KR19990080857A - 액상 1-데아미노-8-d-아르기닌 바소프레신 아세테이트 합성법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 액상 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트 합성법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 분절합성방법에 의해 다음의 아미노산 서열식 2 및 서열식 3으로 표시된 분절펩티드를 합성한 다음, 이들 분절펩티드를 액체상 펩티드 합성법에 따라 분절축합하여 서열식 4로 표시된 폴리펩티드를 얻고, 여기에 단일펩티드인 (R1)-Gln-OH, (R1)-Phe-OH, 및 (R1)-Tyr(R1)-OH를 순차적으로 축합함으로써, 종래의 화학적합성법중 액체상방법보다 반응공정이 단순하여 산업적 이용이 더욱 용이할 뿐만 아니라 생산수율 및 순도가 매우 높게 제조될 수 있는 다음 아미노산 서열식 1로 표시된 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트를 액체상방법으로 합성하는 방법에 관한 것이다.
아미노산 서열식 1: Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2·C2H4O2·3H2O
아미노산 서열식 2: (R1)-Asn-Cys(R2)-Pro-OH
아미노산 서열식 3: (R1)-D-Arg-Gly-NH2/TsOH
아미노산 서열식 4: (R1)-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH
아미노산 서열식 5: Mpa(R3)-Tyr-Phe-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH
상기 아미노산 서열식에서, R1은 N-t-부틸옥시카르보닐이며, R2및 R3는 각각 측쇄보호기로 디페닐메탄올을 나타낸다.

Description

액상 1-데아미노-8-Ｄ-아르기닌 바소프레신 아세테이트 합성법
본 발명은 액상 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트 합성법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 분절합성방법에 의해 다음의 아미노산 서열식 2 및 서열식 3으로 표시된 분절펩티드를 합성한 다음, 이들 분절펩티드를 액체상 펩티드 합성법에 따라 분절축합하여 서열식 4로 표시된 폴리펩티드를 얻고, 여기에 단일펩티드인 (R1)-Gln-OH, (R1)-Phe-OH, 및 (R1)-Tyr(R1)-OH를 순차적으로 축합함으로써, 종래의 화학적합성법중 액체상방법보다 반응공정이 단순하여 산업적 이용이 더욱 용이할 뿐만 아니라 생산수율 및 순도가 매우 높게 제조될 수 있는 다음 아미노산 서열식 1로 표시된 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트를 액체상방법으로 합성하는 방법에 관한 것이다.
아미노산 서열식 1: Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2·C2H4O2·3H2O
아미노산 서열식 2: (R1)-Asn-Cys(R2)-Pro-OH
아미노산 서열식 3: (R1)-D-Arg-Gly-NH2/TsOH
아미노산 서열식 4: (R1)-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH
아미노산 서열식 5: Mpa(R3)-Tyr-Phe-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH
상기 아미노산 서열식에서, R1은 N-t-부틸옥시카르보닐이며, R2및 R3는 각각 측쇄보호기로 디페닐메탄올을 나타낸다.
일반적으로 상기와 같은 펩티드화합물을 얻는 방법으로는 첫째, 천연물로부터 원하는 펩티드화합물을 추출하는 방법; 둘째, DNA를 이용하여 원하는 펩티드화합물을 재조합하는 방법; 그리고, 셋째, 화학적인 방법으로 합성하는 방법 등이 있다.
그러나, 이들 방법중 첫째와 둘째의 방법은 얻고자 하는 펩티드화합물의 수득률이 낮으며, 최종 생산된 펩티드화합물의 순도를 증명하는 방법이 불명확하고, 미생물에서 발생된 불순물을 정제하기 어려운 등의 문제점을 갖고 있어 바람직하지 않다.
따라서, 화학적합성법을 주로 이용하여 효과적으로 펩티드화합물을 합성하는 여러 가지 새로운 방법이 개발되어 왔으며, 현재는 이 방법을 이용하여 펩티드화합물을 대량생산하는 것이 일반적인 통례이다. 이러한 화학적인 합성법은 크게 용액상에서 진행되는 액체상방법과 중합지지체를 이용한 고체상방법으로 나뉘는 데, 우선 후자의 경우에는
ⅰ) 얻고자 하는 펩티드화합물의 구성 아미노산의 측쇄보호기를 최대한 보호해야 하며,
ⅱ) 과량의 아미노산 유도체를 사용하여 한정된 축합방법내에서 반응을 수행하고,
ⅲ) 합성시 중간물질의 정제가 어려우며,
ⅳ) 합성과정에 거대분자의 중합지지체를 운반체로 함으로써, 최종 폴리펩티드사슬을 완성한 후에 중합지지체로부터 펩티드물질을 유리시켰을 때, 수득량이 크게 감소되는 등의 문제점으로 인해 고순도의 펩티드물질을 대량생산하는 방법으로는 부적절한 문제점이 있어 왔다.
이와는 달리, 또다른 화학적합성법인 액체상방법의 경우에는
ⅰ) 펩티드화합물의 성질과 합성과정에 따라 펩티드화합물을 구성하는 아미노산 측쇄기의 보호를 최소한으로 줄일 수 있으며,
ⅱ) 아미노산의 축합방법도 자유로이 선택할 수 있고,
ⅲ) 합성과정중 생성되는 중간물질의 정제가 가능하며,
ⅳ) 목적하는 펩티드화합물의 양에 따라 반응량의 조절이 용이하므로, 다량의 고순도 펩티드화합물을 얻기위한 방법으로 현재까지 널리 사용되고 있다.
그런데, 본 발명에 있어서 목적으로 하는 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트 또는 데스모프레신 아세테이트는 빈뇨(뇨붕증)를 치료하는 중요한 항이뇨제로써, 이는 일반적으로 당뇨성 빈뇨, 야뇨증, 요실금증 등을 치료하는 약물로 사용되어온 바소프레신 유도체 호르몬이다. 그러나, 천연의 바소프레신과는 달리, 그 구조에 있어서 바소프레신 말단의 시스테인이 1-β-머캅토프로피온산(1-β-Mercaptopropionic acid; Mpa)으로 치환되어 있고, 7번 위치의 아르기닌이 D-아르기닌으로 변환되어 있는 특징을 가지고 있어 천연에서의 추출이 불가능하고, 따라서, 유일한 이 물질에 대한 제조방법으로는 화학적합성법을 이용하고 있다.
이러한 예로 미국특허 제 3,497,491호 및 제 5,500,413호가 있는데, 이들은 ⅰ) 반응공정이 여러단계로 장시간이 필요하며, ⅱ) 반응시 부반응의 우려가 높으며, ⅲ) 측쇄보호기의 분리시 수득량의 손실이 크고, ⅳ) 중간생성물인 펩티드 단편의 용해도가 낮아 반응효율이 저하됨으로써 경제적 손실이 발생하고, ⅴ) 최종 펩티드화합물의 정제시 불순물의 분리 및 정제가 어려워 고순도, 고수율의 펩티드화합물을 얻는데 문제점을 가지고 있다.
따라서, 화학적합성법중 액체상법을 이용한 펩티드합성법의 경우 상기와 같은 장점을 지니고 있음에도 불구하고, 여전히 대량으로 고순도, 고수율의 펩티드화합물을 합성하는 데에는 상기와 같은 문제점이 있었던 바, 이에 대한 새로운 공정개발이 현실적으로 시급히 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명은 우선적으로 상기 아미노산 서열식 2와 3으로 표시되는 분절펩티드를 합성한 후, 이 분절펩티드를 분절축합법 및 순차축합법의 혼용방법을 통하여 고순도 및 고수율의 다음 서열식 1로 표시되는 액상의 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트 합성법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명은 액상방법을 통한 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트의 합성방법에 있어서, 다음 아미노산 서열식 2와 서열식 3의 분절펩티드를 분절합성법에 의해 다음 아미노산 서열식 4의 폴리펩티드로 합성하고, 여기에 아미노산 (R1)-Gln-OH, (R1)-Phe-OH 및 (R1)-Tyr(R1)-OH를 순차적으로 축합시켜서 제조하는 다음 아미노산 서열식 1의 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트 합성방법을 그 특징으로 한다.
아미노산 서열식 1: Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2·C2H4O2·3H2O
아미노산 서열식 2: (R1)-Asn-Cys(R2)-Pro-OH
아미노산 서열식 3: (R1)-D-Arg-Gly-NH2/TsOH
아미노산 서열식 4: (R1)-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH
아미노산 서열식 5: Mpa(R3)-Tyr-Phe-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH
상기 아미노산 서열식에서, R1은 N-t-부틸옥시카르보닐(Boc)이며, R2및 R3는 각각 디페닐메탄올(Dpm)을 나타낸다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 상기 아미노산 서열식 2와 서열식 3으로 표시되는 분절펩티드를 합성한 후, 이 분절펩티드를 분절축합법 및 순차축합법의 혼용방법을 통하여 고순도 및 고수율의 다음 서열식 1의 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트를 합성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 그 제조공정에 따라 각각의 필요성분과 함께 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
본 발명은 우선, 상기 아미노산 서열식 2와 서열식 3으로 표시된 분절펩티드를 별도의 공정으로 각각 합성하는 데에 그 특징이 있는 바, 우선 서열식 2로 표시된 측쇄보호기가 결합된 폴리펩티드 (R1)-Asn-Cys(R2)-Pro-OH는 각각의 단일아미노산 (R1)-Cys(R2)-OH, (R1)-Pro-OH 및 (R1)-Asn-OH을 이용하여 당업자에게 통상적인 방법으로 축합한다. 또한, 아미노산 서열식 3으로 표시된 폴리펩티드 (R1)-D-Arg-Gly-NH2/TsOH는 각각의 단일 아미노산 H-Gly-OBzl/TsOH, (R1)-D-Arg-OH를 축합제와 함께 반응을 수행하여 합성한다. 이와 같이, 그 길이를 단지 아미노산 3개 및 2개로 각각 한정한 뒤, 분절축합 및 순차축합하여 본 발명에 따른 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트를 제조함으로써 기존 방법에 비하여 공정을 단순화할 수 있고, 순차축합을 수행할 때 별도의 특별한 정제단계없이 반응을 수행할 수 있음으로 인해 수율 및 순도 향상에 큰 도움이 된다. 또한, 본 발명은 상기와 같이 (R1)-D-Arg-OH의 아미노산 자유염을 이용하여 축합반응을 수행하는 데에 그 특징이 있는 바, 이는 종래의 액체상방법으로 아르기닌이 포함된 펩티드를 합성하는 경우, 측쇄기의 N-말단에 의한 아미드결합과 같은 부반응을 줄이기 위해 일반적으로 N-말단 부분에 매우 결합력이 강한 측쇄보호기를 결합시켜 안정화시키는 방법을 채택사용하였으나, 본 발명에서는 아르기닌(Arg) 측쇄의 N-말단의 염을 이용한 비공유적 보호를 채택하기 때문에 측쇄보호기를 통한 미보호상태에서도 상기와 같은 부작용없이 축합반응을 진행시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 측쇄보호기가 불필요하여 경제적인 장점이 있다. 그리고, 여기에서 사용되는 축합제로는 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 및 1-히드록시-벤조트리아졸(HOBt)만을 사용하며, 따라서 공정변화에 관계없이 동일한 축합제를 사용할 수 있으므로써 반응공정을 단순화시킬 수 있을 뿐만아니라 산업적으로도 연속공정을 가능하게 할 수 있는 장점이 있다. 또한, 이때 적용되는 pH는 7 ∼ 9 범위의 약알카리에서 본 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 만일, pH 7보다 산성조건이면, 일반적으로 펩티드물질이 산성에서는 안정하므로 축합반응시 반응속도가 늦어지게 되고, 또한 pH 9를 초과하는 강알카리 조건일 경우 펩티드물질의 라세미화가 촉진되는 문제점이 있게 된다.
다음으로, 상기 공정에서 합성한 서열식 2 및 서열식 3의 분절펩티드를 분절축합하여 아미노산 서열식 4의 폴리펩티드 (R1)-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH를 합성한다. 이때, 서열식 2 및 서열식 3의 분절펩티드간 분절축합 조건으로는 pH 7 ∼ 9, N-메틸모르포린 촉매의 분위기하에서 수행하는 것에 특징이 있다. 이때, 축합조건이 만일 pH 7보다 산성조건이면, 일반적으로 펩티드물질이 산성에서는 안정하므로 축합반응시 반응속도가 늦어지게 되고, 또한 pH 9를 초과하는 강알카리 조건일 경우 펩티드물질의 라세미화가 촉진되는 문제점이 있게 된다. 그리고, 결과된 폴리펩티드를 보다 안정된 고체형태로 만들고 이에 방습효과를 부여하기 위하여 p-톨루엔설폰산염을 사용할 수 있다.
그런다음, 상기 아미노산 서열식 4의 폴리펩티드 (R1)-Asn-Cys(R2)-Pro-D- Arg-Gly-NH2/TsOH에 (R1)-Gln-OH, (R1)-Phe-OH 및 (R1)-Tyr(R1)-OH를 순차적으로 축합하는데, 처음의 분절펩티드 축합시와 동일한 조건하에서 동일한 축합제인 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 및 1-히드록시-벤조트리아졸(HOBt)만을 사용하여 축합공정을 수행하여 아미노산 서열식 5의 폴리펩티드 Mpa(R3)-Tyr-Phe-Asn-Cys(R2)-Pro -D-Arg-Gly-NH2/TsOH를 합성한다.
마지막으로, 상기에서 합성된 아미노산 서열식 5로 표시되는 폴리펩티드 Mpa(R3)-Tyr-Phe-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH로부터 통상의 방법에 따라 탈보호기 반응을 수행한 뒤, 단순히 물용매상에서 암모니아수를 이용해 pH를 7 ∼ 9로 조절하고 과산화수소로 산화공정을 수행하여 상기 아미노산 서열식 1로 표시되는 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트를 합성한다. 왜냐하면, pH 7보다 산성조건이면, 일반적으로 펩티드물질이 산성에서는 안정하므로 축합반응시 반응속도가 늦어지게 되고, 또한 pH 9를 초과하는 강알카리 조건일 경우 펩티드물질의 라세미화가 촉진되기 때문이다. 또한, 상기 반응을 수행한 후 pH를 4 정도로 유지하면, 펩티드간 이황화물 다리 등의 형성으로 인해 생성물질이 안정화되기 때문에 고분자의 형성과 같은 부반응의 발생을 최대한 억제할 수 있다.
이상의 공정에서 본 발명은 공통적으로 촉매로써 사용되는 N-메틸모르포린은 축합공정에서 발생할 수도 있는 라세미화를 방지할 수 있어 생체내에서 필요로 하는 L-체만을 보다 높은 효율로 얻을 수 있게끔 할 수 있다. 또한, 종래 여러 종류의 측쇄보호기를 사용함으로써 발생하는 생산공정 및 회수공정상의 복잡성을 해결할 수 있도록 N-t-부틸옥시카르보닐 및 디페닐메탄올로 단순화하여 사용함으로써 공정을 보다 단순화할 수 있고, 또한 회수시 이들을 별도로 분리하여야 하는 문제점을 해결할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기에서와 같이 반응공정을 극소화하여 고수율 및 고순도의 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트를 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1 :Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OH(2)
이하, 각 실시예에서 사용된 아미노산은 특별한 표시가 없는 한 L-체를 나타낸다. 단량체 및 합성물질은 얇은막 크로마토그래피(TLC) 및 HPLC(HP Vectra 500기종)를 사용하여 물질 및 순도를 확인하였다. HPLC는 HP Vectra 500기종을 사용하여 C-18(Nuclosil, 10㎝ × 4.6㎜)로 충진된 SUS칼럼으로 자외선 검출기(216㎚)에서 실시하였고, 얇은막 크로마토그래피(TLC)는 머크(Merck)60F254실리카겔을 사용하여 아래의 전개용매로 하였다.
전개용매 :
EPAW-1 : 초산에틸/피리딘/초산/물 = 42/14/6.6/1
BAW-1 : n-부탄올/물/초산 = 4/1/1
CMA-2 : 클로로포름/메탄올/초산 = 90/10/3
그리고, 치환기와 시약 등의 약호는 다음과 같다.
Boc : N-t-부틸옥시카르보닐
Bzl : 벤질
Dpm : 디페닐메탄올
DMF : 디메틸포름아미드
Me : 메틸
TEA : 트리에틸아민
TFA : 트리플루오르아세트산
HOBt : 1-히드록시-벤조트리아졸
우선, Boc-Cys(Dpm)-Pro-OMe는 디메틸포름아미드 56㎖에 Boc-Cys(Dpm)-OH 14.5g와 HOBt 5.1g을 넣어 녹이고 0℃에서 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 8.5g을 넣어 1 시간 동안 교반시킨 뒤 디메틸포름아미드 37㎖에 녹여놓은 H-Pro-OMe/HCl 7.2g과 트리에틸아민 7.5㎖를 넣어 pH 8의 약알카리로 맞추고 교반시켰다. 반응 후 생성된 N,N'-디시클로헥실우레아(DCU)를 여과후 제거하고 여액을 농축한 뒤 잔류물을 초산에틸 200㎖로 추출하고 추출물에 5% NaHCO3수용액, 0.5N 염산, 소금물의 순서로 세척하고 무수황산나트륨상에서 건조시켰다. 다음으로, 무수황산나트륨을 여과하여 제거한 뒤 여액을 농축하였고, 석유에테르를 이용하여 Boc-Cys(Dpm)-Pro-OMe 결정을 얻었다.
H-Cys(Dpm)-Pro-OMe/HCl은 상기에서 얻은 Boc-Cys(Dpm)-Pro-OMe에다 염산/초산용액을 넣어 실온에서 탈보호기 반응을 수행하고, 반응액을 농축한 뒤 톨루엔으로 세척하고 디에틸에테르를 넣어 얻었다.
그리고, Boc-ASn-Cys(Dpm)-Pro-OMe는 디메틸포름아미드 56㎖에 녹인 Boc-Asn-OH 8.8g과 HOBt 5.6g을 넣어 녹이고, 0℃에서 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 9.4g을 넣어 1시간 동안 교반시킨 뒤, 디메틸포름아미드 56㎖에 녹여놓은 상기 공정에서 결과된 H-Cys(Dpm)-Pro-OMe/HCl과 N-메틸모르포린(NMM) 5㎖를 넣어 pH 8의 약알카리로 맞추고 충분히 교반시켰다. 반응후 생성된 N,N'-디시클로헥실우레아(DCU)를 여과하여 제거하고 여액을 농축한 뒤 잔류물을 초산에틸 250㎖로 추출한 뒤, 그 추출물에 5% NaHCO3수용액, 0.5N 염산, 소금물의 순서로 세척하고 무수황산나트륨상에서 건조시켰다. 그런 다음, 무수황산나트륨을 여과하여 제거하고 여액을 농축한 뒤 디에틸에테르를 처리하여 이들의 결정을 얻었다.
Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OH는 Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OMe를 초산 94㎖에 녹인 뒤 2N-NaOH(w/v)를 넣어 실온에서 가수분해 반응을 시키고, 반응후 초산에틸 200㎖로 추출하고 추출물에 4N 염산으로 pH 4의 약산으로 맞추어 유기층을 추출한 뒤 추출액에 0.5N 염산, 소금물을 차례대로 넣어 세척하고 무수황산나트륨상에서 건조시켰다. 건조후 무수황산나트륨을 여과하여 제거하고 여액을 농축한 뒤, 디에틸에테르로 이용하여 결정상태의 Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OH(2)를 얻었다.
성상 : 흰색분말
TLC : Rf=0.25 (CMA-1)
제조예 2: Boc-D-Arg-Gly-NH2/TsOH(3)
우선, Boc-D-Arg-Gly-OBzl/TsOH를 합성하기 위해서 H-Gly-OBzl/TsOH, Boc-D-Arg-OH 8.1g과 HOBt 4.4g을 차례대로 플라스크에 넣고, 여기에 디메틸포름아미드 74㎖를 넣어 녹이고 0℃에서 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 7.4g을 넣어 1 시간 동안 교반시킨 뒤, 저온에서 24시간 동안 방치하였다. 그리고, 반응후 생성된 N,N'-디시클로헥실우레아(DCU)를 여과하여 제거한 뒤, 잔류물을 디에틸에테르로 세척하고 무수황산나트륨상에서 건조시켰다. 건조후 무수황산나트륨은 여과하여 제거하였고, 여액은 농축한 뒤 석유에테르를 이용하여 이들의 결정을 얻었다.
그리고, 다음으로 Boc-D-Arg-Gly-NH2/TsOH는 상기 공정에서 결과한 Boc-D-Arg-Gly-OBzl/TsOH에 암모니아수/메탄올 150㎖를 넣어 실온에서 교반한 뒤 농축한 용액에 메탄올로 세척하고 디에틸에테르를 넣어 결정상태의 Boc-D-Arg-Gly-NH2/TsOH(3)를 얻었다.
성상 : 흰색분말
TLC : Rf=0.45 (BAW-1), Rf=0.3 (EPAW-1)
제조예 3: Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH(4)
우선, 상기 제조예 2에서 합성한 Boc-D-Arg-Gly-NH2/TsOH로부터 0℃에서 트리플루오르아세트산(TFA) 60㎖를 넣고 실온에서 30분간 탈보호기 반응을 수행하여 보호기를 제거하고, 반응액을 농축한 뒤 p-톨루엔설폰산 10g을 넣어 녹이고 다시 농축하고, 여기에 디에틸에테르를 넣어 H-D-Arg-Gly-NH2/2TsOH를 얻었다.
또한, Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH는 상기 탈보호기 공정결과 얻은 H-D-Arg-Gly-NH2/2TsOH 10g과 제조예 1에서 합성한 Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OH 11.6g, 그리고 HOBt 2.6g을 차례대로 넣고 여기에 디메틸포름아미드 40㎖를 넣어 녹이고, 0℃에서 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 4.5g과 N-메틸모르포린(NMM) 5㎖를 넣어 pH 8의 약알카리로 조절한 다음, 얼음물에서 1시간 교반시킨뒤, 실온에서 다시 교반시켜 반응을 수행하였다. 반응후 생성된 N,N'-디시클로헥실우레아(DCU)를 여과하여 제거하고 잔류물을 디에틸에테르로 세척한 뒤, 무수황산나트륨상에서 건조시켰다. 건조후 무수황산나트륨은 여과하여 제거하였고 여액은 농축한 뒤, 초산에틸 100㎖를 넣어 결정상태의 Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly -NH2/TsOH(4)을 얻었다.
성상 : 연한 노란색을 띤 흰색분말
TLC : Rf=0.35 (BAW-1)
제조예 4: Mpa(Dpm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH(5)
상기 제조예 3에서 분절합성한 Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH에다 염산/초산용액 70㎖를 넣어 실온에서 40분간 탈보호기 반응을 수행하였고, 결과된 반응액을 농축한 뒤 p-톨루엔설폰산 3.4g을 넣어 녹이고, 다시 농축한 뒤 톨루엔으로 세척하였고, 여기에 디에틸에테르 100㎖를 넣어 H-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg -Gly-NH2/2TsOH를 얻었다.
상기 공정에서 보호기가 제기된 H-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/2TsOH에 순차적으로 Boc-Gln-OH, Boc-Phe-OH 및 Boc-Tyr(Boc)-OH를 축합시키는데, 우선 Boc-Gln-OH 5g과 HOBt 2.8g을 차례대로 넣고 여기에 디메틸포름아미드 42㎖를 넣어 녹이고 0℃에서 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 3.9g을 넣은 후 디메틸포름아미드 37㎖에 녹여 넣은 H-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/2TsOH와 N-메틸모르포린(NMM) 2.1㎖를 넣어 pH를 약알칼리로 맞추고 실온에서 교반시켰다. 반응후 생성된 N,N'-디시클로헥실우레아(DCU)를 여과후 제거하였고, 여액을 농축한 뒤 초산에틸 100㎖를 넣어 Boc-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH를 얻었다.
다음으로, 상기 공정에서 얻은 Boc-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly -NH2/TsOH에 Boc-Phe-OH를 축합시키기 위해서 우선 Boc-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg -Gly-NH2/TsOH로부터 탈보호기 공정을 수행하였다. 즉, H-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/2TsOH는 Boc-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg- Gly-NH2/TsOH에다 염산/초산용액 90㎖를 넣어 40분간 탈보호기 반응을 하고 반응액을 농축한 뒤 p-톨루엔설폰산 3.2g을 넣어 녹이고, 다시 농축한 뒤 톨루엔으로 세척하였고, 여기에 디에틸에테르 100㎖를 넣어 얻었다. 다음, 여기에 Boc-Phe-OH 4.4g과 HOBt 2.2g을 처례대로 넣고 여기에 디메틸포름아미드 23㎖를 넣어 녹이고 0℃에서 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 3.9g을 넣은 후 디메틸포름아미드 37㎖에 녹여놓은 H-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/2TsOH와 N-메틸모르포린(NMM) 2.1㎖를 넣어 pH 8의 약알칼리로 맞추고 실온에서 교반시켜 반응을 수행하였다. 반응후 생성된 N,N'-디시클로헥실우레아(DCU)를 여과후 제거하고 여액은 농축한 뒤 초산에틸 100㎖를 넣어 Boc-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly -NH2/TsOH를 얻었다.
그리고, 상기에서 결과된 Boc-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH에 Boc-Tyr(Boc)-OH를 축합하는데, 이를 위해서는 우선 Boc-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm) -Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH로부터 보호기를 제거하는 공정이 필요하다. 즉, 상기 공정에서 결과된 Boc-Phe-Gln-Asn-Cys (Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH에다 염산/초산용액 73㎖를 넣어 40분간 탈보호기 반응을 하였고, 반응액을 농축한 뒤, p-톨루엔설폰산 3.3g을 넣어 녹이고 다시 농축한 뒤 톨루엔으로 세척한 뒤, 여기에 디에틸에테르 100㎖를 넣어 H-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/2TsOH를 얻었다. 다음으로, Boc-Tyr(Boc)-OH 6.4g과 HOBt 2.2g을 차례대로 넣은 뒤, 여기에 디메틸포름아미드 23㎖를 넣어 녹이고 0℃에서 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 3.9g을 넣고, 디메틸포름아미드 37㎖에 녹여놓은 탈보호기처리된 H-Phe-Gln-Asn -Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/2TsOH와 N-메틸모르포린(NMM) 2.1㎖를 넣어 pH 8의 약알칼리로 맞추고 실온에서 교반시켜 충분한 반응을 수행하였다. 그리고, 반응후 생성된 N,N'-디시클로헥실우레아(DCU)를 여과하여 제거한뒤, 여액을 농축하였고, 여기에 증류수를 넣어 결정을 형성시킨 뒤 다시 여과하였다. 그런다음, 디메틸포름아미드 125㎖에 녹여 다시 농축하고 초산에틸 250㎖를 넣어 Boc-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH를 얻었다.
마지막으로, 상기 공정에서 결과된 Boc-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D -Arg-Gly-NH2/TsOH으로부터 서열식 5의 폴리펩티드를 얻기 위해서는 우선, 이들로부터 탈보호기반응을 수행하여야 한다. 따라서, Boc-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm) -Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH에다 염산/초산용액 75㎖를 넣어 40분간 탈보호기 반응을 하였고, 반응액을 농축한 뒤, p-톨루엔설폰산 2.5g을 넣어 녹이고 다시 농축한 뒤 톨루엔으로 세척하였고, 여기에 디에틸에테르 100㎖를 넣어 H-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys (Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/2TsOH를 얻었다. 그리고, 상기에서 미리 탈보호기처리된 후 디메틸포름아미드 23㎖에 용해시켜 놓은 H-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys (Dpm)-Pro -D-Arg-Gly-NH2/2TsOH에 Dpm-S(CH2)2-COOH 2.8g과 HOBt 1.4g을 차례대로 넣고, 여기에 디메틸포름아미드 11㎖를 넣어 녹이고 0℃에서 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 2.3g와 N-메틸모르포린(NMM) 1.1㎖를 넣어 pH 8의 약알카리로 맞추고 실온에서 교반시켜 반응을 수행하였다. 그리고, 반응후 생성된 N,N'-디시클로헥실우레아(DCU)를 여과하여 제거하고 여액은 농축한 뒤 초산에틸 1000㎖를 넣어 결정 Mpa(Dpm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH(5)를 얻었다.
성상 : 흰색분말
TLC : Rf=0.2(BAW-1)
실시예: Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2(아세테이트)(1)
상기 제조예 4에서 합성한 Mpa(Dpm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg -Gly-NH2/TsOH에 m-크레졸/TFA 100㎖(1:12, V/V)를 넣어 녹이고 고온에서 40분간 탈보호기 반응을 수행하였다. 그리고, 결과된 반응액을 농축한 후 톨루엔으로 세척하였고, 여기에 초산에틸 100㎖를 넣어 탈보호기된 결정형태의 Mpa-Tyr-Phe -Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH를 얻었다. 그런 다음, 이 결정을 디메틸포름아미드 75㎖에 녹이고 암모니아수 1㎖를 넣어 pH를 7 ∼ 9 정도로 유지하고 과산화수소 2㎖를 넣어 산화반응을 시켰다.
다음, 본 발명에서 목적으로 하는 서열식 1의 물질을 포함하고 있는 용액은 리크로스퍼(Lichrospher™) RP-18이 충진된 분취용 고성능 액체크로마토그래피를 통하여 통과시켜 분리하였다. 즉, 5% 아세토니트릴/초산용액에서 35% 아세토니트릴/초산용액으로 전개시켜 분취용 고성능 액체크로마토그래피 분석을 이용하여 99% 이상의 순도를 포함한 용액만을 모았고, 이렇게 모은 용액을 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 p-톨루엔설폰산염 형태에서 아세테이트 형태로 전환시켰다. 그리고, 이렇게 전환된 용액을 농축 및 냉동건조시킨 후 결정을 얻어 흰색의 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트 또는 데스모프레신 아세테이트(1)를 얻었다.
성상 : 흰색분말
[α]D: -78.30
실험예 1 ∼ 5: 제조예 1 ∼ 4 및 실시예에서 합성된 물질의 생산량, 순도 및 수율
상기 제조예 1 ∼ 4 및 실시예에서 합성된 각각에 대하여 HPLC 및 TLC방법을 이용하여 순도 및 수율을 측정하였으며, 그리고 결과된 생산량을 결정하여 다음 표 1에 요약하여 나타내었다.
구 분 합성물질 생산량(g) 순도(%) 수율(%)
제조예 1 Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OH 11.6 95 88
제조예 2 Boc-D-Arg-Gly-NH2/TsOH 13.2 95 98
제조예 3 Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH 14.7 95 90
제조예 4 Mpa(Dpm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH 12.7 95 91
실시예 Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly- NH2(아세테이트) 6.3 99 57
비교예 1 ∼ 7: 미국특허 제 3,497,491호 개시 합성물에 대한 생산량, 순도 및 수율의 비교
미국특허 제 3,497,491호에서는 β-벤질머캅토프로피오닐-L-티로신 메틸 에스터[β-Benzylmercaptopropionyl-L-tyrosine methyl ester]로부터 순차적으로 β-벤질머캅토프로피오닐-L-티로실-L-페닐알라닌 메틸 에스터[β-Benzylmercapto propionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanine methyl ester], β-벤질머캅토프로피오닐-L-티로실-L-페닐알라닌 히드라진[β-Benzylmercaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenyl alanine hydrazine], β-벤질머캅토프로피오닐-L-티로실-L-페닐알라닐-L-글루타아미닐-L-아스파라지닐-S-벤질-L-시스테인 메틸 에스터[β-Benzylmercapto propionyl -L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteine methyl ester], β-벤질머캅토프로피오닐-L-티로실-L-페닐알라닐-L-글루타아미닐-L-아스파라지닐-S-벤질-L-시스테인 히드라진[β-Benzylmercaptopropionyl-L- tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteine hydrazine] 및 β-벤질머캅토프로피오닐-L-티로실-L-페닐알라닐-L-글루타아미닐-L-아스파라지닐-S-벤질-L-시스테인-L-프롤릴-NG-토실-D-아르기닐-글리신아미드[β-Benzylmercaptopropionyl-L-tyrosyl-L-phenylalanyl-L-glutaminyl-L-asparaginyl-S-benzyl-L-cysteine-L-prolyl-NG-tosyl-D-arginyl-glycinamide]을 합성한 뒤, 최종적으로 1-디아미노-8-D-아르기닌-바소프레신[1-deamino-8-D-arginine-vasopressin]을 합성하는 방법이 개시되어 있다. 그리고 결과된 각 단계별 생산량은 다음 표 2로 요약된다.
구 분 합성물질 생산량(g) 순도(%) 수율(%)
비교예 1 β-벤질머캅토프로피오닐-L-티로신 메틸 에스터 16.3 - 93
비교예 2 β-벤질머캅토프로피오닐-L-티로실-L-페닐알라닌 메틸 에스터 7.6 - 97
비교예 3 β-벤질머캅토프로피오닐-L-티로실-L-페닐알라닌 히드라진 10.1 - 72
비교예 4 β-벤질머캅토프로피오닐-L-티로실-L-페닐알라닐-L-글루타아미닐-L-아스파라지닐-S-벤질-L-시스테인 메틸 에스터 11.3 - 76
비교예 5 β-벤질머캅토프로피오닐-L-티로실-L-페닐알라닐-L-글루타아미닐-L-아스파라지닐-S-벤질-L-시스테인 히드라진 6.7 - 62
비교예 6 β-벤질머캅토프로피오닐-L-티로실-L-페닐알라닐-L-글루타아미닐-L-아스파라지닐-S-벤질-L-시스테인-L-프롤릴-NG-토실-D-아르기닐-글리신아미드 - - 68
비교예 7 1-디아미노-8-D-아르기닌-바소프레신 100 ∼ 200㎎ - -
비교예 8 ∼ 13 :미국특허 제 5,500,413호 개시 합성물에 대한 생산량, 순도 및 수율의 비교
미국특허 제 5,500,413호에는 Boc-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH으로부터 시작하여 순차적으로 Mpa(Acm)-Tyr-Phe-NHNH2, Mpa(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm) -Pro-OH, Boc-D-Arg(HCl)-Gly-NH2, Mpa(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg (HCl)-Gly-NH2을 합성한 뒤, 최종적으로 Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg -Gly-NH2(아세테이트)를 합성하는 방법이 개시되어 있다. 그리고, 결과된 각각의 단계별 생산량은 다음 표 3으로 요약된다.
구 분 합 성 물 질 생산량(g) 순도(%) 수율(%)
비교예 8 Boc-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH - - 78.5
비교예 9 Mpa(Acm)-Tyr-Phe-NHNH2 - - 85
비교예 10 Mpa(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-OH 17.6 - 86
비교예 11 Boc-D-Arg(HCl)-Gly-NH2 6.8 - 90
비교예 12 Mpa(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg(HCl)-Gly-NH2 15.5 94.5 84.9
비교예 13 Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2(아세테이트) 약 5 >99 53
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 촉매로써 N-메틸모르포린을 사용함으로써 축합공정중 발생할 수도 있는 라세미화를 방지할 수 있어 생체내에서 필요로 하는 L-체만을 보다 높은 효율로 얻을 수 있게끔하며, 또한 아르기닌이 포함된 펩티드를 액체상방법에 의한 합성임에도 불구하고, 아르기닌(Arg)의 측쇄기를 미보호상태에서도 아무런 부작용없이 축합반응을 진행시킬 수 있어 필요로 하는 측쇄보호기가 불요하여 경제적인 장점이 있을 뿐만 아니라, 종래 여러 종류의 측쇄보호기를 사용함으로써 발생하는 복잡성을 해결할 수 있도록 N-t-부틸옥시카르보닐 및 디페닐메탄올로 단순화함으로써 공정을 보다 단순화할 수 있고, 또한 회수시 이들을 별도로 분리하여야 하는 문제점을 해결할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기에서와 같이 반응공정을 극소화하여 고수율 및 고순도의 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트를 얻을 수 있는 효과를 갖는다.

Claims (6)

  1. 액상방법을 통한 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트의 합성방법에 있어서, 다음 아미노산 서열식 2와 서열식 3의 분절펩티드를 분절합성법에 의해 다음 서열식 4의 폴리펩티드로 합성하고, 여기에 아미노산 (R1)-Gln-OH, (R1)-Phe-OH 및 (R1)-Tyr(R1)-OH를 순차적으로 축합시켜 서열식 5의 폴리펩티드를 제조한 연후에 이에 대한 탈보호기 반응 및 산화공정을 수행하는 것을 특징으로 하는 다음 서열식 1의 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트 합성법.
    아미노산 서열식 1: Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2·C2H4O2·3H2O
    아미노산 서열식 2: (R1)-Asn-Cys(R2)-Pro-OH
    아미노산 서열식 3: (R1)-D-Arg-Gly-NH2/TsOH
    아미노산 서열식 4: (R1)-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH
    아미노산 서열식 5: Mpa(R3)-Tyr-Phe-Asn-Cys(R2)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/TsOH
    상기 아미노산 서열식에서, R1은 N-t-부틸옥시카르보닐이며, R2및R3는 각각 디페닐메탄올을 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 서열식 2 및 서열식 3의 분절펩티드는 pH 7 ∼ 9, 축합제 및 N-메틸모르포린 분위기하에서 축합시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트 합성법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 축합제는 디시클로헥실카르보디이미드(DCC)와 1-히드록시-벤조트리아졸(HOBt)인 것을 특징으로 하는 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트 합성법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 아미노산 서열식 3의 분절펩티드는 다음 서열식 6의 아미노산 자유염을 사용하여 축합시키는 것을 특징으로 하는 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트 합성법.
    아미노산 서열식 6 : (R1)-D-Arg-OH
    상기 아미노산 서열식에서, R1은 N-t-부틸옥시카르보닐을 나타낸다.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 아미노산 서열식 4의 폴리펩티드는 서열식 2 및 서열식 3의 분절펩티드를 이용하여 pH 7 ∼ 9, p-톨루엔설폰산염 및 N-메틸모르포린 분위기하에서 분절축합시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트 합성법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 산화공정은 물용매상에서 암모니아수로 pH 7 ∼ 9로 조절한 후, 과산화수소를 이용하여 상기 아미노산 서열식 5의 폴리펩티드의 산화를 수행하는 것을 특징으로 하는 1-데아미노-8-D-아르기닌 바소프레신 아세테이트의 합성법.
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