KR19990036734A - 단백질 제조 방법 - Google Patents

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프리돌린 클라우스너, 롤란드 비. 보레르
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Abstract

본 발명은 억제성 기질을 탄소원으로 사용하여 형질전환되거나 비형질전환된 진핵 세포의 배양에 의해 내생성 또는 이종 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

단백질 제조 방법
메틸로트로픽(methylotropic) 효모는 최근 이종 단백질을 위한 적합한 발현 시스템으로서 연구되어왔다. 특히, 한세뉼라 폴리모파 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 광범위한 외부 유전자를 위한 숙주 미생물로서 취급하기 쉬운 것으로 개시되어왔다(겔리센(G. Gelissen) 및 멜버(K. Melber)의 문헌[1996, "Methylotrophic yeast Hansenula polymorpha as production organism for recombinant pharmaceuticals, Drug Res. 46, 943-948] 및 크렉(J. M. Cregg) 및 마덴(K. R. Madden)의 문헌[1988, Development of methylotrophic yeast, Pichia pastoris, as a host system for the production of foreign proteins, Developments in Industrial Microbiology 29, 33-41]을 참조할 수 있다). 메탄올 대사에 관계되는 효소를 위한 프로모터는 매우 강한 것으로 발견되었기 때문에, 이들은 일반적으로 단백질의 이종 발현을 제어하는데 사용된다(유럽 특허 제 0173378 호, 유럽 특허 제 0299 108 호, 유럽 특허 제 0 183 071 호를 참조할 수 있다).
이들 미생물을 배양하는데 이용되는 탄소원은 프로모터 조절에 매우 영향을 미친다. 겔리센, 홀렌버거(C.P. Hollenberger) 및 야노윅(Z. M. Janowicz)의 문헌[1994, Gene expression in methylotropic yeasts, In: Smith A.(편집): Gene expression in recombinant microorganisms, Dekker, New York, 195-239]은 한세뉼라 폴리모파의 메탄올 대사에서의 주 효소가 메탄올중에서의 성장동안 다량으로 존재함을 개시한다. 또한 상당한 수준의 효소 메탄올 옥시다제(oxidase)(MOX) 및 포르메이트 디하이드로게나제(dehydrogenase)(FMDH)는 글리세롤 성장 세포에서 검출될 수 있지만, 글루코즈가 탄소원으로 사용되면 없음이 밝혀졌다(유럽 특허 제 0299 108 호를 참조할 수 있다). 이 자료를 기준으로, 이들 효소가 메탄올에 의해 유도되었음을 결론지었다. 글리세롤중에서 성장하는 동안 MOX 및 FMDH의 발현은 프로모터의 활성화로 설명된다. 한세뉼라 폴리모파 및 클로에케라(Kloeckera) sp. 2201의 글루코즈 제한 물질 환경 조절 장치 배양에서, FMDH는 매우 소량으로 0.1/h이하의 성장 속도 로만 생성된다(에글리(Th. Egli), 반 디켄(J.P. Van Dijken), 벤휘스(M. Veenhuis), 하더(W. Harder) 및 피에처(A. Fiechter)의 문헌[1980, Methanol metabolism in yeasts: Regulation of the synthesis of catabolic enzymes, Arch. Micrbiol. 124, 115-121]을 참조할 수 있다). 따라서, 이제까지 비억제성 탄소원이 메틸로트로픽 효모를 이용한 단백질의 이종 발현을 위해 사용되어왔다. 한세뉼라 폴리모파는 글리세롤을 이용한 단일 탄소원 모드 또는 글리세롤과 추가의 메탄올을 이용한 2가지 탄소원 모드로 공급 배치 방법으로 다양한 약학적 단백질의 생산을 위해 배양된다(글리센 및 멜버의 상기 문헌을 참조할 수 있다). 공통 방법 전략은 히루딘의 생산을 위한 웨이더만(Weydemann, P.), 케업(Keup, M.), 피온텍(Piontek, A.W.M.), 스트라쎄(Strasser, J), 슈베덴(Schweden, G.), 겔리슨 및 야노윅의 문헌[1995, High-level secretion of hirudin by Hansenula polymorpha, Appl Microbiol Biotechnol 44, 377-385]에 의해 보다 자세히 개시된다. 비억제성 탄소원으로서 또한 글리세롤을 이용한 피치아 파스토리스를 이용하여 트롬보모듈린을 생산하는 방법이 첸(Y. Chen), 크롤(J. Krol) 및 프리드만(D. Freedman)의 문헌[1996, Continuous production of Thrombomodulin from a Pichia pastoris fermentation, J. Chem. Tech. Biotechnol, 67, 143-148]에 개시되어있다.
글리세롤이 고가이므로, 이 방법은 이제까지 사료 또는 산업용 효소와 같은 저가의 단백질을 제조하기위해서는 적합하지않았다. 따라서, 본 발명의 목적은 이런 장애를 극복하고, 형질전화되거나 또는 비-형질전환된 진핵 세포의 배양에 의해 내생성 또는 이종 단백질의 제조를 위한 방법을 제공하는 것이다.
도 1a 및 1b는 공급 단계중의 단독 탄소원으로써 글리세롤 및 글루코즈를 이용하여 수행된 한세뉼라 몰리모파(Hansenula polymopha)배양의 시간 경과의 비교를 나타낸다.
도 2는 공급 용액중의 글루코즈의 비율을 증가시킨, 반복적인 공급-배치 배양 주기를 나타낸다.
본 발명의 방법은 억제성 기질이 탄소원으로 사용되고, 탄소원이 공급 단계동안 제한되고 전체 배양동안 연속적인 산소 제한이 없음을 특징으로하거나; 또는 단백질이 효소, 특히 사료용 효소, 예를 들면 피타제(phytase), 셀룰라제(cellulase), 크실라나제(xylanase) 또는 산업적 효소, 예를 들면 아밀라제(amylase), 프로티아제(protease), 인버타제(invertase), 리파제(lipase), 카탈라제(catalase), 셀룰라제(cellulase), 글루코즈 옥시다제, 알콜 옥시다제, 펙티나제(pectinase), 나라기나제(naraginase), 콜라게나제(collagenase), 퍼옥시다제(peroxidase) 또는 풀랄라나제(pullalanase)이거나, 또는 세포가 메틸로트로픽이고/이거나 메탄올 대사에 관계하는 효소를 위한 프로모터, 예를 들면 포르메이트 디하이드로게나제(FMD 또는 FMDH) 프로모터, 메탄올 옥시다제(MOX) 프로모터 또는 디하이드록시아세톤 신타제(synthase)(DAS 또는 DHAS) 프로모터를 포함하는 DNA 서열에 의해 형질전환되거나; 또는 세포가 메틸로트로픽 효모, 바람직하게는 한세뉼라, 피치아, 칸디다(Candida) 또는 토룰롭시스(Torulopsis), 예를 들면 한세뉼라 폴리모파 또는 피치아 파스토리스이거나; 또는 억제성 기질이 탄소원의 1 내지 100%, 바람직하게는 40 내지 100%, 보다 바람직하게는 90 내지 100%이거나 또는 유일한 탄소원이거나; 또는 기질이 단당류, 이당류, 올리고당 또는 다당류, 예를 들면 글루코즈, 프락토즈, 슈크로즈, 말토즈, 전분, 글리코겐, 셀룰로즈 또는 덱스트로즈, 또는 당 함유 화합물, 예를 들면 당밀, 글루코즈 시럽 또는 프락토즈 시럽이거나; 또는 반복적인 공급-배치의 형태로 수행되는 방법임을 특징으로한다. 또한 이런 방법은 공급 속도 범위가 미생물의 대사 특징 및 생물 반응기의 매스 이동 성능, 특히 산소에 의해 제한됨을 특징으로한다. 공급 속도는 바람직하게는 최저에서 배양물중의 산소 제한을 피할 수 있는 최대량사이로 유지된다.
이종 단백질의 생산 방법의 경우, 진핵 세포는 DNA 서열 또는, 이종 단백질, 본 발명의 경우 피타제를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터에 의해 형질전환된다. 분자 생물학 분야에 숙련된 이들은 이런 형질전환된 진핵 세포의 제조에 사용된 방법에 익숙하고, 예를 들면 구체적인 예로서 유럽 특허 제 684 313 호 또는 유럽 특허원 제 97810175.6호를 참조할 수 있다.
본 발명에서 "배양"은 당분야에 숙련된 이들에게 통상적인 의미를 갖는다. 특정한 배양 조건은 사용하는 세포 및 생성되는 단백질 및 발현 시스템에 의존할 것이다. 단백질의 발효 생산의 분야에 숙련된 이들은 또한 이런 조건에 익숙하다. 또한, 짧은 배치 단계 즉, 세포의 성장 단계동안 본 발명을 실시하기위해서, 억제성 또는 비억제성 탄소원, 예를 들면 각각 글루코즈 또는 글리세롤을 사용할 수 있다. 바람직한 단백질의 생성 단계인 공급 배치 단계동안, 배양 공정은 본 발명에서 제공된 것과 같은 방식으로 수행된다.
또한, 본 발명의 실시를 위해 흥미있는 메틸로트로픽 효모는 유럽 특허 제 173 378 호, 37 및 38면에 개시되어있다.
실시예
실시예 1
주 탄소원으로써 글리세롤 또는 글루코즈를 이용한 한세뉼라 폴리모파를 이용한 에이. 푸미가투스(A. fumigatus) 피타제의 생산
공급 기질로서 글리세롤 또는 글루코즈를 이용한 피타제의 생산을 비교하기위해, 2개의 공급 배치 실험을 FMD 프로모터의 제어하에서 아스퍼길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 야생형 피타제 유전자(파사몬테스(L. Pasamontes), 하이커(M. Haiker), 비스(M. Wyss), 테시어(M. Tessier) 및 반 룬(A.P.G.M. VanLoon) 의 문헌[1997, Gene cloning, purification, and characterization of a heat-stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus, Appl. Environ. Microbiol, 63, 1696-1700])를 약 80카피 함유한 한세뉼라 폴리모파 균주를 이용하여 15ℓ들이 반응기에서 수행하였다.
하기 조성을 갖는 50㎖의 배지중에 -70℃에서 유지시킨 글리세롤 저장용 세포 현탁액 1㎖로 접종하여 진탕 플라스크 배양을 시작하였다: 3.0g/ℓ 글리세롤; 2.5g/ℓ KH2PO4; 5g/ℓ NH4H2PO4; 2.25g/ℓ MgSO4·7H2O; 2.5g/ℓ (NH4)2SO4; 1.15g/ℓ KCl; 0.25g/ℓ NaCl; 0.375g/ℓ CaCl2·2H2O; 0.25㎎/ℓ H3BO3; 0.05g/ℓ (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O; 4㎎/ℓ CuSO4·5H2O; 15㎎/ℓ ZnSO4·7H2O; 20㎎/ℓ MnSO4·H2O; 0.05g/ℓ Na-EDTA; 0.5㎎/ℓ NiSO4·6H2O; 0.5㎎/ℓ CoCl2·6H2O; 0.5㎎/ℓ Na2MoO4·2H2O; 0.5㎎/ℓ KI; 0.05g/ℓ 티아민·HCl; 0.15㎎/ℓ 바이오틴. 이들을 30℃, 200rpm에서 24시간동안 배양하였고, 30㎖를 300㎖의 동일한 배지를 갖는 제 2 진탕 플라스크 단계로 이동시키고, 30℃, 200rpm에서 또한 24시간동안 배양시켰다.
이 씨드 배양물 300㎖를 하기와 같은 조성을 갖는 초기 배지 5ℓ를 갖는 15ℓ들이 발효기를 위한 접종원으로 사용하였다: 10.0g/ℓ 글리세롤; 5.0g/ℓ KH2PO4; 10g/ℓ NH4H2PO4; 4.5g/ℓ MgSO4·7H2O; 5.0g/ℓ (NH4)2SO4; 2.3g/ℓ KCl; 0.5g/ℓ NaCl; 0.2㎖/ℓ 소포제; 0.75g/ℓ CaCl2·2H2O; 0.5㎎/ℓ H3BO3; 0.1g/ℓ (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O; 8㎎/ℓ CuSO4·5H2O; 30㎎/ℓ ZnSO4·7H2O; 40㎎/ℓ MnSO4·H2O; 0.1g/ℓ Na-EDTA; 1.0㎎/ℓ NiSO4·6H2O; 1.0㎎/ℓ CoCl2·6H2O; 1.0㎎/ℓ Na2MoO4·2H2O; 1.0㎎/ℓ KI; 0.1g/ℓ 티아민·HCl; 0.3㎎/ℓ 바이오틴. 전체 공정동안, 온도, pH 및 통풍을 30℃, pH 4.6 및 5ℓ/h으로 각각 일정하게 유지시켰다. NH325%를 첨가하여 pH를 조절하였다. 산소 포화는 교반기 속도 및 압력(0 내지 0.5바)을 제어함으로써 반응기에서 20% 포화의 최소값에서 유지시켰다. 배지에서 초기 글리세롤의 완전 소비는 pO2값을 신속하게 증가시키고 이는 배치 단계의 종결을 나타낸다. 이 시점에서, 700g/ℓ의 글리세롤 또는 글루코즈 용액의 공급을 시작한다. 시간당 25g 용액의 초기 공급 속도를 처음 18시간 공급동안 사용한후 속도를 50g/h으로 증가시켰다. 배양 부피는 배양 종결시에는 약 11ℓ까지로 약 6ℓ의 탄소원 용액의 공급으로 인해 증가하였다.
글루코즈를 이용한 배양 공급의 경우, 공정동안 대사되는 전체 탄소원의 98%가 글루코즈이고, 나머지 2%는 배치 단계동안 사용되는 글리세롤에 상응한다. 전체 공정동안, 글루코즈는 상층액에서 정량화될 수 없다.
165시간의 공정 시간후에, 5.86g/ℓ의 피타제가 단백질 측정을 위한 브래드포드(Bradford) 방법을 이용하여 글리세롤이 있는 배양물로부터 취한 시료중에서 정량되었다. 글루코즈가 있는 배양물로부터, 160시간 공정후의 시료는 동일한 방법에 의해 측정시 7.12g/ℓ의 피타제를 함유하였다. 이들 결과는 글루코즈의 억제 효과가 공급 단계동안 엄격한 탄소 제한을 보증하기위한 공급 전략에 의해 회피될 수 있음을 확인시킨다. 도 1은 주 탄소원으로 글리세롤 및 글루코즈를 이용하여 수행된 배양에 대한 시간 경과의 비교를 나타낸다.
실시예 2
주 탄소원으로서 슈크로즈를 이용한 한세뉼라 폴리모파를 이용한 에이. 푸미가투스 피타제의 생산
이 실시예에서, 배양은 실시예 1에서와 동일한 균주를 이용하여 15ℓ들이 생물 배양기에서 수행되었다. 씨드 배양물 및 주 배양 조건은 실시예 1과 정확하게 동일하고, 단 공급 용액이 700g/ℓ의 슈크로즈를 함유하였다. 이 공정동안, 상층액 시료중의 슈크로즈 농도는 1g/ℓ를 초과하지않았고, 반면 글루코즈 또는 프락토즈는 동일한 시료에서 검출되지않았다. 167시간의 배양 시간후에, 5.27g/ℓ의 피타제가 단백질 검출을 위한 브래드포드 방법에 의해 배지중에서 측정될 수 있었다.
실시예 3
주 탄소원으로서 글루코즈를 이용한 한세뉼라 폴리모파를 이용한 에이. 푸미가투스 피타제의 생산
이 실시예에서, 배양은 실시예 1 및 2와 동일한 균주를 이용하여 15ℓ들이 생물 반응기에서 수행되었다. 씨드 배양물은 실시예 1 및 2와 동일한 조건하에서 수득되었다. 주 배양은 초기의 10g/ℓ 글리세롤이 10g/ℓ 글루코즈로 치환된 점을 제외하고는 실시예 1에서 개시된 것과 동일한 조성을 갖는 생물 반응기중의 5ℓ 초기 배지로 출발하였다. 공급 용액은 700g/ℓ 글루코즈로 구성되고, 실시예 1에 개시된 것과 정확하게 같은 조건하에서 배양물에 첨가되었다. 160시간 공정 시간 후에, 7.21g/ℓ의 피타제가 브래드포드 방법으로 측정시, 배지에서 검출될 수 있었다.
실시예 4
반복적인 공급 배치 모드인 한세뉼라 폴리모파를 이용한 에이. 푸미가투스 피타제의 생산
이 실시예에서는, 실시예 1, 2 및 3에서 사용한 동일한 한세뉼라 폴리모파 균주를 이용하여 15ℓ들이 반응기중에서 반복적인 공급-배치 배양을 수행하였다. 제 1 배양을 위해서, 씨드 배양물을 하기 조성을 갖는 배지 300㎖에 -70℃에서 유지된 글리세롤 저장용 세포 현탁액 1㎖를 접종시켜 수득하였다: 30.0g/ℓ 글리세롤; 13.3g/ℓ NH4H2PO4; 3.0g/ℓ MgSO4·7H2O; 6.7g/ℓ (NH4)2SO4; 3.3g/ℓ KCl; 0.33g/ℓ NaCl; 1.0g/ℓ CaCl2·2H2O; 0.67㎎/ℓ H3BO3; 0.067g/ℓ (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O; 5.3㎎/ℓ CuSO4·5H2O; 20㎎/ℓ ZnSO4·7H2O; 26㎎/ℓ MnSO4·H2O; 0.067g/ℓ Na-EDTA; 0.67㎎/ℓ NiSO4·6H2O; 0.67㎎/ℓ CoCl2·6H2O; 0.67㎎/ℓ Na2MoO4·2H2O; 0.67㎎/ℓ KI; 0.13g/ℓ 티아민·HCl; 0.4㎎/ℓ 바이오틴. 진탕 플라스크를 30℃, 200rpm에서 30시간동안 배양하고, 300㎖를 7.5ℓ 배지의 초기 부피에 대해 150.0g 글리세롤; 100.0g NH4H2PO4; 22.5g MgSO4·7H2O; 50.0g (NH4)2SO4; 25g KCl; 2.5g NaCl; 7.5g CaCl2·2H2O; 5㎎ H3BO3; 0.5g (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O; 40㎎ CuSO4·5H2O; 150㎎ ZnSO4·7H2O; 40㎎ MnSO4·H2O; 0.5g Na-EDTA; 5.0㎎ NiSO4·6H2O; 5.0㎎ CoCl2·6H2O; 5.0㎎ Na2MoO4·2H2O; 5.0㎎ KI; 1g 티아민·HCl; 3㎎ 바이오틴을 함유하는 15ℓ들이 생물 반응기에서 주 배양에 대한 접종원으로 이용하였다.
전체 공정 온도동안, pH 및 통기는 각각 30℃, 5.0 및 9.0ℓ/분으로 일정하게 유지시켰다. pH는 NH325%를 첨가하여 조절하였다. 산소 포화는 교반기 속도 및 압력(0 내지 0.5바)을 조절함으로써 반응기중에서 20% 포화의 최소값으로 유지되었다. 배지중의 초기 글리세롤의 완전한 소비는 pO2값을 신속하게 증가시키고 배치 단계의 종결을 나타낸다. 이 시점에서, 공급물은 40% 글루코즈 및 60% 글리세롤을 포함하는 용액으로 시작하여 700g/ℓ의 총 탄소원 농도로 간다. 공급 속도는 전체 공급 단계동안 45g/h으로 조절되었다.
하기 반복적인 공급-배치 배양의 경우, 이전에 수행한 0.5 내지 1ℓ의 배양액을 다음 수행을 위한 접종원으로써 공정 말기에 생물 반응기 내에 유지시켰다. 상기 개시된 염의 동일한 총량을 포함하지만 탄소원이 없는 새로운 멸균 배지를 정의된 초기 부피까지 생물 반응기에 첨가하였다. 따라서, 배치 단계는 없고, 공급은 하기 개시된 바와 같이 즉시 시작되었다. 공급 용액은 총 700g/ℓ 탄소원을 함유한다. 하기와 같은 상이한 비율의 글리세롤 및 글루코즈, 및 초기 부피를 사용하였다:
제 2 회 배양: 66% 글루코즈, 34% 글리세롤, 7.5ℓ의 초기 부피
제 3 회 배양: 90% 글루코즈, 10% 글리세롤, 7.5ℓ의 초기 부피
제 4 회 및 제 5 회 배양: 100% 글루코즈, 5ℓ의 초기 부피
각각의 배양 말기에서 수득된 피타제의 농도는 도 2에 나타난 바와 같이 제 1 회 내지 제 5 회 배양의 경우 각각 4.7g/ℓ, 3.9g/ℓ, 4.3g/ℓ, 6.0g/ℓ 및 4.4g/ℓ이었다. 제 4 회 배양에서, 성장 단계의 말단에서 더 느린 연장된 공급 모드가 더 높은 생산물 농도를 이끌어내었다.
실시예 5
한세뉼라 폴리모파를 이용한 컨센서스(consensus) 피타제의 생산
이 실시예에서, FMD 프로모터의 제어하에서 컨센서스 피타제 유전자(유럽 특허원 제 97810175.6 호)를 약 40 카피 함유한 한세뉼라 폴리모파의 균주를 공급-배치 단계의 경우 700g/ℓ를 함유하는 공급 용액을 이용하여, 실시예 1에서 개시된 것과 동일한 배지를 이용하여 동일한 조건하에서 15ℓ들이 생물 반응기중에서 배양하였다. 165시간 배양 시간후에, 배지중의 피타제 농도는 브래드포드 방법에 의해 결정시 13.1g/ℓ이었다.
본 발명의 방법에 의해 고가인 글리세롤을 사용하지않고, 억제성 기질을 탄소원으로 이용한 형질전화되거나 또는 비-형질전환된 진핵 세포의 배양에 의해 내생성 또는 이종 단백질을 제조할 수 있다.

Claims (7)

  1. 억제성 기질이 탄소원으로 사용되고, 상기 탄소원이 공급 단계동안 제한되고, 전체 배양 기간동안 연속적인 산소 제한이 없음을 특징으로하는, 형질전환되거나 비형질전환된 진핵 세포의 배양에 의한 내생성 또는 이종 단백질의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    단백질이 효소, 특히 사료 효소, 예를 들면 피타제, 셀룰라제, 크실라나제, 또는 산업적 효소, 예를 들면 아밀라제, 프로티아제, 인버타제, 리파제, 카탈라제, 셀룰라제, 글루코즈 옥시다제, 알콜 옥시다제, 펙티나제, 나라기나제, 콜라게나제, 퍼옥시다제 또는 풀룰라나제인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    세포가 메틸로트로픽(methylotropic)이고/이거나 메탄올 대사에 관련된 효소용 프로모터, 예를 들면 포르메이트 디하이드로게나제(FMD 또는 FMDH) 프로모터, 메탄올 옥시다제(MOX) 프로모터 또는 디하이드록시아세톤 신타제(DAS 또는 DHAS) 프로모터를 포함하는 DNA 서열로 형질전환된 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,
    세포가 메틸로트로픽 효모, 바람직하게는 한세뉼라(Hansenula), 예를 들면 한세뉼라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 피치아(Pichia), 예를 들면 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 칸디다(Candida) 또는 토룰롭시스(Torulopsis)인 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
    억제성 기질이 탄소원의 1 내지 100%, 바람직하게는 40 내지 100%, 보다 바람직하게는 90 내지 100%이거나, 또는 유일한 탄소원인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
    억제성 기질이 단당류, 이당류, 올리고당 또는 다당류, 예를 들면 글루코즈, 프락토즈, 슈크로즈, 말토즈, 전분, 글리코겐, 셀룰로즈 또는 덱스트로즈와 같은 당, 또는 당 함유 화합물, 예를 들면 당밀, 글루코즈 시럽 또는 프락토즈 시럽인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,
    반복적인 공급-배치의 형태로 수행하는 방법.
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