 얻은 결과와 유사하다. 이와 뚜렷하게 대조되는 것으로, 미리 방사선 조사한 마우스로부터 형성된 세포주는 다량의 SAA3 메시지를 함유한다. 이 후자의 세포주의 세포를 시험관내에서 조사시키므로써 SAA3 메시지 양은 추가로 더 증가된다. 이 세포주를 50 Gy 이온화 방사선에 시험관 내에서 노출한 지 일주일만에 SAA3 메시지의 양은 2 내지 3 배로 증가하였다.

따라서, 생체내에서 이온화 방사선에 대해 마우스를 노출시키면 골수 기질 세포에서의 SAA3 메시지가 유도된다. 증가된 메시지 양은 노출후 최대 1 년 동안 검출될 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따라 골수 기질 세포에서의 SAA3 양을 검출하면 과거 방사선 조사 여부를 알 수 있다. 본 명세서내의 실시예는 골수 기질 세포 내에서의 발현 증가를 보고하고 있으나, 폐, 비장, 신장, 간, 심장, 흉선 및 뇌를 비롯한 기타의 세포도 방사선에 노출된 후 SAA3의 증가된 양을 검출하는 데 표적 세포로 사용될 수 있다. 전술한 바와 같이, 지방세포 및 예비 지방세포는 특히 SAA 메시지의 증가된 레벨을 검출하기 위한 세포로서 바람직하다.

다양한 시점에서 대조군 및 미리 방사선 조사한 마우스로부터 총 골수 기질 세포 및 기타의 조직을 수거하고, 즉시 RNA를 분리하는 방법을 사용하여 생체내 발현을 연구하였다. 발현양이 변화됨에 따라 확인된 시험관내 전사체의 발현에 대하여 총 RNA를 분석하였다. 시험관내 방사선 조사후 변화된 양을 보이는 전사체는 유사하게 생체내 발현에서도 변화된 양을 지속적으로 보여준다는 것이 밝혀졌다. 예를 들면, SAA3에 대한 메시지도 대조군 시료에서는 검출되지 않았으나, SAA3 메시지는 생체내 노출후 연장된 시간에 검출되었다.

마우스에서의 결과와 유사한 결과가 인간에게서 관찰된다. 인간 SAA 유전자군은 4개 이상의 일원을 포함한다. 인간 세포주, 바람직하게는 골수 기질 세포주를 마우스에 대해 전술한 것과 유사한 프로토콜로 시험관내에서 이온화 방사선에 노출시키고, 차별 표시법을 사용하여 이온화 방사선에 의해 유도되는 SAA 유전자 군의 일원을 확인하였다. SAA 유전자의 생체내 발현은, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 또는 유방암을 비롯한 고형 종양에 대한 치료중에 있는, 자가 골수 이식을 계획하는 방사선에 노출된 환자들에게서 확인되었다. 유도된 인간 SAA 유전자 군내의 유전자 또는 유전자들을 결정하는 데 있어서 각각의 군 일원에 대해 발생되는 특이적인 프라이머와 이들 프라이머를 갖는 군내에서 각각의 SAA 유전자의 역전사 효소(RT) RCR 증폭을 사용하였다. 인간 유전자 SAA1 및 SAA2는 특히 바람직하다. 인간 SAA2 유전자는 마우스 SAA3 유전자와 유사하다. 즉, 실질적으로 대조군에서는 검출되지 않으나 이온화 방사선에 노출된 후에는 지속적이고, 검출가능한 증가 현상을 보여준다. 인간 SAA1 유전자는 대조군 및 방사선 조사된 배양물 모두에 존재한다.

일단 본 발명의 생물학적 지표가 확인되면, 그것을 사용하여 검체가 미리 이온화 방사선에 노출되었는 가를 결정할 수 있다. 한가지 분석법을 사용하여 이온화 방사선에 노출되었을 가능성이 있는 세포군의 생물학적 지표의 발현양을 측정하였다. 이 양을 상당량의 이온화 방사선에 노출되지 않았던 대조군의 발현양과 비교한다. 분석하고자 하는 세포는 검체로부터 최근에 제거된 세포 또는 검체로부터 미리 제거된 세포 중 어느 하나일 수 있다. 그후 이것을 배양한다. 이 분석법은 노턴 블롯 또는 RT-RCR 기술을 사용한다. RT-PCR을 사용하여 과거 노출 여부를 검출하는 경우에는, 본 발명에 따라 차별 표시 분석법에 의해 확인된 방사선 조사-유도 전사체에 대해 특이적인 서열을 프라이머로서 사용한다.

검체가 이미 이온화 방사선에 노출되었는 가를 결정하는 성분들은 이온화 방사선에 노출시킨후 검출하기 위해 키트 내에 함께 포장하는 것이 간편하다. 그 키트는 이온화 방사선에 노출된 후 지속적인 지표인 유전자 또는 유전자 단편에 특이적인 프라이머, RT-PCR 분석에 대한 시약, 및 검체로부터 제거된 세포가 이온화 방사선에 노출된 후 상기 지속적인 지표를 함유하는가를 측정하는 분석 시약과 프라이머를 사용하기 위한 지침서를 포함한다. 바람직한 일양태에서는, 상기 키트는 SAA 유전자, 특히 인간 SAA1 또는 인간 SAA2 에 대한 특이적인 프라이머를 포함한다.

하기한 실시예들은 이온화 방사선에 노출시킨 후의 증세인 지속적으로, 검출가능한 생물학적 지표를 확인하는 특정 프로토콜을 예시한다. 전술한 프로토콜에 대한 다양한 변경 및 수정 또한 본 발명의 정신 및 범위 내에 존재한다.

발명의 개요

그러므로, 본 발명의 제1목적은 이온화 방사선의 노출에 대한 생물학적 지표를 제공하는 데 있다. 이 지표는 노출후 몇주 또는 몇 개월간 검출가능하다,

본 발명의 제2목적은 방사선 조사의 생물학적 지표를 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제3목적은 본 발명에 따라 확인된 생물학적 지표의 농도 변화가 있는 지를 검출하여 이온화 방사선에 대한 과거의 노출 여부를 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명이 전술된 목적 및 기타 목적을 달성하기 위해서, 이온화 방사선에 세포군을 노출시키는 단계; 이에 노출된 세포군의 유전자 발현을 이에 노출되지 않은 대조 세포군에서의 유전자 발현과 비교하기 위해 차별 표시(differential display)를 사용하는 단계; 대조 세포군에 비하여 노출된 세포군에서 유전자 발현양을 변화시키는 유전자 또는 유전자 단편을 선택하는 단계를 포함하여, 이온화 방사선에 대한 노출의 생물학적 지표를 확인하는 방법을 제공한다. 이 발현양은 이온화 방사선에 노출후 지속적으로 유지된다.

본 발명은 개체가 방사에 노출되었는 지를 측정하는 방법으로서, 개체로부터 세포를 얻는 단계, 방사선 조사에 대한 과거 노출의 지속적인 생물학적 지표가 존재하는지를 확인하기 위해 세포를 분석하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따라 이온화 방사선에 대한 과거 노출을 검출하는 키트가 제공된다. 이 키트는 이온화 방사선에 대한 과거의 노출을 지속적으로 나타내는 지표으로서 유전자 또는 이의 단편에 특이적인 프라이머; RT-PCR 분석용 시약; 검체로부터 제거된 세포가 이온화 방사선에 대한 과거 노출의 지속적인 지표를 포함하는지를 확인하기 위한 측정 분석에 프라이머와 시약을 사용하기 위한 지침서를 포함한다.

본 발명의 다른 목적, 잇점, 특징은 후술되는 상세한 설명에서 확실히 나타날 것이다. 하지만, 본 발명의 바람직한 구체예는 구체화의 목적만 지니며, 상세한 설명, 특정 실시예가 기재되어 있지만 당업자라면 본 발명의 영역과 정신을 벗어나지 않는 범주에서 변형 및 수정이 가능하다는 것을 알 수 있다. 이러한 예에 의하여 전신성 독소에 대한 노출; 화학 요법의 알킬화제; 화학 발암물질에 대한 노출; 및 다른 DNA쇄를 분해하며 자극 손상을 유발하는 다른 반응제에 대한 노출을 나타내는 생물학적 지표를 후술되는 프로토콜에 의해 확인할 수있다.

실시예 1. 쥐 세포에 대한 시험관내 방사선 조사 시험과 RNA 분리

다양한 쥐 세포주를 본 발명에 기재된 시험관내 이온화 방사선에 노출시켰다. 이 중에서 주요 세포주는 종래 개시된 바 있는 본래 C3H/HeJ 장기간 골수 배양물에서 분리한 쥐의 섬유아세포 기질 세포주인 D2XRII 세포주이다. 이 세포는 골수 섬유아세포 또는 예비지방세포로서 분류된 바 있다[Naparstek et al., J.Cell.Physiol. 126:407(1986)]. D2XRII 세포는 FBS 10%를 함유하는 DMEM에서 융합성 단층으로 증식시킨 뒤, 6 MeV X선 1 Gy, 5 Gy, 10 Gy 또는 50 Gy로 200 cGy/min 조사량에 노출시켰다. 방사선 조사후 1시간, 1일, 4일, 1주, 2주 및 3주 후에 세포를 수거하였다. 총 RNA를 문헌[Chomcynski and Sacchi, Anal.Biochem. 162:156(1987)]의 방법을 기초로 하여 총 RNA 분리 키트(프로메가 코포레이션, 미국 위스콘신주 매드슨 소재)를 사용하여 분리하였다. 총 RNA를 DNase 처리 후, 노던 블롯, RT-PCR 및 차별 표시 분석법(differential display analysis)으로 분석하였다.

실시예 2. 차별 표시 분석법

차별 표시 분석에는 시판용 RNAmap 키트(GenHunter Corp., 미국 매사츄세츠주 브룩클라인 소재)를 사용하였다. 간략히 설명하면, 200ng의 DNase 처리된 총 RNA를 4가지 올리고(dT)계 프라이머중 1가지를 사용하여 역 전사용 주형으로서 사용하였다. 역전사 후, cDNA는 올리고(dT) 프라이머와 임의의 10개 염기로 된 프라이머 20가지중 1가지를 혼합한 혼합물을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 4가지 다운스트림 올리고 (dT)계 프라이머와 임의의 20가지 업스트림 프라이머를 혼합하여 cDNA를 증폭시키면 세포내에 10,000가지의 mRNA종이 존재하였다(Liang et al., 1993). 증폭 후, PCR 생성물은 6% 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하였다. 그 다음 겔을 건조시키고, 자동방사능사진으로 생성물을 검측하였다.

각 표시 전사체의 양을 RNA 개체수간에 비교하였다. 위양성군의 분리를 최소화하기 위하여 각 차별 표시 반응은 동일한 RNA 개체군에 대하여 2회 반복으로 실험하였고, 이 반응군에서 동일하게 다량의 변화량을 나타내는 전사체만을 이후 실험에 사용하였다.

차별 발현을 나타내는 밴드는 폴리아크릴아미드 겔에서 직접 절단해내었다. 겔 조각으로부터 DNA 를 분리하고, 본래의 프라이머와 조건을 사용하여 Taq DNA 폴리머라제로 PCR 증폭시킨 뒤, pT7-Blue T-벡터에 결찰시켰다. 이와 같이 하여 얻은 플라스미드를 사용하여 XL-1 Blue 세포를 형질전환시켰다(노바겐 인코포레이티드, 미국 위스콘신주 매디슨 소재). 클로닝된 PCR 생성물을 함유하는 콜로니를 분리하고, 삽입체는 1 fmol의 DNA 서열결정 키트(프로메가 코포레이션, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 사용하여 플라스미드로부터 서열분석하였다. 서브클로닝된 단편으로부터 1가지 이상의 서열이 결정된 경우에는, 각 서열의 발현 패턴을 조사하여 목적하는 서열인지를 차별하였다.

실시예 3. 노던 블롯 분석

노던 블롯은 본 명세서에 참고문헌으로 인용한 문헌[Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABOLATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같이 실시하였다. 간략히 설명하면, 총 RNA 10㎍ 내지 20 ㎍을 1% 포름알데히드-아가로스 겔에서 전기영동시키고, 지지된 니트로셀룰로스 막(Schleicher and Schuell)으로 전이시킨 뒤, BSA 1%, Na₂HPO₄250mM, EDTA 1mM 및 SDS 7%를 함유하는 용액중에 함유된 목적하는 PCR 서브클론을 나타내는 α³²P-dCTP(NEN)-지표 프로브와 하이브리드화시켰다. 세척 후, 블롯을 X-omat 필름(코닥)에 노출시키고 밴드를 농도계측기로 정량하였다. 동일 블롯을 가열된 0.1% SDS를 사용하여 벗겨낸 뒤, 이어서 각 레인에 존재하는 RNA 장입량의 대조군인 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 유전자(G-3-PDH)를 나타내는 프로브와 하이브리드화시켰다.

실시예 4. RT-PCR 분석

DNase 처리된 RNA(1㎍)의 올리고 (dT)-프라이밍된 역 전사는 Tris-HCl(pH 8.4) 20 mM, KCl 50 mM, MgCl₂5mM, dNTP 1mM, RNase 억제제 20 유니트(파마시아, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 및 역전사효소 200 유니트(기브코-BRL, 미국 매릴랜드주 게이터스버그 소재)를 함유하는 용액 총 20 ㎕ 중에서 실시하였다. 반응물은 실온에서 10분, 그 다음 37℃에서 45분간 항온처리하였다. 그 다음, 99℃에서 5분간 변성시켰다. 대조군의 반응은 역전사효소를 첨가하지 않고 실시하였다. 이 반응물을 물로 100 ㎕로 희석하고, 이 중 5 ㎕(첨가 RNA 약 50 ng)를, dNTP 200 μM, MgCl₂1.5 mM, Tris-HCl(pH 8.4) 및 Taq DNA 폴리머라제(뵈링거 맨하임) 2.5 유니트의 존재하에 센스 프라이머 20 pmol과 안티센스 프라이머 20 pmol를 사용하여 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 1분간의 사이클을 20회 실시하여 증폭시켰다. 목적하는 서브클론이나 유전자에 특이적인 프라이머와 G-3-PDH 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하는 평행 PCR 반응을 실시하였다. 증폭 후, 생성물을 아가로스 겔에서 전기영동하고 에티디움 브로마이드 염색으로 가시화하였다.

실시예 5

쥐 세포의 시험관내 방사선 조사 후 얻은 차별 표시 전사체 분석

배양물내의 D2XRII 세포의 시험관내 조사로 유전자 발현양의 증가 또는 감소를 나타내는 차별 표시 전사체의 군을 생성하였다. 형질 발현이 증가된 24개의 클론의 제1 군을 하기 표 1에 제시한다.

조사된 D2XRII 골수 기질 세포의 차별 표시 겔로부터 분리한 발현이 증가된 분자 클론
	시간	1 시간	1 시간	1 시간	1 일	1 일	1 주	1 주	크기(bp)
클론	투여량(Gy)	0	10	50	10	50	10	50	크기(bp)
C21	(+)	-	-	+	+	+	+	353
G91	-	-	-	-	-	2+	2+	195
G101	(+)	+	+	+	+	2+	2+	268
A12	(+)	(+)	(+)	(+)	(+)	2+	+	475
A113	-	-	-	(+)	(+)	+	+	430
T34	+	+	+	+	+	2+	2+	270
T36	(+)	(+)	(+)	(+)	(+)	+	+	255
T101/2	-	-	-	-	-	+	+	345
C122	(+)	(+)	(+)	(+)	(+)	3+	3+	185
G63	(+)	(+)	(+)	2+	2+	2+	2+	250
G143	-	+	+	+	+	+	+	265
A41	-	-	-	+	+	+	+	>600
A63	+	+	+	2+	2+	3+	2+	325
A91	-	-	-	+	+	+	+	550
A92	-	-	-	+	+	+	+	340
A111	-	-	-	+	+	+	+	>600
A112	(+)	(+)	(+)	+	+	+	+	475
A181	-	-	-	+	+	+	+	600
T61	-	+	+	+	+	+	+	320
C51	-	-	-	+	+	+	+	265
C54	-	+	+	2+	2+	2+	2+	470
C91	+	+	+	2+	2+	2+	2+	362
C102	-	(+)	(+)	+	+	+	+	520
C103	-	-	-	2+	2+	2+	2+	340
표 1은 차별 표시 반응에 사용된 프라이머의 80개의 조합물로부터 동정된 재생가능한 차별 발현된 밴드 모두를 나타낸다(이중 실험을 실시함). 이러한 클론은 이온화 방사선의 노출후 경과 시간[1 시간, 1 일 및 1 주)] 및 투여량[10 Gy(10) 또는 50 Gy(50)] 모두에 의해 변형된 형질 발현을 나타낸다. 각각의 밴드는 이의 형질 발현 패턴[부재 (-), 존재 (+)] 및 크기가 제시되어 있다.

이와 같은 7 가지의 차별 표시 전사 G91, G101, A113, T34, T36, T101/2 및 C122는 조사한 지 1주후 증가된 양을 나타내며, 이들을 추가의 연구에 선택하였다. 이러한 7 가지 전사체의 하나인 클론 C122을 재증폭시키고, 서브클로닝시키고, 서열결정하였다.

차별 발현된 서열을 사용하여 알려진 서열과 상동성의 존재를 결정하는 GenBank 데이터베이스를 조사하였다. 비교에 의하면, C122 는 쥐의 혈청 아밀로이드 A3 유전자의 3' 말단과 동일한 것으로 밝혀졌다. 이러한 비교는 도 1에 제시되어 있다. GenBank에서 서열과의 최적합성 비교에 의해 SAA3 유전자와 99% 동일하다는 것을 알았다.

보고된 서열을 갖는 선택된 단편의 상동성이 없는 것으로 밝혀진 경우, 미지의 서열의 PCR 산물을 프로브로서 사용하여 전장 클론에 대한 적절한 cDNA 라이브러리(대조용 또는 조사된 것)를 스크리닝할 수 있다. 참고 문헌[샘브룩 일동 (1989), 상동].

형질발현이 감소된 12 개의 제2 군을 하기 표 2a 내지 표 2b에 제시한다.

조사된 D2XRII 골수 기질 세포의 차별 표시 겔로부터 분리한 발현이 감소된 분자 클론
	시간	1 시간	1 시간	1 시간	1 일	1 일	1 주	1 주	크기(bp)
클론	투여량(Gy)	0	10	50	10	50	10	50	크기(bp)
C31	+	2+	2+	-	-	-	-	347
C84	+	+	+	-	-	-	-	462
G32	3+	3+	3+	+	+	+	+	275
G82	+	+	+	-	-	-	-	220
G111	+	+	+	-	-	-	-	600
G141	2+	2+	2+	-	-	-	-	385
G142	+	+	+	-	-	-	-	290

조사된 D2XRII 골수 기질 세포의 차별 표시 겔로부터 분리한 발현이 감소된 분자 클론
	시간	1 시간	1 시간	1 시간	1 일	1 일	1 주	1 주	크기(bp)
클론	투여량(Gy)	0	10	50	10	50	10	50	크기(bp)
G152	+	+	+	-	-	-	-	208
A121	+	+	+	-	-	-	-	410
T11	+	+	+	+	+	-	-	195
T62	2+	2+	2+	+	+	-	-	305
T111	3+	3+	3+	+	+	-	-	425
표 2는 차별 표시 반응에 사용된 프라이머의 80개의 조합물로부터 동정된 재생가능한 차별 발현된 밴드 모두를 나타낸다(이중 실험을 실시함). 이러한 클론은 이온화 방사선의 노출후 경과 시간[1 시간, 1 일 및 1 주)] 및 투여량[10 Gy(10) 또는 50 Gy(50)] 모두에 의해 변형된 발현을 나타낸다. 각각의 밴드는 이의 발현 패턴[부재 (-), 존재 (+)] 및 크기가 제시되어 있다.

형질 발현이 감소된 것으로 나타난 클론중에서, 클론 31은 c-myc 업스트림 1본쇄 결합 단백질, MSSP-1 및 MSSP-2와 상동성을 갖는 것으로 나타났다. 비교는 각각 도 2A 및 도 2B 에 예시되어 있다. GenBank 서열과의 최적합성 비교 결과 MSSP-1 및 MSSP-2 유전자와 모두 99% 동일하다는 것을 알았다.

발현이 증가된 SAA3는 다른 세포주에서 시험관내 방사선 노출후 나타내었다. 예를 들면, SAA3 메시지양의 2 배 증가는 대식세포 세포주의 노출후 나타났다.

실시예 6

시험관내 조사된 세포에 의한 SAA3 발현의 노던 블롯 확인

클론 C122 에 의한 SAA3의 형질 발현은 노던 블롯 분석에 의해 증명하였다. RNA를 10 또는 50 Gy X-선에 세포를 노출시킨지 1 시간, 1 일, 1 주 또는 3주 경과후 D2XRII 세포로부터 수거하였다. 1 % 포름알데히드-아가로스 겔상에서의 전기영동후, RNA를 니트로셀룰로스에 옮기고, 차별 표시 밴드 C122를 나타내는³²P-표지된 프로브를 사용하여 하이브리드화하였다. 자동 방사선 사진술로 하이브리드화 시그널을 검출하였다. 아가로스 겔의 에티디움 브로마이드 염색으로 각 레인에서의 RNA의 존재를 확인하였다. 노던 블롯 분석으로, 조사된 세포에서 확인된 차별 표시 단편이 인공물이 아님을 확인하였다.

실시예 7. 쥐 세포의 시험관내 노출 후 시간에 대한 SAA3의 발현과 용량-반응 곡선의 형식화

조사후 1주 이상 클론 C122에 의한 SAA3의 형질 발현은 노턴 블롯 분석으로 확인하였다. RNA는 10 Gy의 x선에 노출된 지 1 시간, 1일, 4일 또는 1주, 2주 또는 3주에 D2XRII 세포로 수집되었다. 1% 포름알데히드-아가로스겔에서 전기영동시킨 후에, 니트로셀룰로오스로 RNA를 전달하고, 차별 표시 밴드 C122를 나타내는³²P-표지된 프로브로 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 시그널은 방사능 사진으로 검출하였다. 한천겔의 에티듐 브로마이드 염색으로 각각의 레인에서 RNA의 존재를 확인하였다.

SAA3 유전자는 시험관내 조사한지 4일 후에 유도되었고, 조사한 후 적어도 3주 이상 높은 메시지 양이 유지되었다. 10 Gy의 x선에 노출된 후, 증가된 SAA3 전사체는 노출한 지 4일 후에 약 10배로 증가하였고, 1주 후에는 20배, 2주 후에는 35배, 3주 후에는 40배로 증가하였다. 이는 세포가 이온화 방사선에 시험관내 노출되는 것이 SAA3 메시지의 장기간 생성을 유도함을 의미한다. SAA3에 대한 용량-반응 곡선은 메시지 양이 시험관내 100 cGy의 이온화 방사선에 노출된 후에 검출되고, 500 cGy, 1,000 cGy 및 5,000 cGy에서 노출시킨 후 최대 유도화에 도달함을 보여준다.

실시예 8. 이온화 방사선에 노출된 쥐에서 얻은 세포 배양물중 SAA3의 발현

CBA/Ca 수컷 쥐(미국 뉴욕주 브룩해븐 실험실)에 200 cGy의 총 신체 조사(250 KVP, GE Maxitron, 조사량 90 R/분, 1 mm 알루미늄과 0.5 mm 구리 여과)를 행하였다. 조사된 쥐는 조사된지 100일 후에 경부 탈구로 치사시켰다. 대조군은 동일수의 연령이 일치하는 수컷 CBA/Ca 대조용 쥐를 포함한다.

조사된 쥐의 골수와 대조용 쥐의 골수는 각각은 25% 말 혈청과 10⁵M 하이드로코르티손으로 보충된 피셔 배지의 원뿔형의 15 ml 들이 윈심분리 튜브에 분출시켰다. 연속 골수 배양액을 조사된 쥐와 대조용 쥐 각각의 뒷다리 발(경골 및 비골)로부터 각각 얻었다.

공개된 방법에 따라 4주 후에, 말 혈청 대신 25% 태아 혈청을 사용하여 배양액의 수명을 최대로 하였다. 배양액은 이들이 약간의 배지 변화에서 104 세포/플라스크 이상의 자갈 섬 또는 생성이 더 이상 검출되지 않는다고 입증될 때까지 유지하였다. 대표적인 플라스크를 선정하여 특정 시간에 골수 기질 세포을 얻었다. 유리된 세포는 시험관내에서 3 개월간 증식시켰다.

골수 기질 세포주는 대조용 쥐의 골수 기질 세포 배양액과 이미 조사시킨 쥐의 골수 기질 세포 배양액 둘다에서 얻었다. 이어서, 얻은 세포주를 약 1년 동안 배양액에서 증식시킨 후에, 본 발명에 따른 시험관내 기술로 추정 생물학적 지표에 대한 메시지의 양을 시험하였다. 추정 생물학적 지표의 양은 본 명세서에 기재된 동일한 기술을 사용하여 이온화 방사선에 시험관내 노출된 D2XRII 세포에 대하여 평가하였다.

하기 표 3에 나타낸 SAA 쥐 유전자군의 일원에 대한 특이 프라이머를 사용하여 배양액에서의 대조용 쥐 및 조사된 쥐에서 유래한 쥐 SAA1, SAA2, SAA3 및 SAA4 유전자를 증폭시켰다. 대조군 배양액에서는 SAA 전사체가 확인되지 않았으나, 조사된 쥐의 배양액에서는 SAA3 전사체가 발견되었다.

쥐 SAA 군의 일원에 대한 프라이머 서열

전사체	프라이머 서열	생성물 크기(bp)
muSAA1	GAAGGAAGCTAACTGGAAAAACTCCAGGCCCCCAGCACAACCTACT	284
muSAA2	ATGAAGGAAGCTGGCTGGAAAGATGCTCAGGACCCCAACACAGCCTTCT	268
muSAA3	AGCCTTCCATTGCCATCATTCTTACCCAGTAGTTGCTCCTCTTCTCG	426
muSAA4	GCTTGGGGAAGGAAGACACCTAATATGTGTCATCTAATAAGT	345

대조군 배양액에서 유도된 CC3 세포주로 명명한 대표적인 세포주는 50 Gy 이온화 방사선에 시험관내 노출된지 1주 후까지는 상당량의 SAA3 메시지를 함유하지 않음이 확인되었다. 이 세포주가 50 Gy 이온화 방사선에 시험관내 노출된지 1주 후에, SAA3 메시지는 2 내지 3배로 증가되었다. 이 결과는 D2XRII 세포의 시험관내 조사에 대하여 얻은 것과 유사하다.

이와는 반대로, CT4 세포주로 명명한 예비 조사된 쥐에서 얻은 대표적인 세포주는 다량의 SAA3 메시지를 함유함이 확인되었다. 시험관내 CC4 세포주로부터 유래한 세포의 조사는 SAA3 메시지 양을 더욱 증가시켰다.

CC3 및 CT4 세포에서의 SAA3의 발현은 노턴 블롯 분석법으로 확인하였다. RNA는 0 또는 50 Gy의 x선에 노출된 지 1주에 세포에서 수거하였다. 블롯을 차별 표시 밴드 C122를 나타내는³²P-표지된 프로브로 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 시그널은 방사능 사진으로 검출하였다. 아가로스겔의 에티듐 브로마이드 염색은 각각의 레인에서 RNA의 동일 적재를 확인하였다.

실시예 9. 이온화 방사선에 노출된 쥐의 SAA3 생체내 발현

CBA/Ca 쥐의 아계인 CBA/CaJ(미국 메인주 바 하버 소재의 잭슨 실험실) 쥐를 사용하여 이온화 방사선에 생체내 노출된 후 SAA3의 발현이 향상됨을 확인하였다. CBA/CaJ 쥐는 50 cGy, 200 cGy, 400 cGy 및 700 cGy의 총 신체 조사 x선에 노출되었다. 쥐는 노출된지 7일, 14일, 28일, 3 개월 및 7 개월 후에 치사시켰고, 모든 골수 및 기타 조직을 수거하였다. 골수 및 조직에서 RNA를 분리한 직후에 실시예 8에서 설명한 봐 같이 SAA1, SAA2, SAA3 및 SAA4 각각에 대한 특이 프라이머로 RT-PCR을 사용하여 SAA1, SAA2, SAA3 및 SAA4 메시지의 존재를 분석하였다. 대조용 골수에서는 메시지가 검출되지 않았으나, 700 cGy의 총 신체 조사에 노출된 쥐에서 SAA3 메시지는 노출후 연장된 시점에서 골수중 메시지가 검출되었다.

C57B16/J 및 C3H/HeJ 쥐를 비롯한 다른 주의 쥐에서 유래한 세포에서 유사한 결과가 얻어졌다. 이 결과는 쥐를 이온화 방사선에 생체내 노출시킨 것이 골수 기질 세포에서 SAA3 메시지를 유발하고, 이는 노출시킨 후 장시간 까지 메시지 증가가 검출가능함을 보여준다. 이것은 SAA3 유전자가 이온화 방사선 노출의 생물학적 지표로 적합하다는 것을 보여준다.

실시예 10. 인간 세포의 시험관내 조사 후 SAA 전사체의 발현

다양한 인간 세포주를 본 발명에 따라 이온화 방사선에 노출시켰다. 이들 중에서 주된 것은 골수 기질 세포주 KM101, KM102 및 KM104이고, 이들은 피츠제랄드 등의 문헌[Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys. 15:1153~1159(1988)]에 기재되어있다. 세포들은 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 융합 단층으로 증식시킨 다음, 0 Gy(대조용) 또는 10 Gy의 이온화 방사선에 노출시켰다. 하기 표4에 나타낸 SAA 인간 유전자 군의 일원에 대한 특이 프라이머를 사용하여 인간 SAA1, SAA2, SAA3 및 SAA4 유전자를 증폭시켰다.

인간 SAA 군의 일원에 대한 프라이머 서열

전사체	프라이머 서열	생성물 크기(bp)
huSAA1	CTCGGGACATGTGGAGAGCCTACTCTATTAGATACCCATTGTGTACCCTCT	369
huSAA2	CTCGGGACATGTGGAGAGCCTACTCTGCCATATCTCAGCTTCTCTGGACATA	376
huSAA3	GAGATGGGGTCTTGCTATGTTTCTAGGGATATAGAATTCAAGTAACTGTAGGT	491
huSAA4	AAGATACCAGCAGCTCTGCCTTTACACTTCGAGTCCTCCAATACAGTGC	368

3개의 세포주 모두에서, 조사된 세포중 SAA1 전사체가 발견되었다. 메시지 양은 대조군 세포에 비해 조사된 세포에서 증가되었다. SAA1 전사체는 대조용 KM101에서 4일째에 개시됨이 발견되었다. SAA2 전사체는 어떤 시간에서도 대조군 세포에서는 발견되지 않았으나, 조사된 세포에서 발견되었고, 노출후에도 지속되었다. SAA3 및 SAA4 전사체는 대조군 또는 조사된 세포 어디에도 검출되지 않았다.

실시예 11

생체내에서 이온화 방사선에 인체를 노출시킨 후 SAA 전사체의 발현

인간의 SAA 전사체의 발현을 확인하기 위해서, 이온화 방사선에 노출시키기 전에 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 또는 유방암을 비롯한 고형 종양을 치료중인 자가 골수 이식이 계획되는 환자에게서 시료를 취한다. 시료를 저온 보관한다. 이어서 환자의 몸 전체를 방사선에 노출시키고, 방사선에 노출후에 임상적인 재발의 증거 또는 적절한 시점에서, 분석을 위해 골수를 빼내에 조직 배양물에서 증식시킨다. 인체 골수 기질 세포를 얻어 증식시키는 기술은 그린버거의 문헌[In Vitro, 15(10):823-828(1979)]에 개시되어 있으며, 본원에서 참고로 인용하였다.

의도하는 임상용 조직 병리학 분석을 위해 일부 시료를 제거한 후, 빼낸 골수를, 10^-6M 히드로코르티손 및 맥코이 5A 배지로 보충한 25% 태아 소 혈청이 있는 조직배양 플라스크에 둔다. 이 세포를 7% CO₂, 33℃의 고습도 항온조에서 증식시킨다. 플라스크 표면에 부착된 기질 세포를 트립신 처리하고 재평판배양하여 증식시킨다.

이온화 방사선으로 처리하기 전에 동일한 환자에게 얻어 저온보관한 골수 세포 분액을 해동시키고 세포를 동일한 조건에서 배양한다. 25% 태아 소 혈청 및 10^-6M 히드로코르티손의 존재하에 플라스크 표면에 결합되어 단층으로 증식하는 기질 세포가 형성된다. 세포가 적절한 수, 즉, 각 제조시 약 10⁷으로 증식한 후에, 긁어내거나 트립신 처리하여 이들 세포를 회수한다. 총 RNA를 추출하고 SAA 전사체를 사용하여 RT-PCR로 증폭시키고, SAA 전사체 양을 분석하고 전술한 바와 같이 노던 분석으로 확인하였다.

실시예 12

인간 검체가 과거 이온화 방사선에 노출되었지를 결정하는 분석법

검체가 상당량의 방사선에 노출된 적이 없는 대조군에 비해 SAA의 증가된 발현양을 나타내는지를 검출하기 위해서, 인간 검체로부터 얻은 골수 기질 세포를 생검한다. 실시예 9에서 전술한 프로토콜과 프라이머를 사용하여 SAA 의 양에 대해 세포를 즉시 분석하거나, 또는 검체로부터 제거한 후에 배양하여 SAA 양을 분석할 수 있다.

전술한 프로토콜은 방사선 조사에 노출되기 전에 기타 원인제, 예를 들어 전신 독서, 화학치료 알킬화제, 화학적 발암물질과, DNA 가닥을 파괴하고 방사선 치유를 유도하는 기타 제제에 노출용 생물학적 지표를 동정하기 위해서 사용할 수 있다. 특히, 차별 표시를 사용하여 원인제에 노출된 검체로부터 취한 조직에서 본 발명의 생물학적 지표의 발현양의 증가를 검출할 수 있다.

Claims

세포군을 이온화 방사선에 노출시키는 단계;

차별 표시(differential display)를 사용하여 이온화 방사선에 노출된 지 3주 후 세포군의 유전자 발현과 이온화 방사선에 노출되지 않은 대조 세포군에서의 유전자 발현을 비교하는 단계;

대조 세포군에 비하여 노출된 세포군의 유전자 발현양을 변화시키고, 이온화 방사선에 노출된 후 적어도 3주 동안 발현양을 유지하는 유전자 또는 유전자 단편을 선택하는 단계를 포함하며, 이온화 방사선에 노출시 생물학적 지표를 확인하는 방법.
제1항에 있어서, 유전자 또는 유전자 단편의 서열결정 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 세포군을 이온화 방사선에 노출시키는 단계가 시험관내에서 세포 배양물을 노출시키는 단계인 방법.
제1항에 있어서, 세포군을 이온화 방사선에 노출시키는 단계가 생체내에서 세포를 노출시키는 단계인 방법.
제1항에 있어서, 유전자 또는 유전자 단편이 혈청 아밀로이드를 암호하는 유전자에 해당하는 방법.
제5항에 있어서, 혈청 아밀로이드가 쥐 혈청 아밀로이드 A3인 방법.
제5항에 있어서, 혈청 아밀로이드가 인체 혈청 아밀로이드 A1 또는 A2인 방법.
제1항에 있어서, 세포가 골수세포인 방법.
제1항에 있어서, 유전자 또는 유전자 단편이 대조 세포군에 비하여 방사선에 노출된 세포군에서 증가된 유전자 발현양을 갖는 방법.
제9항에 있어서, 증가된 발현양이 대조군에서 관찰되는 발현양의 2배 이상인 방법.
제9항에 있어서, 대조군중 생물학적 지표의 양이 실제로 종래 기술에 의해 검출될 수 없는 방법.
제1항에 있어서, 유전자 또는 유전자 단편이 대조 세포군에 비해 방사선에 노출된 세포군에서 감소된 발현양을 갖는 방법.
개체로부터 세포를 얻는 단계와, 방사선에 노출후 유지되는 생물학적 지표의 존재를 확인하기 위해 세포를 분석하는 단계를 포함하여, 개체가 방사선에 노출되었는지의 여부를 측정하는 방법.
제13항에 있어서, 세포를 분석하는 단계를 수행하기 전에 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
제13항에 있어서, 노던 블롯 분석이 상기 분석 단계에서 사용되는 방법.
제13항에 있어서, RT-PCR 분석이 상기 분석 단계에서 사용되는 방법.
제13항에 있어서, 생물학적 마커가 혈청 아밀로이드를 암호하는 유전자에 해당하는 유전자 또는 유전자 단편인 방법.
제17항에 있어서, 혈청 아밀로이드가 쥐 혈청 아밀로이드 A3인 방법.
제17항에 있어서, 혈청 아밀로이드가 인체 혈청 아밀로이드 A1 또는 A2인 방법.
제13항에 있어서, 세포가 골수 세포인 방법.
제13항에 있어서, 유전자 또는 유전자 단편이 대조 세포군에 비해 방사선에 노출된 세포군에서 증가된 유전자 발현양을 나타내는 방법.
제21항에 있어서, 증가된 발현양이 대조군에서 관찰되는 발현양의 2배 이상인 방법.
제21항에 있어서, 대조군의 생물학적 지표의 양이 실제로 종래 기술로 검출될 수 없는 방법.
제13항에 있어서, 유전자 또는 유전자 단편이 대조 세포군에 비해 방사선에 노출된 세포군에서 감소된 유전자 발현양을 나타내는 방법.
이온화 방사선에 노출된 후에 3주 이상 지속되는 변화된 발현양을, 이온화 방사선에 노출시 나타내는 유전자 또는 유전자 단편에 특이적인 프라이머;

RT-PCR 분석용 시약; 및

검체로부터 제거된 세포가 유전자 또는 유전자 단편을 포함하는지를 측정하는 분석에 프라이머 및 시약을 사용하기 위한 지침서를 포함하여, 이온화 방사선에 과거 노출여부를 검출하는 키트.
제25항에 있어서, 세포가 골수 세포인 키트
제26항에 있어서, 프라이머가 SAA 유전자 또는 이의 단편에 특이적인 키트.