JPH11169173A - タンパク質製造方法 - Google Patents

タンパク質製造方法

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JPH11169173A
JPH11169173A JP10274104A JP27410498A JPH11169173A JP H11169173 A JPH11169173 A JP H11169173A JP 10274104 A JP10274104 A JP 10274104A JP 27410498 A JP27410498 A JP 27410498A JP H11169173 A JPH11169173 A JP H11169173A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 低コストのタンパク質の製造に適した、外来
性のまたは異種のタンパク質の、真核細胞の培養による
調製方法を提供すること。 【解決手段】 外来性のまたは異種のタンパク質の、形
質転換されたまたは形質転換されていない真核細胞の培
養による調製方法であって、抑制基質を炭素源として用
い、炭素源が流加相の間制限され、培養の全期間中、連
続的な酸素制限が生じないことを特徴とする調製方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、外来性のまたは異
種のタンパク質の、形質転換されたまたは形質転換され
ていない真核細胞の培養による調製方法であって、抑制
基質を炭素源として用い、炭素源が流加相の間制限さ
れ、培養の全期間中、連続的な酸素制限が生じないこと
を特徴とする調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】メチロトローフ酵母は、近年、異種タン
パク質の適切な発現系として研究されてきた。特に、Ha
nsenula polymorphaおよびPichia pastorisは、幅広い
種々の外来遺伝子について宿主生物を扱いやすいと記載
されてきた（概説は、Gelissen& Melber 1996およびCre
gg & Madden 1998を参照）。メタノール代謝に関与する
酵素のプロモーターは非常に強いことが見出されていた
ので、それらは一般にタンパク質の異種発現を制御する
ために用いられている（ＥＰ０１７３３７８、ＥＰ０２
９９１０８、ＥＰ０１８３０７１を参照）。
【０００３】これらの生物の培養のために用いられる炭
素源がプロモーター調節に大きな影響を与えることは公
知である。Gelissenら（1994）は、Hansenula polymorp
haにおけるメタノール代謝の鍵酵素が、メタノール上で
の増殖の間に大量に存在すると記載している。有意なレ
ベルの酵素メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）およびギ
酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤＨ）は、グリセロール増殖
細胞中では検出することができるが、グルコースが炭素
源として用いられている場合には存在しないこともまた
見出された（例えば、ＥＰ０２９９１０８参照）。この
データに基づくと、これらの酵素がメタノールによって
誘導されると結論づけられる。グリセロール上での増殖
の間のＭＯＸおよびＦＭＤＨの発現は、プロモーターの
脱抑制により説明される。Hansenula polymorphaおよび
Kloeckera sp.2201のグルコース制限ケモスタット培養
では、ＦＭＤＨのみが増殖速度０．１ｈ-１未満で非常
に少量産生される（Egliら、1980）。したがって、これ
までは、非抑制炭素源がタンパク質の異種発現のために
メチロトローフ酵母と一緒に用いられてきた。Hansenul
a polymorphaは、幅広い種々の医薬タンパク質の製造の
ため、グリセロールによる単一炭素源モードで、あるい
はグリセロールおよび更なるメタノールによる２炭素源
モードのいずれかで流加培養法で培養されている（Geli
sson & Melber 1996）。一般的な操作手順は、Weydeman
nら（1995）によりヒルジンの製造について詳細に記載
されている。非抑制炭素源としてやはりグリセロールを
用いているPichia pastorisによるトロンボモジュリン
の製造方法がChenら（1996）により記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、グリセ
ロールの値段が高いので、この方法は現在まで、飼料ま
たは工業用酵素のような低コストのタンパク質の製造に
は適していない。したがって、本発明の目的は、そのよ
うな障害を克服し、外来性のまたは異種のタンパク質
の、形質転換されたまたは形質転換されていない真核細
胞の培養による調製方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】この方法においては、抑
制基質を炭素源として用い、この炭素源が流加相の間制
限され、培養の全期間中、連続的な酸素制限はないか；
あるいは、そのような方法においてタンパク質が酵素、
特に飼料酵素、例えば、フィターゼ、セルラーゼ、キシ
ラナーゼ、または工業用酵素、例えば、アミラーゼ、プ
ロテアーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、カタラーゼ、
セルラーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキ
シダーゼ、ペクチナーゼ、ナラギナーゼ(naraginase)、
コラゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、もしくはプルラナー
ゼであるか；あるいはそのような方法において、細胞は
メチロトローフであるか、および／またはメタノール代
謝に関与する酵素のプロモーター、例えば、ギ酸デヒド
ロゲナーゼ（ＦＭＤまたはＦＭＤＨ）プロモーター、メ
タノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）プロモーターもしくは
ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳまたはＤＨＡ
Ｓ）プロモーターを含むＤＮＡ配列で形質転換されてい
るか；あるいはそのような方法において、細胞はメチロ
トローフ酵母、好ましくはHansenula、pichia、Candid
a、またはTorulopsis、例えば、Hansenula polymorpha
またはPichia pastorisであるか；あるいはそのような
方法において、抑制基質は、炭素源の１〜１００％、好
ましくは４０〜１００％またはより好ましくは９０〜１
００％を占めるか、あるいは単一の炭素源であるか；あ
るいはそのような方法において、基質は、モノ−、ジ
−、オリゴ−、もしくはポリサッカライドのような糖、
例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マル
トース、デンプン、グリコーゲン、セルロース、もしく
はデキストロース、または糖含有化合物、例えば、糖
蜜、グルコースシロップ、もしくはフルクトースシロッ
プであるか；あるいはそのような方法は反復流加培養の
形態で行なわれる、ことを特徴とする。さらに、そのよ
うな方法は、流加速度範囲が微生物の代謝特性および
（特に、酸素についての）バイオリアクターのマストラ
ンスファー能力により制限される。流加速度は、産生を
可能にする最小値と培養物中の酸素制限を回避する最大
値との間に好ましくは維持される。
【０００６】
【発明の実施の形態】異種タンパク質の製造方法の場
合、真核細胞は、そのような異種タンパク質、例えば、
本件の場合のフィターゼ、をコードするＤＮＡ配列を含
むＤＮＡ配列またはベクターにより形質転換される。分
子生物学の分野の当業者はそのような形質転換真核細胞
を調製するために用いられる方法を熟知しており、例え
ば、本件の特定の例については、ＥＰ６８４３１３また
は欧州特許出願第９７８１０１７５．６を参照された
い。
【０００７】本発明の関係において、「培養」とは、当
業者が熟知している通常の意味を有する。特定の培養条
件は、用いられる細胞と産生されるタンパク質およびそ
れらの発現系に依存する。タンパク質の発酵生産の分野
の当業者もまたそのような条件を熟知している。さら
に、短いバッチ相、すなわち、細胞の増殖期の間に本発
明を実施するためには、抑制または非抑制炭素源、例え
ば、それぞれグルコースまたはグリセロールを用いるこ
とができることも理解される。流加相は、所望のタンパ
ク質の産生期であるが、その間は、培養方法は本発明に
より提供される方法で行なわれる。
【０００８】さらに、本発明の実施のための目的のメチ
ロトローフ酵母は、例えば、ＥＰ１７３３７８の第３７
および３８頁から得ることができる。
【０００９】
【実施例】実施例１ 主な炭素源としてグリセロールまたはグルコースを用い
るHansenula polymorphaによるA.Fumigatusのフィター
ゼの産生 流加する基質としてグリセロールまたはグルコースを用
いてフィターゼの産生を比較するため、２つの流加培養
実験を、１５lのリアクター中で、約８０コピーのAsperg
illus fumigatusの野生型フィターゼ遺伝子（Pasamonte
sら1997）をＦＭＤプロモーターの制御下で用いて行な
った。
【００１０】振盪フラスコ培養を、−７０℃で以下の組
成の５０mlの培地で維持していたグリセロール保存細胞
懸濁液１mlを接種することにより開始した：３０．０g/
lグリセロール；２．５g/lＫＨ2ＰＯ4；５g/lＮＨ4Ｈ2
ＰＯ4；２．２５g/lＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；２．５g/l
（ＮＨ4)2ＳＯ4；１．１５g/lＫＣｌ；０．２５g/lＮａ
Ｃｌ；０．３７５g/lＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ；０．２５mg/
lＨ3ＢＯ3；０．０５g/l（ＮＨ4)2Ｆｅ（ＳＯ4)2・６Ｈ
2Ｏ；４mg/lＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；１５mg/lＺｎＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ；２０mg/lＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；０．０５g/lＮａ
−ＥＤＴＡ；０．５mg/lＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏ；０．５mg
/lＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；０．５mg/lＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ
2Ｏ；０．５mg/lＫＩ；０．０５g/lチアミン・ＨＣｌ；
０．１５mg/lビオチン。それらを３０℃、２００rpmで
２４時間培養し、３０mlを第２の振盪フラスコ工程に同
じ培地３００mlと一緒に移し、３０℃、２００rpmでさ
らに２４時間培養した。
【００１１】このシード培養物３００mlを、以下のよう
に構成された開始培地５lの入った１５lの発酵槽用の接
種物として用いた：１０．０g/lグリセロール；５．０g
/lＫＨ2ＰＯ4；１０g/lＮＨ4Ｈ2ＰＯ4；４．５g/lＭｇ
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；５．０g/l（ＮＨ4)2ＳＯ4；２．３g/l
ＫＣｌ；０．５g/lＮａＣｌ；０．２ml/l消泡剤；０．
７５g/lＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ；０．５mg/lＨ3ＢＯ3；
０．１g/l（ＮＨ4)2Ｆｅ（ＳＯ4)2・６Ｈ2Ｏ；８mg/lＣ
ｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；３０mg/lＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；４０
mg/lＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；０．１g/lＮａ−ＥＤＴＡ；
１．０mg/lＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏ；１．０mg/lＣｏＣｌ2
・６Ｈ2Ｏ；１．０mg/lＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ；１．０
mg/lＫＩ；０．１g/lチアミン・ＨＣｌ；０．３mg/lビ
オチン。全工程の間は、温度、pH、および通気はそれぞ
れ３０℃、pH４．６、および５l/hの一定に保たれた。p
Hは２５％のＮＨ3の添加により制御した。酸素飽和度
は、スターラー速度と圧力（０〜０．５bar）を制御す
ることにより、リアクター内で最小値の２０％飽和に維
持した。培地中の最初のグリセロールの完全消費はｐＯ
2値の急速な上昇を導き、バッチ相の終わりを示した。
この時点で、グリセロールまたはグルコースのいずれか
の溶液７００g/lの流加を開始した。最初の１８時間の
流加には、２５g溶液/hの開始流加速度を用い、次い
で、速度を５０g/hまで増加させた。培養物容量は、約
６lの炭素源溶液の流加のため培養の最後には約１１lま
で増加していた。
【００１２】グルコースが流加される培養の場合、この
工程の間に代謝される全炭素源の９８％がグルコースで
あり、残りの２％はバッチ相の間に使われるグリセロー
ルに相当する。全工程の間、上清中でグルコースを計測
することはできなかった。
【００１３】１６５時間の工程時間の後、５．８６g/l
のフィターゼが、グリセロールを用いた培養から得たサ
ンプル中で、タンパク質測定のためのBradford法を用い
ることにより定量された。グルコースを用いた培養から
は、１６０時間の工程時間の後のサンプルに７．１２g/
lのフィターゼ（同じ方法により測定された）が含まれ
ていた。これらの結果により、グルコースの抑制的効果
を、流加相の間の厳格な炭素制限を確実にする流加法に
より、回避することができることが確認された。図１
は、主な炭素源としてグリセロールを用いて行なった培
養とグルコースを用いて行なった培養の時間経過の比較
を示す。
【００１４】実施例２ 主な炭素源としてスクロースを用いるHansenula polymo
rphaによるA.Fumigatusのフィターゼの産生 この実施例では、培養は１５lのバイオリアクター内
で、実施例１由来のそれと同じ株を用いて行なった。シ
ード培養と主培養の条件は、流加溶液が７００g/lのス
クロースを含んでいること以外は、実施例１のときと全
く同じであった。工程の間、上清サンプル中のスクロー
ス濃度は、一度も１g/lより高くならず、同じサンプル
中にはグルコースもフルクトースも検出され得なかっ
た。１６７時間の培養時間の後、フィターゼ５．２７g/
lをタンパク質測定のためのBradford法により培地中で
測定することができた。
【００１５】実施例３ 単一の炭素源としてグルコースを用いるHansenula poly
morphaによるA.Fumigatusのフィターゼの産生 この実施例では、培養は実施例１および２と同じ株を用
いて１５lのバイオリアクター内で行なった。シード培
養物は実施例１および２と同じ条件下で得た。主培養
は、最初のグリセロール１０g/lをグルコース１０g/lに
よって置換した以外は実施例１に記載したのと同じ組成
でバイオリアクター中５lの開始培地を用いて開始し
た。流加溶液はグルコース７００g/lからなり、実施例
１に記載したのと全く同じ条件下で培養物に添加した。
１６０時間の工程時間の後、フィターゼ７．２１g/lをB
radford法による測定で培地中に検出することができ
た。
【００１６】実施例４ 反復流加培養モードでのHansenula polymorphaによるA.
Fumigatusのフィターゼの産生 この実施例では、実施例１，２および３で用いたのと同
じHansenula polymorpha株をもちいて、反復流加培養を
１５lのリアクター内で行なった。最初の培養のため、
シード培養物は、以下の組成の３００mlの培地に、−７
０℃で維持していたグリセロール保存細胞懸濁液１mlを
接種することにより得た：３０．０g/lグリセロール；
１３．３g/lＮＨ4Ｈ2ＰＯ4；３．０g/lＭｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ；６．７g/l（ＮＨ4)2ＳＯ4；３．３g/lＫＣｌ；
０．３３g/lＮａＣｌ；１．０g/lＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ；
０．６７mg/lＨ3ＢＯ3；０．０６７g/l（ＮＨ4)2Ｆｅ
（ＳＯ4)2・６Ｈ2Ｏ；５．３mg/lＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；
２０mg/lＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；２６mg/lＭｎＳＯ4・Ｈ2
Ｏ；０．０６７g/lＮａ−ＥＤＴＡ；０．６７mg/lＮｉ
ＳＯ4・６Ｈ2Ｏ；０．６７mg/lＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；
０．６７mg/lＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ；０．６７mg/lＫ
Ｉ；０．１３g/lチアミン＊ＨＣｌ；０．４mg/lビオチ
ン。振盪フラスコを、３０℃、２００rpmで３０時間培
養し、３００mlを、主培養の接種物として以下を含む１
５lのバイオリアクター中で開始容量７．５lの培地に対
して用いた：１５０．０gグリセロール；１００．０gＮ
Ｈ4Ｈ2ＰＯ4；２２．５gＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；５０．０
g（ＮＨ4)2ＳＯ4；２５gＫＣｌ；２．５gＮａＣｌ；
７．５gＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ；５mgＨ3ＢＯ3；０．５g
（ＮＨ4)2Ｆｅ（ＳＯ4)2・６Ｈ2Ｏ；４０mgＣｕＳＯ4・
５Ｈ2Ｏ；１５０mgＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；４０mgＭｎＳ
Ｏ4・Ｈ2Ｏ；０．５gＮａ−ＥＤＴＡ；５．０mgＮｉＳ
Ｏ4・６Ｈ2Ｏ；５．０mgＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；５．０mg
Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ；５．０mgＫＩ；１gチアミン・
ＨＣｌ；３mgビオチン。
【００１７】全工程の間は、温度、pH、および通気はそ
れぞれ３０℃、５．０、および９．０l/分の一定に保た
れた。pHは２５％のＮＨ3の添加により制御した。酸素
飽和度は、スターラー速度と圧力（０〜０．５bar）を
制御することにより、リアクター内で最小値の２０％飽
和に維持した。培地中の最初のグリセロールの完全消費
はｐＯ2値の急速な上昇を導き、バッチ相の終了を示し
た。この時点で、全炭素源濃度７００g/lに対してグル
コース４０％およびグリセロール６０％を含む溶液を用
いて、流加を開始した。流加速度は、全流加相の間４５
g/hに制御された。
【００１８】次の反復流加培養のため、先に実施したも
のからの０．５〜１lの培養ブロスを、工程の終わり
に、次の実施のための接種物としてバイオリアクター内
に維持した。上記と同じ総量の塩を含むが炭素源のない
新しい滅菌培地を所定の開始容量までバイオリアクター
内に添加した。したがって、バッチ相はなく、流加を上
記のように直ちに開始した。流加溶液は全部で７００g/
lの炭素源を含んでいた。異なる割合のグリセロールと
グルコースならびに開始容量を以下のように用いた：
【００１９】第２サイクル−グルコース６６％、グリセ
ロール３４％、開始容量７．５l 第３サイクル−グルコース９０％、グリセロール１０
％、開始容量７．５l 第４および第５サイクル−グルコース１００％、開始容
量５l
【００２０】各サイクルの終わりに獲得したフィターゼ
の濃度は、図２に示すように、それぞれ第１〜第５サイ
クルについて、４．７g/l、３．９g/l、４．３g/l、
６．０g/l、および４．４g/lであった。第４サイクルで
は、増殖期の終わりのより緩慢で長い流加モードがより
高い生成物濃度を導いた。
【００２１】実施例５ Hansenula polymorphaによるコンセンサスフィターゼの
産生 この実施例では、ＦＭＤプロモーターの制御下の約４０
コピーのコンセンサスフィターゼ遺伝子（欧州特許出願
第９７８１０１７５．６号）を含むHansenulrapolymorp
haの株を、実施例１に記載したのと同じ培地で同じ条件
下で１５lのバイオリアクター内で、流加培養相のため
に７００g/lのグルコースを含む流加溶液を用いて、培
養した。１６５時間の培養時間の後、培地内のフィター
ゼ濃度は、Bradford法による測定で、１３．１g/lであ
った。
【００２２】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】流加相において単一の炭素源としてグリセロー
ルまたはグルコースを用いるH.polymorphaの比較培養の
時間経過。
【図２】流加溶液中のグルコースの割合を増加させなが
ら行なった反復流加培養サイクル。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルアル・ロペス−ウリバッリ スイス国、ツェーハー−4310 ラインフェ ルデン、アルテ・ザリネ 10 (72)発明者 アン・フランソワ・マイヤー ドイツ連邦共和国、デー−79639 グレン ツァハ−ヴィーレン、ヴァルター・ヴェッ ツェル・ヴェーク ８ (72)発明者 ハインリッヒ・ヴィンフリート・シュリー カー ドイツ連邦共和国、デー−79541 レール ハ、ゼーゲンマットシュトラーセ 24 (72)発明者 アドルフス・ファン・ルーン スイス国、ツェーハー−4310 ラインフェ ルデン、バルトシューテルシュトラーセ 17

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 外来性のまたは異種のタンパク質の、形
    質転換されたまたは形質転換されていない真核細胞の培
    養による調製方法であって、抑制基質を炭素源として用
    い、炭素源が流加相の間制限され、培養の全期間中、連
    続的な酸素制限が生じないことを特徴とする調製方法。
  2. 【請求項２】 タンパク質が、酵素、特に飼料酵素、例
    えば、フィターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、または
    工業用酵素、例えば、アミラーゼ、プロテアーゼ、イン
    ベルターゼ、リパーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、グル
    コースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ペクチ
    ナーゼ、ナラギナーゼ、コラゲナーゼ、ペルオキシダー
    ゼ、もしくはプルラナーゼである、請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 細胞が、メチロトローフであるかおよび
    ／またはメタノール代謝に関与する酵素のプロモータ
    ー、例えば、ギ酸デヒドロゲナーゼプロモーター、メタ
    ノールオキシダーゼプロモーターもしくはジヒドロキシ
    アセトンシンターゼプロモーター、を含むＤＮＡ配列で
    形質転換されている、請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 細胞が、メチロトローフ酵母、好ましく
    はHansenula、例えば、Hansenula polymorpha、Pichi
    a、例えばPichia pastoris、Candida、またはTorulopsi
    sである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】 抑制基質が、炭素源の１〜１００％、好
    ましくは４０〜１００％もしくはより好ましくは９０〜
    １００％を占めるか、または単一の炭素源である、請求
    項１〜４のいずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】 抑制基質が、モノ−、ジ−、オリゴ−、
    もしくはポリサッカライドのような糖、例えば、グルコ
    ース、フルクトース、スクロース、マルトース、デンプ
    ン、グリコーゲン、セルロース、もしくはデキストロー
    ス、または糖含有化合物、例えば、糖蜜、グルコースシ
    ロップ、もしくはフルクトースシロップである、請求項
    １〜５のいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 反復流加培養の形態で行なわれる、請求
    項１〜６のいずれか１項記載の方法。
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