KR19990053259A

KR19990053259A - 해당화 지하부의 추출물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR19990053259A
Application number: KR1019970072865A
Authority: KR
Inventors: 전기엽; 문성필
Original assignee: 전기엽; 문성필
Priority date: 1997-12-24
Filing date: 1997-12-24
Publication date: 1999-07-15
Also published as: KR100282168B1

Abstract

본 발명은 해당화 지하부를 열수추출하여 얻은 추출물을 한외여과하여 분리한 고분자분획으로서 가수분해형 탄닌류의 고분자 화합물로 구성된 해당화 지하부의 추출물(이하 로사닌 : rosanin이라함) 및 그 제조방법에 관한 발명이다. 로사닌은 항고혈당, 고중성지방혈증 강하 및 간세포보호 효과를 가질 뿐만 아니라, 급성독성이 매우 약하여 인체에 안전한 생약추출물이다. 로사닌의 치료효과를 파악하기 위하여 당뇨를 유발한 쥐를 대상으로 실험하여 혈당, 중성지방, 간조직 등을 검사한 바 대조군에 비하여 뚜렷한 효과를 관찰할 수 있었다.

Description

해당화 지하부의 추출물 및 그 제조방법

본 발명은 생약재료인 해당화 지하부(또는 근부라 함)를 열수추출 및 한외여과하여 얻은 추출물이 항고혈당, 항중성지방혈증, 간세포보호 등에 특이한 효과를 나타내는 해당화 지하부의 추출물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

해당화(Rosa rugosa var. typica)는 낙엽관목으로서 해변 모래땅, 산록에서 자라며, 지리적으로 일본, 만주, 캄챠카에 분포한다(정태현, 한국식물도감, 목본부, 이문사, p.177, 1974). 본 식물의 지하부는 우리나라 민간에서 당뇨병의 치료에 사용되어 왔다. 해당화 지하부의 추출물을 이용한 항고혈당 작용에 대한 연구는 일부 국내 학자들에 의하여 보고되어 왔다. 송(송선두 외2명, 연세의대 논문집, 10, 125 (1977))등은 알록산(alloxan)으로 고혈당을 유발시킨 쥐에 해당화 지하부의 열수 추출물을 경구 투입하여 약간의 혈당강하 효과가 있음을 보고하였다. 이명열(이명열, 중앙대학교 석사학위논문, 1982, 조선대 제약연구, 6, 19(1984))등은 해당화 근피의 열수 추출물, 메탄올 추출물 및 사포닌을 실험용 고혈당증의 집토끼에 적용하여 메탄올 추출물 및 사포닌이 혈당강하 효과를 나타낸다는 것을 밝혔다.

한편, 양(약학회지, 31(6), 394(1987))등은 해당화 근부의 메탄올 추출물의 경우, 근혈당강하 효과는 없으나 고지혈증에는 효과가 있다고 보고하였다. 이상과 같이 해당화 지하부에 대한 항고혈당 효과 및 항고지혈증 효과가 몇몇 학자들에 의하여 연구되었으나, 실질적인 항고혈당 효과는 매우 낮으며, 확실한 항고혈당 성분과 항고지혈증 성분은 물론 그 구분 조차도 확립되어있지 않은 상태이다.

그러나 근래 본 연구자들은 해당화 지하부의 열수 추출물을 저급 알코올류로 추출하고 얻어진 추출물을 다시 서로 다른 극성의 용매로 순차 추출·분획하여 항고혈당 구분을 검토하였다. 그 결과 부탄올 추출후의 수층에서 알록산 또는 스트렙토조토신 유발 당뇨백서에 있어서 강력한 항고혈당 효과는 물론 거의 독성이 없으며, 저혈당을 유발하지 않는다는 사실을 발견하여 특허 출원(출원번호 제95-26833호)한 바 있다.

또한, 이들 부탄올 추출후 수층을 분석하여 과당(fructose) 및 β-D-포도당(glucose)이 주성분이며, 혈당강하를 주도하는 저분자 물질인 것을 밝혔다. 특히 β-D-포도당(glucose)은 새롭게 밝혀진 항고혈당 성분으로 본 물질에 대해서도 특허 출원(출원번호 제96-9386)한 바 있다.

본 발명은 해당화 지하부의 추출물에 있어서 항고혈당 특성을 나타내는 분획이 본 연구자들에 의하여 특허출원(95-26833)된 부탄올 추출후 수층과 이들 수층의 주성분을 이루며, 강력한 항고혈당 효과를 나타내는 과당 및 β-D-포도당(특허출원96-9386)이외에 해당화 지하부 열수추출물중의 고분자 분획에 현저한 항고혈당 활성을 확인하고 본 발명을 완성되었다. 즉, 해당화 지하부의 열수추출물을 분획분자량 10,000의 한외여과막으로 여과하면, 열수추출물에 대하여 약20%의 고분자 분획이 단리된다. 이들 고분자 획분은 소량, 경구투여로 알록산 또는 스트렙토조토신 유발 당뇨쥐에 대하여 강력한 혈당강하 효과를 나타낸다. 이러한 결과는 해당화 지하부의 혈당강하 성분으로서 새롭게 밝혀진 사실이다. 또한 이와 더불어 이러한 고분자 구분은 항고중성지방혈증 효과와 간세포 보호 효과를 가진다는 사실도 아울러 새롭게 발견하였다.

본 발명의 목적은 생약재료를 이용하여 부작용이 적고, 인슐린 의존성 고혈당증에도 적용가능한 혈당 강하제 및 이의 제조 방법을 제공하기 위한 것이며, 본 발명의 또 다른 목적은 혈당강하, 고중성지방혈증 강하 및 간세포 보호에 효과가 있는 건강 보조식품을 제공하기 위한 것이다.

도 1은 본 발명의 한외여과막을 이용한 고분자 활성분획에 대한 Shodex OH Pak KB804칼람의 크로마토그램

도 2는 본 발명의 활성고분자 분획에 대한 분자량 분포를 나타낸 크로마토그램

도 3은 본 발명의 활성고분자 분획을 산가수분해한 후 수층의 주성분인 2, 3, 6위가 메틸화된 D-포도당(glucose)의 질량 스펙트럼

도 4는 대조군으로서 본 발명의 해당화 추출물을 투여하지 않은 당뇨 백서군에서의 손상된 간세포의 광학 현미경 사진(200배율)

도 5는 본 발명의 해당화 추출물을 투여한 당뇨 백서군의 간세포의 광학현미경 사진(200배율)

상기 항고혈당, 고중성지방혈증 강하 및 간세포 보호 성분을 얻는 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다.

제1단계는 해당화 지하부를 열수 추출하며, 제2단계는 상기 열수추출물중 침전물을 제거한 후 분획분자량 10,000의 한외여과막으로 저분자부분을 제거하고, 제3단계는 한외여과한 후 고분자 분획을 원심분리하여 침전을 제거하고 건조시켜 제조한다. 상기 고분자 분획을 원심분리한 후 침전을 제거하여 얻은 여액이 활성성분이다.

상기의 해당화 지하부를 열수 추출하기 위하여 지하부를 그대로 사용해도 좋으나, 분쇄 또는 미분화 하는 것이 더욱 바람직하다.

해당화 지하부의 열수추출물은 동결건조하거나 분무건조하여 분말화 또는 농축 하지않은 상태로 다음 단계에서 사용할 수도 있다.

이하 실시에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 혈당강하 활성구분의 분리

20메쉬 이하의 해당화 근부 분말 12kg과 시료중량에 대하여 6배량의 증류수를 대형 스텐레스제 솥에 넣고 1시간 끓인 후 여과포에 옮겨 압착·탈수하어 열수추출물을 분리한다. 그리고 압착된 잔사에 다시 소량의 증류수를 넣고 세정한 후 세정액 또한 상기 용액과 합하여 필터(3㎛)로 여과하고 그 여과액은 한외여과에 도입하였다. 열수추출물로부터 대량의 고분자 분획을 분리하기 위하여 선경인더스트리의 SUPERANE SKU-103-0810(분획분자량 10,000, polysulfone제 중공사막), BUS-200의 한외여과 모듈 및 분리시스템을 사용하였다.

열수추출물을 한외여과하면, 제1도의 GPC분석결과에 나타낸 것처럼 용이하게 저분자 분획을 제거할 수 있으며, 또한 고분자구분을 분리할 수 있다. 한외여과후 여과액은 원심분리하여 침전을 제거하고 동결건조 후 진공건조 하였다. 이러한 분리공정을 거쳐 분말화된 해당화 지하부의 고분자 분획은 233g이었다.

상술한 방법에 의하여 분리된 항고혈당, 항고중성지방혈증 및 간세포 보호에 효과가 있는 활성 고분자 분획을 편의상 "로사닌(Rosanin)"으로 명명하였다.

실시예 2 : 활성 분획 "로사닌"의 특성 및 화학적 조성

상기 실시예 1에서 얻은 활성 고분자 분획인 로사닌을 다양한 기기분석 및 그 가수분해를 통하여 화학적 조성 및 전체적인 화합물군을 파악 하였다.

로사닌은 수용성 물질로서 표준 분자량의 덱스트란을 기준으로 분자량을 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 로사닌의 중량 평균분자량 830,000, 수 평균분자량 : 60,000이었다. 분리된 로사닌은 담갈색 분말상으로서 210℃부근에서 탄화되기 시작하였다. 적외선분광분석에서는 에스테르결합, 방향족화합물이 존재함을 알 수 있었다.

또한 자외선 분광분석, 이온화 시차분석을 통하여 로사닌중에는 대량의 페놀성 수산기가 존재함을 알 수 있었다. 그리고¹³C-NMR분석으로 주된 골격이 당류임을 확인하였다. 이러한 결과로부터 로사닌을 구성하는 주된 화합물을 분석하기 위하여 로사닌을 산 가수분해하고 이들 분해물을 정밀 검토하였다.

고분자구분인 로사닌을 3%황산으로 가수분해하면, 포도당(glucose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 키실로스(xylose), 아라비노스(arabinose)가 생성하였으며, 이중 주된 단당류는 포도당으로서 전체 당류의 68.2%를 차지하였다. 로사닌을 구성하는 주된 당류인 포도당의 결합형태를 파악하기 위하여 로사닌을 Hakomori법(S. Hakomori, J. Biochem., 55(2), P. 205∼208, 1964)으로 메틸화, 산가수분해후 다시 아세틸화하여 이들을 GC-MS분석 하였다. 그 결과를 구성하는 주된 당류인 D-포도당은 제3도의 질량 스펙트럼에 나타낸것처럼 2, 3, 6번 수산기가 메틸화되어 있는 것으로 판명되어, 결과적으로 D-포도당이 1→4 결합으로 연결되어 있다는 것을 알 수 있었다.

로사닌의 산가수분해후 수층의 에틸아세테이트 추출물중에는 주성분으로서 갈산(gallic acid : 3,4,5-tri-hydroxybenzoic acid), 그리고 소량의 단순 페놀류(4-hydroxy-3-methoxy-benzoic acid, 3,4-di-hydroxybenzoic acid, p-hydroxybenzoic acid, 2,5-dihydroxy-benzoic acid, 1,4-benzoiccarboxylic acid, p-hydroxybenzaldehyde)가 검출 또는 정량되었다. 또한 산가수분해후에는 대량의 침전이 생성되었는데(로사닌에 대하여 29.5%) 이들의 FT-IR스펙트럼 분석결과 엘라그산(ellagic acid)관련 물질이었으며, 실제 이들 침전을 메틸화하여 칼람으로 분리·동정한 결과 메틸화된 엘라그산이 현저한 양으로 단리되었다.

따라서 해당화 근부 열수추출물중의 고분자 구분인 로사닌은 주로 D-포도당과 엘라그산 또는 갈산등과 같은 페놀산이 서로 결합하여 이루어진 가수분해형 탄닌의 고분자물이라는 것을 알 수 있었다. 해당화 지하부의 열수추출물에서 로사닌과 같은 고분자 가수분해형 탄닌이 스트렙토조토신 유발 당뇨 백서에 대하여 강력한 혈당강하작용을 한다는 사실은 아직 밝혀진 예가 없을 뿐만아니라, 고중성지방혈증 및 간세포 보호에 효과가 보고된적이 없다.

실시예 3: 고분자 분획의 항고혈당, 항고중성지방혈증 및 간세포 보호효과

상기 실시예 1에서 분리한 로사닌의 항고혈당 효과를 검증하기위하여 인위적으로 당뇨를 유발한 쥐를 대상으로 실험하였다. 실험용 백서는 체중 약 250∼300g의 것을 사용하였으며, 스트렙토조토신 65㎎/㎏을 주사하고 5일후 식후 혈당이 200㎎/㎗(11.1m㏖/ℓ)이상인 것들을 무작위로 3군으로 분류하여 실험에 사용하였다. 실험기간동안 사료와 식수는 자유롭게 취할 수 있도록 하였다. 단, 로사닌 투여군의 경우에는 10㎎/㎏/day을 식수에 녹여 위내 삽관을 통하여 투여하였으며, 일반 경구 혈당강하제인 다오닐은 10㎎/㎏/day를 같은 방법으로 투여하였다. 치료 1주 및 2주후 백서의 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였고, 치료 3주째에는 공복시에 페바노바비탈나트륨(phenobarbital sodium) 50㎎/㎏으로 마취한 후 복부동맥에서 혈액을 채취하여 혈당 및 중성지방을 측정하였다. 이때 각 군에서 간 조직을 분리하여 헤마톡시린-에오신(hematoxylin-eosin)으로 염색한 광학현미경 상에서 관찰하였다.

다음 표 1에서 나타낸 바와 같이 인위적으로 당뇨를 유발시킨 고혈당 쥐에 대하여 로사닌은 미처리군이나 다오닐 투여군에 비해서 월등한 혈당강하 효과 뿐만아니라 3주간의 투여로 거의 정상 혈당을 유지 할 수 있다는 놀라운 결과를 나타내었다. 또한 인위적으로 당뇨를 일으킨 고혈당 쥐에서 로사닌은 미처리군이나 다오닐(글리벤클라마이드) 투여군에 비해서 3주간의 투여로 현저한 중성지방 강하 효과를 나타내었다.

실험후 간 조직들을 떼어내어 광학현미경으로 관찰한 결과, 다오닐 치료군은 재생성 간세포등이 많이 나타났고 스트렙토조토신의 주사 후에 간에 약간의 손상이 생긴 것을 알 수가 있었다. 도 4에 나타낸것처럼 치료받지 않은 당뇨군에서는 정상 간세포 괴사(spotty hepatic necrosis)와 재생성 간세포(regenerating cells)가 다수 관찰되어 스트렙토조토신 투여 후에 간에 많은 손상이 있음을 알 수 있다. 그러나 로사닌을 투여받은 당뇨군에서는 도 5에 나타낸것처럼 간세포가 거의 정상 조직 소견을 보여서 로사닌의 사용에 의하여 스트렙토조토신으로 연유될 수 있는 간세포의 손상을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

[표1. 실험용 당뇨백서에서 급성 혈당강하효과 및 고중성지방혈증 강하효과(3주후).]

a: 정상 대조군에 비하여 의의있는 차이, p<0.05

b: 정상 대조군에 비하여 의의있는 차이, p<0.01

c: 정상 대조군에 비하여 의의있는 차이, p<0.001

d: 치료받지 않은 당뇨군에 비하여 의의있는 차이, p<0.05

e: 치료받지 않은 당뇨군에 비하여 의의있는 차이, p<0.001

f: 글리벤클라마이드로 치료받은 당뇨군, p<0.05

g: 글리벤클라마이드로 치료받은 당뇨군, p<0.01

실시예 4: 급성 독성시험

실시예 1에서 제조한 해당화 지하부의 열수추출물에서 분리한 로사닌에 대한 급성독성 시험을 중량 15∼25g의 마우스에 대하여 실시하였다. 마우스를 120마리를 5마리씩 24개군으로 나누어 구강내 주입 13개군에 대해서 하루 1800∼4,000㎎/㎏씩을 일주일간 투여하였으며, 복강내 주입 11개군의 경우 300∼1,600㎎/㎏씩을 일주일간 투여하여 급성 독성을 검토하였다. 그 결과 구강투여의 경우, LD₅₀은 3,075㎎/㎏이었으며, 복강투여의 경우 922㎎/㎏이었다. 본 결과로부터 구강투여의 경우 그 독성이 매우 낮은 것으로 판단되었다.

Claims

해당화 지하부의 추출물 또는 고분자분획이 항고혈당, 항고중성지방혈증, 간세포보호에 효과를 나타내는 특징이 있는 해당화 지하부의 추출물
제1항에 있어서, 해당화 지하부의 추출물 또는 고분자분획은 페놀산이 결합된 가수분해형 탄닌으로서 분자량이 중량평균분자량이 830,000, 수평균분자량이 60,000인 것을 특징으로 하는 해당화 지하부의 추출물
해당화 지하부를 건조시켜 분쇄하여 열수로 추출한 후 한외여과하여 얻은 해당화 지하부의 추출물 또는 고분자분획을 얻는 것을 특징으로 하는 해당화 지하부의 추출물 제조방법
제3항에 있어서, 해당화 지하부의 추출물 또는 고분자 분획을 항고혈당, 항중성지방혈증, 간세포보호를 목적으로 고체, 분말, 시럽 또는 액체의 형태로 약품 또는 식품에 사용할 수 있도록 한 해당화 지하부의 추출물 제조방법