KR19990022541A - 트롬보포이에틴의 정제방법 - Google Patents
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Abstract
트롬보포이에틴으로 이루어진 용액으로부터 단백질 불순물의 제거방법이 개시된다. 용액을 수산화인회석에 노출시켜 단백질 불순물을 수산화인회석에 결합시키고 트롬보포이에틴은 실질적으로 결합되지 않은채로 남겨두고, 결합되지 않은 트롬보포이에틴을 회수한다. 수산화인회석의 사용은 이온-교환 크로마토그래피, 리간드 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 한외여과, 및 분별침전을 포함하여 다른 정제 및 농축기법과 유리하게 조합된다.
Description
조혈은 혈액세포가 골수의 다능성 간세포로부터 발달 및 분화하는 과정이다. 이 과정은 표적세포의 막-결합된 리셉터를 통해 작용하는 폴리펩티드 성장인자(시토킨)의 복잡한 상호작용을 포함한다. 시토킨 작용은 종종 계통-특이적 및/또는 단계-특이적인 특별한 시토킨에 대한 반응으로 세포증식 및 분화를 일으킨다. 간세포로부터 혈소판같은 단일세포형태의 발달은 적당한 순서로 작용하는 다수의 시토킨의 조화된 작용을 요구할 것이다.
공지된 시토킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-8등 같은 인터루킨; 및 G-CSF, M-CSF, GM-CSF, 에리스로포이에틴(EPO) 같은 콜로니 자극인자등을 포함한다. 일반적으로, 인터루킨은 면역 및 염증반응의 매개체로서 작용한다. 콜로니 자극인자는 골수유래세포의 증식을 자극, 성숙 백혈구를 활성화 및 다르게는 염증성, 감염성, 및 면역성 도전에 대한 숙주반응의 필수적 부분을 형성한다.
다양한 시토킨이 치료제로서 발달하여 왔다. 예를들어, 적혈구의 발달을 자극하는 에리스로포이에틴은 신장 결함으로부터 발생하는 빈혈치료에 사용된다. 콜로니 자극 인자중 몇몇은 환자의 면역 시스템의 회복을 빠르게 하기 위해 암 화학요법과 함께 사용되었다. 인터루킨-2, α-인터페론 및 γ-인터페론은 어떤 암의 치료에 사용된다.
거핵구형성 및 전구형성을 자극하는 활성이 혈소판감소증 동물의 체액에서 동정되었으며 문헌에서 트롬보포이에틴으로 언급되었다(최근에 McDonald, Exp. Hematol. 16: 201-205, 1988 및 McDonald, Am. J. Ped. Hematol. Oncol. 14: 8-21, 1992에서 재검토됨). 최근에, 몇몇 그룹이 세포 mpl 리셉터에 결합하며 거핵구형성 및 전구형성을 자극하는 능력을 기초로 하여 트롬보포이에틴(TPO)을 분리 및/또는 클로닝하였다. De Sauvage et al., Nature 369: 533-538, 1994; Lok et al., Nature 369: 565-568, 1994; Kaushansky et al., Nature 369: 568-571, 1994; Wendling et al., Nature 369: 571-574, 1994; 및 Bartley et al., Cell 77: 1117-1124, 1994 참조.
사람 및 마우스 TPO cDNA의 일차 번역산물의 아미노산서열이 각각 서열 1 및 서열 2에 제시되어 있다. 분석적 및 실험적 증거가 성숙 단백질이 잔기 Ser-22(사람) 및 Ser-45(마우스)에서 시작됨을 나타낸다. TPO는 단백질분해를 일으키기 쉬우며 이질성 또는 분해된 형태로 분리되었다(de Sauvage et al., Nature 369; 533- 538, 1994; Bartley et al., Cell 77: 1117-1124, 1994). 25kD만큼 작은 분자종류가 시험관내에서 활성적인 것으로 발견되었으며(Bartley et al., ibid), 완전한 길이의 사람 cDNA(Bartley et al, ibid)의 발현산물이 가지고 있는 바와 같이, 153(de Sauvage et al., ibid) 및 174 아미노산(Bartley et al., ibid)의 재조합 사람 TPO 아미노말단 폴리펩티드가 시험관내에서 활성적인 것으로 보고되었다.
과학 문헌으로 보고된 트롬보포이에틴의 제조는 단백질분해 산물중 적어도 일부는 생물학적으로 활성적이라 하더라도 조성 및 다양한 분자종류의 비교활성에 대해 잘 특징화되어 있지 않다. 그러나, 트롬보포이에틴의 대규모 생산이 지금까지 거의 이루어지지 않았으며 대량 및 비용-효율적 방식으로 단백질을 제조하는 방법에 대한 본 분야에서의 요구가 여전히 남아 있다. 특별히, 생물학적 유체로부터 트롬보포이에틴을 정제하는 방법 및 약학적 제조에서 사용하기에 적당한 형태로 제조하기 위한 요구가 있다. 또한 TPO의 절편 및 응집체를 포함하여 불순단백질이 없는 트롬보포이에틴을 제조하는 방법에 대한 요구가 있다. 본 발명은 다른 관련된 이점뿐만 아니라 이러한 방법을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 트롬보포이에틴 및 트롬보포이에틴 응집체를 포함하여 단백질 불순물로 이루어진 용액으로부터 단백질 불순물을 제거하는 방법을 제공하고 있다. 이들 방법은 용액을 수산화인회석에 노출시켜 단백질 불순물을 수산화인회석에 결합시키고 트롬보포이에틴은 실질적으로 결합되지 않은채로 남아 있게 하고 결합되지 않은 트롬보포이에틴을 회수하는 것으로 이루어진다. 본 발명의 한 구체예 안에서, TPO-함유 용액은 이온-교환 크로마토그래피, 리간드 친화성 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 TPO-함유 액체 조성물을 분별함으로써 제조된다. 다른 구체예 안에서, 회수된 트롬보포이에틴은 양이온-교환 크로마토그래피 또는 한외여과에 의해 농축된다.
관련된 양태안에서, 본 발명은 생물학적 유체로부터 트롬보포이에틴(TPO)을 분리하는 방법을 제공한다. 이 방법들은 (a) 리간드 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 한외여과로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 TPO-함유 생물학적 유체의 부피를 감소시켜 농축된 분획을 제공하는 단계; (b) 농축된 분획에서 염 농도를 조정하여 조정된 용액을 제공하는 단계; (c) 조정된 용액을 산성화하여 불순단백질을 침전시키고 청정해진 용액을 제공하는 단계; (d) 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 청정해진 용액을 분별하여 TPO-풍부한 분획을 제공하는 단계; (e) TPO-풍부한 분획을 수산화인회석에 노출시켜 단백질 불순물을 수산화인회석에 결합시키고 TPO는 실질적으로 결합되지 않는 채로 남겨두는 단계; (f) 결합되지 않은 TPO를 회수하는 단계; 및 (g) 양이온-교환 크로마토그래피 또는 한외여과에 의해 회수된 TPO를 농축시키는 단계로 이루어진다. 한 구체예 내에서 생물학적 유체는 세포-조건화된 배양배지 또는 그것의 분획이다. 다른 구체예내에서 TPO는 사람 TPO이다. 더욱 다른 구체예 내에서 환원단계는 유도화된, 교차결합된 아가로스 비드의 매트릭스상에서 직접적 포착에 의한 것같이 염료-리간드 친화성 크로마토그래피에 의한 직접적 포착으로 이루어진다. 심화된 구체예 내에서 조정단계는 한외여과로 이루어진다. 다른 구체예내에서 농축 단계는 양이온-교환 크로마토그래피 또는 음이온-교환 크로마토그래피로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 구체예내에서 수산화인회석으로부터 회수된 TPO는 변성조건하에서 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 결정하였을 때 70,000±10,000 달톤의 분자량을 가지고 있으며 저 분자량(≤55 kD) 단백질 불순물 및 고분자량 응집체에 대해 실질적으로 자유롭다.
본 발명의 이들 및 다른 양태는 다음 상세한 설명을 참고로 하여 명백해 질 것이다.
본 발명을 상세히 설명하기 전에 여기에 사용되는 일반적 용어들을 정의하는 것이 이해하는데 도움이 될 것이다.
생물학적 유체는 세포, 세포성분 또는 세포 생성물을 함유하거나 또는 이로부터 유래된 어떤 유체를 나타낸다. 생물학적 유체는 세포배양 상층액, 세포 용출물, 깨끗해진 세포용출물, 세포추출물, 조직추출물, 혈액, 혈장, 혈청, 우유 및 이것의 분획을 포함하나 여기에 제한되지 않는다.
세포-조건화된 배양배지는 세포가 배양되며 세포 생성물을 함유하는 영양배지를 의미한다.
본 발명은 세포-조건화된 배양배지를 포함하여 생물학적 유체로부터 TPO를 정제하는 방법을 제공한다. 이 방법들은 단백질 분해생성물 및 고분자량 TPO 응집체를 포함하여 단백질 불순물에 대해 실질적으로 자유로운 TPO의 균질한 제조를 제공하는 점에서 특히 이롭다.
본 발명의 방법은 사람 및 비-사람 (예를들어, 쥐과, 개과, 돼지, 소 및 양) 트롬보포이에틴의 제조에 유용하다. 이 방법들은 세포-조건화된 배양배지 또는 그것의 분획(즉, 다른 분리기술에 의해 TPO에 대해 미리 풍부하게 한 세포-조건화된 배양배지의 분획)으로부터 TPO의 정제에 특히 매우 적합하다. 따라서 일반적으로 본 분야에 공지된 방법에 따라 유전학적으로 조작된, 배양된 세포에서 이 트롬보포이에틴을 제조하는 것이 바람직하다. 이 방법들을 요약하면, TPO를 암호하는 DNA 분자는 숙주세포에서 이것의 유지 및 전사를 제공하는 다른 DNA 서열에 결합된다. 결과적인 발현벡터는 숙주세포로 삽입되고 결과적인 형질전환된 세포는 적당한 영양배지에서 배양된다. 비록 TPO를 세포용출물로부터 회수하고 시험관내에서 처리하여 활성 단백질을 얻을 수 있다 하더라도 세포를 조작하여 배지로 TPO를 분비시키는 것이 바람직하다. 일반적으로, de Sauvage et al., Nature 369: 533-538, 1994; Lok et al., Nature 369: 565-568, 1994; Kaushansky et al., Nature 369: 568-571, 1994; Wendling et al., Nature 369: 571-574, 1994; Bartley et al., Cell 77: 1117-1124, 1994; 및 계류중, 공동 양도된 U.S. 특허 출원 일련번호 08/366,859 및 일련번호 08/347,029 참조. 모두 참고문헌으로 여기에 통합되어 있다.
또한 TPO는 트렌스제닉 동물에 의해 제조될 수 있다. 트렌스제닉 동물을 사용할 때 이들의 우유로 이질성 단백질을 생성하는 것이 특히 유리하다. 따라서 소, 양 및 염소 같은 낙농동물이 바람직한 숙주이다. 예를들어, WIPO 공보 WO 88/ 00239, WO 90/05188, WO 91/02318, 및 WO 92/11757; 및 U.S. 특허 번호 4,873,191; 4,873,316; 및 5,304,489 참조. 모두 참고문헌으로 여기에 통합되어 있다.
본 발명은 트롬보포이에틴 및 단백질 불순물의 용액이 이 용액을 수산화인화석에 노출시킴으로써 효과적으로 분별될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초하고 있다. TPO의 고분자량 응집체를 포함하여 단백질 불순물은 우선적으로 수산화인회석에 결합하지만, 완전한 생물학적으로 활성적인 트롬보포이에틴은 실질적으로 결합되지 않은 채로 남아 있다. 수산화인회석의 사용은 이온교환 크로마토그래피, 리간드 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 한외여과 및 분별침전을 포함하여 다른 침전 및 농축기법과 유리하게 조합된다.
복잡한, 트롬보포이에틴-함유용액(예를들면, 세포-조건화된 배양배지)을 수산화인회석에 노출시키기 전에 농축 및/또는 분별시키는 것이 바람직하다. 농축은 리간드 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 한외여과, 또는 이런 기술의 조합에 의한 직접적 포착을 사용하여 부피감소 같은 그러한 기술에 의해 달성될 수 있다. 음이온-교환 크로마토그래피는 이 용액을 수산화인회석에 노출시키기 전에 분별(풍부하게 함)하기 위한 바람직한 방법이다.
본 발명의 바람직한 구체예내에서 TPO는 우선 리간드 친화성 크래마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 한외여과에 의해 유체 샘플의 부피를 감소시키는 일련의 단계로 TPO 및 단백질 불순물을 함유한 생물학적 유체로부터 정제되어 출발물질과 비교했을 때 감소된 부피를 가지는 농축된 분획을 제공한다. 그후 농축된 분획에서 염 농도를 조정하여 조정된 용액을 제공한다. 염농도를 조정하는 방법은 다이아필트레이션, 희석, 투석 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한다. 그후 조정된 용액은 산성화하여 불순 단백질을 차별적으로 침전시키고 이것을 여과 또는 다른 수단에 의해 용액으로부터 제거시킨다. 결과의 깨끗해진 용액을 그후 음이온교환 크로마토그래피로 분별하여 TPO-풍부한 분액을 제공한다. 선택적으로, pH는 음이온교환 크로마토그래피전에 pH 5-9, 바람직하게는 약 pH 7-8로 조정될 수 있다. TPO-풍부한 분획은 그후 수산화인회석과 조합함으로써 단백질 불순물은 수산화인회석에 결합되고 TPO는 실질적으로 결합되지 않은 채로 남게 된다. 결합되지 않은 TPO는 그후 양이온교환 크로마토그래피 또는 한외여과에 의한 것같이 수집되고 농축된다. 당 업자는 일상적 실험에서 이들 단계 순서가 변할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 완충 조성물, 이온강도, 및 pH는 특정기법 및 분별배지의 선택, 및 단계순서에 의해 필요할 때마다 조정될 것이다.
세포, 세포잔해 등을 함유하는 생물학적 유체로 작업할 때 먼저 유체를 여과하여 이런 특별한 불순물을 제거하는 것이 바람직하다.
상기 언급한 바와 같이, 부피 감소 단계는 리간드 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 한외여과를 사용할 수 있다. 리간드 친화성 크로마토그래피에 의한 직접 포착을 사용한 부피 감소가 바람직하며, 염료-리간드 친화성 배지의 사용이 특히 바람직하다. 적당한 염료-리간드 친화성 배지로는 MIMETIC RedTM2 A6XL, MIMETIC RedTM3 A6XL, MIMETIC BlueTM1 A6XL, MIMETIC BlueTM2 A6XL, MIMETIC OrangeTM1 A6XL, MIMETIC OraugeTM2 A6XL, MIMETIC OrangeTM3 A6XL, MIMETIC YellowTM1 A6XL, MIMETIC YellowTM2 A6XL 및 MIMETIC GreenTM1 A6XL(Affinity Chromatography Ltd., Freeport, Great Britain)을 포함한다. 이들 배지는 6% 교차-결합된 아가로스 비드, 45-164㎛이며, 여기에 염료 리간드가 공극팔을 통해 연결되어 있다. 1.0ml 수지/300ml 샘플 부피의 칼럼 크기를 가진 MIMETIC GreenTM1 A6XL을 사용하는 것이 특히 바람직하다. TPO는 이들 배지를 적용하기 전에 생물학적 유체의 pH 및 이온강도를 조정할 필요가 제거되는 생리학적 조건(다소 알칼리성 pH 및150 mM의 염농도)하에서 MIMETIC GreenTM1 A6XL, MIMETIC BlueTM1 A6XL, MIMETIC BlueTM2 A6XL, 및 MIMETIC RedTM3 A6XL에 결합한다. 결합된 TPO는 증가된 염농도, 증가된 pH, 변성제, 또는 이들의 조합을 사용하여 용리될 수 있다. 예를들어, MIMETIC GreenTM1 A6XL에 결합된 TPO는 1% NH4OH 또는 4M 구아니딘 중의 3M NaCl로 용리될 수 있다. 다른 적당한 염료-리간드 친화성 배지로는 Blue SepharoseR(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)등을 포함한다. 박테리아 오염 가능성을 최소화하기 위해 차게(4-10℃) 이 단계를 수행하는 것이 바람직하다. 염료-리간드 친화성 배지의 결합 특이성 및 TPO에 적당한 용리조건을 결정하는 방법이 본 분야에 공지되어 있으며 시중구입 가능한 분석 키트(예를들어, Affinity Chromatography Ltd.로부터 구입가능한 PIKSITM시험 키트)의 사용을 포함한다. 예를들어, Kroviarski et al, J. Chromatography 449: 403-412, 1988 및 Miribel et al., J. Biochem, Biophys. Methods 16: 1-16, 1988 참조.
TPO-함유 생물학적 유체의 부피를 감소시키기 위한 대안적 방법이 또한 사용될 수 있다. 부피 감소는 유체의 pH 및 전도도의 적당한 조정후에 음이온 또는 양이온-교환 배지상에서 TPO를 포착함으로써 달성될 수 있다. TPO를 포착후에 염 또는 pH 구배로 용리될 수 있다. 두 번째 대안적 방법에서는 TPO는 유체의 염농도의 적당한 조정후에 소수성 상호작용 크로마토그라피(HIC)에 의해 포착될 수 있다. TPO는 낮음 이온강도 완충액과 함께 HIC 칼럼으로부터 용리될 수 있다. 또한 한외여과가 부피를 감소시키기 위해서 사용될 수 있다. 이들 방법의 다양한 조합이 또한 사용될 수 있다.
농축된 분획의 염농도는 그후 후속적 분별을 위해 필요할때마다 조정된다. 예를들어, 음이온-교환 크로마토그래피에 의한 분별은 전형적으로 허용할 수 없는 손실을 피하기 위해서 약 3-6 mS/cm로 전도도의 조정을 요구할 것이다. 바람직한 조정방법은 다이아필트레이션에 의한 완충액 교환이다. 염농도를 조정하는 다른 방법은 원하는 전도도로 희석 및 pH 조정, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔여과, 및 역상 크로마토그래피를 포함한다. 바람직한 HIC 배지로는 Phenyl SepharoseR(Pharmacia Biotech), Butyl SepharoseR(Pharmacia Biotech), 및 FractogelREMD Propyl 650(S) 및 FractogelREMD Phenyl 1 650(S), 20-40㎛(EM Science, Gibbstown, NJ)를 포함한다. HIC의 사용은 일반적으로 우선 염의 첨가로 풍부한 분획의 전도도를 증가시키는 것을 필요로 할 것이다. 그후 TPO는 낮은 이온강도 완충액을 사용하여 HIC 배지로부터 용리된다. 필요하다면, 용리액의 이온강도는 추가적 분별전에 더 조정된다. 바람직한 겔 여과 배지로는 SephacrylRS-200 HR 또는 S-300 HR(Pharmacia Biotech) 및 SuperdexR(Pharmacia Biotech)같은 아가로스, 폴리아크릴아미드 또는 다른 중합체의 교차-결합된 비드를 포함한다. 바람직한 역상배지로는 다공성 수지 Oligo R2 및 Oligo R3(PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA)를 포함한다.
불순 단백질은 마일드 산 침전 및 여과에 의해 결과적인 조정된 용액으로부터 제거될 수 있다. 조정단계에서 다이아필트레이션을 사용할 때 산성교환 완충액(예를들어, 25mM 아세트산나트륨 완충액, pH 5.0)을 사용하여 염농도의 조정 및 불순물의 차별침전을 조합하는 것이 편리하다.
음이온-교환 크로마토그래피는 일반적으로 3차 또는 4차 아민기로 유도화된 불용성, 특별한 지지체로 이루어지는 배지를 사용하여 수행된다. 이것과 관련하여 적당한 지지체로는 아가로스 비드, 덱스트란 비드, 폴리스티렌 비드 등을 포함한다. 트리메틸아미노에틸기로 유도화된 지지체가 바람직하다. 적당한 음이온-교환 배지로는 Macro-PrepRQ(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), Q-HyperDTM(BioSepra, Inc., Marlborough, MA), Q SepharoseR(Pharmacia)등을 포함한다. 특히 바람직한 음이온-교환제는 FractogelREMD TMAE-650(S)(EM Science, Gibbstown, NJ)이다. 음이온-교환 크로마토그래피는 전형적으로 트리스 또는 인산 완충액에서 pH 5-9, 바람직하게 6.5-8.0 및 온도 약 18-25℃, 바람직하게 약 20℃(실온)에서 수행된다. 바람직한 칼럼크기는 20-30mg 총단백질당 1.0ml 수지이다.
그후 음이온-교환 칼럼으로부터의 용리액은 수산화인회석에 노출시켜 단백질 불순물은 수산화인회석에 결합되고 TPO는 실질적으로 결합되지 않은채로 남게 된다. 바람직한 방법내에서, 수산화인회석은 샘플의 총 단백질의 4.0-8.0mg당 1.0 ml 수지를 사용하여 칼럼의 형태로 제조된다. 칼럼은 pH 5.5-7.5의 10 mM 인산나트륨완충액 같은 중성 pH에 가까운 다소 산성의 낮은 이온강도 완충액으로 평형화된다. 음이온-교환 단계로부터의 용리 분획의 전도도는 약 10-30 mS/cm, 바람직하게는 약 11 mS/cm로 조정되고, 용액은 실온에서 칼럼에 적용되고 TPO를 함유하는 병류 분획은 수집된다.
그후 결합되지 않은 TPO를 함유하는 병류 분획은 농축된다. 적당한 농축 방법은 양이온-교환 크로마토그래피 및 한외여과를 포함한다. 양이온-교환 크로마토그래피는 일반적으로 술포프로필 또는 카르복시메틸기로 유도화된 불용성, 특별한 지지체로 이루어지는 배지를 사용하여 수행된다. 이점에 있어서 적당한 지지체로는 구슬화된, 교차-결합된 아가로스, 아크릴아미드, 메타크릴레이트 등을 포함한다. 술포프로필기로 유도화된 지지체가 바람직하다. 이 형태의 시중구입 가능한 양이온-교환 배지로는 S-HyperDTM(BioSepra), TSK-GelRS(TosoHaas, Montgomeryville , PA), SP SepharoseR(Pharmacia Biotech)등을 포함한다. 특히 바람직한 술포프로필-유도화된 배지는 FractogelREMD SO3 --650(S)(EM Science)이다. 전형적 방법에서, 산성 pH(예를들어, 4.0-5.0) 및 저이온강도(예를들어, 3-6 mS/cm)를 가지는 TPO-함유 용액이 실온에서 1.0ml수지/3.0-6.0mg 총단백질(A280에 의한)을 사용하여 FractogelREMD SO3 --650(S)의 칼럼에 적용된다. 칼럼은 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고 TPO를 고 이온강도 완충액(예를들어, pH6-9의 0.1-0.5 M NaCl)으로 용리한다. 바람직한 용리 완충액은 0.28M NaCl을 함유한 pH 9, 40 mM Na 포스페이트 완충액이다.
상기 기재된 방법 및 다음 실험 실시예가 칼럼 크로마토그래피를 이용하고 있다 하더라도, 당업자는 배치공정이 또한 이용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본 발명에 따라 제조된 트롬보포이에틴은 무형성빈혈, 척수이형성 증후군, 화학요법 또는 선천성 혈구감소증에 의해 유도되는 것같은 혈구감소증의 치료에서와 같이 골수의 세포증식을 증가시키기 위해 원하는 곳에서 치료적으로 사용될 수 있다. TPO는 특히 혈소판감소증의 치료에서와 같이 혈소판 생성을 증가시키는데 유용하다. 혈소판감소증은 이 상태를 생성하기 위해서 단독 또는 함께 작용하는 다양한 그룹의 질환 및 임상적 상황과 관련되어 있다. 낮아지는 혈소판 수는 예를들어, 혈소판 생성에서의 결함, 비정상적 혈소판 분포, 대량 수혈로 인한 희석적 손실, 또는 비정상적 혈소판 파괴로부터의 결과일 수 있다. 예를들어, 암 치료에서 사용되는 화학치료제는 골수의 혈소판 전구세포의 발달을 억제하고, 결과적인 혈소판감소증은 화학치료를 제한하고 수혈을 필요로 할 것이다. 게다가, 어떤 악성은 혈소판 생성 및 혈소판 분포를 손상시킬 수 있다. 악성 세포를 죽이기 위해서 사용되는 방사선요법은 또한 혈소판 전구세포를 죽인다. 혈소판감소증은 또한 약제, 신생아 동종면역성 또는 혈소판 수혈 동종면역성에 의해 유도되는 다양한 혈소판 자가면역 장애로부터 발생할 수 있다. TPO는 수혈의 필요를 감소 또는 제거하여 혈소판 동종면역성의 발생을 감소시킬수 있다. 혈소판의 비정상적 파괴는 (1) 혈관 그래프트 또는 상처난 조직에서 증가된 혈소판 소모; 또는 (2) 예를들어, 약제-유도 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증 자반병(ITP), 자가면역질환, 백혈병 및 골수와 관련된 임파종 또는 전이암 같은 조혈장애와 관련된 면역기작으로부터 초래될 수 있다. TPO에 대한 다른 징후들은 예를들어 AZT로 HIV 감염의 화학요법 또는 치료로부터의 결과적인 무형성빈혈 및 약제-유도 골수억제를 포함한다.
혈소판감소증은 상처, 궤양 또는 주사부위로부터의 삼출뿐만아니라 비강면 또는 위장관으로부터 점막출혈같은 증가된 출혈로서 명백하다.
약학적 사용을 위해, TPO는 종래방법에 따라 비경구적, 특히 정맥내 도는 피하내 배급으로 조제된다. 정맥내 투여는 한시간 내지 수시간의 전형적 기간에 걸쳐 거환 주사 또는 주입에 의할 것이다. 일반적으로, 약학적 조제는 염수, 완충된 염수, 물중의 5% 덱스트로스등 같은 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합한 TPO를 포함할 것이다. 조제는 하나 이상의 부형제, 방부제, 용매제, 완충제, 바이알 표면상에서 단백질 손실을 예방하기 위한 알부민 등을 더 포함할 수 있다. 게다가, TPO는 다른 시토킨, 특히 간세포인자, IL-3, IL-6, IL-11 또는 GM-CSF 같은 초기작용 시토킨과 조합될 수 있다. 이러한 조합치료를 이용할 때, 시토킨은 단일 조제물로 조합될 수 있거나 또는 분리된 조제물로 투여될 수 있다. 조제방법은 본 분야에 잘 공지되어 있으며 예를들어 Remington's Pharmaceutical Science, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990에 개시되어 있으며 여기 참고문헌으로 통합되어 있다. 치료적 투여량은 일반적으로 치료되는 조건의 상태 및 심각성, 환자형질 등을 고려하여 허용되는 표준에 따라 임상의에 의해 결정된 정확한 투여량으로 일당 환자체중의 0.1 내지 100㎍/㎏, 바람직하게는 일당 0.5-20㎍/㎏범위일 것이다. 투여량의 결정은 본 분야에서 일반적인 기술수준내에 있다. TPO는 보통 화학요법 또는 골수이식후에 28일까지의 기간에 걸쳐 투여되거나 또는 혈소판수가 20,000/mm3, 바람직하게는 50,000/mm3에 도달할때까지 투여될 것이다. 더욱 보통적으로, TPO는 일주일이하, 종종 1일 내지 3일에 걸쳐 투여될 것이다. 일반적으로, TPO의 치료적 유효량은 림프구 또는 골수전구세포의 증식 및/또는 분화에서 임상학적으로 중요한 증가를 생성하기에 충분한 양이며, 이것은 성숙세포(예를들어, 혈소판 또는 중성구)의 순환수치에서의 증가로서 명백해질 것이다. 따라서 혈소판 장애의 치료는 혈소판수가 적어도 20,000/mm3, 바람직하게는 50,000/mm3에 도달될때까지 계속될 것이다. TPO는 또한 IL-3, -6 및 -11; 간세포인자; 에리스로포이에틴(EPO); G-CSF 및 GM-CSF 같은 다른 시토킨과 조합하여 투여될 수 있다. 조합치료의 계획내에서, 다른 시토킨의 일일 투여량은 일반적으로 EPO, ≤ 150 U/kg; GM-CSF, 5-15㎍/㎏; IL-3, 1-5㎍/㎏; 및 G-CSF, 1-25㎍/㎏일 것이다. 예를들어 EPO와 조합치료는 낮은 EPO 수치를 갖는 빈혈 환자에서 지시된다.
TPO는 또한 세포분화의 기작을 밝히기 위해 그리고 성숙세포의 계통을 결정하기 위한 것같이 조혈세포의 분화 및 발달의 시험관내 연구에 유용한 도구이며, 또한 세포배양에서 증식제로서의 유용성을 발견할 수 있다.
또한 TPO는 자가이식성 골수배양에서와 같이 생체외에서 사용될 수 있다. 간단하게, 골수를 화학치료전에 환자로부터 제거하고 선택적으로 하나이상의 다른 시토킨과 조합하여 TPO로 처리한다. 처리된 골수는 그후 골수의 회복을 빠르게 하기 위해 화학치료후에 환자에게 되돌려진다. 게다가, TPO는 골수 또는 말초혈액 전구세포(PBPC)의 생체외 팽창을 위해 사용될 수 있다. 화학치료전에, 골수는 초기 전구세포를 말초 순환계로 방출하기 위해 간세포인자(SCF) 또는 G-CSF로 자극될 수 있다. 이런 전구세포를 말초혈액으로부터 수집하고 농축한 후 선택적으로 SCF, G-CSF, IL-3, GM-CSF, IL-6 또는 IL-11를 포함하나 여기에 제한되지 않는 하나 이상의 다른 시토킨과 조합한 TPO를 배양중에 처리하여 고밀도 거핵세포배양으로 분화 및 증식시킨후 고-투여량 화학치료후에 환자에게 되돌려질 수 있다.
본 발명은 다음 비-제한적인 실시예에 의해 더 예시된다.
실시예 1
MIMETIC GreenTM1 A6XL (Affinity Chromatography Ltd., Freeport, Great Britain)(9cm의 직경×12cm의 높이)의 칼럼을 제조하였다. 칼럼 조작을 4℃에서 수행하였다. 칼럼을 1cm/분의 유속으로 인산 완충된 염수(PBS; 120mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM 포스페이트, pH 7.2)의 5컬럼 부피를 사용하여 평형화하였다.
사람 TPO 발현벡터로 감염되고 TPO를 함유하는 베이비 햄스터 신장세포에 의해 조건화된 세포배양배지 200리터를 0.22㎛ 아세트산 셀룰로오스 또는 풀리수폰 막 필터를 통해 여과하였다. 여과된 배지를 1cm/분 속도로 칼럼으로 로딩하였다.컬럼을 PBS의 5컬럼 부피로 세척하거나 또는 흡광도(280nm)가 기준선에 도달할때까지 세척하였다. 결합된 단백질을 1% 수산화암모늄, 3M NaCl의 용액을 사용하여 칼럼으로부터 용리하였다. 칼럼 용리액의 단백질 함량을 흡광도 280nm에서 측정하였다. 피크 분획을 수집하였다. 단백질 피크는 전형적으로 약 2컬럼 부피로 용리하였다.
용리피크를 15분간 4℃에서 유지한 후 pH를 50% 아세트산으로 5.0으로 조정하였다. 유백색 침전물이 형성되었고, 이것을 용리액중에 -80℃에 저장하였다.
칼럼을 3컬럼 부피의 1.0M NaOH를 사용하여 청정하게 하였다. NaOH를 2시간동안 수지상에 남겨둔후 수지를 5부피의 물로 세척하고 20% 에탄올중에 저장하였다.
700리터의 조건화된 배지(출발부피)를 MIMETIC GreenTM칼럼을 통해 네 개의 배치로 처리한 후, 용리된 물질을 푸울하였다. 이 푸울은 대략 총 단백질의 6그람을 함유하였다.
MIMETIC GreenTM칼럼(약 2리터 부피)으로부터의 용리액/침전물을 실온에서 하룻밤 녹인후 155cm2, 3㎛ 폴리우레탄 막 캡슐필터(# 12116 주름직 캡슐, Gelman Science, Ann Arcor, MI)를 통해 여과하여 어떤 침전물을 제거하였다. 여과가 종료되었을 때, 캡슐을 pH 5.0, 25mM 아세트산나트륨 300ml로 세척하였다.
청정한 여과액의 염 농도를 AG/Technology (Needham, MA)로부터의 다이아필트레이션 공동 섬유막(30,000 분자량 차단) 및 하우징 크기 6 (0.28m2면적; AG/ Technology로부터 #UFP-30-E-6A)을 사용하여 한외여과에 의해 조정하였다. 교환 완충액은 25mM Na 아세테이트, pH 5.0이었다. 여과액 유속은 20psi에서 약 60ml/분이었다. 물질은 약 3부피의 다이아필트레이션후에 흐려졌다. 약 7부피후에, 전도도는 약 4 mS/cm에 달했다. pH는 5.0이었고 물질은 혼탁한 형상의 유백색을 가지고 있었다. 이 물질을 4℃에서 하룻밤 저장하였다.
다이아필트레이션 유닛을 물로 플러싱하고 한시간동안 이 시스템을 통해 0.5M NaOH를 순환시키고 물로 다시 플러싱함으로써 청정하게 하였다. 이 시스템을 20% 에탄올 또는 0.1M NaOH에 저장하였다.
다이아필트레이션된 물질을 1M Tris, pH 8.0으로 20mM Tris에로 조정하였고 그 결과 용액의 pH를 2M NaOH로 8.0로 조정하였다. 그후 용액을 0.45㎛ 폴리우레탄 막캡슐 필터를 통해 여과하였다(# 12131 VersaflowTM캡슐; Gelman Science, Ann Arbor, MI).
여과된 물질을 그후 입자크기 0.025-0.04mm를 가지는 직경 9cm×높이 11cm 칼럼의 FractogelREMD TMAE-650(S)(대략 700ml의 수지)(EM Science)상에서 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 분별하였다. 칼럼을 먼저 pH 8.0, 20mM Tris의 3칼럼부피로 평형화하였다. 단백질 용액을 1cm/분의 선속도로 칼럼을 통해 로딩하였다. 로딩된 칼럼을 20mM Tris, pH 8.0의 3칼럼 부피로 세척한 후 결합된 단백질을 20mM Tris, pH 8.0중의 0-0.3M NaCl 구배의 10칼럼 부피로 용리한후, 20mM Tris pH 8.0중의 0.3M NaCl의 2칼럼 부피로 용리하였다. TPO가 약 30mM NaCl에서 칼럼으로부터 용리되기 시작하였다.
FractogelR칼럼을 20mM Tris pH 8.0중의 1M NaCl의 3칼럼 부피로 깨끗하게 하고 0.5M NaOH의 3칼럼 부피로 소독한후, 2시간동안 0.5M NaOH중에 놓아두었다. 그후 칼럼을 5부피의 물로 세척한 후 20% 에탄올중에 저장하였다.
칼럼으로부터의 분획을 환원 조건하에서 10-20% 구배 폴리아크릴아미드 겔(Novex, San Diego, CA)상에서 전기영동후에 웨스턴 블랏 분석으로 분석하였다. 웨스턴 블랏에서 양성을 나타내는 70kD 물질의 분획을 푸울하였다.
TMAE 용리액의 단백질 함량을 280nm 흡광도에서 측정함으로써 정량하였다. 용리액을 0.5M Na 포스페이트 pH 6.8로 10mM Na 포스페이트로 조정하고 이 용액의 pH를 2N NaOH로 6.8로 조정하였다. 전도로를 물로 희석함으로써 10 mS/cm(대략 두배 희석)로 조정하였고 pH를 필요할때마다 6.8로 재조정하였다.
그후 희석된 용리액을 대략 총 단백질 6mg당 수지 1ml를 사용하여 세라믹 수산화인회석(Macro-PrepR세라믹 수산화인회석, 40㎛; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)의 칼럼을 통해 러닝하였다. 이 지점에서 처리된 700리터의 조건화된 배지는 약 900mg의 단백질을 함유하고 있었으며, 150ml의 수지(4.4cm직경×15cm의 칼럼크기)상에서 처리하였다. 칼럼을 10mM Na 포스페이트 pH 6.8로 평형화한 후 1.5cm/분의 속도로 로딩하였다. 병류 분획을 수집하였다. 그후 칼럼을 10mM Na 포스페이트 pH 6.8의 4칼럼 부피로 세척하고 그 첫번째 칼럼 부피의 세척액은 병류 분획과 합하였다. 남아 있는 불순물 및 잔류 TPO(총 TPO의 약 10-20%)를 0.5M Na 포스페이트 pH 6.8로 칼럼으로부터 세척하였다. 칼럼을 3 칼럼 부피의 0.5M NaOH로 소독하고 칼럼을 2시간동안 NaOH에 놓아둔후, 5컬럼 부피의 물로 세척하였다. 그후 칼럼을 20% 에탄올에 저장하였다.
수산화인회석상에서 정제전 및 후의 생성물류를 C-18 칼럼 및 아세토니트릴 구배를 사용하여 역상 HPLC로 분석하였다. TMAE 용리액 푸울에 존재하는 본질적으로 모든 불순물이 수산화인회석에 결합되는 결과가 나타났다. 수산화인회석 칼럼으로부터의 병류 분획은 HPLC에 의해 단일 피크를 함유했다.
수산화인회석 칼럼으로부터의 TPO-함유 분획은 A280에 의해 약 250mg 총단백질을 함유하였다. 이 물질을 분말 Na 아세테이트 첨가로 20mM Na 아세테이트로 조정하고, pH는 5.0으로 조정하였으며 이 용액은 전도도 6mS/cm로 물로 희석하였다.
대략 30ml의 FractogelREMD SO3 --650(S)(EM Science)를 함유하는 3.2cm직경×3.7cm 칼럼을 20mM Na 아세테이트, pH 5.0의 3 칼럼 부피로 평형화하였다. TPO 용액을 2cm/분의 유속으로 칼럼을 통해 로딩하였다. 칼럼을 20mM Na 아세테이트, pH 5.0의 5칼럼 부피로 세척하였다. TPO를 0.5M NaCl을 함유하는 20mM Na 아세테이트 pH 5.0으로 칼럼으로부터 용리하였다. 용리액의 단백질 농도는 대략 1mg/ml였다.
칼럼을 0.5M NaOH의 3칼럼 부피로 청정하게 하고 2시간동안 NaOH에서 유지한 후 물의 5칼럼 부피로 세척하고 20% 에탄올에서 저장하였다.
실시예 2
실시예 1에 개시된 바와 같이 본질적으로 제조된 사람 TPO를 4-20% 트리스-글리신 겔(Novex, San Diego, CA로부터 얻음)상에서 전기영동후 은 염색 또는 웨스턴 블라팅으로 분석하였다. 1㎍의 단백질을 환원조건하에서 전기영동하고 겔을 코마시 블루로 염색하고 탈색한후 Daiichi 은 염색 키트(Integrated Separation System, Natick, MA)로 염색하였다. 이런 무거운 겔 로딩으로, 단일의 어두운, 넓은 밴드가 Mr70kD에 집중되었다. 100ng의 단백질을 비환원 조건하에서 전기영동하고 니트로셀룰로스 막으로 전이하였다. 블랏을 항-TPO 단일 클론 항체의 칵테일로 프로빙한후, 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 항체 및 ECLTM검출시약 (Amersham Corp.)으로 프로빙하였다. 그후 블랏을 X-레이 필름에 노출시켰다. 넓은 밴드가 약 70kD에 집중되어 나타났다. 250kD 바로 밑에서 시작하는 몇몇 매우 흐린 밴드가 또한 검출되었다.
TPO의 생물학적 활성은 표적세포로서 사람 MPL 리셉터를 암호하는 발현벡터(Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5640-5644, 1992)로 감염된 BaF3세포를 사용하여 유사분열 분석으로 분석하였다. BaF3는 쥐 골수로부터 유래된 인터루킨-3 의존성 전-림프구 세포주이다(Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727- 734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986). 세포를3H-티미딘의 존재하에서 시험샘플에 노출시켰다. 세포 DNA로 통합된3H-티미딘의 양을 사람 TPO의 표준곡선과 비교하여 정량하였다. 제조물은 1.77×106유닛/ml 활성을 가지는 것으로 발견되었으며, 여기서 10 U/ml는 유사분열 분석에서 ½-최대 자극을 제공하는 양으로 정의된다. 아미노산분석에 의해, 제조물에서 단백질 농도는 4.32×106U/mg의 비활성을 제공하는 0.41mg/ml였다.
상기로부터, 본 발명의 특정 구체예가 예시를 위해 여기 기재되었다 하더라도, 다양한 변형이 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어남이 없이 만들어질 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부되는 청구범위를 제외하고 제한되지 않는다.
서열목록
(1) 일반정보
(ⅰ) 출원인: 지모제네틱스 인코퍼레이티드
미국 워싱톤 98102 시애틀 이스트레이크 애비뉴 1201
(ⅱ) 트롬보포이에틴의 정제방법
(ⅲ) 서열의 개수: 2
(ⅳ) 연락주소:
(A) 주소자: 지모제네틱스 인코퍼레이티드
(B) 거리: 이스트레이크 애비뉴 이스트 1201
(C) 도시: 시애틀
(D) 주: 워싱톤
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 98102
(ⅴ) 컴퓨터 판독형태:
(A) 매체유형: 플로피디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성
(C) 운영체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: Patent In Release #1.0, 버젼 #1.25
(ⅵ) 계류중 출원 데이타:
(A) 출원번호:
(B) 출원일자:
(C) 분류:
(ⅷ) 대리인 정보:
(A) 성명: 게리 이 파커
(B) 등록번호: 31-648
(C) 참조번호: 95-04
(ⅸ) 통신정보:
(A) 전화: 206-442-6600 내지 6637
(B) 팩스: 206-442-6678
(2) [서열 1]에 대한 정보:
(ⅰ) 서열특성:
(A) 길이: 353 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자유형: 단백질
(xi) 서열순서: 서열 1
(2) [서열 2]에 대한 정보:
(ⅰ) 서열특성:
(A) 길이: 379 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자유형: 단백질
(xi) 서열순서: 서열 2
Claims (19)
- 생물학적 유체로부터 트롬보포이에틴(TPO)의 정제방법에 있어서,리간드 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 한외여과로 구성되는 군으로부터 선택된 방법에 의해 TPO-함유 생물학적 유체의 부피를 감소시켜 농축된 분획을 제공하는 단계;농축된 분획의 염농도를 조정하여 조정된 용액을 제공하는 단계;조정된 용액을 산성화하여 불순단백질을 침전시키고 청정화된 용액을 제공하는 단계;음이온-교환 크로마토그래피에 의해 청정화된 용액을 분별하여 TPO-풍부한 분획을 제공하는 단계;TPO-풍부한 분획을 수산화인회석에 노출시켜 단백질 불순물은 수산화인회석에 결합시키고 TPO는 실질적으로 결합되지 않은채로 남겨두는 단계;결합되지 않은 TPO를 수집하는 단계; 및양이온-교환 크로마토그래피 또는 한외여과에 의해 수집된 TPO를 농축시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 생물학적 유체는 세포-조건화된 배양배지 또는 그것의 분획인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, TPO는 사람 TPO인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 감소단계는 염료-리간드 친화성 크로마토그래피에 의해 직접적 포착으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 감소단계는 유도화된, 교차-결합된 아가로스 비드의 매트릭스상에서 직접적 포착으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 조정단계는 한외여과로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 농축단계는 양이온-교환 크로마토그래피로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 농축단계는 술포프로필기로 유도화된 불용성 지지체를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 분별단계는 음이온-교환 크로마토그래피로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 분별단계는 트리메틸아미노에틸기로 유도화된 불용성 지지체를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 수집된 TPO는 변성 조건하에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정하였을 때 70,000±10,000달톤의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 불순물은 트롬보포이에틴의 응집체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 생물학적 유체로부터 트롬보포이에틴(TPO)의 정제방법에 있어서,염료-리간드 친화성 크로마토그래피에 의한 직접적 포착으로 TPO-함유 생물학적 유체의 부피를 감소시켜 농축된 분획을 제공하는 단계;한외여과에 의해 농축된 분획의 염 농도를 조정하여 조정된 용액을 제공하는 단계;음이온-교환 크로마토그래피에 의해 조정된 용액을 분별하여 TPO-풍부한 분획을 제공하는 단계;TPO-풍부한 분획을 수산화인회석에 노출시겨 단백질 불순물을 수산화인회석에 결합시키고 TPO를 용리하는 단계; 및양이온-교환 크로마토그래피에 의해 용리된 TPO를 농축시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 트롬보포이에틴 및 단백질 불순물로 이루어진 용액으로부터 단백질 불순물의 제거방법에 있어서, 용액을 수산화인회석에 노출시켜 상기 단백질 불순물을 상기 수산화인회석에 결합시키고 상기 트롬보포이에틴은 실질적으로 결합되지 않은채로 남아 있게 하고, 결합되지 않은 트롬보포이에틴을 회수하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 단백질 불순물은 트롬보포이에틴의 응집체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 용액은 이온-교환 크로마토그래피, 리간드 친화성 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 트롬보포이에틴-함유 액체 조성물을 분별함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 용액은 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 트롬보포이에틴-함유 액체 조성물을 분별함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 용액은 음이온-교환 크로마토그래피 및 리간드 친화성 크로마토그래피의 조합에 의해 트롬보포이에틴-함유 액체 조성물을 분별함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 회수된 트롬보포이에틴은 양이온-교환 크로마토그래피 또는 한외여과에 의해 농축되는 것을 특징으로 하는 방법.
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