KR19990028403A - 시신경 손상 치료(2-이마다졸린-2-일라미노) 키녹살린 사용 방법 - Google Patents

Abstract

시신경 세포의 상해 이전 또는 상해에 뒤이어 그러나 세포사 이전의 기간 내에 포유 동물의 시신경 및/또는 망막에 식 I의 약품의 투여로 시신경 세포에 대한 세포 보호가 주어지는 방법.

[식 1]

여기에서, 2-이미다졸린-2-일라미노 군은 키녹살린 핵의 5- 또는 6-위치중 하나에 있으며; x, y, 및 z는 나머지 5-, 6-, 7- 또는 8-위치 중 하나에 있으며, 수소, 할로겐, 하부 알칼, 하부 알콕시 또는 트리플루오르메틸로부터 선택되며, R은 키녹살린 핵의 2- 또는 3-위치 중 하나의 선택적 치환제이며 수소, 하부 알킬 또는 하부 알콕시, 또는 그 약제학적으로 수용 가능한 솔트 및 그 혼합물일 수 있다.

Description

시신경 손상 치료 (2-이마다졸린-2-일라미노) 키녹살린 사용 방법

본 발명은 시신경의 보호 및 녹내장 또는 그 외 병원인에 의해 유발된 안 내(intraocular) 압력의 상승의 효과에 의한 손상과 이들 시신경에 손상된 피 흐름을 포함하는 유독성 유발 원인으로 인한 포유 동물의 눈의 망막의 보호 방법에 관한 것이다.

녹내장은 안 내 압력의 상승으로 인해 특징되는 질병이다. 이 병인학에 기초하여, 녹내장은 일차 또는 이차적인 것으로 분류된다. 또한, 성인의 일차 녹내장은 만성 오픈-앵글 (open-angle) 또는 만성 앵글-클로져 (angle-closure)일 수 있다. 이차 녹내장은 포도막염, 안 내 종양 또는 확장된 백내방과 같은 먼저 존재하던 눈 질병으로부터 유발된다.

일차 녹내장의 원인은 아직 잘 알려져 있지 않다. 안 내 압력 증가는 차단 또는 안방수 유출에 기인한다. 만성 오픈-앵글 녹내장에서, 전방실과 그 해부 구조는 통상적인 것으로 보이지만, 안방수의 배수는 차단되게 된다. 급성 만성 앵글-클로져 녹내장에서는, 후방실이 얇고, 여과각도가 좁으며 홍채가 쉴렘관의 입구에서 결체 조직 메시워크 (trabecular meshwork)를 차단할 수 있다. 동공 확장법은 홍채근을 각도에 대해 전방으로 가압하거나, 동공 블록을 생성하여 안 내 압력의 상승으로 인한 급성 충격을 촉진시킨다. 좁은 후방실 각도를 갖는 눈은 다양한 정도의 급성 앵글-클로져 녹내장에 영향을 준다.

이차 녹내장은 전방실에서 후방실로, 뒤이어서 쉴렘관으로의 안방수 흐름의 차단으로 유발된다. 후방실이 염증은 팽륜 홍채에 완전한 후방 유착증을 유발하여 안방수 누출을 방지할 수 있으며, 삼출물로 배수 채널을 막을 수 있다. 다른 일반적인 원인은 안 내 종양, 확장 백내장, 복추 정맥 폐쇄, 눈의 상해, 동작 과정 및 안내 출혈이 있다.

모든 형태를 함께 고려하면, 녹내장은 40세 이상의 모든 사람의 약 2%에 발생하며, 급속한 시력 상실로 진행하기 전에는 몇 년간 증후성이 나타나지 않을 수 있다. 진찰로 나타나지 않는 경우, 국소적 베타-아드레노셉터 앤터고니스트(beta-adrenoceptor antagonist)가 녹내장을 치료하는 의약품이었다. 그러나, 알파-아드레너직 어고니스트(alpha-afrenergic agonist)는 상승된 안 내 압력의 치료에 사용되는 인가를 기다리고 있으며 이것이 일단 사용 가능하게 되면 이 질병의 치료에 중요하게 될 것이다.

알파²어고니스트 활성을 갖는 여러 가지 키녹살린 유도체가 미국 특허 번호 3,890,319 및 4,029,792에서, 예를 들어, Danielewicz 등에 의해 치료제로서 제시되고 있다. 이들은 다음의 식을 갖는 카디오배스큘러 시스템의 조절자로서 화합물을 개시하고 있다:

여기에서 2-이미다졸린-2-일라미노 군은 키녹살린 핵의 5-, 6-, 7- 또는 8- 위치중 어느 것일 수 있으며; x, y, z는 나머지 5-, 6-, 7-, 8-위치 중 어느 것일 수 있으며 수소, 할로겐, 하부 알킬, 하부 알콕시 또는 트리플루오르메틸로부터 선택될 수 있으며; R은 키녹살린 핵의 2- 또는 3-위치중 하나의 선택적인 치환물로서, 수소, 하부 알킬 또는 하부 알콕시일 수 있다. 현재 유용한 화합물은 Danelewicz 등에 의해 강조된 과정에 따라서 제조될 수 있다. 미국 특허 번호 3,890,319 및 4,029,792의 내용은 여기에서 전체적으로 참조되고 있다.

"고양이, 쥐 및 원숭이의 비교적 선택적인 알파-2 어고니스트(UK-14,304-18)의 시각 효과" [J. A. Burke, 등, Current Eye Rsrch., 5, (9), pp.665-676(1986)]에서, 키녹살린 유도체는 쥐, 고양이 및 원숭이의 안 내 압력을 감소시키는 데에 효과적인 것으로 나타났다. 이 연구의 화합물은 연구 동물의 눈에 국소적으로 투여되었다.

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녹내장의 속발증중 하나로서 시신경 헤드에 손상을 입힌다는 것은 오랫 동안 알려져 왔다. "쿠핑(cupping)"으로 언급되는 이 손상은 망막 유두의 신경 섬유 영역의 강하를 유발한다. 이 쿠핑으로부터 시력 손실이 진전되며 이 조건이 효과적으로 치료되지 않으면 실명에 까지 이를 수 있다.

안타깝게도 약물의 투여 또는 안방수의 유출을 촉진하는 치료에 의해 안 내 압력을 저하하는 것이 녹내장 상태에서 신경에 손상을 입히는 것을 방지하는 데에 항상 효과적인 것은 아니다. 이런 명백한 모순은 논문, "후방 시신경의 마이크로현관계"에서, Cioffi 및 Van Buskirk [Surv. of Ophthalmol., 38, suppl. p.S107-16, 디스커션 S116-7, May 1994]에서 언급되었다. 요약을 하면:

안 내 압력(IOP) 증가의 불일치로서의 녹내장 정의가 진료 상황을 지나치게 간소화하고 있다. 어떤 녹내장 환자는 정상 IOP보다 결코 더 크지 않지만 어떤 사람은 IOP의 최대 저하에도 불구하고 시신경 손상이 계속 진행된다. 녹내장의 병원인의 다른 가능한 요인으로는 후방 시신경의 마이크로혈관계의 조정이 있을 수 있다. 마이크로혈관계 요인이 중요하다고 믿는 한 가지 이유는 많은 미세혈관계 질병이 녹내장 시신경병과 관련된다는 것이다.

Cioffi 등에 뒤이어, Matusi는 "Ophthalmolgic aspects of Systemic Vasculitis"[Nippon Rinsho, 52(8), p.2158-63, 1994 8월]에서의 논문을 발표하였으며 많은 미세 혈관계 질병이 녹내장 시신경병과 관련된다는 확인을 지지하고 있다. 이를 요약하면;

결절성 다발 동맥염, 거대 세포 맥관염, 대동맥염 증후군, 전신계 홍반성 난창과 같은 전신계 맥관염의 시각 고찰을 행한다. 전신계 홍반성 낭창이 전신계 맥관염으로 분류되지 않지만, 그 시각 고찰은 마이크로맥관병이다. 따라서, 이 고찰을 이 문서에 포함한다. 이 질병의 가장 통상적인 고찰은 시신경 또는 망막 맥관 차단이다. 따라서 시신경과 망막 및 맥락막 차단의 진단과 발병의 몇가지 점이 논의된다. 플루오레스세인 맥관병이 이들 상해에 인가되기 때문에, 맥락막 국소 빈혈이 진달될 수 있게 된다. 맥락막의 동맥이 차단될 때, 망막 피그먼트 상피가 손상된다. 이것은 상피의 장벽 기능의 차단을 유발하고 맥락막 혈관계로부터의 유출을 가능하게 한다. 이것은 망막의 장막 분리의 발병인이다. 망막 동맥 차단은 비살포 망막을 형성한다. 이 하이폭식 망막과 홍채 혈관 신생을 자극하는 맥관병 요인을 유출하여 홍채 혈관 신생이 녹내장을 유발한다.

"Circulatory Defects of the Optic Disk and Retina in Ocular Hypertension and High Pressure Open-Angle Glaucoma"[Surv. Ophthalmol., 38, Suppl. pp.S23-24, 1994. 5]에서, B.Schwaetz는 녹내장의 진전과 관련된 시신경과 망막의 상해 진행의 측정에 대해 개시하고 있다. 그는 여기에서:

플루오레스세인 (fluorescein) 상해는 시각 손실 및 망막 신경 섬유층 손실과 상호 관련되어 있다. 제2순환 상해는 망막 혈관, 특히 망막 정맥의 플루오레스세인의 흐름을 감소시켜, 나이가 들수록, 그리고 확장기 혈압, 안 압력 및 시력 손실이 커질수록 흐름은 적어지게 된다. 망막 유두와 망막 순환은 치료되지 않은 고혈압 눈에서 발생하게 된다. 이들은 망막 유두와 망막의 순환 결함은 눈 고혈압과 오픈-앵글 녹내장에서 발생하고 질병의 악화로 증가하게 된다.

따라서 녹내장 또는 그 외 눈 질병의 결가로 신경에 발생하는 손상의 악화를 정지 또는 지연시킬 수 있는 눈의 신경 보호 효과를 갖는 약품이 필요하다는 것이 명백하다.

<발명의 요약>

녹내장 및 그 외 유독성 유발인에 의한 손상으로부터 포유 동물의 눈의 시신경 및 망막을 보호하는 새로운 방법이 개발되고 있다. 이 방법은 전신계적 또는 연수내의 주입으로 포유 동물에게 특정 아릴-이미노-2-이미다졸리다인(여기에서 정의), 그 솔트 및 그 혼합물중 하나 이상의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 이 새로운 방법은 신경의 손상이 발생하기 전에, 또는 녹내장과 같은 질병의 장기간 진전이 발생하기 전에, 예방 치료로서 투여될 때 특히 효과적이다.

도 1은 녹내장 치료 몇 일 후에 플롯된 글루타민산염으로 치료하여 죽은 세포의 퍼센티지를 나타내는 막대 그래프이다. 글루타민산염으로 치료되지 않은 대조가 어떠한 치료 없이 발생하는 세포사를 결정하도록 포함된다. 또한 AGN191103과 글루타민산염으로의 치료, 및 MD-801 및 글루타민산염으로의 치료 이후의 측정을 또한 나타내고 있다. MK-801은 이 기술에서 잘 알려진 세포 보호제이다. 글루타민산염; AGN191103+글루타민산염; 및 MK-801+글루타민산염에 대한 막대 아래의 수자는 각 경우 글루타민산염과 약제의 농도를 나타낸다. 8일 째에, AGN 191103 및 MK-801은 글루타민산염 유도 신경유독성으로부터 세포를 보호하는 데에 비교적 효과적이다. 이 도면의 데이터 발생에 뒤이어지는 실험적 과정을 실시예 1에서 상세히 설명한다.

도 2는 시신경 섬유에 대해 측정된 화합물 활동 전위(CAP)의 점선을 나타내고; 좌측 프레임에서 AGN 191103(상측선)으로 치료된 시신경에 대한 것과 대조(하측선)로서 치료받지 않은 신경에 대한 2주 후의 손상(즉, 신경 크러시)로 측정된 것을; 우측 프레임에서 손상되지 않은 시신경의 대비 CAP를 나타낸다. 플롯의 크기는 각 프레임에 대해 주어진다. 손상 후의 가로좌표 크기는 25×비손상 플롯의 크기이다. (단위:밀리볼트 및 밀리세컨드). 화합물 활동 전위치는 각 곡선 아래 영역의 인티그랄로 연산된다. 곡선의 불균일성은 화합물 반응 분산의 특성이고; 몇개의 신경 세포는 다른 것보다 더욱 급속히 반응하므로 측정 전압의 크기는 시간 경과에 따라 변하게 된다.

도 3은 쥐의 시신경 크러시에 의해 손상되어 1) 운반자막으로 2) 클로니다인(clonidine) 및 3)AGN191103으로 치료된 세포의 최대 CAP 크기를 마이크로볼트(㎶)로 나타내는 막대 그래프이다. 각 약품은 네 개의 다른 농도(시험 물체의 체중의 크기로 투여)로 시험되며 챠트에서 막대로 표시된다. 클로니다인은 매우 잘 정의된 약제학에서 α2 어고니스트 화합물을 밴치마크로서 선택되어 시험 화합물 AGN191103과 대비된다. 클로니다인이 운반자 만에 대해서 몇가지 세포 보호 작용을 나타내지만, 이것은 AGN191103의 최대 CAP 응답의 약 절반을 나타내는 것이다.

도 4는 시각 촉진 전위 응답의 그래프로서 시각 (광) 자극의 결과로서 시각 피질(뇌전도와 비교 가능)의 표면에서 촉진되는 전기 전위 작용을 나타낸다. 이 시험은 살아 있는 쥐에서 실행되며 망막으로부터 시신경을 통해 측면 안면 신경으로 궁극적으로는 뇌 후반부에 위치된 시각 피질로의 전 시각계의 통합성을 측정하기 위한 것이다. 좌측 프레임은 신경 크러시 상해 없는 반응을, 우측 프레임은 위의 AGN191103(포지티브로 표시)로 치료 받은 쥐와 신경 크러시 이전에 아래의(네가티브로 표시) 대비 쥐에 대한 손상 2주후에 측정된 응답을 나타낸다. 두 플롯의 ㎶ 대 밀리세컨드의 크기는 좌표축 아래에서 나타낸다.

신경 크러시 모델과 신경 손상 및 회복의 평가시의 중요도에 관한 토의 및 참고 문헌으로는 "Functional Recovery and Morphological changes after Injury to the Optic Nerve", Sabel, B.A.와 Aschoff, A.,, 28, pp.62-65(1993)가 있다.

포유 동물 중심 신경계(CNS)의 어느 다른 부분에서와 같이, 포유 동물 시신경의 손상은 축색 돌기 변성에 뒤이은 세포체의 손실에 이르르고, 생존한 뉴우런으로부터의 착색 돌기 재성장이 실패하게 된다. 초기에, 손상된 신경의 변성은 직접적인 신경 손상에 기여할 수도 있다. 그러나, 상해 바로 후에 신경에 발생하는 관련 물리학 및 생화학 이벤트는 직접 상해된 축색 돌기 뿐만 아니라, 일차 손상을 벗어나 장기간의 기능적 결과를 크게 결정하는 축색 돌기의 뒤이온 진전성 변성에 책임이 있을 수 있다.

급작스런 상해로 유도된 응답은 뒤이은 변성 응답에 영향을 미친다. 따라서, 급작스런 응답을 감소 또는 감쇄하는 치료로서 이차 변성 과정의 최적 방지 또는 지연을 성취할 수 있게 한다. 급작스런 반응의 감시를 위해서는, 비칩습성 기술을 이용하는 것이 바람직하다. 최초 외상 후의 이벤트의 측성을 가능하게 하기 위한 니코틴아미드 아데나인 디뉴클레오티드(NADH) 감시 기술의 적용이 비칩습성 접근이 되는 것으로 판명되었다. 이 기술을 이용하게 되면 성장 쥐의 시신경에 가해지는 크러시 상해 이전과 이후에 상해의 급작스런 효과가 온라인으로 평가될 수 있다. 이 실험 프로그램에서, 손상된 시신경의 신진 대사 작용의 측정은 손상된 축색 돌기와 이들의 관련된 비신경 세포를 나타내고, 이에 따라서 손상 압력에 대처하기 위한 잠재적 능력을 평가한다. 이 모델은 또한 이러한 압력으로 인한 신경 세포 손상이나 세포사를 해결하거나 완화할 수 있는 여러 약제의 작용을 감시하는 데에 유용하다.

최근에 상해 유도 응답은 국소 빈혈 상태가 완전히 제외되는 조건하에서, 신경의 에너지 상태의 감소이다. 에너지 상태의 감소는 1) 미토콘드리아 기능과 간섭되어 결과적으로 전달의 언커플링이 발생하게는 되는, 상해 후의 자유 지방산 수준의 상승; 2) 세포내 자유 Ca²⁺의 상승에 관련될 수 있다. 축색 돌기 손상에 이어 일반적으로 세포외 포스타슘 이온의 상승이 뒤따른다고 알려져 있으며, 이 이온은 전압 감지 채널(L, T, 또는 N형) 또는 리셉터-동작 Ca²⁺채널을 통해 Ca²⁺의 소비를 자극한다. 세포내 자유 Ca²⁺의 상승은, 미토콘드리아 손상을 유발하고 세포사를 갑자기 유도할 수 있는, Ca²⁺계 효소, 주로 리파제, 프로테아제 및 엔도뉴클리제를 포함하여, 세포 생존에 유해한 과정을 가속화할 수 있다. 이들 경우를 없애기 위해서, 세포는 이온 항상성을 회복하기 위해서 더욱 많은 에너지를 필요로 한다. 상해 위치에서 미토콘드리아 기능 장해로부터 결과된 에너지 상승의 요구와 에너지 감소의 보존의 조합이 상해에 뒤이어 신경 손상 및 신경 변성의 주요 원인이 될 수 있다. 신진 대사 작용의 초기 측정은 축색 돌기, 그 관련 신경교 세포 및 그 비신경 세포체의 운명을 나타낸다. 미토콘드리아 활동의 회복으로 상해후 신경에서 발생하는 변성 과정을 방지하는 데에 중요할 수 있다는 것을 위에서 알 수 있다.

신경 크러시 모델의 신경에 가해진 상해는 잘 조절되고 대조된 상해이기 때문에, 장기간에 걸친 형태학 및 물리학적인 효과로 약품이나 그 외 치료에 의해 이들의 초기 상태 후의 신진 대사 결핍과 가능한 이들의 완화와 상호 관련될 수 있다.

다음의 도면 및 설명으로부터 신경 크러시 모델의 글루타민산염 유도 독성 및 물리적 상해의 신경 세포에 대해 신경 보호가 부여된다.

신경 보호가 식 1의 약품을 시신경 세포의 손상 이전 또는 손상 이후이지만 세포사 이전의 기간 내에 포유 동물의 시신경 및/또는 망막에 투여하는 시신경 세포에 대해 세포 보호가 주어짐을 알았다.

식 1

여기에서, 2-이미다졸린-2-일라미노군은 키녹살린 핵의 5- 또는 6-위치에 있을 수 있으며, x, y, z는 나머지 5-, 6-, 7-, 또는 8-위치중 하나일 수 있으며, 수소, 할로겐, 하부 알킬, 하부 알콕시, 또는 트리플루오르메틸 중에서 선택될 수 있으며,; R은 키녹살린 핵의 2- 또는 3-위치중 하나의 선택적인 치환제이며 수소, 하부 알킬 또는 하부 알콕시 일 수 있다.

정의

AGN 191103으로 분류된 화합물은 다음과 같은 화학 구조를 갖는다.

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이것은 또한 화학 명명법에 의해 6-메틸-(2-이미다졸린-2-일미노) 키녹살린으로 알려져 있다.

MK-801로 분류되는 신경 보호제가 또한 이름 디조실핀 (dizocilpine)으로 알려져 있으며 다음의 화학구조를 갖는다.

9페이지 하부

이것은 또한 모노그래프 넘버 3392에서 메르크 인덱스의 11판에서 분류 및 설명되고 있다.

인간에의 복욕량 및 투여

본 발명의 목적은 사람을 포함하는 포유 동물을 치료하는 데에 유용하도록 하는 것이다.

본 발명에 따르면, 포유 동물은 일정 시주기 동안과 일정 시간에 유효량의 신경 보호제로 치료하여 시신경과 망막에의 유독성 유발 원인이 시경 세포를 죽이거나 영구적으로 손상을 가하지 않도록 하는 것이다. 보호제는 본 기술에서 알려진 어떤 다른 이송 수단에서 의해 또는 경구로 투여된다.

본 발명에 따르면, 유효량의 보호제가 신경 손상을 치료하거나 신경 세포사를 방지하도록 투여될 수 있다. 다르게는 보호제가 녹내장 치료제, 예를 들어, 베타-블럭커, 알파²아고니스트, 필로카핀 (pilocarpine)과 같은 무스카린제(muscarinic agent), 탄소 탈수효소 방지제(CAI), 또는 안 내 압력(IOP)를 평균 수준으로 유지하거나 상승된 IOP를 저하시키는데에 유용한 다른 약제와 함께 순차적으로, 또는 동시에 투여될 수 있다. 가장 효과적인 투여 방법 및 보호제의 복용량 양생법은 치료되는 질병의 형태, 심각성 및 이 질병의 경과, 이전의 치료, 환자의 건강 상태, 약에 대항 응답성 및 치료하는 의사의 판정에 따라 다르다. 일반적으로, 신경 보호제는 0.01nM 내지 50nM의 세럼 또는 인트라비트리얼 (intravitreal) 농도를 성취하는 복용량으로 투여되어야 한다. 신경 보호제는 신경에 손상을 가하기 전에 투여되는 것이 바람직하지만, 경감 효과를 위해 상해가 발생한 후에 투여될 수도 있다.

보호제, 예를 들어, MK-801의 종래의 투여 및 표준 복용량 양생법을 사용할 수 있다. 신경 보호제와 함께 약품, 예를 들어, IOP-저하 약품의 투여를 위한 최적의 복용량은 종래 기술에서 알려진 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 신경 보호제의 복용량은 약품이 함께 투여되는 약물의 복용량과 치료 양생법에 대한 환자의 반응에 기초하여 각 환자에게 조절될 수 있다. 보호제는 한 번에 또는 여러 번의 치료시에 환자에게 투여될 수 있다.

혈/뇌 장벽을 통과하지 않는 약품, 예를 들어, MK-801은 국부적으로, 예를 들어 연수내 주입에 의해 인트라비트리얼로 또는 인트라티컬로 (intrthecally) 투여될 수 있다. 혈/뇌 배리어를 통과할 수 있는 약품, 예를 들어 AGN191103은 계통적으로, 예를 들어, 구강으로, 또는 정맥내로 또는 주입에 의해 투여될 수 있다.

이들 치료시에 사용되는 화합물은 여러 가지 형태가 가능하다. 이들은 예를 들어, 태블릿, 필, 파우더, 솔루션, 또는 서스팬션과 같은 고형, 반고형, 및 액상 투여 형태를 포함한다. 또한 이 화합물은 본 기술을 잘 알고 있는 종래의 약제학적으로 수용 가능한 캐리어를 포함하는 것이 바람직하다.

다음의 비제한적인 예들은 1) 글루타민산염 유도 독성으로부터 신경 세포의 보호하는 방법과 2) 기계적 손상의 신경 크러시 모델의 신경 보호제로 부여되는 신경 보호 방법에 사용되는 것을 설명한다.

실시예 1

신경 세포에 대한 글루타민산염 유도 독성 자극 효과 모델에서의 신경 보호를 나타내는 실험 과정

저밀도의 쥐 히포캠펄 (hippocampal) 신경 배양을 고슬신과 뱅커의 과정으로 준비한다. 이들이 서로 붙지 않도록 하는 방법으로 자기 래크 (rack)에서 커버 글래스가 세정 및 살균된다(코헨 커버 글래스 스테이닝 래크, 토마스 사이언티픽). 커버 글래스(13mm)가 스테이닝 래크에 위치되고, 증류수로 린스되어(네번의 린스, 각각 1분간) 먼지를 제거하고 36시간 동안 HNO3로 전달된다. 커버 글래스는 증류수로 세정되고(3시간 동안 네 번의 교체) 건조열로 살균된다(224℃에서 밤새). 커버 글래스는 24개의 웰 디시 (well dish)로 전달되고, 웰 당 하나의 유리 덮개가 있다. 배양 동안 글리아 (glia) 위에 커버 글래스를 지지하기 위해서, 디시 위에 파라핀 도트를 놓고, UV 방사(30분)을 커버 글래스 도입 전에 인가한다. 폴리-L-리신 하이드로브로마이드(PLL)(Sigma)(MW 30,000-70,000) 1 mg/mL이 보레이트 버퍼(0.1M,pH8.5)에 용해되고, 필터되고, 살균되어 각 커버 글래스를 밤새 덮는데 사용된다. PLL이 제거되고, 커버 글래스가 증류수로 세정되고(두번 세척, 각각 2시간), 플레이팅 매체 [여분의 글루코스(600mg/L)과 10%의 호스 세럼을 함유하는 Earle의 솔트를 갖는 Earle의 MEM]이 추가되고 디시가 인큐베이터 내에 저장된다. 아스토로글리아를 함유하도록 하는 것을 제외하고는, 레빈슨과 맥 카티에 의해 설명된 방법과 유사한 방법으로 신생 쥐의 뇌로부터 마련한다. 글리얼 배양은 한 주에 두 번 플레이팅 매체가 공급되고 플레이팅 후 약 이주 동안 교회(confluence)에 이른 후에 사용된다. 사용 후 하루 뒤에, 프레이팅 매체가 제거되고, 신생 부양 매체(N2가 추가된 MEM)이 부가되고, 인큐베이션에 계속된다. 3×104 쥐 히포캠펄 신경(E18 엠브로이)이 플레이팅 매체로 유지되는 PLL-치료된 유리 덮개 위에 플레이트된다. 3-4시간 후에, 대부분의 신경이 부착되면, 신생측이 글리아에 면해 있도록 하여 커버 글래스가 배양 매체에 글리얼 세포를 함유하는 디시에 전달되고, 이 글리아는 신생 생존을 도와준다. 글리얼 증식을 감소시키기 위해서는, 키토신 아라비노사이드(1-b-아라비노프라노실키토신)(칼비오켐)(5×10M 최종 농도)가 플레이팅 2일 후에 배양에 부가되다. 배양 6일 째에 세포는 1mM 글루타민산염 또는 AGN-191103-0.1nM(MW=200) 또는 MK-801-10nM를 갖는 글루타민산염으로 치료된다(2-3 커버 글래스가 각 치료에 사용된다).

인큐베이션 24시간 후에, 세포는 트리판 블루 (trypan blue)로 오염된다. 산 신경과 죽은 신경은 임의로 선택된 배양 필드(각 커버 글래스로부터 5개의 필드)로 부터 카운트된다. 죽은 세포의 퍼센티지가 연산된다.

실시예 2

신경 크러시 상해 과정과 상해에 뒤이은 화합물 작용 포텐셜(CAP) 측정

파트 A.

신진 대사 측정

동물 이용은 검사시 동물을 사용할 때 ARVO 레졸루션에 따른 것이다. 메일 스프라그-돌리(SPD) 쥐의 중량 300-400g이 소듐 펜토바비톤으로 가정된다(인트라페리토니얼리, 35mg/kg). 카뉼레 (cannula)는 필요할 때 인공 호흡관 내에 도입된다. 동물의 머리가 헤드 홀더로 고정되어 있을 때, 측면 캔토토미 (canthotomy)가 두 눈 조작 현미경 아래에서 실행되고 결막이 각막에 축면으로 새겨진다. 후인근 안 근육의 분리 후에, 시신경이 분류되고 303.5mm의 길이가 해부에 의해 안구 근처에서 노출된다. 경막은 손상되지 않고 남아 있으며 신경을 손상을 주지 않도록 치료된다. 광 인도 홀더의 제1파트가 시신경 아래 삽입되고 신경은 광 인도관 내로 용이하게 도입된다. 다음에 제2파트는 광 가이드가 손상이 투약되는 위치로부터 1mm 떨여져 시신경 표면 상에 위치되어 있도록 고정되어 있다.

표면 플루오메트리-리플렉토미트리(fluorometry-reflectometry)

인트라미토콘드리아 NADH 레독스 상태의 검사가 366nm에서 NADH의 형광에 기초하여 행해지는데, 그 결과 450nm에서 피크 강도를 갖는 청광이 발산되고, 이것은 형광성을 갖지 않는 산화 형태, NAD+과 다르다. 366nm 여기원은 강한 366nm 필터(코닝 5860(7-37) 플러스 9782(4-96))가 장치된 100W 공기 냉각 수은 램프이다. 유연성 Y형 광 섬유 다발(광 가이드)이 시신경에 그리고 시신경으로부터 광을 전송하는 데에 사용되므로, 측정을 기술적으로 가능하게 한다. 여기 광은 여기 섬유 다발을 통해 신경으로 전송된다. 제2신경 다발을 통해 전송된 후에, 하나의 채널 직류 플루오르미터-리플렉토미터에 접속된 두 개의 포토멀티플라이어에 의하여 신경으로부터 방출된 광은 450nm에서 형광(90%)과 366nm에서 반사광(10%)의 측정에 대해 90:10의 비율로 분리된다. 동물들 사이의 다양성을 최소화하기 위해서, 표준 신호 조정 과정을 레코딩 시작시 적용한다. 실험 중에 형광 및 반사 신호의 변화가 조정 신호에 상대적으로 연산된다. 절대적인 것은 아니지만, 이 조정 형태가 각종 동물들로부터 다른 실험실 사이에서 신뢰할 만한 결과를 내는 것으로 알려져 있다.

반사광의 변화는 동맥 혈압과 신경 볼륨의 변경 뒤에 생기는 시신경의 헤모 다이나믹 효과 및 이동으로 야기된 조직 흡수의 변경과 상호 관련된다. 형광 측정은 형광으로부터 반사광(366nm)을 감하여 NADH 레독스 상태 측정으로 적당히 정정되어 이 정정된 형광 신호를 성취하는 것으로 판정되었다.

신진 대사 측정

여전히 마취 상태의 동물들은 상술된 외과 과정으로부터 30분간 회복되게 한 다음에 산소 결핍증과 수소 결핍증에 노출된다. 산소 결핍증은 2분간 100% 질소의 분위기에서 쥐가 숨쉬게 하여 성취되고, 그 후에 공기중으로 복구되다. 동물이 통상의 숨쉬기로 자동적으로 복귀되지 못할 때마다, 호흡관내로 두 번 불어 통기되게 한다. 수소 결핍증은 6-10분간 동물이 100% 산소를 숨쉬게 하여 유도된다. 시시경의 신진 대사 작용을 평가하기 위해서, 산소 결핍증과 수소 결핍증에 응답하여 반사광과 형광의 강도의 상대적 변경을 크러시 상해 이전과 이후에 측정한다.

신진 대사 측정을 위한 실험적 프로토콜

조정된 크로스-액션 포셉(forcep)를 이용하여, 잘 조정된 보통의 크러스 상해가 30초간 120g에 대응하는 압력에서 눈과 광 가이드 홀더 사이의 신경에 가해진다.

파트 B.

생리적 측정

화합물 활동 전위(CAP)를 기록하는 실험적 셋업:

전자 생리적 측정을 위한 시신경의 제거 이전에, 쥐는 70mg/kg의 펜토바르비톤으로 깊게 마취되다. 피부가 두 개골로부터 제거되고 시신경의 안구로부터 분리된다. 단두가 실행되고 두 개골이 골겸자로 개방된다. 대뇌가 측면에서 변위되어, 시신경의 두개골 내 부분을 노출시킨다. 키아즘 수준에서의 해부는 시경의 전체 길이의 제거를 가능하게 하며, 이것은 95% O2와 5% CO2로 채워진, NaCl(125mM), KCl(5mM), KH2PO4(1.2mM), NaHCO3(26mM), MgSO4(0.6mM), CaCl2(24mM), D-글루코스(11mM)으로 이루어지는 신선한 냉 크레브스(Krebs) 솔루션을 함유하는 바이탈에 전달된다. 신경은 이 솔루션에 유지되고, 여기에서 적어도 3-4시간 동안 전기 작용이 안정되게 유지되다. 1시간의 회복 후에, 신경은 37℃에서 크레브스 솔루션에 담겨진다. 전기 생리적 기록은 신경이 너무 작아 크러시의 양 측면에서 측정을 가능하게 하기 때문에, 크러시 상해에서 가장 먼 신경으로부터 성취된다. 신경 단부가 다음에 솔루션에 담겨진 두 개의 흡입 Ag-AgCl 전극에 접속된다. 자극 펄스가 근접 단부에서 전극을 통해 인가되고 활동 전위가 먼 전극에 의해 기록된다. Grass SD9 자극제가 전기 자극(2V, 50㎲)에 사용되다. 신호는 메델렉 PA63 사전 증폭기, 다음에 메델렉 MS7 일렉트로미오그래프 및 AA7T 증폭기에 전송된다. 솔루션, 자극자, 및 증폭기는 공통 접지를 갖는다. 8개의 평균 CAP의 최대 크기가 기록되어 플로라이드 카메라로 촬영된다. 좌 신경(손상되지 않음)이 보통의 신경의 기준치를 측정하여 크러시 포셉을 조정하는 데에 사용된다.

시각 자극 전위(VEP) 응답의 기록

손상된 약물 치료 쥐는 그 기능 회복의 평가를 위해 상해 2주후에 검사된다. 이 실험에서는, 광 자극에 응답하여 전위의 패턴이 일차 시각 피질로부터 기록되다. 광에 의해 자극된 전위는 망막에서 발생하여 생존한 축색 돌기를 따라 전파되어 최종 목표물, 시각 축색 돌기에 도달한다. 일차 및 이차 변성 과정에서 살아 남은 축색 돌기만이 활동 전위를 유도할 수 있다. 치료받은 동물과 치료 받지 않은 동물의 필드 전위 패턴의 비교 분석이 축색 돌기 생존에 대한 치료 효과를 밝히고 있다.

마취된 쥐(럼폰, 케틀라)는 작은 동물 스테로택식(sterotaxic) 기구에 놓는다. 두 개골의 노출 후, 두 구멍을 실린더형 드릴 비트로 뚫고, 경뇌막을 손상 없이 유지하여 피질 손상을 최소화한다. 코 뼈 위에 뚫은 한 구멍을 기준점으로 사용한다. 제2구멍은 좌표 브레그마 #8mm, 레터럴 #3mm의 영역OC1에 있는다. 나사에 접속된 골드 접촉 핀이 전극으로 사용되는데, 이 전극은 구멍 내에 나사식 접합되어 두 개골에 아크릴 세멘트로 접착되어 있다. 필드 전위는 분 당 평균 90 스위프로 스트로보스코프 스티뮬레이션으로 자극된다. 플래시 자극된 전위는 랩 뷰(Lab View) 데이터 인식 및 관리 시스템을 이용하여 분석된다. 필드 전위는 오프-라인 분석을 위해 디지트화되어 저장된다.

파트 C

신경 보호 특성을 위한 약품 테스트 효과 측정

제1세트의 실험이 신진 대사 측정을 포함한다. 각 약품은 몇 개의 다른 농도로 인트라페리토니얼로 주입된다. 각 약품은 8개의 동물 그룹이 8개의 대조 동물(버퍼 비이클로 치료되는 상해 동물들)과 함께 시험된다. 각 경우, 상해 전, 상해 후 반시간후, 그 후 4-6시간 동안 매 시간에 신진 대사 측정이 온-라인으로 성취된다. 성취된 데이터는 ANOVA로 분석된다.

장기간 효과 측정, 생리 작용

CAPS

상해 바로 후에, 시험되는 약품이 10개의 동물들에게 주입되고, 10개의 대조 동물이 비이클로 주입된다. 이주 후에 각 신경의 CAP는 흡입 전극을 이용하여 비트로 (vitro)에 기록된다. 대측이 내부 대조로서 사용된다. 이 결과는 시험된 약품이 스페어 축색 돌기의 치료시 및/또는 변성의 저하에 대한 어떤 잠재적인 효과를 갖고 있는지를 나타낸다. 좋은 결과가 각 약품의 최적의 복용량 결정을 이끌어낸다.

VEP 반응

두 살의 성별이 일치한 그룹에서 신생 SDP 쥐의 피질에 전극이 이식된다. 이식 바로 후에, VEP 반응이 좌측으로부터 기록되는 한편 광은 좌측 눈이 닫힌 상태에서 우측 눈에 플래시된다. 대조된 크러시 상해가 다음에 시신경에 가해지고 약품이 바로 이전에 결정된 최적의 복용량으로 투여된다. 대조 동물은 약품이 아닌 비이클이 투여되는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 취급된다. 각 동물의 VEP 반응이 수술 하루, 일주, 이주, 및 사주 후에 기록된다.

본 발명은 여러 가지 특정 실시예에 관련하여 기술되고 있지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고 오직 첨부한 청구범위의 영역의 해석에 의해 이해되어야 할 것이다.

도면을 먼저 간단히 설명한다.

Claims (19)

1. 유독 작용을 받거나 유독 작용을 받을 위험에 있는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포를 보호하는 방법에 있어서,

   식 I의 화합물의 유효량을 상기 포유 동물에 투여하여 신경 세포 상해나 세포사를 방지하는 것을 포함하고,

   18페이지

   여기에서, 2-이미다졸린-2-일미노 군은 키녹살린 핵의 5- 또는 6-위치중 하나에 있으며; x, y, 및 z는 나머지 5-, 6-, 7- 또는 8-위치 중 하나에 있으며, 수소, 할로겐, 하부 알칼, 하부 알콕시 또는 트리플루오르메틸로부터 선택되며, R은 키녹살린 핵의 2- 또는 3-위치 중 하나의 선택적 치환제이며 수소, 하부 알킬 또는 하부 알콕시, 또는 그 약제학적으로 수용 가능한 솔트 및 그 혼합물일 수 있는 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 유독 작용은 녹내장의 안 내 압력의 상승인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 유독 작용은 녹내장과 관련된 국소 빈혈인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 유독 작용은 당뇨 망막증인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 유독 작용은 비녹내장 국소 빈혈인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 유독성 작용은 특성이 세관 이상이며 결절성 다발 동맥염, 거대 세포 맥관염, 대동맥염 증후군, 전신계 홍반성 낭창으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질병의 징후인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 구강 투여가 포유 동물에게 화합물을 전신계적으로 공급하도록 사용되는 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 투여된 화합물량은 5-15mg/kg인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 눈의 연수 내 주입이 포유 동물에게 상기 화합물을 공급하는 데에 사용되는 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 비경구적 투여가 상기 화합물을 포유 동물에게 전신계적으로 공급하는 데에 사용되는 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 근육내 주입이 상기 화합물을 포유 동물에게 전신계적으로 공급하는 데에 사용되는 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 식 I의 화합물은 키녹살린 링의 6-위치에 2-이미다졸린-2-일라미노를 갖고, y와 z는 모두 할로겐으로 7-위치와 8-위치에 배치되고 x는 키녹살린 링의 5-위치에 있는 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 식 I의 화합물은

    인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 식 I의 화합물은

    인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 식 I의 화합물은

    이고, x는 청구항 1에서 정의된 것과 같고 유독 작용이 안 내 압력 상승인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 식 I의 화합물은

    이고, x는 청구항 1에서 정의된 것과 같고 유독 작용이 녹내장과 관련된 국소 빈혈인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 식 I의 화합물은

    이고, x는 청구항 1에서 정의된 것과 같고 유독 작용이 녹내장과 관련된 국소 빈혈인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 식 I의 화합물은

    이고, x는 청구항 1에서 정의된 것과 같고 유독 작용이 비녹내장성 국소 빈혈인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 식 I의 화합물은

    이고, x는 청구항 2에서 정의된 것과 같고 유독 작용은 특성이 세관 이상이며 결절성 다발 동맥염, 거대 세포 맥관염, 대동맥염 증후군, 전신계 홍반성 낭창으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질병의 징후인 것을 특징으로 하는 포유 동물의 망막 또는 시신경 세포 보호 방법.