KR19990073601A

KR19990073601A - 신규 패니바실러스 속 균주, 그로부터 생산되는 균체외 다당및이를 포함하는 시멘트 혼합물용 첨가제

Info

Publication number: KR19990073601A
Application number: KR1019990030844A
Authority: KR
Inventors: 서원택; 임서형; 박용하; 윤정훈
Original assignee: 서원택
Priority date: 1999-07-28
Filing date: 1999-07-28
Publication date: 1999-10-05
Also published as: KR100352651B1

Abstract

본 발명은 토양으로부터 분리한 신규 패니바실러스 속(Paenibacillus sp.) 균주, 그로부터 생산되는 균체외 다당 및 이를 포함하는 시멘트 혼합물용 첨가제에 관한 것으로, 구체적으로 토양으로부터 분리한 본 발명의 패니바실러스 속 WN9 균주는 분자량 약 3150만인 균체외 다당을 생산하고, 상기 균체외 다당은 온도 및 pH의 변화에도 안정한 점성을 유지하는 특성이 있어 이를 시멘트 혼합물의 재료분리를 방지하고 물성을 개선하는 시멘트 혼합물용 첨가제로 이용하는 용도에 관한 것이다.

Description

신규 패니바실러스 속 균주, 그로부터 생산되는 균체외 다당 및 이를 포함하는 시멘트 혼합물용 첨가제{Paenibacillus sp. WN9, an extracellular microbial polysaccaride produced thereby and an additive for cement mixture containing the polysaccaride}

본 발명은 토양으로부터 분리한 신규 패니바실러스 속 균주, 그로부터 생산되는 균체외 다당 및 이를 포함하는 시멘트 혼합물용 첨가제에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 토양으로부터 분리한 본 발명의 패니바실러스 속 WN9 균주는 분자량 약 33150만인 균체외 다당을 생산하고, 상기 균체외 다당은 온도 및 pH의 변화에도 안정한 점성을 유지하는 특성이 있어 이를 시멘트 혼합물의 재료분리를 방지하고 물성을 개선하는 시멘트 혼합물용 첨가제로 이용하는 용도에 관한 것이다.

미생물은 균종 및 배양방법에 따라서 다양한 종류의 균체외 다당을 생산하고 있으며, 이들 균체 및 균체외 다당은 점착능, 유화안정화능, 필름 형성능, 겔 형성능, 표면장력 조절능, 물 흡수능 등의 물리적 특성과 다양한 생리활성을 나타낸다. 따라서 식품산업, 화장품 산업, 화학산업, 석유산업, 의약산업 등의 각종 산업에서 균체 및 균체외 다당이 중요한 소재로 사용되고 있으며, 최근에는 선박의 난류억제제나 시멘트 콘크리트의 물성개량제의 용도로도 개발되어 사용되고 있다.

건축 토목 현장에서 시멘트는 물과 혼합되어 시멘트 현탁액으로 사용되지만, 이러한 물과 시멘트만으로 구성된 단순한 시멘트 현탁액을 사용하게 되면 콘크리트의 형성시에 급격한 재료분리와 함께 물이 많이 손실되어 양생된 콘크리트의 강도가 떨어지는 등의 문제가 발생한다. 따라서 콘크리트 제조시에 높은 유동성과 재료분리 저항성을 부여함으로써 고품질의 콘크리트 제조가 가능한데, 이를 위하여 고성능 감수제, 가소제 및 증점제로서 셀룰로스 유도체 등과 같은 다당류 등을 첨가한다.

그러나, 증점제를 첨가하면 콘크리트의 재료분리를 막을 수는 있으나 유동성을 낮추는 역효과가 발생하고, 콘크리트 응결시간을 지연시키기도 하며 과량의 공기를 혼입시키는 등의 바람직하지 않은 현상을 초래하기도 한다.

따라서, 콘크리트 재료분리 저항성을 높이고, 응결시간을 지연시키지 않으며, 공기 혼입량이 적고, 수용성이며, 다루기 쉽고, 소량의 첨가로도 우수한 재료분리 저감능 및 점성을 갖게하는 첨가제 개발이 요구되고 있다.

시멘트 콘크리트의 재료분리를 방지하고 물성을 개선할 목적으로 개발되어 사용되고 있는 기존의 시멘트 콘크리트 첨가제에는 미생물 균체외 다당류인 커드란 (curdlan) 및 웰란 검 (welan gum) 등이 있으며, 셀룰로스 유도체인 하이드록시에틸 셀룰로스 (hydroxyethyl cellulose, HEC), 카르복시메틸하이드록시에틸 셀룰로스 (carboxymethylhydroxyethyl cellulose, CM HEC), 셀룰로스 설페이트 (cellulose sulfate) 등이 있다. 이들 다당 및 그 유도체는 시멘트량의 0.1 - 0.9 % 수준으로 첨가되어 시멘트 콘크리트 물성을 개선하는데 이용되고 있다 (미국특허 제 4,963,668호; 미국특허 제 5,573,589호; 일본특허 08-340448).

본 발명자들은 시멘트 콘크리트 물성을 개선하는 새로운 첨가제를 개발하기 위하여 연구한 결과, 점성이 높은 집락을 형성하는 신규 패니바실러스 속 WN9 균주를 분리하여 이로부터 온도 및 pH의 변화에도 안정한 점성을 유지하는 균체외 다당을 정제하고 이를 시멘트 혼합시에 첨가하면 시멘트 혼합물의 재료분리를 방지하고 유동성을 개선하며 압축강도를 증가시키는 등의 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 신규한 패니바실러스 속 균주와, 그 균주가 생산하는 균체외 다당을 이용하여 시멘트 혼합물의 재료분리를 방지하고 물성에 변화를 주어 충진성 및 시공성을 향상시켜 궁극적으로는 건축 토목 현장에서 콘크리트의 작업성을 향상시킬 수 있는 시멘트 혼합물용 고성능 첨가제를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

도 1은 16S rDNA의 염기서열에 기초한 연관종과 본 발명의 신규 패니바실러스 속 WN9 균주와의 진화계통 관계(phylogenetic relationships)를 나타낸 게통도이고,

도 2는 본 발명의 패니바실러스 속 WN9 균주가 생산하는 균체외 다당 표준품의 IR 스펙트럼이다.

본 발명은 상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 토양으로부터 분리한 신규 패니바실러스 속 WN9 균주를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 패니바실러스 속 WN9 균주가 생산하는 균체외 다당을 제공한다. 상기 균체외 다당의 분자량은 약 3150만이다.

또한 본 발명은 상기 패니바실러스 속 WN9 균주가 생산하는 균체외 다당을 포함하는 시멘트 혼합물용 첨가제를 제공한다. 이 때 첨가제는 시멘트 중량을 기준으로 0.02-1.0 중량%, 바람직하게는 0.02-0.1 중량%로 혼합한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 패니바실러스 속 WN9 균주를 제공한다. 상기 패니바실러스 속WN9 균주는 토양으로부터 분리한 것으로 배양배지에서 점성이 높은 집락을 형성한다. 상기 균주는 호기성, 그람 양성, 운동성, 유포자 간균의 형태학적, 배양학적 특성을 나타내며, 16S rDNA의 염기서열에 기초한 계통분류학적 분석 결과 패니바실러스 속에 속하는 신규 세균임을 확인하여(서열 1 및 도 1 참조), 이를 패니바실러스 속 WN9으로 명명하고 1999년 6월 24일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 8951P).

상기 패니바실러스 속 WN9 균주는 발효배지에서 균체외 다당을 생산하는데, 이는 미생물로부터 균체외 다당을 분리정제하는 통상의 방법으로 분리할 수 있다. 본 발명에서는 상기 균주의 배양액에 에틸알콜 및 염화 세틸피리미디니움(cetylpyrimidinium chloride) 용액을 가하여 균체외 다당을 침전시키고, 알칼리용액에서 용해시킨 다음 다시 알콜로 침전시켜 본 발명의 균체외 다당을 분리하였다. 상기 균체외 다당의 물리화학적 특성을 분석한 결과, 패니바실러스 속 WN9 균주가 생산하는 균체외 다당은 분자량이 약 3150만 정도이고, 만노스(mannose), 포도당(D-glucose) 및 타이로신(tyrosin) 등을 구성성분으로 함유하고 있으며, 특히 광범위한 pH와 온도 및 시멘트 추출액에서 안정한 점성을 유지하는 성질을 나타내었다.

상기 균체외 다당의 특성으로 인하여 이는 시멘트 혼합물에서 물성을 개선하는 첨가제로 이용될 수 있는 데, 이때 시멘트 혼합물은 시멘트 반죽, 모르타르, 시멘트 풀 및 콘크리트 등과 같이 구체적 용도나 양생형태에 제한되지 않고 시멘트와 물을 혼합하여 만들어지는 모든 시멘트 혼합물을 포함한다. 본 발명에서는 균체외 다당을 시멘트 혼합물에 첨가한 경우에 나타나는 물성의 개선을 확인하기 위하여, 우선 시멘트와 본 발명의 균체외 다당을 섞고 잔골제, 감수제 등의 기타 첨가제와 물, 모래를 배합하여 시멘트 콘크리트를 제조하였다. 그 결과 본 발명의 균체외 다당이 첨가된 시멘트 혼합물은 재료분리 및 블리딩(bleeding)이 방지되고, 유동성이 개선되며, 양생된 콘크리트의 압축강도가 증가되었다.

시멘트 혼합시 본 발명의 균체외 다당은 시멘트 중량을 기준으로 0.02 - 1.0 중량%, 바람직하게는 0.02 - 0.1 중량% 수준으로 첨가한다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1-미생물의 분리>

다당류 생산균주의 선별

경상남도 진주시 지역에서 수집한 각종 토양시료 1g을 9㎖의 멸균 생리식염수에 현탁하여 강하게 진탕하고 5분간 방치하여 토양입자를 침전시키고 상등액을 균원시료로 사용하였다. 상등액을 백금이로 묻혀 이스트-말트 엑스트랙트 한천 (yeast-malt extract agar) 평판배지[배지조성: 이스트 추출물 2.5 g/l, 말트 추출물 2.5 g/l, 글루코스 30 g/l, K₂HPO₄2 g/l, MgSO₄·7H₂O 0.5 g/l, 한천 15 g/l; pH 7.0]에 도말하였다. 평판을 30℃의 항온기에서 48시간 배양한 후 출현한 세균집락 가운데 점성이 높은 집락을 같은 배지조성의 평판배지에서 순수분리 하였다. 형태학적으로 순수한 상태로 분리된 점성이 높은 집락을 소량의 0.5 N 염산과 0.5 N 수산화나트륨 용액에 각각 현탁시켰을 때에도 외견상 점성의 변화가 없는 균주를 선별하여 분리하였다.

최종적으로 분리된 균주를 WN9으로 명명하여 이를 본 발명의 균체외 다당류 생산균주로 선별하였으며, 선별된 균주는 이스트 엑스트랙트 펩톤 덱스트로즈 (yeast extract peptone dextrose) 한천배지[배지조성: 이스트 추출물 5g/l, 펩톤 5 g/l, 글루코스 30 g/l, 한천 15 g/l, pH 7.0)에서 계대배양하며 보관하였다.

분리 균주의 미생물학적 특성

상기에서 분리한 WN9 균주를 이스트 엑스트랙트 펩톤 덱스트로즈 한천배지에 접종하고 30℃에서 2일간 배양한 결과 직경 1.5 - 2 ㎜ 크기의 점탄성이 있는 원형의 볼록한 불투명한 집락을 형성하였으며, 배양시간 경과에 따라 집락의 중심이 함몰하여 평편한 모양으로 되었다. 수용성 색소는 생산하지 않았으며, 배양중의 세포를 가시광선에 노출시킨 경우 옅은 핑크색 색소를 생성하였다. 증식가능 온도는 15 - 45℃ 였으며, 증식 가능 pH는 5 - 9 범위였다. 기타 본 균주의 세균학적 특성을 하기 표 1에 나타내었다.

성질	결과	성질	결과
그람염색	+	탄수화물로부터 산 생성	포도당	+w
세포모양	간균 (rod)		자일로스	+w
내생포자	+		아라비노스	+w
편모	+		만니톨	+w
카탈라제	+	전분 가수분해	+w
옥시다제	+	카제인 가수분해	+w
O/F 시험	산화적 (O)	젤라틴 액화	+w
증식온도 (℃)	10	-	요소 가수분해	-
	15 - 45	+	질산염 환원	-
	50	-	인돌 (indole) 생성	-
증식 pH	4	-	메틸레드 (MR) 반응	-
	5 - 9	+	VP 반응	- (pH6.6)
	10	-	구연산 (citrate) 자화	-
증식 식염농도 (%)	1	+
증식 식염농도 (%)	3	-
+: 양성, -:음성, w: 매우 약한 반응

상기 표 1의 결과로부터, WN9은 호기성, 그람 양성, 운동성, 유포자 간균임을 확인하였다.

가스 크로마토그래피로 세포 지방산을 분리하고 MIDI 시스템으로 분석 하였다. 세포 지방산 조성은 하기 표 2에 나타내었다.

세포 지방산	함량 (%)	세포 지방산	함량 (%)
C₁₄아이소 (iso)	1.96	C₁₆아이소 (iso)	7.53
C₁₅아이소 (iso)	3.84	C₁₆노르말 (n)	5.73
C₁₅안테아이소 (anteiso)	68.15	C₁₇아이소 (iso)	1.59
C₁₅노르말 (n)	4.34	C₁₇안테아이소(anteiso)	6.87

또한 아이소프레노이드 퀴논(isoprenoid quinone)을 분석한 결과 호기성의 내생포자 형성균인 바실러스 속에서 발견되는 메나퀴논(menaquinone), MK-7이 주요 퀴논으로 함유되어 있었다.

WN9이 어느 속에 포함되는지를 보다 명확히 하기 위하여 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다(서열 1 참조). 이 염기서열을 미국 진뱅크 (GenBank) 데이터베이스로부터 얻은 세균학적으로 연관되어 있을 것으로 추정되는 염관종의 16S rDNA 염기서열과 크러스탈 더블류 (CLUSTAL W) 소프트웨어를 사용하여 계통분류학적 분석을 한 결과 도 1에서 보는 바와 같이 패니바실러스 속 (Paenibacillus genus) 에 속함을 알 수 있었다. WN9은 페니바실러스 발리더스 (Paenibacillus validus), 패니바실러스 라베 서브스페시스 라베 (Paenibacillus larvae subsp. larvae), 패니바실러스 라베 세브스페시스 펄비페시언스 (Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens), 패니바실러스 알지노티커스 (Paenibacillus alginoticus), 패니바실러스 콘드로이티너스 (Paenibacillus chondroitinus) 의 표준균주들과 분자통계학적 그룹을 형성하고 있었으나 기지의 패니바실러스와 일치하는 종명은 존재하지 않았다. 따라서, 선별 균주 WN9은 패니바실러스속 (Paenibacilluse sp.) 에 속하는 신규 세균임을 알 수 있었고, 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 6월 24일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 8951P).

상기의 미생물학적 특성을 밝히는 실험은 카푸치노와 셔먼의 방법 (Cappuccino, James G and Sherman, Natalie, MICROBIOLOGY, A LABORATORY MANUAL, 4 ed. The Benjamin/Cumming Publishing, Inc., Menlo Park, California, 1996)과 윤 등의 방법(Yoon et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 833-837, 1998)에 준하여 실시하였다.

<실시예 2-균체외 다당의 제조>

미생물의 배양

패니바실러스속 (Paenibacilluse sp.) 신규 균주로 동정된 WN9 을 균체외 다당류 생산을 위한 발효배지[배지조성: 글루코스 10 g/l, 이스트 추출물 4g/l, K₂HPO₄2 g/l, MgSO₄·7H₂O 0.5 g/l, KCl 0.5 g/l, FeSO₄·7H₂O 0.01 g/l; pH 7.0) 에 접종하고 가동 부피 2ℓ의 발효조에서 30℃, 통기량 0.5 vvm, 교반속도 500 rpm의 조건으로 배양한 결과 세포증식에 따른 균체외 다당 생산 등의 발효경과는 하기 표 3과 같았으며, 48시간 배양시 2.7 g/l의 균체외 다당이 생산되었다.

배양시간	잔당(g/l)	세포증식(OD₆₀₀)	균체외 다당(g/l)	용존산소(%)	pH
0	11.2	0.06	0	100	6.98
4	10.9	0.09	0.04	95	6.97
8	10.1	0.14	0.51	65	6.95
12	9.8	0.31	1.10	0	6.94
16	9.1	0.88	1.53	0	6.81
20	8.7	1.45	1.92	0	6.78
24	8.3	1.85	2.05	0	6.61
28	7.8	2.09	2.12	0	6.52
32	7.5	2.35	2.26	0	6.45
36	7.2	2.45	2.41	0	6.35
40	6.9	2.46	2.57	5	6.35
44	6.6	2.46	2.73	40	6.42
48	6.5	2.47	2.71	45	6.56

다당의 분리정제

발효 종료 후, 배양액을 증류수로 4배 희석한 후 11,000 rpm으로 원심분리하여 세포를 침전시키고 상등액에 4배량의 에틸알콜(ethyl alcohol)을 가하여 균체외 다당을 침전시켰다. 침전물을 회수하여 진공 감압건조기에서 건조시킨 후 증류수에 조 정제다당을 용해시켰다. 조 정제다당 용액에 5% 염화 세틸피리미디니움 용액을 침전이 더 이상 생기지 않을때까지 가하여 산성다당-세틸피리미디니움 복합체 형태로 침전시키고 원심분리에 의해 회수하였다. 회수된 침전물을 10% 염화나트륨 용액에서 용해시킨 후 증류수에서 투석시켰다. 투석 후, 4배량의 알콜을 가하여 정제된 다당을 침전시켜 회수하고 증류수에 용해시켜 동결건조하여 본 발명의 균체외 다당을 분리 정제하였다.

다당의 물리화학적 특성

상기에서 분리정제한 균체외 다당의 IR 스펙트럼은 도 2에 도시한 바와 같으며, 원소분석 결과 탄소 37.31%, 수소 6.42%, 질소 2.23%로 구성되어 있었다. 2M-TFA로 121℃에서 1시간 동안 산 가수분해 후, 고속 액체크로마토그래피로 당을 분석한 결과 만노스와 포도당이 검출되었다. 고속 액체크로마토그래피로 유기산 분석 결과 기지의 유기산과 일치하는 피크는 존재하지 않았다. TFA 가수분해물을 아미노산 분석기로 분석한 결과 아미노산인 타이로신이 다당의 주요 산성부분을 구성하고 있었다. 현재까지 보고된 다당 가운데 타이로신을 함유하는 균체외 다당에 관한 보고는 없었다. 다당의 분자량은 덱스트란 표준품을 기준으로 하여 고속 액체크로마토 그래피로 분석한 결과 약 31,500,000 이었다.

균체외 다당의 점도는 브르크필드(Brookfield LVT D-Ⅲ, spindle No. 25) 점도계를 사용하여 25℃에서 측정하였다. 균체외 다당 1% 용액의 전단속도 (shear rate)와 점도 변화와의 관계를 하기 표 4에 나타내었으며, 본 발명의 균체외 다당은 의가소성(psudoplasticity)을 나타냄을 확인하였다.

전단속도 (sec^-1)	점도 (cP)	전단속도 (sec^-1)	점도 (cP)
0.22	56628	4.4	3959
0.44	33353	6.6	2179
0.66	21915	8.8	2064
0.88	16676	11	1689
1.10	13533	13.2	1440
1.32	11518	15.4	1241
1.54	10078	17.6	1068
1.76	8998	19.8	960
1.98	7998	22	878
2.2	7296

다당 농도 변화에 따른 점도 변화 테스트 결과, 하기 표 5에서 보는 바와 같이 농도 증가에 따라 점도가 직선적으로 비례하여 증가하였다.

다당 농도 (%)	점도 (cP)
0.2	96
0.4	269
0.6	437
0.8	670
1.0	878

온도가 점성에 미치는 영향을 테스트한 결과 하기 표 6에서 나타낸 바와 같이 온도 변화에도 불구하고 안정한 점성을 유지하고 있었다.

온도 (℃)	점성 (cP)
10	830
20	859
30	830
40	811
50	797

점성변화에 미치는 pH의 영향을 테스트한 결과 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 측정 pH 구간에서 안정한 점성을 유지하고 있었다.

pH	점성 (cP)
3	208
5	231
7	236
9	229
11	226
13	208

콘크리트가 강 알칼리라는 점에 착안하여 다당을 pH 13 완충액과 시멘트 침출액(약 pH 13)에 용해시켜 점성을 측정한 결과, 하기 표 8에서 보는 바와 같이 pH 13의 강알칼리 조건에서도 높은 점성을 유지하였다.

처리조건	점성 (cP)
pH 13 완충액에 다당을 용해	208
시멘트 침출액에 다당을 용해	349
시멘트 침출액에 다당을 용해시킨 후 70℃에서 30분 가열	404

<실시예 3-시멘트 혼합물에의 첨가 효과>

시멘트(보통 포틀랜드 시멘트)와 본 발명에 의한 균체외 다당을 30초간 건조 혼합(dry mixing)한 후, 잔골재 (강사: 비중 2.57, 조립율 2.49), 0.7% 고성능 AE 감수제 (폴리카르본산계, SP8N)를 첨가하여 3분간 배합하여 혼합을 완료하였다. 배합기준은 물/시멘트(w/c)를 0.45, 시멘트:모래 (c:s)를 1:1.7로 하였다.

혼합 완료후 3분간 정치시키고 모르타르 슬럼프 플로우 콘(70×100×50 mm)을 사용하여 슬럼프 플로우(slump flow) 값을 측정하였다.

본 발명의 균체외 다당 첨가향은 시멘트 중향을 기준으로 0-0.1%까지 변화시켰으며, 이에 따른 슬럼프 플로우값과 양생 후 압축강도를 하기 표 9에 나타내었다.

균체외 다당 첨가량 (중량%)	플로우값(mm)	재료분리 정도	압축강도 (kg/cm²)
균체외 다당 첨가량 (중량%)	플로우값(mm)	재료분리 정도	3일	7일	28일
0	280	재료분리 및 블리딩 매우심함	238	349	423
0.01	278	재료분리 및 블리딩 심함	240	352	425
0.02	270	재료분리 및 블리딩 약간 있음	260	384	439
0.03	246	재료분리 및 블리딩 없음	270	415	495
0.04	220	재료분리 및 블리딩 없음	288	429	502
0.06	157	재료분리 및 블리딩 없음	279	404	492
0.08	132	재료분리 및 블리딩 없음	237	389	475
0.10	118	재료분리 및 블리딩 없음	232	378	470

표 9에서 보는 바와 같이, 본 발명의 패니바실러스 속 유래 고분자 다당을 포함하는 첨가제를 0.02-0.1 중량%로 시멘트 혼합물에 혼합함으로써 재료분리 및 블리딩을 막을 수 있었으며, 양생된 콘크리트의 압축강도도 증가되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 패니바실러스 속 WN9 균주가 생산하는 균체외 다당은 pH와 온도변화 및 시멘트 추출액에서 안정한 점성을 유지하여 이를 시멘트 혼합시에 소량 첨가하면 재료분리가 방지되고 물성이 개선됨으로써, 각종 건설현장에서 작업성을 향상시키는 고성능 시멘트 혼합물용 첨가제 및 수중 불분리 콘크리트 첨가제로서의 활용이 기대된다.

Claims

신규 패니바실러스 속(Paenibacilluse sp.) WN9 균주 (수탁번호: KCTC 8951P).
제 1항의 패니바실러스 속 WN9 균주가 생산하는 균체외 다당.
제 2항에 있어서, 분자량이 약 3150만인 것을 특징으로 하는 균체외 다당.
제 2항의 패니바실러스 속 WN9 균주가 생산하는 균체외 다당을 포함하는 시멘트 혼합물용 첨가제.
제 4항에 있어서, 시멘트 혼합물에 첨가하는 농도가 시멘트 중량을 기준으로 0.02 - 1.0 중량% 인 것을 특징으로 하는 첨가제.
제 4항에 있어서, 시멘트 혼합물에 첨가하는 농도가 시멘트 중량을 기준으로 0.02 - 0.1 % 인 것을 특징으로 하는 첨가제.